Lekce 7 kurzu GENETIKA Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc. CYTOGENETIKA
Cytogenetika se zabývá studiem organizace genomu a struktury a funkce chromozómů u eukaryot. Genom je souhrn veškeré DNA buňky. Poskytuje program, podle kterého se řídí veškeré biologické procesy v buňce či organismu. DNA je lokalizována v buňce téměř výhradně vjejím jádře a jen malá část je v jiných organelách (mitochondrie, plastidy). Chromozómy byly pozorovány v buněčném jádře již v 19. stol., ale jejich základní role v dědičnosti byla zjištěna až po roce 1900 vr. 1902 W. Sutton (USA) a T. Boveri (Německo) navrhli, že faktory dědičnosti (geny) by mohly ležet na chromozómech (=počátek cytogenetiky). CHROMOZÓMY -většinou pentlicovité útvary, které se formují v průběhu mitotického či meiotického dělení jádra -vinterfázi jsou despiralizovány, a proto jsou opticky nerozlišitelné
Funkce chromozómů -prostorová lokalizace genů (řazeny lineárně, geny stejného chromozómu tvoří tzv. vazbovou skupinu) -transportní funkce (bezchybný přenos kopie genetické informace zbuňky mateřské do buněk dceřinných, a to při mitóze a meióze) -umožňují a zajišťují rekombinaci genetické informace (crossingover) při meióze a tím dávají vzniknout novým kombinacím rodičovských vloh u potomků Počet chromozómů -druhově specifický (viz tab. 1) -haplodiploidní organismy (Hymenoptera - diploidní, haploidní) -B chromozómy -malé, počet se u jednotlivých jedinců daného druhu může lišit, nejsou nutné pro normální růst a vývoj org. -vyskytují se u všech eukaryotních skupin organismů -soudí se, že jde parazitické elementy srovnatelné se sobeckou DNA transposonů -jejich původ je ve fragmentech A chromzómů nebo jde o důsledek mezidruhové hybridizace
Velikost chromozómů -značně odlišná, a to i v rámci jednoho genomu (viz např. člověk, tab. 2-4, kde je rozdíl mezi největším a nejmenším chromozómem čtyřnásobný)
Karyotyp -fotografický obraz souboru chromozómů určitého organismu, kde jsou chromozómy často seřazeny od největšího knejmenšímu (obr. 8-3)
Polyténní chromozómy -obří chromozómy vyskytující se především v tkáních některých skupin hmyzu, např. ve vysoce polyploidních buňkách tkání některých skupin Dipter (slinné žlázy pakomárů, komárů, muchniček nebo drozofily) -vznikají endopolyploidizací (endoreduplikací vláken DNA) a jsou tvořeny velkým množstvím paralelně uspořádaných chromatid -zůstávají stále kondenzovány (jediný známý příklad permanentních interfázních chromozómů) a jejich počet je haploidní, neboť homologní chromozómy jsou trvale konjugovány - po obarvení mají charakteristický vzhled (banding pattern), tzn. střídají se úseky tmavě zbarvené (proužky=bands) s úseky slabě zbarvenými (meziproužky=interbands) a s jejich pomocí lze sestavit cytologickou mapu chromozómů -dalším charakteristickým rysem jsou Balbianiho prstence (pufy=puffs), jež se vyskytují na těch místech chromozómů, které vdaném okamžiku vykazují vysokou transkripční aktivitu (syntéza RNA) - Drosophila melanogaster (n=4) polyténní chromozómy vzájemně spojeny chromocentrem, jenž je tvořeno heterochromatinovými úseky centromer a u samečků navíc i celým pohlavním chromozómem Y; z chromocentra se rozbíhají ramena autozómů a pohlavního chromozómu X (obr. 2-15)
- pakomár rodu Chironomus (většina druhů n=3) polyténní chromozómy jsou tři a nejsou spojeny v chromocentru
Morfologie chromozómů -chromatidy typický chromozóm vmetafázi mitotického dělení je tvořen 2 sesterskými chromatidami, z nichž každá je tvořena dvojitým velmi složitě šroubovitě stočeným vláknem, které reprezentuje jednu molekulu DNA
primární konstrikce (zaškrcení) = centroméra spojuje obě sesterské chromatidy a dělí každou chromatidu na krátké raménko (p) a dlouhé raménko (q) kinetochor destička na povrchu centroméry, kníž se připojují mikrotubuly dělícího vřeténka a tím se podílí na segregaci chromozómů teloméry koncové oblasti chromozómu tvořené sekvencemi DNA odlišnými od ostatních částí chromozómu sekundární konstrikce jen u některých chromozómů, odděluje koncový úsek chromozómu, tzv. satelit; ten je často kulovitý a většinou obsahuje heterochromatin NOR = nucleolar organiser region = organizátor jadérka oblast na jednom či i více v chromozómech mech zodpovědná za tvorbu jadérka; často bývá umíst stěn n v oblasti sekundárn rní konstrikce a obsahuje ribozomáln lní DNA (rdna); počet NOR je druhově specifický (např. člověk k mám 10 NOR na 5 párech chromozómů)
teloméry -tvořeny velkým množstvím (250-1500) opakování krátké sekvence 5 -C n (A nebo T) m -3 (n= 2 nebo více, m = 1-4) (obratlovci, Neurospora, Trypanosoma 5 -CCCTAA-3, Arabidopsis 5 -CCCTAAA-3, Caenorhabditis 5 -GCCTAA-3 ) -stabilizují konce chromozómu vazbou s POT proteinem (protection of telomere) ochrana před nukleázami a před spojováním jednotlivých chromozómů -umožňují koncům chromozómů se replikovat (ve stále se dělících buňkách buňky zárodečných linií, jednobuněčné organismy zabraňují zkracování chromozómů)
Klasifikace chromozómů a) podle polohy centroméry a z toho vyplývajícího poměru délek obou ramének (q/p): chromozómy metacentrické centroméra uvnitř chromozómu, obě raménka zřetelná, dělí se dále na metacentrické a submetacentrické chromozómy akrocentrické centroméra ±na konci, krátké raménko nepatrné chromozómy telocentrické krátké raménko chybí b) podle barvitelnosti (např. Feulgenem) základní substance chromozómu, tj. chromatinu: euchromatin vinterfázi slaběji barvitelný, většina genů heterochromatin vinterfázi silně barvitelný, často geneticky inertní nebo obsahuje jen málo genů fakultativní heterochromatin chromozóm či jeho segment daného druhu se někdy chová jako heterochromatin, někdy jako euchromatin (např. Barrovo tělísko) konstitutivní heterochromatin vždy se chová jako heterochromatin (např. oblast centroméry, B chromozómy)
Trojrozměrná struktura chromozómu Lidská buňka obsahuje kolem 2 metrů DNA. Skládá-li se lidské tělo ze zhruba 10 13 diploidních buněk, pak celková délka DNA v lidském těle je asi 2.10 13 m, což je zhruba 100 astronomických jednotek. Tři úrovně struktur upořádání DNA: a) Nukleozóm oktamer bazických bílkovin histonů, po dvou od typu H2A, H2B, H3 a H4. Molekula DNA tvoří kolem tohoto oktameru 1,65 otočky (145-147 bp) a průměr struktury je 10 nm. b) Chromatozóm tvořený nukleozómem a histonem H1 připojeným na dalších 20-22 bp DNA celý chromatozóm obsahuje cca 167 bp DNA. c) Solenoid - do spirály uspořádané chromatozómy, cca 6 na jednu otočku, průměr 30 nm. Solenoid vytváří smyčky, které jsou připojeny k centrální struktuře (scafold) z nehistonového proteinu. DNA každé solenoidové smyčky je připojena ke scafoldu pomocí tzv. SAR domény (scafold attachment regions), která je tvořena nepřepisovanou DNA. Scafold struktura (250 nm) sama dále formuje spirálu vyššího řádu (průměr 700 nm). Struktura scafoldu obsahuje topoizomerázu II, která hraje důležitou roli při replikaci (rozplétání dvojšroubovice).
Zdá se, že při replikaci a transkripci zůstává nukleozómová organizace zachována, ale dochází kurčité reorganizaci bílkovin nukleozómu (obr. 16-34). Pokud jde o molekuly bílkovin nukleozómu, předpokládá se, že platí disperzivní model, kdy každá zdceřiných molekul DNA obsahuje část oktamerů původních a část oktamerů nově vytvořených (obr. 16-32).
Sekvenční organizace genomu
Rozptýlené genové rodiny skupina homologních genů rozptýlená po celém genomu. Např. aktin 5-30 genů, kreatin více než 20 genů, histony 100-1000 genů. Některé geny v rámci rodiny jsou nefunkční (netranskribované pseudogeny), vzniklé reverzně transkriptázovým procesem (neobsahují introny). Tandemové genové rodiny buňky potřebují produktů některých genů velké množství, proto rodiny těchto genů bývají uspořádány tandemově (viz organizátor jadérka standemově uspořádanými geny pro rrna). Dalšími podobně uspořádanými geny jsou geny pro trna nebo u některých organismů geny pro histony. Nekódující funkční sekvence teloméry (konce chromozómů) mají tandémové uspořádání jednoduché DNA sekvence, která není transkribována.
Sekvence s neznámou funkcí -jsou tvořeny několika kategoriemi: Satelitní DNA je vysoce repetitivní centromerická DNA, tvořená mnohonásobným tandemovým opakováním nukleotidové sekvencedlouhé vrozmezí 200-10000 bp. Délka satelitní DNA bývá v řádu megabází (1-100 Mb). Minisatelitní DNA (variable number tandem repeats, VNTR) se skládá z proměnlivého počtu (200-1000) opakování sekvence o délce 10-200 nukleotidů. Počet lokusů několik set až tisíc. Mikrosatelitní DNA je tvořena mnohonásobným tandemovým opakováním 2-9 bp sekvence, počet lokusů 10 3-10 5. Mikrosatelity jsou používány pro forenzní účely (DNA fingerprinty), kdy např. DNA z krve, tkání apod. je amplifikována PCR, DNA se poté rozdělí na agarózovém gelu a obarví. Objeví se množství různě velkých fragmentů, a to díky tomu, že každý jedinec má v příslušném lokusu rozdílný počet tandemových opakování a že pro PCR se použije více párů primerů amplifikujících mikrosatelity v různých lokusech. Transponovatelné sekvence (mobilní elementy) se dělí na retrotranspozony (např. LINEs, tj. long interspersed nuclear elements, nebo SINEs čili short interspersed nuclear elements) a transpozony.
CHROMOZÓMOVÉ ABERACE -odchylky od normálního či standardního karyotypu -jde buď ozměnu počtu chromozómů (genomové mutace) nebo o změnu struktury chromozómů (chromozómové mutace) -všechny aberace vznikají buď spontánně nebo mohou být indukovány chemickými nebo fyzikálními faktory (mutageny, viz přednáška Mutace) -vzávislosti na rozsahu mají aberace větší či menší následky, řada odchylek nemá žádný nebo má malý dopad na fenotyp selekční tlak slabý v každé populaci či u každého druhu lze zaznamenat výskyt určitých odchylek chromozómů = chromozómový polymorfismus
Genomové mutace Euploidie -změny počtu sádek chromozómů -dělíme na orthoploidii (sudé násobky), jako tetraploidie, hexaploidie, oktoploidie atd. a anorthoploidii (liché násobky základního počtu chromozómů, triploidie, pentaploidie atd.) -zdvojení (tetraploidii, z ní oktoploidii) lze indukovat chemickými látkami, ostatní počty jsou odvozené, převážně hybridizací Aneuploidie -změny počtu jednotlivých chromozómů v sádce -rozeznáváme trizómii (jeden chromozóm je přítomen třikrát místo dvakrát), tetrazómii (jeden chromozóm je přítomen čtyřikrát), monozómii (jeden chromozóm přítomen jedenkrát) a nulizómii (jeden pár homologních chromozómů chybí úplně)
EUPLOIDIE (POLYPLOIDIE) autopolyploidie -dojde ke zvýšení počtu chromozómových sad daného druhu allopolyploidie -organismus obsahuje chromozómové sady různých druhů (blízce příbuzných) -vtomto případě jsou z různých druhů pocházející sady chromozómů homologní pouze částečně (jsou homeologní) Monoploidie -u některého hmyzu jsou samci monoploidní (vznikají partenogeneticky) -u většiny organismů, hlavně živočichů, jsou monoploidi abnormální a vyskytují se jako raritní aberace; pohlavní buňky nemohou být u těchto monoploidů tvořeny meiózou, neboť chromozómy nemají párovací partnery, a proto jsou obecně sterilní (u výše zmíněných druhů -včely, vosy atd. -vznikají samčí gamety mitózou)
-monoploidie hrála a stále hraje důležitou roli při šlechtění rostlin: při klasickém šlechtění je např. indukovaná žádaná recesivní alela nejdříve převedena do homozygotní konstituce křížením, přitom jsou však často ztraceny jiné příznivé alelické kombinace; monoploidie umožňuje tato omezení překonat -uněkterých rostlin lze docílit vzniku haploidní rostliny kultivací prašníků či přímo pylových zrn
-mezi získanými haploidními rostlinami jsou pak hledány rostliny s žádanými vlastnostmi nebo je vznik takových rostlin indukován aplikací mutagenu -vybrané rostliny jsou následně převedeny do diploidního stavu (dihaploidie) aplikací mitotického jedu kolchicinu (z ocúnu, inhibuje tvorbu dělícího vřeténka, takže vznikne buňka diploidní)
-ujiných rostlinných druhů lze docílit haploidie dalším způsobem: např. diploidní ječmen (Hordeum vulgare) může být opylen pylem z diploidního planého druhu Hordeum bulbosum zygoty s jednou sadou chromozómů od každého druhu během následných mitóz však dochází k rychlé eliminaci chromozómů H. bulbosum, takže vzniklé embryo obsahuje pouze haploidní počet chromozómů z H. vulgare Triploidie -obvykle autopolyploidi vznikající buď spontánně nebo uměle křížením jedinců diploidních s tetraploidními -většinou sterilní kvůli párování homologních chromozómů při meióze, kdy vzniká trivalent nebo bivalent s univalentem spárované chromozómy se rozcházejí k opačným pólům vřeténka, avšak nepárový chromozóm jde náhodně k jednomu nebo druhému pólu produktem je jedna buňka s párem homologních chromozómů a jedna buňka s jediným chromozómem (pro 3n=3)
-pravděpodobnost, že všechny nespárované chromozómy se sejdou u jednoho pólu dělícího vřeténka a tak vznikne gameta s haploidním počtem chromozómů je (½) x-1,kde x je počet chromozómů v haploidní sádce -ostatní gamety budou mít počet chromozómů jiný (n<y<2n), budou aneuploidní a je vysoce pravděpodobné, že nedají vznik životaschopnému potomstvu díky genomové nerovnováze (genome imbalance), neboť na rozdíl od euploidie je aneuploidie organismu většinou neslučitelná se životem právě díky nadbytku části genů, což interaguje s normálním fungováním genomu -nejvýznamnějšími rostlinnými triploidy jsou banány (3n=33) a vodní meloun (pouze ty odrůdy, které tvoří plody bez semen)
Pohlavní a nepohlavní rozmnožování karase (upraveno dle Gui et Zhou, 2010)
Autotetraploidie -vzniká spontánně zdvojením počtu chromozómů z 2n na 4n a lze ji i indukovat uměle kolchicinem -autotetraploidní plodiny mají velký význam, neboť jsou obvykle výrazně větší (velikost buněk, plodů, květů, listových průduchů) a tím přinášejí větší užitek než plodiny diploidní
-meióze probíhá u autotetraploidů většinou bez problémů, při meiotickém párování dochází ke vzniku buď 2 bivalentů nebo 1 kvadrivalentu (obě situace vedou ke vzniku funkčních gamet) a nebo vzniká trivalent plus univalent (při této kombinaci následně vzniklé gamety jsou nefunkční)
Allopolyploidie -allopolyploidní rostliny jsou rostliny vzniklé jako mezidruhoví kříženci (spontánně nebo indukovaně) mající dvě nebo více sad chromozómů každého druhu -první allotetraploid byl vytvořen v r. 1928: hybrid byl funkčně sterilní, protože 9 chromozómů zelí bylo rozdílných od 9 chromozómů ředkvičky, takže při meióze chromozómy netvořily bivalenty; nicméně sterilita nebyla úplná a jednou se objevilo na hybridní rostlině několik semen po jejich vysetí vzešly rostliny, které byly normálně fertilní, neboť obsahovaly 36 chromozómů díky spontánní duplikaci 18 chromozómů hybrida -tento typ allopolyploidie se nazývá amfidiploidie (zdvojený diploid); hybrid však neměl list zelí a kořen ředkvičky, ale právě naopak
-dnes jsou allopolyploidní rostliny produkovány rutinně, bez čekání na spontánní duplikaci chromozómů, ale za využití kolchicinu -nicméně dosud byl tímto způsobem vyprodukován pouze jediný hospodářsky využitelný hybrid, Triticale (hybrid pšenice Triticum 2n=6x=42 a žita Secale 2n=2x=14), který kombinuje vysoký výnos pšenice s nenáročností žita
-v přírodě je allopolyploidie hlavním faktorem při speciaci rostlin (viz např. pšenice setá, rod Brassica)
-polyploidie je daleko častější u rostlin, nicméně i u živočichů máme řadu příkladů (nižší červi, někteří obojživelníci a plazi) -rovněž některé ryby jsou polyploidní, např. celá čeleď lososovitých vznikla polyploidizací, uměle byly vytvořeny triploidní (=sterilní) ústřice či některé hospodářsky významné druhy ryb -učlověka je polyploidie, převážně triploidie, příčinou zhruba 10 % spontánních potratů (triploidní dítě se výjimečně narodí, ale záhy umírá) ANEUPLOIDIE -obecnou primární příčinou vzniku aneuploidie je nondisjunkce při mitóze nebo meióze -v důsledku nondisjunkce při meióze vznikají různé aneuploidní gamety nebo část gamet má normální počet chromozómů
-aneuploidie většinou mění fenotyp velmi drasticky, avšak u velké většiny živočichů a u rostlin velmi často vede až k letalitě -př.: Datura stramonium (2n = 24), trisomie jednotlivých chromozómů a její vliv na tvaru a velikost plodu
-nejvýznamnější aneuploidie u člověka: 45, X - Turnerův syndrom, 1/5000 narozených dětí monosomie v jakémkoliv autozomu -vždy aborce embrya 47, XXY - Klinefelterův sy, 1/1000 narozených dětí 47, XYY - super male sy, Jacobův sy, fertilní muži 47, XXX - super female sy, triple X sy, fertilní ženy 47, XY, +21 nebo 47, XX, +21 - Downův sy, ženy mohou být fertilní a produkují normální nebo trisomické potomstvo; muži nefertilní; průměrná očekávaná délka života 17 let, ale 8 % se dožívá více než 40 let; výskyt závisí silně na věku matky (stejně jako u ostatních aneuploidií) 47, XY, +18 nebo 47, XX, +18 - Edwardsův sy, očekávaná délka života několik málo týdnů 47, XY, +13 nebo 47, XX, +13 - Pataův sy, očekávaná délka života 130 dní 47, XY, +8 nebo 47, XX, +8 -Warkanyho sy 2, mozaiková trisomie 8, celková vede k aborci trisomie ostatních autozomů je neslučitelná s životem vůbec
45, X - Turnerův syndrom
47, XXY - Klinefelterův syndrom 47, XY, +21 nebo 47, XX, +21 - Downův syndrom
Přehled chromozómových aberací u člověka
Chromozómové mutace -jde o cytologicky viditelné změny struktury -podmíněny především zářením a polyfunkčními alkylačními látkami (monofunkční alkylační látky mají schopnost indukovat chromozomální aberace nízkou) -při užití ionizujícího záření je mutace možno zaznamenat již v mitóze bezprostředně následující po působení záření, zatímco po působení chemického mutagenu musí mezi působením mutagenu a vznikem aberace proběhnout S fáze -dělí se na různé typy: a) podle mechanismu vzniku: -vyvolané zlomem a znovuspojením -vyvolané crossing-overem mezi repetitivními úseky DNA b) podle stability: -symetrické (stabilní), každý postižený chromozóm má stále jednu centroméru a dvě teloméry -asymetrické (nestabilní) = acentrické fragmenty, dicentrické chromozómy
c) podle typu poškození: -chromozómové postihují obě chromatidy -chromatidové postihují jednu chromatidu d) podle počtu zúčastněných chromozómů: -intrachromozomální = v rámci jednoho chromozómu -interchromozomální = zúčastní se více chromozómů e) podle toho, zda dochází nebo nedochází ke ztrátám resp. zmožení hmoty chromozómů: -balancovaná přestavba = nedojde k žádné ztrátě či naopak duplikaci, ale pouze ke změně pořadí genů na chromozómu (inverze = interní segment chromozómu je otočen o 180 o ; pericentrická i. zahrnuje centroméru, paracentrická nezahrnuje centroméru; reciproká translokace = dva acentrické fragmenty nehomologických chromozómů si vymění vzájemně místo změna vazbových poměrů genů; translokační heterozygoté jsou semisterilní (polovina jejich gamet je nefunkčních, některé specifické translokace spojeny s rakovinou)
-nebalancovaná přestavba = mění dávku genů (delece = ztráta interkalární části chromozómu, deficience = ztráta koncové části chromozómu, mohou být letální i neletální, mohou odhalit recesivní alelu, některé specifické delece spojeny s rakovinou; duplikace = zdvojení části chromozómu, zdroj nového materiálu pro evoluci) Další typy porušení struktury chromozómů indukované mutageny: - lokální achromázie - krátká místa despiralizace chromozómové struktury jedné z obou chromatid; cytologicky je jeví jako krátké nebarvitelné úseky a jsou charakteristickým typem poškození po působení chemických mutagenů, ale další genetické důsledky nemají - mnohotné fragmentace a pulverizace chromozómů - chromozómy se rozpadají na mnoho drobných částí, v extrémních případech se až rozpouštějí; kpulverizaci chromozómů dochází při působení extrémně vysokých dávek mutagenů, ale také po fúzi buněk vzdálených genomů (savčí x rostlinné)
- výměny sesterských chromatid -po působení mutagenů je možno pomocí speciálních technik zviditelnit v metáfázi výměny sesterských chromatid; slouží jako časný test k identifikaci mutagenů v prostředí
Nevyvážená dávka genů způsobená duplikací vede k vývojovým abnormalitám.
Typy gamet u heterozygota s paracentrickou inverzí a crossing-overem v této inverzi.
Typy gamet u heterozygota s pericentrickou inverzí a crossing-overem v této inverzi.