LABORATORNÍ STUDIE ANTIMIKROBNÍ AKTIVITY CHLOROVÝCH PŘÍPRAVKŮ NA BÁZI DICHLORIZOKYANURANU SODNÉHO Doc. Ing. Marie Hartmanová, CSc. Vojenská lékařská akademie JEP, Hradec Králové, Česká republika Mezi klasické, praxí dlouhodobě ověřené, dezinfekční přípravky patří chlorové přípravky. Teoretický základ dezinfekce položil sice německý lékař Ehrlich až v letech 1905-1915, ale první zprávy o použití chloru jako dezinficiens jsou známy mnohem dřív. V časovém harmonogramu využívání chemických látek k dezinfekci je třeba vzpomenout: rok 1791 použití chloru v plynném stavu k vykuřování nemocnic, rok 1827 použití chloru k bělení a dezinfekci, rok 1831 chlorový bělící roztok, rok 1847 chlorové vápno. Porodník I. Semmelweis se nesmířil s vysokou nemocností a úmrtností rodiček a vyslovil tedy roku 1847 názor, že příčinou infekce rodiček jsou sami lékaři, kteří přenášejí nemoc rukama. Navrhl na tehdejší dobu s úspěchem mytí rukou v chlorové vodě, a tak díky dezinfekci rukou snížil počet úmrtí rodiček. V roce 1910 byly poznány antimikrobní vlastnosti organických sloučenin chloru, krátce poté anorganických sloučenin chloru. Pak rok 1954 zaznamenal objev chlorhexidinu a jeho použití k dezinfekci rukou a jako antiseptikum. V témže roce byl použit dichlorizokyanuran sodný jako účinné dezinficiens. Antimikrobní činidla obsahující aktivní chlor, který se uvolňuje, se vyznačují vysokou oxidační aktivitou. Antimikrobní účinnost těchto přípravků je založena na hydrolýze chlorových substituentů za vzniku kyseliny chlorné a z ní uvolňovaného kyslíku ve stavu zrodu a dále i na přímém působení aktivního chloru. Výrazný baktericidní účinek chloru je vysvětlován destrukcí bakteriálních buněk, zejména je přisuzován destrukčnímu působení na některé enzymy nutné pro život mikroorganismů. Sledováním vlivu teploty a hodnoty ph na mikrobicidní účinky volného chloru bylo prokázáno, že nejúčinnější a nejvíce aktivní látkou je vedle chloru kyselina chlorná a ne její chlornanové anionty. Proto aktivita chlorových přípravků vzrůstá v kyselé oblasti ph, při které je kyselina chlorná téměř výlučně ve své nedisociované formě. To, že chlorové přípravky jsou antimikrobně účinnější v kyselé oblasti ph, může být způsobeno v důsledku zesílené oxidace, ale také i z toho důvodu, že nedisociovaná forma proniká vnější vrstvou buňky snadněji.
Přípravky s aktivním chlorem mají široké spektrum antimikrobní aktivity, které zahrnuje: vegetativní bakterie, mykobakterie, viry, řasy, protozoa. Některá sdělení uvádějí i účinnost chloru na bakteriální spory. Přehled různých studií antimikrobního účinku volně dostupného chloru naznačuje široký rozsah koncentrací aktivního chloru (0,5 ppm-1000 ppm) a různě dlouhé expozice (od několika vteřin do 30 minut). Antimikrobní aktivitu chlorových přípravků snižuje přítomnost organických látek, některé chlorové přípravky jsou citlivé na změnu ph. Koncem roku 2001 byla provedena na Katedře epidemiologie VLA JEP v Hradci Králové laboratorní srovnávací studie tří chlorových dezinfekčních přípravků na bázi dichlorizokyanuranu sodného (NaDCC). Všechny tři přípravky jsou distribuovány v tabletované efervescentní formě, liší se od sebe velmi nevýrazně množstvím uvolnitelného aktivního chloru a nevýrazně hodnotou ph. Srovnávací studie byla provedena na přípravcích Presept námi testovaná hmotnost tablety 2,5 g (ASP Johnson & Johnson), Medicarine hmotnost tablety 2,7 g (Henkel- Ecolab), Chloramix DT hmotnost tablety 3,3 g (Bochemie). Všechny tři druhy efervescentních přípravků jsou schváleny v České republice, také ve Slovenské republice. Přípravek Medicarine nebyl testován ve Slovenské republice, jeho dávkování i expozice byly převzaty z výsledků doporučených výrobcem v SRN. V České republice byl Medicarine testován a doporučené dávkování je odlišné, zejména na inaktivaci spor a za přítomnosti bílkovin. Srovnávací studie Medicarine byla v laboratoři provedena koncentracemi doporučenými na Slovensku, porovnávací přepočet na množství uvolnitelného aktivního chloru byl proveden pro dodavatele obou zemí. Doporučené dávkování Preseptu a Chloramixu DT je v obou zemích shodné. Výsledky testování i výpočty pro Presept a Chloramix DT tedy platí pro obě dodavatelské země. Všechny tři přípravky jsou schváleny v ČR pro plošnou dezinfekci a mají své číslo HEM. Všechny jsou určeny pro zdravotnickou i nezdravotnickou praxi. Všechny tři přípravky byly vždy testovány souběžně, za stejných laboratorních podmínek, výsledky testování jsou proto porovnatelné. Pro testování účinnosti byly použity standardní testovací metody doporučené Národní referenční laboratoří pro dezinfekci a sterilizaci při SZÚ Praha. Pro hodnocení účinnosti byly v laboratorních podmínkách použity standardní testovací kmeny z České státní sbírky typových kultur (CNCTC) při SZÚ Praha:
Staphylococcus aureus CNCTC Mau 43/60 Escherichia coli CNCTC Ec 324/70 Pseudomonas aeruginosa CNCTC Ps 79/70 Proteus vulgaris CNCTC PrO 9/46 Candida albicans CNCTC 49/64 spory Bacillus subtilis CNCTC Bs 4/42 E. coli bakteriofág ØX 174 CNCTC 13 706 B 1 hostitelská E. coli CNCTC 13 706-1 427/82 Suspenze bakterií použité v okusech obsahovaly 10 8-10 9 CFU.ml -1 (colony forming units), u modelového viru 10 9 PFU.ml -1 (plaque forming units). U každého pokusu jsou uvedeny přesné denzity suspenzí. Všechny námi sledované přípravky byly považované za 100% a dle potřeby byly v laboratorních podmínkách ředěny sterilní destilovanou vodou. Pro stanovení účinnosti v bílkovinném prostředí byly vzorky ředěny 20% beraním sérem (ZOO Servis, Dvůr Králové nad Labem) nebo živným bujonem. Každý pokus byl prováděn dvakrát až třikrát a v tabulkách jsou uvedeny průměrné hodnoty, pokud není uvedeno jinak. Ve srovnávací studii byly použity metody: standardní suspenzní metoda a mikrometoda (Kneiflová 1985, Kneiflová 1988), fágová metoda hodnocení virů (Bydžovská 1983), titrační stanovení koncentrace aktivního chloru (Jeník 1993). Zvolené expozice byly v rozmezí 2-32 minut. Výsledky testování jsou shrnuty v tabulkách 1-8, jsou uvedeny v % a dále přepočtem na ppm aktivního chloru (mg chloru v litru). Tabulky 1-4 hodnotí suspenzní mikrometodou výsledky testování na grampozitivní mikrob (St. aureus) a gramnegativní mikroby (Ps. aeruginosa, P. vulgaris, E. coli). MIC (minimální inhibiční koncentrace) na St. auresus jsou v procentech shodné 0,4%, nejvyšší ppm má Medicarine, na gramnegativní mikroby má nejnižší Medicarine (0,12%-667 ppm), Presept a Chloramix DT shodné 0,4%-1764 ppm a 1864 ppm. MBC minimální baktericidní koncentrace ve vodě je rozdílná, klesá s přibývající expozicí. Čím delší expozice, tím je nižší účinná koncentrace dezinfekčního prostředku. MBC-B minimální baktericidní koncentrace v bílkovinném prostředí dosahovaly vyšších hodnot než MBC, což je v souladu s literaturou. Bílkovinné prostředí snižuje účinnost dezinfekčních prostředků. Hodnoty MBC-B (v %) jsou shodné pro všechny kmeny i
vzorky, obsah aktivního chloru je v účinné koncentraci rozdílný. Tabulka 5 uvádí fungicidní účinnost na C. albicans. Ve vodném prostředí bylo dosaženo účinnosti již v 5 minutových expozicích, v bílkovinném prostředí při vyšších koncentracích a delších expozicích. Na Candidu albicans byl nejúčinnější v bílkovinné zátěži Presept. Tabulka 6 hodnotí virucidní účinnost. Ve vodném prostředí jsou přípravků shodné již při 5 minutách, v bílkovinném se liší, je nutno zvýšit koncentraci nebo prodloužit expozici. Tabulka 7 hodnotí testování na vysporulovaný Bacillus subtilis. Ve vodném prostředí bylo prokázáno dosažení sporicidnosti při koncentraci 1% (Presept), 10% (Chloramix DT, Medicarine), v bílkovinném prostředí je nutné navýšit koncentraci větší než 10% a výsledky nejsou jednoznačné. Po vyočkování na pevnou půdu rostly jednotlivé spory. Tabulka 8 shrnuje výsledky účinku chlorových přípravků na vysporulovaný Bacillus subtilis ve vodném a bílkovinném prostředí. V bílkovinné zátěži byly použity maximální koncentrace přípravků, které se daly ještě rozpustit. Další navýšení koncentrace už nebylo možné, neboť přípravky silně pěnily a další dezinfekčního prostředku se již nerozpouštělo. Výsledky jsou srovnatelné, po vyočkování na pevnou půdu byl učiněn závěr. K dosažení sporicidnosti v bílkovinném prostředí je u všech tří testovaných vzorků v laboratorních podmínkách potřeba 12% koncentrace za uvedených expozic: Chloramix DT 10 minut, Medicarine 60 minut, Presept 30 minut. V terénním použití jsou však tak vysoké koncentrace nereálné, neboť způsobují na kovových předmětech výraznou korozi a ekonomicky jsou takové roztoky finančně náročné. Na závěr testování byl učiněn praktický pokus s přípravkem Medicarine tak, jak je doporučován dodavatelem ve Slovenské republice. Do 10 litrového vědra s pitnou vodou byly vhozeny 2 tablety Medicarine (celkem tedy 5,4 g, tj. 300 ppm aktivního chloru). S tímto roztokem byla sledována účinnost na kmeny: St. aureus, E. coli, C. albicans a B. subtilis při expozicích 10, 20, 30 a 60 minut. Na testovací kmen St. aureus (G+ bakterie) byla koncentrace dostačující ve vodném prostředí (30 minut), v bílkovinné zátěži (60 minut). Na kmen E. coli (G - bakterie) byl počet tablet dostačující ve vodném i bílkovinném prostředí (10 minut), na C. albicans (kvasinka) je dostačující ve vodném prostředí (10 minut), v bílkovinném (20 minut). Na vysporulovaný B. subtilis naprosto nedostačující ve vodném i bílkovinném prostředí. Tabulka 9 uvádí výsledky titračního stanovení obsahu aktivního chloru v jednotlivých sledovaných přípravcích. Nejvíce chloru obsahuje Medicarine, následuje Chloramix DT, nejméně chloru z předložených vzorků obsahoval Presept. Uvedená
množství aktivního chloru jsou v souladu s předloženými prospekty. Hodnoty ph všech předložených vzorků jsou ve slabě kyselé oblasti ph, i to souhlasí s předloženými materiály. V další části studie byl proveden výpočetní rozbor dávkování tablet tak, jak je doporučeno dodavatelem. 1. Přípravek Presept byl testován na tabletách o hmotnosti 2,5 g. Tato tableta obsahuje 1,1 g aktivního chloru. Dodavatelem doporučena na 5 litrů vody pro nebílkovinné prostředí jedna tableta = 1,1 g aktivního chloru, na bílkovinné prostředí 2 tablety = 2,2 g aktivního chloru; na operační sály předměty 4 tablety = 4,4 g aktivního chloru. Výpočtem pro nebílkovinné prostředí = 220 ppm aktivního chloru, pro bílkovinné prostředí = 440 ppm, pro operační sály předměty 882 ppm aktivního chloru. Porovnáním výpočtu a ověřených laboratorních výsledků bylo prokázáno, že uvedená množství tablet Preseptu jsou pro nebílkovinnou i bílkovinnou zátěž dostačující. 2. Přípravek Medicarine byl testován na tabletách o hmotnosti 2,7 g. Tato tableta obsahuje 1,5 g aktivního chloru. Ve Slovenské republice je doporučena na 10 litrů vody pro nebílkovinné prostředí jedna tableta = 1,5 g aktivního chloru, pro bílkovinné prostředí 2 tablety = 3 g aktivního chloru. Výpočtem pro nebílkovinné prostředí = 150 ppm aktivního chloru, pro bílkovinné prostředí = 300 ppm aktivního chloru. V České republice je dodavatelem doporučeno na základě testování pro dezinfekci všech omyvatelných ploch, předmětů ve zdravotnictví 1-2 tablety na 10 litrů vody při expozici 5 minut. Při biologickém znečištění 1 tableta na 1,5 l vody, expozice 30 minut. Výpočtem pro nebílkovinné prostředí = 300 ppm aktivního chloru, pro bílkovinné prostředí 1012 ppm aktivního chloru. Porovnáním výpočtu a ověřených laboratorních výsledků bylo prokázáno, že dávkování Medicarine schválené pro Slovenskou republiku není dostačující; tomu odpovídající koncentrace jsou neúčinné zejména v bílkovinném prostředí. Je nutné navýšit počty tablet, tj. zvýšit koncentraci aktivního chloru na 1000 ppm a 30 minutovou expozici. Deklarovaná sporicidnost přípravku Medicarine za těchto podmínek v Slovenské republice je velmi diskutabilní a nepravděpodobná. Laboratorní pokusy v naší laboratoři ukázaly, že k inaktivaci spor je nutná ve vodném i bílkovinném prostředí 12% koncentrace Medicarine (66 720 ppm) a minimálně 30 minutová expozice,
pro bílkovinnou zátěž 60 minut při téže koncentraci. V České republice je doporučená koncentrace přípravku Medicarine účinná ve vodném i bílkovinném prostředí, stejně tak i doporučené expozice jsou správné. 3. Přípravek Chloramix DT byl testován na tabletách o hmotnosti 3,3 g. Tato tableta obsahuje 1,54 g aktivního chloru. Dodavatelem doporučeno na 8 litrů vody pro nebílkovinné prostředí 5 tablet = 7,69 g aktivního chloru, pro bílkovinnou zátěž 13 tablet = 20,02 g aktivního chloru. Výpočtem pro nebílkovinné prostředí = 962 ppm aktivního chloru, pro bílkovinné prostředí = 2502 ppm aktivního chloru. Porovnáním výpočtu a ověřených laboratorních výsledků bylo prokázáno, že doporučené koncentrace Chloramixu DT jsou plně účinné ve vodném i bílkovinném prostředí. Závěr Provedená srovnávací studie prokázala, že doporučené koncentrace a expozice přípravků Presept, Medicarine, Chloramix DT jsou účinné v doporučeních pro Českou republiku. Doporučené koncentrace Medicarine pro Slovenskou republiku jsou neúčinné, je nutné navýšit expozici i koncentraci přípravku. Literatura 1. Bydžovská O. Assessment of viral disinfection by means of bacteriophage X 174. J Hyg Epidem Microbiol 1983; 27:60-68. 2. Jeník J. Analytická chemie 2. Praha: SNTL; 1993. 171 s. 3. Kneiflová J. Hodnocení baktericidní účinnosti dezinfekčních prostředků suspenzní mikrometodou. Čs Epidemiol 1988; 37(2):97-104. 4. Kneiflová J. Standardní metody pro hodnocení dezinfekční účinnosti chemických látek. Acta Hyg Epidemiol Microbiol 1985; příloha 1. 25 s.
Tabulka 1. MIC, MBC, MBC-B chlorových přípravků na testovací kmen Staphylococcus aureus Přípravek MIC MBC MBC-B % ppm Cl 2 % ppm Cl 2 % ppm Cl 2 Chloramix DT 0,4 1864 0,4-0,04 1864-186,4 3,3-1,1 15 378-5126 Medicarine 0,4 2224 0,1-0,04 558-222,4 1,1-0,4 6116-2224 Presept 0,4 1764 0,1-0,04 441-176,4 1,1 4851 Vysvětlivky: Denzita suspenze: 2 x 10 9 CFU.ml -1 Tabulka 2. MIC, MBC, MBC-B chlorových přípravků na testovací kmen Pseudomonas aeruginosa Přípravek MIC MBC MBC-B % ppm Cl 2 % ppm Cl 2 % Ppm Cl 2 Chloramix DT 0,4 1864 0,04-0,004 186,4-18,64 1,1-0,4 5126-1864 Medicarine 0,12 667,2 0,1-0,004 558-22,24 1,1-0,4 6116-2224 Presept 0,4 1 764 0,04-0,004 176,4-17,64 1,1-0,4 4851-1764 Vysvětlivky: Denzita suspenze: 2 x 10 9 CFU.ml -1 Tabulka 3. MIC, MBC, MBC-B chlorových přípravků na testovací kmen Escherichia coli Přípravek MIC MBC MBC-B % ppm Cl 2 % ppm Cl 2 % ppm Cl 2 Chloramix DT 0,4 1 864 0,04-0,004 186,4-18,64 1,1-0,4 5126-1864 Medicarine 0,12 667,2 0,01-0,004 55,8-18,64 1,1-0,4 6116-2224 Presept 0,4 1 764 0,04-0,004 176,4-17,64 1,1-0,4 4851-1764 Vysvětlivky: Denzita suspenze: 1 x 10 9 CFU.ml -1
Tabulka 4. MIC, MBC, MBC-B chlorových přípravků na testovací kmen Proteus vulgaris Přípravek MIC MBC MBC-B % ppm Cl 2 % Ppm Cl 2 % ppm Cl 2 Chloramix DT 0,4 1864 0,1-0,01 466,2-46,62 1,1-0,4 5126-1864 Medicarine 0,12 667,2 0,1-0,04 558-222,4 1,1-0,4 6116-2224 Presept 0,4 1764 0,1-0,01 441-44,1 1,1-0,4 4851-1764 Vysvětlivky: Denzita suspenze: 2 x 10 9 CFU.ml -1 Tabulka 5. Účinky chlorových preparátů na Candidu albicans ve vodném a bílkovinném prostředí Prostředek Vodné prostředí Bílkovinné prostředí [%] Ppm Cl 2 [%] Ppm Cl 2 Chloramix DT 0,1 466 0,3 (10) 1 398 (10) Medicarine 0,1 556 0,3 (10) 1 668 (10) Presept 0,05 220,5 0,1 (10) 441 (10) Vysvětlivky: Denzita suspenze: 5 x 10 8 CFU.ml -1 Čísla v závorce: účinné expozice v minutách Tabulka 6. Účinky chlorových preparátů na bakteriofág X 174 ve vodném a bílkovinném prostředí Prostředek Vodné prostředí Bílkovinné prostředí [%] Ppm Cl 2 [%] Ppm Cl 2 Chloramix DT 0,1 466 0,3 (10) 1 398 (10) Medicarine 0,1 556 0,1 (20) 556 (20) Presept 0,1 441 0,5 (10) 2 205 (10) Vysvětlivky: Titr virové suspenze: 1,8 x 10 9 PFU.ml -1 Čísla v závorce: účinné expozice v minutách
Tabulka 7. Účinky chlorových preparátů na vysporulovaný Bacillus subtilis ve vodném a bílkovinném prostředí Prostředek Vodné prostředí Bílkovinné prostředí [%] Ppm Cl 2 [%] Ppm Cl 2 Chloramix DT 46 620 46 620 10 (10) 10 (30) (10) (30) Medicarine 10 55 600 > 10 > 55 600 Presept 44 100 1 4 410 10 (20) (20) Vysvětlivky: Denzita suspenze: 1,8 x 10 9 CFU.ml -1 Čísla v závorce: účinné expozice v minutách Tabulka 8. Účinky chlorových preparátů na vysporulovaný Bacillus subtilis ve vodném a bílkovinném prostředí Vodné prostředí Bílkovinné prostředí Prostředek [%] Ppm Cl 2 [%] Ppm Cl 2 Chloramix DT 55 920 55 920 12 (10) 12 (10) (10) (10) Medicarine 66 720 66 720 12 (30) 12 (60) (30) (60) Presept 52 920 1 (10) 4410 (10) 12 (30) (30) Vysvětlivky: Denzita suspenze: 2 x 10 9 CFU.ml -1 Čísla v závorce: účinné expozice v minutách Vyšší koncentrace chlorových preparátů než je 12 % nelze použít, protože se další množství pevné látky již nerozpustí.
Tabulka 9. Obsah aktivního chloru v jednotlivých chlorových přípravcích a hodnoty ph 1% a 0,5% roztoku Obsah Přípravek Aktivního chloru ph [1%] ph [0,5%] [%] Chloramix DT 46,6 5,4 5,1 Medicarine 55,6 5,1 4,5 Presept 44,1 5,4 5,1 Stanoveno titrací roztokem thiosíranu sodného C (Na 2 S 2 O 3 x 5 H 2 O) = 0,1 mol.l -1