Hmotnostní analyzátory I

Hmotnostní analyzátory I Analýza iontů Tandemová hmotnostní spektrometrie Typy analyzátorů Analyzátor doby letu Magnetický sektorový analyzátor Kvadrupólový analyzátor Iontová past Hmotnostní analyzátor Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua

Analýza iontů Hmotnostní analyzátor je zařízení, které využívá elektromagnetických polí k separaci iontů v plynné fázi podle jejich poměru hmotnost/náboj (m/z). skenující analyzátor zadržující ionty doby letu Skenující - postupně propouští ionty různých hmotností (sektorový analyzátor, kvadrupólový analyzátor) Zadržující ionty zachytí ionty, pak je analyzuje (iontová past, orbitrap, ICR) Průletový měří se čas, který potřebují ionty různých hmotností aby překonaly definovanou vzdálenost (TOF) Hmotnostní analyzátory TOF B Q LIT IT OT ICR Analyzátor doby letu Magnetický sektorový analyzátor Lineární kvadrupól Lineární kvadrupólová iontová past Iontová past Orbitrap Iontová cyklotronová resonance Hmotnostní analyzátory se liší principem měření, a tedy i svými vlastnostmi. Vhodný typ analyzátoru volíme dle aplikace. doi:10.1016/0168-1176(87)80030-7

Parametry hmotnostních analyzátorů Hmotnostní rozsah nejnižší a nejvyšší hodnota m/z, kterou lze s daným analyzátorem měřit Rozlišovací schopnost schopnost poskytnout rozlišené signály pro ionty s malým rozdílem hmotností Přesnost určení hmotnosti přesnost, se kterou lze měřit m/z iontů (udává se pro vnitřní i vnější kalibraci) Dynamický rozsah - počet koncentračních řádů, v nichž je odezva závislá na koncentraci Rychlost rychlost záznamu spekter Parametry hmotnostních analyzátorů

Tandemová hmotnostní spektrometrie Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS n ) Metody, při kterých je sledovaný ion vybrán (první MS), fragmentován a produkty sledovány analyzátorem (další MS) K fragmentaci může dojít: 1/ spontánně (metastabilní ionty); PSD / aktivací iontů (kolizemi s neutrálními částicemi, interakcemi s fotony či elektrony); CID, IRMPD, ECD, ETD Metastabilní ionty Ionty s velkou vnitřní energií (větší než threshold pro fragmentaci), které se nerozpadají ve zdroji, ale až v oblasti hmotnostního analyzátoru. Tandemová hmotnostní spektrometrie Fragmentace za zdrojem (Post Source Decay, PSD) Fragmentace metastabilních iontů ve vakuovém MALDI-TOF. Prekurzory vytvořené ve zdroji (kinetická energie kev) se během letu v letové trubici rozpadají. Fragmenty mají stejnou rychlost jako prekurzor, ale různou kinetickou energii. V TOFu nemohou být rozlišeny (dopadají na detektor ve stejnou dobu), ale v reflektronu ano. Využívá se korelace mezi kinetickou energií fragmentů a jejich hmotností. Př:

Tandemová hmotnostní spektrometrie Disociace vyvolaná srážkou (Collision Induced Dissociation, CID) Nejčastější způsob MS/MS analýzy. Fragmentace iontů založená na jejich srážkách iontů s neutrálními částicemi (He, Ar, N ). Po srážce dochází k rychlému převedení translační energie na energii vibrační a k její rychlé distribuci po všech kovalentních vazbách. Dochází ke štěpení nejslabších vazeb. CID se provádí v kolizní cele (srážkové komoře) Př.: CID v iontové pasti MS MS MS 3 Tandemová hmotnostní spektrometrie Disociace záchytem elektronu (Electron Capture Dissociation, ECD) Fragmentace vícenásobně nabitých iontů po jejich reakci s elektrony. Vícenásobně nabité ionty (vytvořené elektrosprejem) zachycené v ICR cele interagují s nízkoenergetickými (termálními; < 1 ev) elektrony. Tvoří se ionty s lichým počtem elektronů, který díky přebytku energie získaného touto reakcí fragmentují. [M + 3H] 3+ + e - [M + 3H] + fragmenty Vhodné pro strukturní analýzu peptidů včetně identifikace modifikujících skupin. Tvoří se zejména ionty typu c a z.

Tandemová hmotnostní spektrometrie Disociace přenosem elektronu (Electron Transfer Dissociation, ETD) Fragmentace vícenásobně nabitých iontů po jejich reakci s radikál-anionty. Vícenásobně nabité ionty (vytvořené elektrosprejem) interagují s radikál-anionty s dostatečně nízkou elektronovou afinitou sloužícími jako donor elektronů. Tvoří se ionty s lichým počtem elektronů, které fragmentují obdobně jako v případě ECD. A - + [M + 3H] 3+ A + [M + 3H] + fragmenty ETD lze implementovat na IT nebo Q-TOF. Radikál-anionty se tvoří v CI zdroji. Př. reagentů: fluoranthen anthracen azobenzen, -bichinolin Tandemová hmotnostní spektrometrie Technické řešení ETD na lineární iontové pasti Thermo Scientific

Tandemová hmotnostní spektrometrie Multifotonová disociace infračerveným zářením (InfraRed MultiPhoton Dissociation, IRMPD) Fragmentace iontů po jejich interakci s fotony infračerveného záření. Paprsek IR laseru vstupuje do prostoru ICR cely nebo iontové pasti. Ionty absorbují energii fotonů a jsou excitovány do vyšších vibračních stavů až dojde k fragmentaci vazeb, obdobně jako u CID. Spektra jsou podobná CID. IRMPD -na iontových pastech není omezení v nízkých oblastech m/z (pod 1/3 m/z prekurzoru) CID Analyzátor doby letu (TOF)

Analyzátor doby letu Analyzátor doby letu je založený na měření doby, za kterou ionty překonají určitou dráhu. Ionty jsou urychleny vysokonapěťovým pulsem a vstupují do oblasti bez elektrického pole (letové trubice). Ionty s různým m/z získají stejnou energii, ale různou rychlost. Čas, který je potřebný k překonání letové dráhy je rozdílný - těžší ionty potřebují delší čas než lehčí ionty. Na konci trubice je detektor. Analyzátor doby letu Ionty vstupující do analyzátoru jsou urychleny elektrickým polem. Získají tak kinetickou energii o velikosti: E 1 ezu mv Rychlost iontu i urychleného napětím U: p E k v ezu m i Doba letu v trubici o délce l: l t eu mi z k mi z Ionty s nižší hmotností (poměrem m/z) o stejné kinetické energii se pohybují rychleji než ionty s vyšší hmotností. Příklad: Doba letu jednou nabitého peptidu o hmotnosti 1000 Da, napětí 0 kv, délka m: t= 3 s

Zavádění iontů do TOF Ortogonální zavádění, pusher: Iontový svazek je pod úhlem 90 zaváděn do analyzátoru. Napěťové pulsy oddělují jednotlivé části svazku na malé části, které jsou vypuzeny do letové trubice. Prostorová a energetická disperze iontů je tak minimalizována a dosahuje se vysokého rozlišení. MALDI zdroj: Laserové pulsy přímo vytvářejí diskrétní balíčky iontů, které jsou napěťovým pulzem převedeny do letové trubice. Ionty však mají různé počáteční rychlosti, směry pohybu a startovací pozice. Výsledkem je zhoršení rozlišení. Technická řešení: opožděná extrakce po vzniku iontů se vyčká s napěťovým pulzem. Ionty se rozdělí podle rychlostí. Rychlejší se dostanou dále do analyzátoru a při vložení pulzu na ně působí slabší pole. iontové zrcadlo - reflektron Reflektron iontové zrcadlo Reflektron je elektrostatické iontové zrcadlo, které slouží k sjednocení kinetických energií iontů se stejným m/z. Je tvořen soustavou elektrod s postupně se zvyšujícím potenciálem. Ionty s větší kinetickou energií pronikají hlouběji do elektrostatického pole a tím dojde k jejich zpoždění. Délka průniku do reflektronu nezávisí na m/z, pouze na kinetické energii. Ionty se stejnou m/z se tak dostanou na stejnou pozici. Rozlišení se však zvyšuje na úkor citlivosti a snížení hmotnostního rozsahu.

Reflektron iontové zrcadlo BEZ REFLEKTRONU S REFLEKTRONEM TOF s vícenásobným ohybem iontového svazku Přístroje s multiotáčkovou iontovou optikou, která nahrazuje reflektron a prodlužuje dráhu iontů Konstrukční řešení: 4 toroidní elektrostatické sektory s otvory, iontový svazek se několikrát otočí celková dráha iontů ~ 17 m Parametry: -vysoké rozlišení 60 000-80 000 -vysoká přesnost určení m/z:1 ppm s vnitřní kalibrací, 10 ppm s vnější kalibrací -dobrá citlivost -malé rozměry ( benchtop přístroje) Jeol

TOF s vícenásobným ohybem iontového svazku Folded Flight Path (FFP) Ionty ze zdroje jsou odráženy iontovými zrcadly a směrovány sérií fokusačních prvků umístěných v řadě uprostřed. Podle režimu měření ionty prochází různou trajektorií a s tím souvisí i dosažené rozlišení. Bezmřížková iontová zrcadla vysoká transmise (>50 % v High resolution módu) Délka analyzátoru 75 cm, maximálně 64 odrazů (celková dráha až 40 m) Rozlišení max. 100 000 FWHM, přesnost určení hmotnosti <1 ppm, Rychlost sběru dat do 00 spekter za sekundu LECO Corporation TOF s vícenásobným ohybem iontového svazku Folded Flight Path (FFP) Survey High Resolution Ultra High Resolution A D A D A D R=,500 Mass Accuracy: n.d. Full Mass Range R=50,000 Mass Accuracy: <1ppm Full Mass Range R=100,000 Mass Accuracy: <1ppm 4:1 mass Range LECO Corporation

Tandemová MS TOF/TOF Dvě odlišná řešení: TOF/TOF s CID kolizní celou TOF/TOF s CID kolizní celou: Po výběru prekurzoru selektorem jsou ionty fragmentovány v kolizní cele (CID). Produkty jsou následně akcelerovány do reflektronu. TOF/TOF s LIFT celou: Nedochází k CID, ale detekují se ionty vzniklé samovolným rozpadem prekurzorů za iontovým zdrojem (postsource decay, PSD). Prekurzory i PSD fragmenty mají stejnou rychlost (vznikly až po urychlení).v LIFT cele jsou ionty urychleny napěťovým pulsem a získají tak různé rychlosti. Dále procházejí reflektronem a jsou detekovány. TOF/TOF s LIFT celou Analyzátor doby letu Obecně: Hmotnostní analyzátor s teoreticky neomezeným rozsahem m/z, jednoduchý, s vysokou propustností iontů, poměrně vysokým rozlišením a citlivostí. Typické aplikace spojení s MALDI pro analýzu proteinů a peptidů, jako Q- TOFy ve spojení s LC, možno i GC. Analýzy vyžadující vyšší rozlišení, široké možnosti využití. Rozlišení: nízké nebo vysoké (lineární mód x reflektron) Přesnost určení hmotnosti: pod ppm Hmotnostní rozsah: neomezený Rychlost skenu: velmi vysoká > 10 6 u/s

Magnetický sektorový analyzátor Magnetický sektorový analyzátor Ionty jsou urychleny vysokým napětím (4-8 kv) do magnetického pole vytvořeného elektromagnetem. Využívá se zakřivení dráhy iontů v magnetickém poli (poloměr dráhy iontů je úměrný poměru m/z). Při analýze iontů je detektor na fixní pozici, skenuje se buď magnetické pole nebo urychlovací napětí. Klasický typ analyzátoru používaný od počátků organické MS.

Magnetický sektorový analyzátor Iontový zdroj udělí iontům kinetickou energii E k urychlovacím napětím U E k 1 v-rychlost iontu; m-hmotnost iontu; mv qzu ezu e-elementární náboj; z-nábojové číslo Na pohybující se ion v magnetickém poli působí Lorentzova síla F L, která způsobí zakřivení dráhy iontů F L qvb ezvb a zároveň síla dostředivá F c, které jsou v rovnováze FL F c ezvb mv r m r m -poloměr dráhy iontu Ionty se začnou pohybovat po kruhové dráze s poloměrem r m : r m miv ezb Magnetický sektorový analyzátor Kombinací vztahů r m miv ezb a 1 mv ezu Získáme základní rovnici MS (dnes už se tak ale neoznačuje; z=1) m e i rm B U Magnetický sektorový analyzátor separuje ionty v prostoru na základě zakřivení dráhy iontů. Magnetický sektorový analyzátor lze skenovat buď změnou magnetické indukce B nebo napětí U.

Sektorové analyzátory s dvojitou fokusací Analyzátory s dvojitou fokusací kromě magnetického sektoru obsahují ještě elektrostatický sektor, který kompenzuje energetickou disperzi iontů a tak zvyšuje rozlišení. Elektrostatický sektorový analyzátor vytváří radiální elektrické pole mezi dvěma opačně nabitými deskami. Ionty o stejném m/z s různou kinetickou energií jsou zaostřeny (fokusovány) do jednoho místa. Elektrostatický analyzátor neseparuje monoenergetické ionty! Magnetické sektorové analyzátory Obecně: Klasický typ analyzátoru s vysokou rozlišovací schopností umožňující izolace při vysokém rozlišení, a vysokoenergetické MS/MS. Vysoký dynamický rozsah, avšak relativně pomalý. Typické aplikace stopová GC/MS dioxinů, furanů, bromovaných difenyletherů, polychlorovaných naftalenů (PCNs) apod. Rozlišení: do 100 000 (dvojitá fokusace) Přesnost určení hmotnosti: 5 ppm Hmotnostní rozsah: 0 000 Rychlost skenu: pomalý

Kvadrupólový analyzátor (Q) Kvadrupólový analyzátor Analyzátor tvořen 4 paralelními tyčemi kruhového nebo hyperbolického průřezu, na něž je vkládáno napětí. Vstupující ionty začnou oscilovat. Oscilace jsou stabilní pouze pro ionty s určitým poměrem m/z a jen tyto ionty kvadrupólem projdou. Ostatní jsou zachyceny na tyčích. Skenováním jsou propouštěny postupně všechny ionty z požadovaného rozsahu spektra ( hmotnostní filtr ).

Kvadrupólový analyzátor d x dt e m r i 0 Vkládané napětí je složeno ze stejnosměrné (U) a střídavé složky (V): 0 U V cos t Pohybové rovnice pro pohyb iontů v osách x a y (směrem k tyčím): d y e ( U V cos t) x 0 ( U V cos t) y 0 dt m r i 0 -úhlová frekvence Řešením rovnic je poloha iontu o dané hmotnosti v daném čase. Získáme parametry q (časově proměnné, střídavé pole) a a (časově neměnné, konstantní pole). q x q y ev m r i 0 a x a y 4eU m r i 0 r 0 -vzdálenost mezi tyčemi kvadrupólu, -frekvence radiofrekvenčního napětí * Émile Léonard Mathieu (1835-1890), francouzský matematik Stabilitní diagram Závislost parametru a na q vymezuje oblasti, kde je ion o dané hmotnosti stabilní (projde kvadrupólem) nebo nestabilní (neprojde kvadrupólem) nestabilní ion - pohled v ose x nestabilní ion - pohled v ose y stabilní pohyb průchod kvadrupólem

Skenování kvadrupólu Grafické znázornění stabilitního diagramu pro 3 ionty (m/z 8, 69 a 19). Při skenování se současně mění a a q tak, aby jejich poměr byl konstantní. Snížením poměru a/q se zvyšuje oblast m/z (iontů), které projdou analyzátorem. Současně se snižuje rozlišení. Při skenu pro jednotkové rozlišení všech m/z se mění a a q tak, aby sledovaly čárkovanou čáru. Každý ion se měří jen velmi krátkou dobu, ve zbylém čase končí na tyčích kvadrupólu. Pozn: Skenování do 1000 u, sken 1s, ion se měří 1/1000 s. Snížení rozsahu = zvýšení citlivosti. Kvadrupólový analyzátor Obecně: Jednoduchý skenující hmotnostní analyzátor, který se používá v základních (levných) GC/MS a LC/MS přístrojích. Má nízké rozlišení a nízkou přesnost určení hmotnosti. Toleruje vyšší tlak v oblasti analyzátoru, používá se i jako fokusační prvek nebo kolizní cela. Typické aplikace základní analyzátor v běžných GC/MS a nejlevnějších LC/MS Rozlišení: jednotkové (lepší pro hyperbolické tyče) Přesnost určení hmotnosti: 0.1 u (až 5 ppm) Hmotnostní rozsah: 000 (4000 u) Rychlost skenu: max 5000 u/s

RF-only kvadrupóly (hexapóly, oktapóly) Stejnosměrné napětí rovno nule, aplikuje se jen střídavé napětí. Propuští všechny ionty. Využití: iontová optika ( ion guides ), kolizní cely. Trojitý kvadrupól QqQ Skeny trojitého kvadrupólu: Tři kvadrupóly spojeny za sebou, prostřední obsahuje plyn (Ar) a slouží jako kolizní cela, kde je možné ionty fragmentovat Standardní analyzátor pro MS/MS, kvantifikace

Iontová past (IT) Sférická (3D) iontová past Lineární iontová past Sférická iontová past Analyzátor tvořen prstencovou a dvěma koncovými elektrodami (trojrozměrný kvadrupól). Pomocí trojrozměrného RF pole je možno ionty uvnitř uchovávat a selektivně vypuzovat. Uvnitř pasti je helium (1 mtorr).

Sférická iontová past uvažujeme elektrické pole ve 3 rozměrech: Napětí vkládané na prstencovou elektrodu (rovina xy) : Napětí vkládané na koncové elektrody: 0 0 Pole uvnitř pasti v z,r souřadnicích (r 0 je vnitřní poloměr pasti): Pohybové rovnice: 0 x, y, z ( r z ) r 0 d z 4e dt m r i 0 d r e ( U V cos t) z 0 ( U V cos t) r 0 dt m r i 0 a a 16eU q 8eV z r z r mir0 mir0 q f f= základní RF frekvence Řešením diferenciální rovnice je poloha iontu o dané hmotnosti v daném čase Zachycení iontů v pasti Zavádění iontů do pasti ( nástřik ) je umožněno systémem iontové optiky, která funguje jako brána (-V otevřeno, +V zavřeno). Délka plnění pasti je řízena tak, aby nedošlo k její přeplnění. Ion zůstane v pasti zachycen, pokud se nachází uvnitř stabilitního diagramu. Jeho oscilace musí být stabilní jak v ose z, tak v ose r. Pohyb iontu v 3D pasti Stabilitní diagram - závislost parametru a na q vymezuje oblasti, kde je ion o dané hmotnosti stabilní (zůstane v pasti) nebo nestabilní (zanikne na elektrodách nebo je vypuzen).

Zachycení iontů v pasti Přeplnění pasti: Pokud by se do pasti dostalo příliš mnoho iontů, tak by ty vnější stínily pole těm uvnitř a došlo by ke zhoršení rozlišení, snížení signálu a posunu m/z jak zabránit přeplnění pasti? předsken výpočet z předchozího skenu předsken (Thermo) před vlastním skenem se provede velmi krátký předsken, kdy se zjistí počet iontů přicházejících do pasti. Podle toho se upraví doba otevření brány. výpočet z předchozího skenu (Bruker) doba, po kterou je brána otevřena se počítá z množství iontů v předchozím skenu. Helium tlumící a kolizní plyn: Do pasti je kontinuálně zaváděno He. Slouží ke snížení kinetické energie iontů (zvýšení rozlišovací schopnosti a citlivosti) a jako kolizní plyn pro MS n experimenty. Skenování iontové pasti Na prstencovou elektrodu se aplikuje tzv. fundamentální RF napětí. Frekvence je konstantní, mění se amplituda V. Stejnosměrné napětí se neaplikuje; a z =0). Postupně se zvyšuje amplituda napětí V. Tím roste q z pro všechny ionty až dosáhne limitu stability. Tím je ion vypuzen ve směru osy z (na detektor dopadne 50% iontů).

Tandemová MS s iontovou pastí Iontové pasti umožňují izolaci iontů, jejich aktivaci, fragmentaci a skenování vzniklých fragmentů na jednom místě (v jednom zařízení) MS n až do~10 stupně pravidlo 30/70 ionty s hmotností 30% hmotnosti prekurzoru a nižší nemohou být v pasti stabilizovány Př. Reserpin Rauwolfia Sférická iontová past Obecně: Poměrně levný analyzátor zadržující ionty vyznačující se vysokou rychlostí skenu a umožňující tandemovou MS (vhodný pro určování struktury). Horší rozlišení, omezený rozsah spektra. Typické aplikace analyzátor pro tandemovou MS, spojení s LC i GC, velmi široké použití, možnost kvantifikace Rozlišení: jednotkové (snížením rychlosti skenu může být zvýšeno) Přesnost určení hmotnosti: 0.1 u Hmotnostní rozsah: 000 (4000 u) Rychlost skenu: max 5000 u/s

Lineární iontová past (D past, LIT) Lineární iontová past je v podstatě RF only multipól (kvadrupól), na jehož přední i zadní straně jsou umístěny elektrody na vyšším DC potenciálu. Uvnitř multipólu tak vzniká pole umožňující uchovávat a selektivně vypuzovat ionty. Ionty mohou být vypuzeny axiálně i radiálně. LIT segmentovaný kvadrupól, radiální ejekce iontů Thermo Scientific

Vlastnosti lineárních iontových pastí myoglobin Vysoká kapacita: (až 50x ve srovnání se sférickou pastí) minimalizace problémů s prostorovým nábojem, širší lineární dynamický rozsah Vysoká účinnost plnění a detekce iontů: (možnost dvou detektorů) vyšší citlivost (~ 10-0 x ve srovnání se sférickou pastí) Vyšší rozlišení