BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY MOŽNOSTI ENKAPSULACE KOFEINU ENCAPSULATION OF CAFFEINE BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR KLÁRA PATOČKOVÁ doc. RNDr. IVANA MÁROVÁ, CSc. BRNO 2012

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12 Zadání bakalářské práce Číslo bakalářské práce: FCH-BAK0655/2011 Akademický rok: 2011/2012 Ústav: Ústav chemie potravin a biotechnologií Student(ka): Klára Patočková Studijní program: Chemie a technologie potravin (B2901) Studijní obor: Potravinářská chemie (2901R021) Vedoucí práce doc. RNDr. Ivana Márová, CSc. Konzultanti: Ing. Petra Matoušková Název bakalářské práce: Možnosti enkapsulace kofeinu Zadání bakalářské práce: 1. rešerše - charakterizace kofeinu, výskyt v potravinách a přírodních látkách, fyziologické účinky. 2. Optimalitace analytického stanovení kofeinu. 3. Enkapsulace kofeinu do liposomů, charakterizace částic a jejich stabilita v různých podmínkách. Termín odevzdání bakalářské práce: 4.5.2012 Bakalářská práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu bakalářské práce. Toto zadání je přílohou bakalářské práce. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Klára Patočková doc. RNDr. Ivana Márová, CSc. doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Student(ka) Vedoucí práce Ředitel ústavu V Brně, dne 31.1.2012 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Tato bakalářská práce je zaměřená na možnosti enkapsulace kofeinu do mikro- a nanočástic. Teoretická část práce byla věnována informacím o kofeinu, liposomech a polysacharidech a také na způsobu enkapsulace. V experimentální části byly mikro- a nanočástice s enkapsulovaným kofeinem připraveny 5 různými technikami. Kofein byl enkapsulován do liposomů i polysacharidových částic (chitosan/alginát). Účinnost enkapsulace byla stanovena pomocí HPLC/UV-VIS. U připravených částic byla sledována jejich velikost a stabilita metodou dynamického rozptylu světla. Částice byly vystaveny účinku umělé žaludeční, pankreatické a žlučové šťávy. Byla sledována stabilita částic a množství uvolněného kofeinu. Sedimentační rychlost a stabilita částic byla monitorována analytickou centrifugací. V nealkoholických nápojích byla stanovena koncentrace částic kofeinu, kdy došlo k zakalení nápoje. ABSTRACT This bachelor thesis is focused on possibilities of encapsulation caffeine in micro- and nanoparticles. In the theoretical part was devoted to information about caffeine, liposomes and polysaccharides and also on the techniques of encapsulation. In the experimental part 5 different methods were used for preparation of micro- and nanoparticles with encapsulated caffeine. Caffeine was packaged into liposomes and polysaccharide particles (chitosan/alginate). Encapsulation s effectiveness was determined by HPLC/UV-VIS. Prepared particles were monitored for size and stability by dynamic light scattering. The particles were exposed to the arteficial stomach and intestinal juices and bile acids. Particle stability and amount of released caffeine was monitored. Analytical centrifugation was used to measurement of sedimentation velocity and stability of the prepared particles. Caffeine containing particles were added in several soft drinks to determine particles amount when turbidity occurred. KLÍČOVÁ SLOVA: kofein, enkapsulace, liposomy, polysacharidové částice KEYWORDS: caffeine, encapsulation, liposomes, polysaccharide particles 3

PATOČKOVÁ, K: Možnosti enkapsulace kofeinu. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2012. 61 s. Vedoucí bakalářské práce doc. RNDr. Ivana Márová, CSc.. PROHLÁŠENÍ: Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatné a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkanem FCH VUT... podpis studenta PODĚKOVÁNÍ: Ráda bych poděkovala vedoucí bakalářské práce RNDr. Ivaně Márové, CSc. za cenné informace, odborné vedení a všestrannou pomoc, dále Ing. Petře Matouškové za pomoc při experimentální práci, ochotu a trpělivost. 4

OBSAH 1 ÚVOD... 8 2 TEORETICKÁ ČÁST... 9 2.1 Kofein... 9 2.1.1 Charakterizace kofeinu... 9 2.1.3 Výskyt v potravinách... 9 2.1.4 Kávovník, čajovník... 10 2.1.5 Fyziologické účinky... 10 2.2 Enkapsulace... 11 2.2.1 Princip... 11 2.2.2 Kritéria... 11 2.2.3 Materiály... 12 2.2.5 Sprejové sušení... 12 2.2.6 Sprejové chlazení... 12 2.2.4 Polyelektrolyty... 12 2.2.6 Fluidní vrstva... 12 2.2.7 Emulze... 13 2.2.6 Hydrogely... 13 2.2.8 Liposomy... 13 2.3 Liposomy... 13 2.3.1 Charakteristika liposomů... 13 2.3.2 Transport léčiv... 14 2.3.3 Příprava... 14 2.3.4 Stabilita... 15 2.3.5 Lecithin... 15 2.3.6 Cholesterol... 15 2.4 Polysacharidové částice... 16 2.4.1 Charakterizace... 16 2.4.2 Polysacharidy... 16 2.4.3 Chitosan... 16 2.4.4 Alginát... 17 2.5 Metody využívané k analýze částic a enkapsulovaných látek... 17 2.5.1 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie... 17 2.5.2 Stanovení velikosti částic metodou dynamického rozptylu světla... 18 2.5.3 Stanovení stability částic pomocí analýzy zeta potenciálu... 19 2.5.4 Analytická centrifugace... 20 2.6 Cíl práce... 21 3 PRAKTICKÁ ČÁST... 22 3.1 Použité chemikálie a přístroje... 22 3.1.1 Použité chemikálie... 22 3.1.2 Standardní chemikálie... 22 3.1.3 Ostatní chemikálie... 22 3.1.4 Přístroje a pomůcky... 22 3.2 Stanovení kofeinu metodou HPLC s UV-VIS detekcí... 23 3.3 Enkapsulace kofeinu do liposomů... 23 3.3.1 Metoda ethanolového vstřikování - EV... 23 5

3.3.1.1 Izolace lecithinu z vaječného žloutku... 23 3.3.2 Metoda odpařování na tenké vrstvě (thin layer evaporation) TLE... 23 3.3.3 Metoda odpařování z tenké vrstvy na reverzní fázi (reverse phase thin layer evaporation) - RP-TLE... 24 3.4 Enkapsulace kofeinu do polysacharidových částic... 24 3.4.1 Chitosan-alginátové částice - CHA... 24 3.4.2 Chitosanové částice - CH... 24 3.5 Stanovení enkapsulační účinnosti... 24 3.6 Stanovení velikosti částic metodou dynamického rozptylu světla... 24 3.7 Stanovení stability částic... 25 3.7.1 Stanovení zeta potenciálu... 25 3.7.2 Stanovení stability a rychlosti usazování částic - analytická centrifugace... 25 3.7.3 Stabilita částic v modelovém fyziologickém prostředí... 25 3.7.3.1 Žaludeční šťáva... 25 3.7.3.2 Pankreatická šťáva... 25 3.7.3.3 Žlučová šťáva... 25 4 VÝSLEDKY A DISKUSE... 26 4.1 Optimalizace stanovení kofeinu... 26 4.2 Stanovení enkapsulační účinnosti... 26 4.2.1 Enkapsulace kofeinu do liposomů... 26 4.2.1.1 Liposomy připravené metodou ethanolového vstřikování... 26 4.2.1.2 Liposomy připravené metodou TLE... 27 4.2.1.3 Liposomy připravené metodou RP-TLE... 28 4.2.2 Polysacharidové částice... 28 4.2.2.1 Chitosan-alginátové částice... 28 4.2.2.2 Chitosanové částice... 29 4.2.3 Srovnání enkapsulační účinnosti jednotlivých metod... 29 4.3 Stanovení velikosti částic... 30 4.3.1 Vizualizace částic pod mikroskopem... 30 4.3.1.1 Liposomy pod elektronovým mikroskopem... 31 4.4 Stanovení částic metodou dynamického rozptylu světla... 32 4.4.1 Liposomy... 32 4.4.1.1 Liposomy připravené metodou ethanolového vstřikování... 32 4.4.1.2 Liposomy připravené metodou TLE... 33 4.4.1.3 Liposomy připravené metodou RP-TLE... 33 4.4.2 Polysacharidové částice... 34 4.4.2.1 Chitosan-alginátové částice... 34 4.4.2.2 Chitosanové částice... 35 4.5 Stanovení stability částic analýzou zeta potenciálu... 36 4.6 Stanovení stability a rychlosti usazování částic metodou analytické centrifugace... 37 4.6.1 Posouzení stability liposomů s využitím analytické centrifugace... 38 4.6.1.1 Liposomy připravené metodou ethanolového vstřikování... 38 4.6.1.2 Liposomy připravené metodou TLE... 39 4.6.1.3 Liposomy připravené metodou RP-TLE... 40 4.6.2 Polysacharidové částice... 41 4.6.2.1 Chitosan-alginátové částice... 41 6

4.6.2.2 Chitosanové částice... 42 4.7 Stabilita částic v modelovém fyziologickém prostředí... 43 4.7.1 Vliv žaludeční šťávy... 43 4.7.2 Vliv pankreatické šťávy... 44 4.7.3 Vliv žlučových šťáv... 44 4.8 Posouzení stability částic v modelovém fyziologickém prostředí pomocí stanovení zeta potenciálu... 45 4.8.1 Žaludeční šťáva... 45 4.8.2 Pankreatická šťáva... 46 4.8.3 Žlučové šťávy... 48 4.8 Přídavek vybraných částic do modelových nápojů... 49 4.8.1 Přídavek liposomových částic... 49 4.8.1.1 Perlivá voda Magnesia... 49 4.8.1.2 Kofola... 49 4.8.2 Přídavek polysacharidových částic... 51 4.8.2.1 Perlivá voda Magnesia... 51 4.8.2.2 Kofola... 52 5 ZÁVĚR... 54 6 LITERATURA... 56 7 SEZNAM ZKRATEK... 59 8 SEZNAM PŘÍLOH... 60 10 PŘÍLOHY... 61 7

1 ÚVOD V dnešní uspěchané době je čím dál častěji vyhledáván stimulant, který probudí naše smyslové organy a podpoří lepší mozkovou činnost. Většina lidí sáhne po kofeinu, který rychle dodá energii. Pro většinu populace je kofein spojený s kávou, ale můžeme jej nalézt ve spoustě jiných potravin a nápojů. Má kromě pozitivních účinků i negativní. Mezi negativní důsledky požití kofeinu patří podrážděnost, nespavost, závislost či nervozita. Kofein může při vysoké dávce způsobit i smrt. Bakalářská práce se zabývá možností enkapsulace kofeinu do organických částic. Při zapouzdření dojde k zabalení aktivní látky do polymerního nebo membránového obalu. Tato metoda byla vytvořena pro přenos látek na místo působení, aniž by došlo k jejich poškození, rozpuštění či jinému znehodnocení. Možnosti způsobu enkapsulace jsou široké. Ale u potravin se musí dodržovat předpisy a legislativní nařízení potravinářského průmyslu. V práci byly vytvořeny polysacharidové částice ze směsi chitosanu a alginátu a ze samotného chitosanu. Také byly připraveny liposomy z lecithinu a cholesterolu. U všech částic byla zkoumána účinnost enkapsulace kofeinu a podmínky stability. Liposomy a polysacharidové částice byly vystaveny též účinku umělých trávicích šťáv; žaludeční, pankreatické a žlučovým kyselinám. Připravené roztoky částic s kofeinem byly přidány do nealkoholických nápojů a byla testována nejvyšší koncentrace enkapsulovaného kofeinu, která ještě nezpůsobila zákal. 8

2 TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Kofein 2.1.1 Charakterizace kofeinu Kofein nebo-li 1,3,7-trimethylxanthin patří mezi purinové alkaloidy. Alkaloidy jsou odvozeny od xanthinu, což je produkt oxidace purinu [1]. Sumární vzorec je C 8 H 10 N 4 O 2 a molekulová hmotnost 194,19. Kofein je pevná bílá látka, bez zápachu, silné hořké chuti. Je hořlavý a bod tání je při 235-239 C [2]. Lze jej nalézt ve více než 60 druzích rostlin, a to v semenech, listech i v plodech. Nejznámější výskyt je u kávových zrn, kakaových bobů, guarany, čaji, lián a koly. Úloha kofeinu u rostlin je působit jako pesticid, protože paralyzuje a zabijí hmyz [1]. Obrázek 1: Kofein [3] 2.1.3 Výskyt v potravinách Kofein je obsažený v čaji, kávě, čokoládě, nealkoholických i alkoholických nápojích a v lécích spojených s potlačováním chuti k jídlu. Limitní obsahy v nealkoholických nápojích jsou 250 mg dm -3, v energetických nápojích 320 mg dm -3 a do lihovin se přidává pouze nezbytné množství. Obsah kofeinu v sušině kávy se pohybuje od 0,5 do 2,7 %. V jednom šálku kávy (100 ml) je asi 80 mg kofeinu, obsah se mění podle způsobu přípravy. Ve filtrované kávě je obsaženo 93-127 mg kofeinu na 100 ml, v instantní kávě 23-91 mg na 100 ml, v překapávané 37-132 mg na 100 ml a v dekofeinované kávě 1-6 mg na 100 ml. Kávu bez kofeinu získáme extrakcí organickým rozpouštědlem nebo oxidem uhličitým. V kakaových bobech je obsažen kofein v množství 0,02-0,5 %. Guaranové oříšky jsou nejvíce bohaté na kofein, nalezneme zde 2,5-7,5 %. V čajovníku jsou pouze 2 % kofeinu a listy keře yerba maté obsahují 1,4-2,7 % kofeinu v sušině [1]. Spotřeba kávy je v každé zemi odlišná. Nejvyšší spotřeba - více než 10 kg na osobu za rok - je ve skandinávských zemích, Rakousku a Nizozemsku. Ve většině západoevropských zemí, v Brazílii a Kostarice je spotřeba 6-9 kg na osobu za rok. Nejmenší spotřeba, 5 kg na osobu za rok, je uváděna ve Spojených státech, Itálii, Paraguayi, Alžírsku a Nikarague [4]. 9

Tabulka 1:Obsah kofeinu v nápojích a v čokoládě (100 g)[5] Nápoj Množství kofeinu Nápoj Množství kofeinu Káva (cca 2dl) 115 mg Pepsi cola 38 mg Čaj (cca 2dl) 50 mg RC Cola 36 mg Ledový čaj (cca 2dl) 30 mg 7up 0 mg Limonáda 15 mg Kakao (nápoj) 4 mg Coca-cola (3dl) 46 mg Čokoládové mléko 3 mg Cherry cola 45 mg Mléčná čokoláda 30 mg Dr. Pepper 40 mg Hořká čokoláda 130 mg 2.1.4 Kávovník, čajovník Plody kávovníku se mechanicky zbaví dužiny, zbytky jsou odstraněny fermantací. Semena se oloupou a praží při 200-250 C. Kofein částečně sublimuje, a proto se zachytává v kondenzátoru. Kofein spolu s dalšími složkami se váže na kyselinu chlorogenovou. Čajovník čínský obsahuje kofein v listech, jeho procentuální zastoupení závisí na stáří listu - čím mladší list, tím více kofeinu obsahuje. Černý čaj se získá z listů, které se nechají uvadnout a následně se smotají a fermetují. Zelený čaj se naopak pouze usuší na pánvi [6]. 2.1.5 Fyziologické účinky O prospěchu či škodlivosti kávy jsou vedeny rozsáhlé diskuze, které se v poslední době spíše ubírají k závěru, že kofein do jistého množství není škodlivý. Při výzkumu nebyly prokázány negativní účinky spojené s neplodností, sklony k potratu či nádorem prsu. Maximální denní dávka by neměla být vyšší než 300 mg kofeinu. Účinky kofeinu trvají 4-12 hodin. Projevy kofeinu na lidské tělo zásadně závisí na době podání. Pokud se káva konzumuje v určitém časovém rozestupu, dojde naopak ke snížení hladiny kofeinu, a to kvůli dehydratační vlastnosti kávy. To znamená, že kofein je z těla vyloučen. Dále také závisí na jedinci, každý člověk bude mít po konzumaci kávy jinou odezvu. Rovněž byl proveden výzkum vlivu kofeinu na růst nervových buněk v mozku (dendrity). Testované myši embrya, staré 19 dní, měly vyšší počet dendritů a výběžky buněk se prodloužily o 33 %. Tento jev je pravděpodobně zapříčiněn uvolněním vápníku, který následně podporuje růst buněk. U člověka růst nervových buněk vlivem kofeinu pozorovat nemůžeme, protože použitá koncentrace kofeinu je tak vysoká, že by převládaly negativní účinky [5]. Kofein jako stimulant působí pouze v malých dávkách, obvykle méně než 3 mg na kilogram váhy člověka. Účinky kofeinu jsou především spojovány s aktivitou mozkové kůry. Blokuje adenosinové receptory, dochází k zvýšení krevního tlaku, k uvolnění adrenalinu z ledvin a noradreanalinu z CNS a zvýšení glykogenolýzy [7]. Zvýšení srdeční činnosti a uvolnění adrenalinu stimuluje lepší sportovní výkony, proto se v některých zemích řadí mezi doping [8]. Kofein podporuje stav bdělosti, pozornost, vzrušení a náladu. Tyto účinky lze jen těžko kvantifikovat, jsou u každého jednice jiné. Aby kofein byl účinný, musí být dosažena potřebná individuální koncentrace. Neprokázané jsou terapeutické účinky u Parkinsonovy nemoci a u neurodegenerativních onemocnění [9]. Deriváty kofeinu 10

se aplikují u léčby migrény, mohou vést ke snížení bolesti hlavy zúžením průsvitu mozkových cév [8]. Menší koncentrace kofeinu mohou vyvolat u starších lidí spánek [7]. Naopak vyšší dávky mohou způsobit vzrušení, nespavost, zčervenání obličeje, nervozitu, zvýšené močení či střevní potíže. Účinek kofeinu na srdce závisí na množství obsaženém v kávě. Pokud je káva silná, dojde k zrychlení srdeční činnosti, naopak u slabé kávy se tep srdce zpomalí. U jedinců s oslabenou srdeční činností může požití kofeinu vyvolat srdeční arytmii. Pití kávy nelze počítat do denního příjmu tekutin, naopak káva zvyšuje vylučování vody ledvinami, proto je nutné dodržovat pitný režim [8]. Nelze zcela vyvrátit souvislost mezi kofeinem a vyplavováním vápníku z kostí [5]. Smrtelná dávka kofeinu je 6,5 až 50 g, záleží na individuální vnímavosti jedince [8]. Abstinenční příznaky projevující se při náhlém přerušení konzumace kávy jsou např. bolesti hlavy, vyčerpanost, nervozita a ospalost. Doporučuje se snižovat dávku postupně, stejně jako u většiny návykových látek. Podle některých odborníků by těhotné ženy mohly pít dva šálky kávy denně. Oponenti však upozorňují na možnost transportu kofeinu z krevního oběhu matky přes placentu do krevního oběhu plodu, kde zapříčiní zvýšení frekvenci tepu. Následně si plod vytváří návyk na kofein [5]. 2.2 Enkapsulace 2.2.1 Princip Enkapsulace je děj, při kterém dojde k zapouzdření jedné látky druhou látkou. Uvnitř pouzdra je aktivní látka a látka, která ji obklopuje, se nazývá povlak. Aktivní látkou může být kapalina, plyn či pevné těleso. Technologie byla vyvinuta v 60 letech pro biotechnologii, farmaceutický sektor podávání léků a očkování. Zapouzdření se hojně využívá v potravinářství, a to především k přenosu bioaktivních molekul (minerály, antioxidanty, mastné kyseliny či vitamíny) nebo živé buňky do potravin. Obsah kapsle se v časovém období postupně uvolňuje, a to za specifických podmínek. Velikost částic se pohybuje od několika nm až mm. V potravinách se snažíme o zpomalení degradačních procesů, dokud není výrobek dodán na místo určení. Tím pádem je cílem zapouzdření zachovat stabilitu látek při skladování a zpracování [10]. Obrázek 2: Možnosti enkapsulace [11] 2.2.2 Kritéria Při použití enkapsulace se vyhodnocuje metoda podle požadavků na nutriční vlastnosti, zlepšení kvality výrobku. Pro výběr správné metody zapouzdření je důležité, jakým procesem hotový výrobek projde, jestli dojde k tepelně úpravě, změně ph či přidání jiných aditivních látek. Dále se musí uvážit podmínky při skladovaní, výrobek se může skladovat při pokojové 11

teplotě nebo naopak dojde k ochlazení produktu. Rozhodující vliv sehrává i délka skladování, připravené částice mají pouze určitou životnost. Pro finální výrobek je důležitá velikost a hustota částic a hlavně mechanismus uvolnění částic. Kdyby se částice při vyšší teplotě porušily, tak se produkt nesmí tepelně zpracovávat [11]. 2.2.3 Materiály V potravinářském průmyslu se nepoužívají stejné materiály pro zapouzdření jako například v biotechnologii, což je především způsobeno nutností dodržovat předpisy pro suroviny určené ke konzumaci. Nejpoužívanější jsou polysacharidy, tj. rostlinné extrakty, mořské extrakty, mikrobiální a živočišné extrakty. Bílkoviny používané pro enkapsulaci jsou především želatina, lepek či kasein. Z lipidů se používají fosfolipidy, vosky, mastné alkoholy, glyceridy a mastné kyseliny [10]. 2.2.5 Sprejové sušení Sušení rozprašováním patří mezi nejstarší a nejrozšířenější techniky zapouzdření. Po ekonomické stránce patří k nejvýhodnějším [10]. Přidáním pomocné látky, například sacharózy, laktózy, PVA nebo albuminu, se zabrání degradaci při atomizaci vzorku pro sušení. Vzduch při sušení dosahuje vysoké teploty, ale teplota materiálu se výrazněji nemění. Výtěžek se pohybuje v rozmezí 20-50 %, zavedením cyklon se účinnost zvýší až na 70 %. Velmi obtížně lze řídit velikost vzniklých částic, částečně se problém vyřeší přidáním ultrazvukových trysek [12]. 2.2.6 Sprejové chlazení Technologie sprejového chlazení je obdobná s procesem sprejového sušení, ale při použití studeného vzduchu nedochází ke ztrátě vody ze vzorku. Metoda se používá na výrobu lipidových částic s vůní. Do lipidového roztoku se přidá aroma nebo jiná aktivní látka. Atomizovaný roztok se vhání do vychlazené komory. Vůně se z lipidů uvolní po dosáhnutí bodu tání [11]. 2.2.4 Polyelektrolyty Je to nejjednodušší metoda pro vytvoření fyzické bariéry kolem živých buněk. Pro tento účel jsou použity jak přírodní, tak i syntetické polymery. Mezi přírodní polymery patří alginát, který se často používá při enkapsulaci. Alginát-PLL systém je velice dobře prozkoumaná metoda. PLL je poly-l-lysin, který slouží jako kation. Naopak alginát se chová jako anion. Nejdříve se vytvoří alginátové kapsle se zachycenými aktivními látkami. Na zpevnění částic se přidává vápník. Nakonec se vytvoří membrána přimísením PPL do roztoku [13]. 2.2.6 Fluidní vrstva Superkritická fluidní technika kombinuje výhody plynu a kapaliny. Práškové částice jsou zastaveny v proudění vzduchu o určité teplotě a jsou postříkány atomizovaných materiálem pro potažení částic. Potahový materiál by měl být teplotně stabilní a mít dobrou viskozitu. Velikost částic z 5-50 % závisí na výběru potahové hmoty [11]. 12

2.2.7 Emulze Existují dva základní druhy emulze, voda v oleji nebo olej ve vodě. Složitější částice typu voda v oleji ve vodě se nejčastěji používají pro přípravu zabalených látek. Kapsle se vyznačují dobrou stabilitou, kterou umocníme vysušením aktivní látky před zabalením. Dojde ke ztrátě vody, která by mohla ovlivnit kvalitu výrobku [12]. 2.2.6 Hydrogely Hydrogely jsou nerozpustné ve vodě. Tvoří síť vláken polymerů, kde je volný prostor pro uchování aktivních látek. Pro přípravu se používají kationtové a aniontové polymery chitosan a karagenan. Chitosan nachází svoje využití při tvorbě gelu, naopak karagenan má důležitou úlohu při uvolňování z gelu. NaCl se přidává kvůli zpomalení tvorby gelu, protože při nekontrolovatelném gelovatění dochází k nehomogenní suspenzi. Karagenan se přimísí jako opačný polyelektron k chitosanu [14]. 2.2.8 Liposomy Pro výrobu liposomů se používají fosfolipidy, zejména lecithin a dále cholesterol. Jedná se o hydrofilní a hydrofobní interakci mezi molekulami vody a fosfolipidy. Aktivní látku můžeme umístit do vodní fáze uvnitř liposomů, což je vhodné pro hydrofilní látky, nebo do membrány pro lipofilní látky. Během skladování liposomů často dochází ke shlukování částic, tomuto ději se zabrání elektrostatickým odporem nebo sterickou stabilizací. V potravinách je použití liposomů omezené, hlavně díky fyzikální a chemické nestabilitě, avšak zkoumá se jejich pozitivní efekt při zrání tvrdých sýrů [15]. 2.3 Liposomy 2.3.1 Charakteristika liposomů Liposom je uměle připravená biomembrána. Většinou je tvořena fosfolipidy. Ve vodném prostředí dojde k vytvoření mikromolekul, které mají dvojvrstvu s hydrofobními řetězci směřující dovnitř molekuly, a hydrofilní hlavu orientovanou do vodné fáze. Liposomy jsou schopné zapouzdřit hydrofobní či hydrofilní molekulu ve vodném prostředí. Používají se při transportu léčiv do těla nebo jako model biologické membrány [16]. Unilamelární liposomy jsou ohraničeny pouze jednou dvojvrstvou membránou, velikost částic je v rozmezí 25 až 1 000 nm. Poskytují řadu výhod oproti multilamelárním liposomům, jako je vysoké zapouzdření látek rozpustných ve vodě a míra reprodukovatelnosti uvolňování aktivních látek. Multilamelární liposomy mají kolem jádra nejméně dvě dvojvrstvé membrány, jejich velikost se pohybuje od 50 do 10 000 nm [17]. 13

Obrázek 3: Liposom [18] 2.3.2 Transport léčiv Enkapsulace do liposomů může snižovat nežádoucí reakce léků, podporovat dostupnost aktivních látek léčiv, zvyšovat stabilitu nebo naopak rozpustnost látek v těle. Pomáhá cílenému uvolnění léků v místě požadovaného účinku. Využití v lékařství je velmi široké, liposomy lze nalézti v lécích proti rakovině, vakcínách, protivirových či antibakteriálních látkách aj. Klasické liposomy jsou občas nevhodné pro léčiva, protože může dojít k jejich vyloučení z těla, aniž by došlo k požadované aplikaci léku. Tento jev může být způsoben zejména velikostí částic. Tendence k zadržení aktivní látky je významná zejména u liposomů aplikovaných v játrech a slezině. Neúčinnost závisí též na dávce léku. Stabilizované liposomy cirkulují v těle delší dobu než klasické; pro stabilizaci se používají polymery nebo povrchové sacharidy [19]. Jsou různé možnosti, jak se lék přichytí na liposomu, může být adsorbován na povrchu membrány, připevněn k lipidovému řetězci či k hydrofilní hlavě, případně enkapsulován uvnitř liposomu [16]. 2.3.3 Příprava Základní metody přípravy liposomů jsou ruční protřepání lamelárních váčků, ethanolové vstřikování, odpaření reverzní fáze, vytvoření liposomů pomocí ultrazvuku, pomocí zmrazení a vysušení či vysokotlaké homogenizace [20]. Nejjednodušší metodou pro získání malých liposomů je injekční ethanolová metoda. Liposomy lze připravit i hydratací tenkého filmu 1,2-distearoyl-cn-glycero-3-fosfocholinu, lipidy se rozpustí v butanolu [21]. Multilamelární liposomy se připravují buď pouze z fosfolipidů, či s přídavkem ekvimolárního množství cholesterolu. Látky se rozpustí v chloroformu, který je následně odstraněn v odparce. Poté se do baňky s odparkem přidá vodná fáze a mechanickým mícháním dojde k tvorbě liposomů. Pro zvýšení stability se liposomy zmrazí. Nejprve se vystaví teplotě -20 C a pak se po 12 hodin suší. Vzorky musí být uskladněny ve tmě, při teplotě 1 5 C a ve vakuově uzavřených nádobách. Proliposomy se připravují ze sacharózy a roztoku chloroformu, který obsahuje lecithin a cholesterol v poměru 1:1 [20]. 14

2.3.4 Stabilita Stabilitu liposomů posuzujeme z fyzikálního, biologického i chemického hlediska. Chemické rozložení je způsobeno hydrolýzou či oxidací lipidů. Častěji probíhá oxidace díky nenasyceným vazbám v hydrofilním řetězci. U fyzické stability zkoumáme stálost obsahu tuku v mikromolekule a velikost. Biologická stabilita závisí na prostředí, v kterém se liposom nachází. Kationty liposomů jsou po důkladné sterilizaci dlouhodobě stabilní při 4 C, stabilnější tekutou formu nalezneme v přítomnosti antioxidantů a nízkých solí či u mrazem sušených liposomů [17]. 2.3.5 Lecithin Lecithin je významná chemikálie pro přípravu liposomů [13]. Patří mezi fosfolipidy, název lecithin by se měl používat pouze pro průmyslovou výrobu. Z chemického hlediska to je fosfatidylcholin. V potravinách se nachází především ve vnitřnostech (srdce, mozek, játra a ledviny), v sádle, másle, obilí, zelenině a rostlinných olejích. Vysoký obsah lecithinu je ve vaječném žloutku, který je celkově bohatý na fosfolipidy. Průmyslový preparát lecithinu, vzniklý při rafinaci rostlinného oleje, obsahuje acylglyceroly, steroly, volné mastné kyseliny, tokoferoly, barviva a další stržené látky. V potravinářství se používá při přípravě těsta, jako emulgátor při výrobě majonéz nebo ke snížení viskozity při výrobě čokolády [22]. Obrázek 4:Lecithin [23] 2.3.6 Cholesterol Patří mezi steroly, které jsou nedílnou součástí lipoproteinů a membrán. Člověk přijímá cholesterol v potravě, ale většinu si musí syntetizovat. Zdravotní problémy jsou spojeny s přenosem cholesterolu v lipoproteinech s nízkou hustotou (LDL) ze střeva do krevního oběhu. Doporučená denní dávka je 300 mg. V živočišných potravinách nalezneme cholesterol především ve vaječném žloutku, mozku, svalovině, mléku, sýru či sádlu. U rostlinných potravin je největší zastoupení cholesterolu v palmovém oleji [22]. Pro enkapsulaci je cholesterol nezbytný, protože je amfifilní povahy a ve vodném prostředí je schopen se začlenit do fosfolipidové dvojvrstvy a stabilizovat tak liposomy [13]. 15

Obrázek 5: Cholesterol [24] 2.4 Polysacharidové částice 2.4.1 Charakterizace Polysacharidy představují nejčastěji používaný materiál v zapouzdření pro potravinářský průmysl. Běžně se využívají škrob a jeho deriváty nebo celulóza a její deriváty. Kromě těchto nejznámějších polysacharidů se pro tvorbu polysacharidových částic hojně využívají rostlinné extrakty, mikrobiální a živočišné polysacharidy, mořské extrakty nebo sójové polysacharidy [10]. Aktivní látky se přichytnou na vazebná místa v řetězci polysacharidu [22]. Po přidání opačně nabitého elektrolytu dojde k vytření gelové struktury [12]. 2.4.2 Polysacharidy Obsahují stovky až tisíce monosacharidových jednotek, kterou jsou vzájemně spojeny glykosidickou vazbou. Mají obvykle jen jeden redukující konec, tedy mají volnou pouze jednu anomerní hydroxylovou skupinu na konci řetězce. Dělíme je obecně na heteropolysacharidy a homopolysacharidy. První jmenované se skládají z různých monosacharidových podjednotek, zatímco homopolysacharidy jsou složeny pouze z jednoho druhu monomeru. Nejběžnější glukózové homopolysacharidy jsou škrob a celulóza [25]. V přírodě se polysacharidy vyskytují ve volné i vázané formě [26]. Vyznačují se bezpečností, stabilitou a netoxicitou. Mají hydrofilní povahu a jsou schopny vytvořit gel. Používají se jako nosiče pro cílenou aplikaci léčiv, ale je zde problém s jejich poměrně vysokou rozpustností. [27] 2.4.3 Chitosan Chitosan je polykationový polysacharid odvozený z přírodního chitinu alkalickou deacetylací. Je dobře biologicky rozložitelný, netoxický a biokompatabilitní. Pro podávání léků do tlustého střeva je nutné dodat k chitosanu ještě střevní vrstvu, která by jej chránila proti žaludečním šťávám, protože chitosan je rozpustný v kyselém prostředí. V tlustém střevě dojde k rozpuštění střevní vrstvy, chitosanové jádro se naruší působením mikroflóry a uvolní se lék z částic [27]. Obrázek 6: Chitosan [28] 16

2.4.4 Alginát Algináty jsou soli odvozené od alginové kyseliny, která je obsažena jako matrice v hnědé mořské řase. Průmyslově se získává extrakcí řas alkáliemi. V alginátovém řetězci se střídají úseky tvořené kyselinou guluronovou (G) a mannuronovou (M), jejich poměr je závislý na původu alginátu. Zastoupení kyseliny guluronové v látce je určující pro tvorbu termostabilních gelů a filmů. Gel vznikne navázáním vápenatého kationtu na vazebné místo skládající se ze čtyř po sobě jdoucích jednotek kyseliny guluronové. Alginát se často využívá jako stabilizátor, emulgátor a zahušťovadlo do potravin i jiných obchodních výrobků [22]. Obrázek 7: Struktura alginátu [29] 2.5 Metody využívané k analýze částic a enkapsulovaných látek 2.5.1 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Chromatografie je separační metoda založena na existenci fázového rozhraní dvou fází, z nichž jedna je mobilní a druhá stacionární. Vzorek je unášen mobilní fází, která obtéká stacionární fázi. Některé složky vzorku snadněji adsorbují ke stacionární fázi než k mobilní, tím dojde k zadržení jedné části látky víc než druhé. Dělení vzorku mezi stacionární a mobilní fázi lze vyjádřit distribuční konstantou, jež udává poměr mezi množstvím látky ve stacionární fázi k mobilní fázi. Čím je konstanta vyšší, tím déle vzorek zůstává ve stacionární fázi. Retenční čas je charakteristický pro každou látku, udává dobu, která uplyne od nástřiku vzorku do dosažení maxima eluční křivky. Retenční objem je objem mobilní fáze, která za tento čas protekla. Mezi rozdělovací faktory pro kapalinovou chromatografii patří výběr mobilní fáze (kapaliny) a i výběr kolony [30]. Lze využít různé mechanismy separace: adsorpční, rozdělovací, iontově výměnou a gelově permeační chromatografii. Přístroj pro HPLC se skládá ze zásobníku mobilní fáze, směšovače, čerpadla, dávkovače vzorku, kolony, detektoru, odpadu a vyhodnocovací jednotky. Zásobník slouží pro dostatek mobilní fáze, směšovač smíchá mobilní fáze ve zvoleném poměru. U čerpadla je snaha o dlouhodobý konstantní průtok, kterého se díky pulzování obtížně dosahuje. Existují tři typy čerpadel. Pneumatické čerpadlo používající jako zdroj tlaku stlačený plyn. Bezpulsní čerpadlo má lineární dávkovač, rychlost zasouvání a opětovného vysouvání pístu je přesně definována krokovým motorem. U recipročních čerpadel je při nasávání kapaliny do čerpadla uzavřen výstupní ventil, takže má pulsní tok sinusový průběh, proto se používá soubor dvou a více čerpadel, která pulsy vyruší [31]. Jako detektor lze použít fotometrický, refraktometrický, fluorescenční, elektrochemický detektor či hmotnostní spektrometr. Fotometrický detektor je nejpoužívanější, měří průběžně absorbanci eluátu z kolony. Refraktometrický detektor 17

vyhodnotí rozdíl indexu lomu mezi čistou mobilní fází a eluátem. Fluorescenční detektor zjišťuje schopnost látek absorbovat záření a zpětně emitovat záření o vyšší vlnové délce [30]. Obrázek 8: Schéma přístroje pro kapalinovou chromatografii [30] 2.5.2 Stanovení velikosti částic metodou dynamického rozptylu světla Přítomností částic ve vzorku dochází k difrakci laserového paprsku, ohyb je nepřímo úměrný jejich velikosti. Velké částice ohnou paprsek pod malým úhlem, intenzita paprsku je velká. U malých částic je tomu naopak. Laserový paprsek prochází přes kyvetu do roztoku, kde většina paprsku projde přes roztok, ale část se rozptýlí od částic přítomných ve vzorku. Detektor změří intenzitu rozptýleného světla, většinou je umístěn v úhlu 173 nebo 90. Při příliš vysoké intenzitě světla, u vzorků obsahujících velké částice nebo vyšší koncentrace, se musí použít zeslabovač, aby nedošlo k přetížení detektoru. Zapojení zeslabovače se naopak pomine, pokud vzorek nerozptyluje příliš světlo, obsahuje malé částice či nízkou koncentraci. Signál rozptýleného světla, který se odrazí do detektoru, dopadá na desku pro digitální zpracování zvanou korelátor. Korelátor srovnává intenzitu světla v po sobě jdoucích intervalech a zaznamenává, s jakou rychlostí se mění intenzita signálu. Tyto informace se přenesou do počítače a vyhodnotí se velikost částic ve vzorku. Je-li částice o menším průměru osvětlena laserem, dojde k rozptylu světla na všechny strany. Když se v blízkosti částic nachází fotodetektor, vyhodnotí obrázek s tmavými či jasnými místy. Tmavá místa vzniknou destruktivním fázovým přídavkem. Jasná oblast je místo, kde na detektor dopadlo rozptýlené světlo se stejnou fází [32]. 18

Obrázek 9: Schéma zařízení pro analýzu dynamického rozptylu světla [32] 2.5.3 Stanovení stability částic pomocí analýzy zeta potenciálu Potenciálem proudění je nazýváno elektrické pole, které vznikne prouděním kapaliny kolem stacionárně nabitého povrchu. Sedimentační potenciál popisuje elektrický proud vzniklý pohybem nabitých částic ke stacionární kapalině. Pohyb kapaliny pod vlivem elektrického pole je elektroosmóza. Elektroforéza je založena na pohybu nabitých částic v kapalině v elektrickém poli. Zeta potenciál se stanoví elektroforetickou pohyblivostí s použitím Henryovy rovnice. Kolem každé částice se vytvoří elektrická dvojvrstva. Kapalina obtékající částice se rozděluje na vnitřní oblast (tzv. Sternova vrstva) a vnější difúzní oblast. V difúzní vrstvě je hranice, která odděluje ionty pohybující se s částicí a ionty neputující s částicí. Zeta potenciál se nachází právě na této hranici. Velikost potenciálu udává stabilitu koloidního systému [32]. Náboj větší než ±60 mv označuje vynikající stabilitu. Dobrá stabilita je při od ±40 mv až ±60 mv, systém s nábojem od ±30 mv do ±40 mv vykazuje střední stabilitu. Počínající nestabilita se ukazuje u náboje od ±10 do ±30 mv. Náboj, který se pohybuje od 0 mv do ±5 mv, vykazuje velkou nestabilitu částic, tj. že částice se mají tendenci shlukovat a fluktuovat [33]. Částice, které mají zeta potenciál nula jsou nejméně stabilní a nachází se v izoelektrickém bodě. Zeta potenciál závisí na ph. Pokud máme částice se záporným nábojem a přidáme kyselinu, dosáhneme bodu neutralizace či získání kladného náboje částic [32]. 19

2.5.4 Analytická centrifugace Vlivem gravitačního zrychlení dochází k oddělení dispergovaných částic v systému. Částice s nižší hustotou než okolní prostředí směřují proti gravitačnímu zrychlení, částice s větší hustotou putují se zrychlením. Ze závislosti rychlosti usazování v odstředivém zrychlení lze odhadnout rychlost usazování v tíhovém poli. Zařízení LUMisizer patří mezi temperované odstředivky a zaznamenává změny koncentrace dispergovaných látek působením odstředivé síly. Sedimentace částic se projeví vyčeřením části vzorku (zvýšením transmitance) a zároveň tvorbou sedimentu (snížením transmitance). Výsledkem měřením je profil transmitance, který vyjadřuje závislost transmitance na vzdálenosti od středu rotace [32]. 20

2.6 Cíl práce Cílem práce bylo studium možností enkapsulace kofeinu do organických částic. V rámci práce byly řešeny následující dílčí úkoly: 1. Zpracování rešerše na téma charakterizace kofeinu, výskyt v potravinách a přírodních látkách a fyziologické účinky. 2. Optimalizace analytického stanovení kofeinu s využitím RP-HPLC/UV-VIS 3. Testování možností enkapsulace kofeinu do liposomů, charakterizace částic a jejich stabilita v různých podmínkách. 21

3 PRAKTICKÁ ČÁST 3.1 Použité chemikálie a přístroje 3.1.1 Použité chemikálie Methanol - Vitrum LachNer (ČR) Ethanol - Vitrum LachNer (ČR) Kyselina chlorovodíková, 35 % - Vitrum LachNer (ČR) Kyselina octová, 98 % - Vitrum LachNer (ČR) Diethylether - Vitrum LachNer (ČR) Chloroform - Vitrum LachNer (ČR) Methanol pro HPLC Vitrum LachNer (ČR) 3.1.2 Standardní chemikálie Kofein - Sigma Aldrich (SRN) Lecithin ze sóje - Serva (SRN) Cholesterol směs hydroxy-5-cholestenu a cholesten-3β-olu - Serva (SRN) Chitosan z chitinu - Sigma Aldrich (SRN) Algin alginátu sodného - Sigma Aldrich (SRN) Tripolyfosfát sodný - Sigma Aldrich (SRN) Bile salts-směs kyseliny cholové a deoxycholové - Sigma Aldrich (SRN) Pankreatin z vepřové slinivky - Sigma Aldrich (SRN) Pepsin z prasečí žaludeční sliznice - Sigma Aldrich (SRN) 3.1.3 Ostatní chemikálie Dihydrát chloridu vápenatého - Vitrum LachNer (SRN) Dihydrát hydrogenfosforečnanu sodného - Vitrum LachNer (SRN) Dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného - Vitrum LachNer (SRN) Hydrogenuhličitan sodný - Vitrum LachNer (SRN) 3.1.4 Přístroje a pomůcky Membránový extrudér - Avestin-Liposo Fast (SRN) Homogenizátor - Bandelin Sonoplus- Sonorex Technik (SRN) Analytická odstředivka - Dispersion Analyser-LUMiSizer (USA) Dynamický rozptyl světla - Zetasizer Nano ZS Malvern (UK) Sestava HPLC Ecom spol s.r.o. (ČR) Programátor gradientu GP5 Vysokotlaké čerpadlo LCP 4020 Dávkovací analytický ventil smyčkový C R54157 Termostat kolon LCO 101 Spektrofotometrický detektor LCD 2084 Integrátor DataApex CSW verze 1.7 Kolona Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 x 150 mm, 5 m) Analyické váhy Boeco (SRN) Mikropipety U-32-R, Boeco (SRN) Mikropipety Discovery (SRN) 22

Ultrazvuk PS02000 Ultrasonic Compact Cleaner 1,25L, PowerSonic (SR) Vortex Genius 3, IKA Vortex (SRN) Světelný mikroskop a software Lucia Skenovací elektronového mikroskopu JEOL JSM-7600F 3.2 Stanovení kofeinu metodou HPLC s UV-VIS detekcí Vzorky kofeinu byly na kolonu aplikovány nástřikem pomocí dávkovacího ventilu o objemu smyčky 20 μl. Chromatografie probíhala na koloně Agilent Eclipse (150 x 4,6 mm) naplněné reversní fází C 18 (5 μm) při 30 C. Eluce probíhala izokraticky při průtoku mobilní fáze 0,75 ml min -1. Jako mobilní fáze byl použit roztok methanolu pro HPLC a okyselené vody v poměru 45:55. Okyselená voda byla připravena z destilované vody a kyseliny chlorovodíkové v poměru 99:1. Vzorky byly detekovány na spektrofotometrickém detektoru při vlnové délce 280 nm. Z chromatogramů o různých koncentracích kofeinu byly zjištěny plochy píků a sestavena externí kalibrační křivka pro kvantitativní stanovení koncentrace kofeinu. 3.3 Enkapsulace kofeinu do liposomů 3.3.1 Metoda ethanolového vstřikování - EV Připravený ethanolový roztok lecithinu o koncentraci 100 mg ml -1 byl pomocí injekční stříkačky pomalu nastřikován do roztoků kofeinu v různých poměrech. Část takto připraveného vzorku byla centrifugována a supernatant byl použit ke stanovení enkapsulační účinnosti, druhá část byla použita pro stanovení stability a velikosti částic. Metoda byla provedena s různými koncentracemi kofeinu v rozmezí 0,01-1 mg ml -1 [34]. 3.3.1.1 Izolace lecithinu z vaječného žloutku Žloutek byl smíchán s 25 ml acetonu a za občasného míchání ponechán stát 10 minut. Poté byla směs zfiltrována a zbytek sraženiny na filtru byl opět smíchán s 25 ml acetonu a izolace byla opakována. Po zfiltrování byla sraženina rozpuštěna v 15 ml 95 % ethanolu. Směs byla zfiltrována a sraženina byla znovu smíchána s 15 ml 95 % ethanolu rozpuštěna a přefiltrována. Oba ethanolové filtráty byly spojeny dohromady a odpařeny do sucha. Odparek (izolovaný lecithin) byl rozpuštěn v 15 ml ethanolu. Takto připravený izolovaný surový lecithin obsahující i jiné typy přírodních fosfolipidů byl následně použit k přípravě liposomů. 3.3.2 Metoda odpařování na tenké vrstvě (thin layer evaporation) TLE 80 mg sójového lecithinu a 10 mg cholesterolu bylo rozpuštěno v 10 ml směsi chloroformu a methanolu v poměru 80:20. Roztok byl přelit do odpařovací baňky a na vakuové odparce odpařen do sucha. K odparku bylo přidáno 10 ml roztoku kofeinu ve fosfátovém pufru ph 8 vytemperován na 40 C. Směs byla střídavě míchána na vortexu a ultrazvukována, dokud nedošlo k úplnému rozpuštění lipidového filmu na stěnách baňky. Část připraveného vzorku byla centrifugována, supernatant byl použit ke stanovení enkapsulační účinnosti a část byla použita pro stanovení velikosti a stability částic [35]. 23

3.3.3 Metoda odpařování z tenké vrstvy na reverzní fázi (reverse phase thin layer evaporation) - RP-TLE 62,5 mg cholesterolu a 250 mg sójového lecithinu bylo rozpuštěno v 50 ml směsi chloroformu a methanolu v poměru 80:20. Roztok byl přelit do odpařovací baňky a na vakuové odparce odpařen do sucha. Vytvořený lipidový film byl rozpuštěn ve 40 ml etheru. K tomuto roztoku bylo přidáno 10 ml fosfátového pufru o ph 8 s obsahem kofeinu o koncentraci 1 mg ml -1. Pomocí ultrazvuku byla vytvořena emulze. Z této emulze byl za laboratorní teploty na vakuové odparce odpařen ether, takže zbylá směs přešla na vodnou suspenzi. Tato suspenze byla dále naředěna fosfátovým pufru na 50 ml. Určitý podíl připraveného vzorku byl centrifugován, supernatant byl dílem použit pro stanovení stability a velikosti částic a ke stanovení enkapsulační účinnosti [36]. 3.4 Enkapsulace kofeinu do polysacharidových částic 3.4.1 Chitosan-alginátové částice - CHA 40 mg alginátu sodného bylo rozpuštěno v 40 ml destilované vody a ph bylo upraveno na hodnotu 5. Do roztoku alginátu byl přidán kofein. Vzniklý roztok byl ultrazvukován a po malých dávkách byl do něj přidáván roztok CaCl 2 v koncentraci 3,35 mg ml -1 (CaCl 2 byl rozpuštěn v destilované vody a ph bylo upraveno na 5). Směs byla dále ultrazvukována a po malých dávkách byl přidáván roztok chitosanu o koncentraci 0,8 mg ml -1 (chitosan byl rozpuštěn v 2 % kyselině octové a ph bylo upraveno na hodnotu 5). Část takto připraveného vzorku byla centrifugována, supernatant byl použit ke stanovení enkapsulační účinnosti a část byla použita pro stanovení stability a velikosti částic [37]. 3.4.2 Chitosanové částice - CH 250 mg chitosanu bylo rozpuštěno v 50 ml 5 % kyseliny octové. Do připraveného roztoku byl přidán kofein, aby výsledná koncentrace byla 0,22 mg ml -1. Vzniklý roztok byl ultrazvukován a po malých dávkách do něj byly přidávány 4 ml 2 % tripolyfosfátu sodného. Určitý podíl připraveného vzorku byl centrifugován, část supernatantu byl použit ke stanovení enkapsulační účinnosti a druhá část byla použita pro stanovení velikosti a stability částic [38]. 3.5 Stanovení enkapsulační účinnosti Vzorek kofeinu po enkapsulaci byl centrifugován 30 minut při 14 000 otáčkách, supernatant byl slit a byla v něm stanovována pomocí HPLC koncentrace zbylého volného kofeinu, stejně tak jako ve vzorku před enkapsulací. Z těchto dvou hodnot byla poté vypočítána enkapsulační účinnost dané metody. 3.6 Stanovení velikosti částic metodou dynamického rozptylu světla Velikost částic byla stanovena na přístroj Zetasizer Nanoseries, který využívá dynamického rozptylu světla. Měří se časová závislost kolísání intenzity rozptýleného světla dané Brownovým pohybem částic. Analýza intenzity rozptýleného světla umožňuje určit difuzní koeficient částic a vypočítat distribuci velikosti částic v daném vzorku. Připravené částice byly zředěny Mili-Q vodou a analyzovány. Vzorek připravený ethanolovým vstřikováním byl zředěn 20krát, ostatní 10krát. Před měřením byly vzorky 24

zfiltrovány přes membránu s velikosti 5000 nm. Následně byla u vzorku upravena velikost částic pomocí liposomátoru s membránou 100 nm a vzorky byly opět podrobeny analýze. 3.7 Stanovení stability částic 3.7.1 Stanovení zeta potenciálu Měření zeta potenciálu bylo provedeno na přístroj Zetasizer Nanoseries. Měření je založeno na technice Laser Doppler Velocimetry, tj. jak rychle se pohybují částice v kapalině za působení elektrického pole. Zeta potenciál je rozdíl potenciálů na pohybovém rozhraní, který se ustavuje při relativním pohybu tuhé fáze s elektrickou dvojvrstvou vůči roztoku. Znaménko je opačné než znaménko iontů vnější vrstvy elektrické dvojvrstvy. 3.7.2 Stanovení stability a rychlosti usazování částic - analytická centrifugace Rychlost usazování částic byla změřena pomocí analytické centrifugace na přístroji LUMisizer. Částice připravené ethanolovým vstříkání byly 10krát zředěny. Ostatní vzorky nebyly nijak upraveny. Centrifugace probíhala 2 hodiny a 45 minut. 3.7.3 Stabilita částic v modelovém fyziologickém prostředí 3.7.3.1 Žaludeční šťáva Žaludeční šťáva byla připravena z 0,25 g pepsinu, který byl rozpuštěn ve 100 ml destilované vody. Následně bylo přidáno 0,84 ml 35% HCl. Hodnota ph byla upravena na 0,9 [39]. Vzorky pro sledování stability částic byly připraveny v poměru 1:1 (žaludeční šťáva:částice s enkapsulovaným kofeinem). Byla změřená koncentrace kofeinu v čase nula a poté po 15 minutách působení umělé žaludeční šťávy, přičemž byly vzorky inkubovány při 37 C. Z rozdílu koncentrace bylo vypočteno množství kofeinu uvolněného z částic působením žaludeční šťávy. Souběžně byl u vzorků v daných časech stanoven také zeta potenciál částic. 3.7.3.2 Pankreatická šťáva Pankreatická šťáva byla připravena z 0,25 g pankreatinu a 1,5 g NaHCO 3, které byly rozpuštěny ve 100 ml destilované vody, ph bylo upraveno na hodnotu 8,9 [39]. Vzorky pro sledování stability byly připraveny v poměru 1:1 (pankreatická šťáva:částice s enkapsulovaným kofeinem). Byl změřen zeta potenciál částic v čase nula a pak po 15 minutách působení umělé pankreatické šťávy při 37 C. Souběžně byla u vzorků v daných časech stanovena koncentrace kofeinu. Z rozdílu koncentrace bylo vypočteno množství kofeinu uvolněného z částic působením pankreatické šťávy. 3.7.3.3 Žlučová šťáva Žlučová šťáva byla připravena přidáním 0,8 g žlučových solí do 200 ml pufr ph 8 [39]. Vzorky pro sledování stability byly připraveny v poměru 1:1 (žlučová šťáva:částice s enkapsulovaným kofeinem). Byla změřená koncentrace kofeinu v čase nula a poté po 60 minutách působení solí žlučových kyselin při 37 C. Z rozdílu koncentrace bylo vypočteno množství kofeinu uvolněného z částic působením žlučové šťávy. Zároveň byl u vzorků v daných časech stanoven zeta potenciál částic. 25

4 VÝSLEDKY A DISKUSE 4.1 Optimalizace stanovení kofeinu Stanovení množství kofeinu bylo provedeno podle postupu uvedeného v metodách (kap. 3.2). Všechna měření byla provedena třikrát a z naměřených hodnot byl vypočten průměr. Záznam stanovení kofeinu z HPLC je v příloze č. 1. Graf 1: Kalibrační křivka pro kvantitativní stanovení kofeinu 4.2 Stanovení enkapsulační účinnosti Vzorky připravených částic po enkapsulaci byly vždy centrifugovány 30 minut při 14 000 otáčkách, supernatant byl slit a byla v něm stanovována pomocí HPLC koncentrace volného kofeinu, která byla srovnána s koncentrací kofeinu v roztoku před enkapsulací. Z těchto dvou hodnot byla poté vypočítána enkapsulační účinnost dané metody. 4.2.1 Enkapsulace kofeinu do liposomů 4.2.1.1 Liposomy připravené metodou ethanolového vstřikování V tabulce č. 3 jsou uvedeny výsledky enkapsulační účinnosti metody ethanolového vstřikování pro zabalení kofeinu. Z připravených vzorků se nejlépe osvědčila metoda, kdy poměr lecithinu ze žloutku a roztoku kofeinu byl 1:1. Množství kofeinu enkapsulované do částic představovalo více než 76 % z původního množství. Při smíchání 0,375 ml roztoku kofeinu s 0,625 ml roztoku lecithinu dojde k zabalení cca 73 % kofeinu z roztoku. Pokud zvýšíme množství lecithinu, tak už je enkapsulace neúčinná. Když bylo smícháno 10 ml roztoku kofeinu s 1 ml lecithinu, účinnost zabalení byla závislá na koncentraci roztoku kofeinu. Při koncentraci 0,1 mg ml -1 došlo k enkapsulování kofeinu ze 48 %, při koncentraci 0,05 mg ml -1 bylo zabaleno 69 %. Při poměru 1:1 docházelo se snižující se koncentrací roztoku kofeinu ke snížení účinnosti enkapsulace. U koncentrace kofeinu 0,1 mg ml -1 byla účinnost pouze 7 % a s poklesem koncentrace na 0,01 mg ml -1 byla již účinnost enkapsulace nulová. 26

Tabulka 2: Příprava vzorků vzorek Použitý poměr kofein: lecithin A 10 ml roztoku kofeinu s 1 ml lecithinu v ethanolu B 10 ml roztoku kofeinu s 1 ml lecithinu v ethanolu C 0,5 ml roztoku kofeinu s 0,5 ml lecithinu v ethanolu D 0,5 ml roztoku kofeinu s 0,5 ml lecithinu v ethanolu E 0,375 ml roztoku kofeinu s 0,625 ml lecithinu v ethanolu F 0,5 ml roztoku kofeinu s 0,5 ml lecithinu v ethanolu G 0,25 ml roztoku kofeinu s 0,75 ml lecithinu v ethanolu H 0,125 ml roztoku kofeinu s 0,875 ml lecithinu v ethanolu Tabulka 3: Enkapsulace částic ethanolového vstřikování s kofeinem (EVK) Koncentrace kofeinu Vzorek nezabaleno [%] zabaleno [%] c počáteční [mg ml -1 ] c konečná [mg ml -1 ] A 51,48 48,52 0,10 0,05 B 30,69 69,31 0,05 0,01 C 100 0 0,01 0,01 D 92,87 7,13 0,10 0,09 E 26,79 73,21 1,00 0,27 F 23,84 76,16 1,00 0,24 G 100 0 1,00 1,00 H 100 0 1,00 1,00 4.2.1.2 Liposomy připravené metodou TLE Tabulka č. 5 znázorňuje výsledky enkapsulace kofeinu s využitím metody na tenké vrstvě. Výsledky zabalení se pohybují pod 50%. U postupu, kdy byl 1 mg kofeinu rozpuštěn v 1 ml pufru a pufr byl použit pro rozpuštění odparku, nebylo vůbec detekováno zabalení kofeinu. Tabulka 4: Příprava vzorků Vzorek Příprava vzorku I 1 mg kofeinu byl rozpuštěn v hydrofobním roztoku, odparek byl rozpuštěn v 1 ml pufru J 1 mg kofeinu byl rozpuštěn v hydrofilním roztoku, odparek byl rozpuštěn v 1 ml pufru K 10 mg kofeinu bylo rozpuštěno v hydrofobním roztoku, odparek byl rozpuštěn v 10 ml pufru L 10 mg kofeinu bylo rozpuštěno v hydrofilním roztoku, odparek byl rozpuštěn v 10 ml pufru 27

Tabulka 5: Enkapsulace TLEK částic Koncentrace kofeinu Vzorek nezabaleno [%] zabaleno [%] c počateční [mg ml -1 ] c konečná [mg ml -1 ] I 53,95 46,05 1,00 0,54 J 100 0 1,00 1,00 K 57,85 42,15 1,00 0,58 L 56,85 43,15 1,00 0,57 4.2.1.3 Liposomy připravené metodou RP-TLE Tabulka č. 7 obsahuje výsledky enkapsulace kofeinu do liposomových částic připravených metodou RP-TLE. Nejúspěšnější enkapsulace byla prokázána u vzorku N, při jehož přípravě se použilo nejvíce lecithinu a cholesterolu. Do částic se podařilo uzavřít přes 30 % kofeinu přítomného v roztoku. Pro nejmenší množství lecithinu a cholesterolu se podařilo enkapsulovat pouze cca 18 %. Nejmenší účinnost byla pozorována při použití 300 mg lecithinu a 75 mg cholesterolu. Tabulka 6: Příprava vzorků Vzorek Příprava vzorku M 300 mg lecithinu a 75 mg cholesterolu bylo rozpuštěno ve směsi chloroformu a ethanolu N 350 mg lecithinu a 87,5 mg cholesterolu bylo rozpuštěno ve směsi chloroformu a ethanolu O 250 mg lecithinu a 62,5 mg cholesterolu bylo rozpuštěno ve směsi chloroformu a ethanolu Tabulka 7: Enkapsulace RP-TLEK částic Koncentrace kofeinu Vzorek nezabaleno [%] zabaleno [%] c počáteční [mg ml -1 ] c konečná [mg ml -1 ] M 90,55 9,45 0,20 0,18 N 69,47 30,53 0,20 0,14 O 81,89 18,11 0,20 0,16 4.2.2 Polysacharidové částice 4.2.2.1 Chitosan-alginátové částice Tabulka č. 9 znázorňuje účinnost enkapsulace kofeinu do částic připravených ze směsi polysacharidů chitosan-alginát postupem uvedeným v kapitole (3.4.2). Zabalené množství kofeinu bylo přes 53 % z původního množství. Poněkud lépe byl vyhodnocen vzorek, při kterém bylo použito více chitosanu, tedy vhodnější je poměr chitosanu a alginátu 1:1. Tabulka 8: Příprava vzorků Vzorek Příprava vzorku P 30 ml chitosanu, 15 ml CaCl 2 a 40 ml alginátu R 40 ml chitosanu, 15 ml CaCl 2 a 40 ml alginátu 28