Quantum Blue Calprotectin Ascites Kvantitativní laterální průtokový test LF-ASC25 25 testů Datum revize: 28.3.2013 BÜHLMANN LABORATORIES AG Baselstrasse 55 CH - 4124 Schönenbuch, Switzerland Tel.: +41 61 487 1212 Fax: +41 61 487 1234 info@buhlmannlabs.ch
ZAMÝŠLENÉ POUŽITÍ Quantum Blue Calprotectin Ascites, LF-ASC25 je kvantitativní test navržený pro stanovení zvýšené koncentrace Calprotectinu v lidských ascites v kombinaci se čtečkou Quantum Blue Reader. Test byl navržen pro testování point of care pro pacienty trpící cirhózou jater nebo jinými onemocněními doprovázenými akumulací ascites v pobřišnici. Je použit jako marker pro zvýšený počet polymorfonukleárních buněk (PMN). Používá se jako pomůcka pro samovolný vývoj bakteriálního zánětu pobřišnice (SBP) (1). Pouze pro profesionální použití.* *Kanada, Taiwan: pouze pro laboratorní použití. PRINCIPY TESTU Test je navržen pro selektivní měření antigenu Calprotectinu (MRP8/14) pomocí sendvičového imunotestu. Zachycená monoklonální protilátka (mab) vysoce specifická na Calprotectin je potažena na membránu testu. Druhá detekce monoklonální protilátky konjugovaná na zlaté koloidy je uložena na uvolněný konjugát na podložce a uvolněna do reakčního systému po přidání zředěného vzorku ascites. Calprotectin/anti-Calprotectin zlatý konjugát se váže na protilátky anti-calprotectinu, které jsou potaženy na membránu testu (řada testu, skupina testu) a zbývající volný anti-calprotectin zlatý konjugát se váže na kozí anti-myší protilátku potaženou na membráně testu (kontrolní řada; kontrolní skupina). Intenzita signálu testovací řady a kontrolní řady je měřena kvantitativně pomocí čtečky BÜHLMANN Quantum Blue Reader. DODÁVANÉ REAGENCIE A PŘÍPRAVA Reagencie Množství Kat. č. Poznámka Testovací kazety 25 kusů B-CAL-TC vakuově baleno v sáčku Chase pufr 10 lahví B-ASC-CB Připraveno k použití 10 ml RFID čipová karta 1 kus B-ASC-RCC Bílá plastová karta Tabulka 1 SKLADOVÁNÍ A ŽIVOTNOST REAGENCIÍ Součásti soupravy jsou stabilní při 2 8 C do data expirace, které je uvedeno na štítcích. PREVENTIVNÍ OPATŘENÍ BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Žádná z reagencií ze soupravy neobsahuje složky lidského původu. Se vzorky pacientů by mělo být manipulováno jako s možným přenašečem infekcí a v souladu s dobrou laboratorní praxí za použití příslušných opatření. Nepoužitý roztok by měl být zlikvidován v souladu s místními nařízeními. TECHNICKÁ OPATŘENÍ Součásti soupravy Všechny reagencie a testovací vzorky musí být vytemperovány na pokojovou teplotu (18 28 C) před tím, než provedete test. Dobře zamíchejte (vortex) reagencie před použitím. Součásti soupravy nesmí být použity po datu expirace, které je vytištěno na štítku. Nemíchejte různé šarže reagencií. Testovací kazety nesmí být použity znovu. Postup testu Před tím, než provedete test, si pečlivě přečtěte instrukce. Výkon testu bude nepříznivě ovlivněn, pokud jsou reagencie špatně zředěny, je s nimi špatně manipulováno nebo jsou skladovány podle jiných podmínek, než jsou uvedeny v tomto návodu k použití. Použijte bílou čipovou kartu RFID, abyste změnili šaržově specifické parametry testu. 2/7
Před provedením testu musí být Quantum Blue Reader zapnutý a naprogramovaný na test Quantum Blue Calprotectin Ascites (viz manuál). Vzorky pacientů, se kterými není ihned manipulováno, mohou způsobit nepřesné výsledky. Zředěné vzorky by měly být použity do několika hodin a nesmí být skladovány delší dobu. Nezředěné ascites vzorky mohou být skladovány při < -20 C po dobu do 3 měsíců. POŽADOVANÉ MATERIÁLY NEDODÁVANÉ SE SOUPRAVOU Quantum Blue Reader od BÜHLMANN (kat. č. BI-POCTR-ABS) Přesné pipety s jednorázovými špičkami: 10 200 µl Centrifuga pro mikrozkumavky Eppendorf zkumavky pro ředění vzorků Stopky Rukavice a laboratorní plášť ODBĚR VZORKU A SKLADOVÁNÍ Odebírejte vzorky ascites do čistých zkumavek a skladujte v chladničce při 2 8 C po až 7 dnů. Pro delší skladování zmrazte vzorky při <-20 C. Vzorky jsou stabilní po 3 měsíce. Důležité: Vzorek musí být odebrán bez chemických nebo biologických přídavků do odběrového nástroje. POSTUP TESTU Ředění vzorku Řeďte vzorky ascites před jejich použitím pro analýzu 1:5 pomocí Chase pufru (např. 20 µl vzorku a 80 µl Chase pufru). Míchejte. Postup pro laterální průtokový test a odečet Existují dvě alternativní metody pro Quantum Blue Reader: <ASC_720> a <ASC_0>. Vyberte jednu z těchto metod před spuštěním testů. Vložte šaržově specifická kritéria z RFID čipové karty. 1. Metoda <ASC_720> s interním časovačem Vložte testovací kazetu do držáku testovacích kazet readru. Přidejte 60 µl naředěného vzorku ascites do otvoru pro vkládání vzorků testovací kazety. Zavřete držák kazet a začněte měřit stištěním tlačítka. Sken začne automaticky po 12 minutách (720 vteřin). 2. Metoda <ASC_0> bez vnitřního časovače Přidejte 60 µl naředěného vzorku ascites do otvoru pro vkládání vzorků testovací kazety. 12 minut +/- 1 minuta inkubujte (nastavte časovač ručně). Vložte testovací kazetu do držáku kazet readru. Skenujte kazetu pomocí Quantum Blue Readeru stisknutím tlačítka start (<ENTER>). Poznámka: Podívejte se prosím do manuálu pro Quantum Blue Reader, abyste se naučili základní funkce a jak inicializovat a jak zacházet s readrem, zvláště, jak vybrat testovací metodu a jak načíst šaržově specifická kritéria z RFID čipové karty, abyste změřili vzorky. KONTROLA KVALITY Pokud přesnost testu nekoreluje se stanovenými limity a opakování vyloučilo chyby v technice, zkontrolujte následující problémy: pipetování, kontrolní teplota a stopky, data expirace reagencií a skladování a podmínky pro inkubaci. Výsledky samo-testování Quantum Blue Readeru provedené při uvedení do provozu přístroje musí být platné. VALIDACE VÝSLEDKŮ Pro platný výsledek testu, musí být v každém případě viditelná Kontrolní řada (C) (viz Příloha 1, Obrázky 1A a 1B). Je použita pouze funkční kontrola testu a nemůže být použita pro interpretaci 3/7
testovací řady (T). Pokud není testovací řada (T) detekovatelná po 12 minutách inkubace (Obrázek 1A), přítomná koncentrace Calprotectinu ve vzorcích ascites je pod detekčním limitem. Pokud je testovací řada (T) zjistitelná po 12 minutách inkubace (Obrázek 1B), koncentrace Calprotectinu přítomná ve vzorku ascites je vypočítána readrem Quantum Blue Reader. Pokud je zjistitelná pouze testovací řada (T) po 12 minutách inkubace (Obrázek 1C), výsledek testu je neplatný a test Calprotectinu musí být opakován z a pomocí další testovací kazety. Pokud není ani kontrolní řada (C) ani testovací řada (T) zjistitelná po 12 minutách inkubace (Obrázek 1D), výsledek testu je neplatný a test musí být opakován pomocí další testovací kazety. Zatímco Quantum Blue Reader umožňuje kvantitativní výpočet testovacích (T) a kontrolních (C) řad, je provedena další kontrola platnosti kontrolní řady (C). Pokud je intenzita signálu kontrolní řady (C) pod šaržově specifickým prahem po 12 minutách inkubace, výsledek testu je také neplatný a Test Calprotectin Ascites musí být opakován za použití další testovací kazety. STANDARDIZACE A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Laterální průtokový test je kalibrován pomocí BÜHLMANN Calprotectin ELISA (kat. č.: EK-CAL). BÜHLMANN Quantum Blue Reader používá šaržově specifickou standardní křivku k výpočtu koncentrace Calprotectin Ascites. Tato šaržově specifická standardní křivka je vygenerována v průměrných hodnotách (n 10 každá míra) od 10 získané kalibrační body získané z různých vzorků se známými koncentracemi Calprotectin Ascites. Rozmezí testu je mezi 0,18 a 1,8 µg/ml. Pro kvantitativní měření vzorků s vyšší hodnotou než 1,8 µg/ml řeďte ascites vzorky 1:50 (namísto 1:5) chase pufrem a testujte znovu podle postupu. Měřené koncentrace musí být vynásobeny objemovým faktorem x 10, aby byl získán konečný výsledek. OMEZENÍ Reagencie dodávané se soupravou jsou optimalizovány pro měření lidského Calprotectinu ve vzorcích ascites. BÜHLMANN Quantum Blue Calprotectin Ascites rychlý test může být použit k získání výsledků dříve než počet PMN. Nemělo by to nahrazovat PMN počet, ale může pomoci stanovit diagnózu. Nicméně negativní výsledek nevylučuje vývoj onemocnění na spontánní bakteriální peritonitidu, SBP. Výsledky získané pomocí rychlého testu BÜHLMANN Quantum Blue Calprotectin Ascites by měly být potvrzeny pomocí měření jiných biomarkerů (jako je počítání polymorfonukleárních buněk PMN ascitu) a anamnéza pacienta před přijetím jakéhokoliv rozhodnutí o terapii nebo než je proveden lékařský zákrok. Vzorky ascitu kontaminované erytrocyty nebo hemoglobinem mohou způsobit falešně pozitivní výsledky a neměly by být použity. VÝSLEDKY A INTERPRETACE Calprotectin ascites rychlý test pomáhá rychle stanovit první odhad, pokud se očekává zvýšený počet PMN, což může lékaři pomoci. Klinická pilotní studie (1) používající rychlý test BÜHLMANN Quantum Blue ukázala, že je vhodné předvídání hladin. Podle dat, které ukazuje Burri a kolektiv (1), doporučujeme následující referenční intervaly pro interpretaci výsledku calprotectinu: Počet PMN 250 buněk (n = 111): Medián: 0,38 µg/ml, IQR 0,38 0,562. Počet PMN 250 buněk (n = 19) Medián: 2,78 µg/ml, IQR 2,05-5,37. 4/7
Při cut of 0,51 µg/ml calprotectinu, dosáhla sensitivita 100% a specificita 84,7% s 6,53 LR+ a 0,0 LR-. Celková přesnost testů byla 87,7%. NPV calprotectinu testovaného v ascites byla 100%. V této studii žádného z pacientů se zvýšeným počtem PMN neminul rychlý test (viz obrázek 3). Doporučená interpretace výsledků calprotectinu: < 0,51 µg/ml: počet PMN > 250 je možné vzácně. 0,51 µg/ml: počet PMN > 250 může možně nastat. Limit blanku (LoB): < 0,044 µg/ml calprotectinu. Detekční limit (LoD): <0,09 µg/ml calprotectinu. CHARAKTERISTIKY VÝKONU Opakovatelnost: 19% CV. Opakovatelnost testu Quantum Blue Calprotectin byla vypočítána z 6 vzorků ascites obsahujících 0,18 a 1,6 µg/g calprotectinu. Každý vzorek byl testován podle postupu testu v jednom kolem po 20 kopiích nastavených v 10 minutách. Průměrné hodnoty tří různých šarží testovacích kazet je uvedeno v Tabulce č. 6. Opakovatelnost se liší mezi 13,7 34,5% CV. Linearita: 0,18 at 1,8 µg/ml. Čtyři vzorky ascites se zvýšenými koncentracemi Calprotectinu byly naředěny vzorkem ascites s nízkou hladinou calprotectinu. Každý roztok byl následně testován podle postupu testu. Výsledky ukázaly linearitu v označeném měřicím rozmezí od 0,18 do 1,8 µg/ml testu Quantum Blue Calprotectin Ascites pro všechny 4 vzorky (R2 % 0,986 0,995). Srovnání metod: R 2 = 0,82; y = 1,001x 0,90 µg/ml. Bylo analyzováno 49 vzorků ascites v označeném měřicím rozsahu testu Quantum Blue Calprotectin podle postupu testu a porovnáno s hodnotami získanými pomocí BÜHLMANN Calprotectin ELISA. Korelační data jsou zobrazena. Kvantifikační limit (LoQ): dolní LoQ: 0,18 µg/ml calprotectinu; horní LoQ: 1,8 µg/ml calprotectinu. LoQ byl stanoven s 12 vzorky ascites při koncentraci mezi 0,12 a 2,46 µg/ml. Vzorky byly měřeny pomocí 20 kopií každý. Výsledná přesnost ukazuje Obrázek 2. Kvantifikační limit odpovídá koncentraci Calprotectinu s nepřesností pod 25% CV, která umožňuje kvantitativní stanovení v rozmezí od 0,18 (spodní LoQ) do 1,8 µg/ml (horní LoQ). 5/7
PŘÍLOHA 1 TABULKY A OBRÁZKY Obrázek 1 Výsledky testu Obrázek 3 Calprotectin v ascites a počet PMN Obrázek 1A Obrázek 1B Obrázek 1C Obrázek 1D Tabulka 6 Přesnost (opakovatelnost) Vzorek Průměrná koncentrace [µg/ml] Opakovatelnost [CV] Celková přesnost [CV] ASC1 0,19 16,7% 18,8% ASC2 0,32 12,9% 13,7% ASC3 0,53 11,1% 18,8% ASC4 0,75 21,0% 23,7% ASC5 1,28 26,2% 26,2% ASC6 1,60 32,7% 34,5% Průměr 20,1% 22,6% Box Plot: Hladiny calprotectinu v ascites, klasifikováno podle počtu pacientova PMN: >250 nebo < 250 buněk/ml. Obrázek 4 Srování metod Obrázek 2 Profil přesnosti 6/7
PŘÍLOHA II LITERATURA 1. Burri E. et al: Measurement of calprotectin in ascitic fluid to identify elevated polymorphonuclear cell count; World J. Gastroenterol., 2013 April 7; 19(13):2028-2036 2. Homann C. et al.: Ascites fluid and plasma calprotectin concentrations in liver disease. Scand J Gastroenterol 2003; 38(4): 415-420. 3. Erwin Biecker et al.: Diagnosis and therapy of ascites in liver cirrhosis; World J Gastroenterol 2011 March 14; 17(10): 1237-1248. 4. Garcia-Tsao G. Current management of the complications of cirrhosis and portal hypertension: variceal hemorrhage, ascites, and spontaneous bacterial peritonitis. Gastroenterology 2001; 120(3): 726-748 5. D'Amico G, Garcia-Tsao G, Pagliaro L. Natural history and prognostic indicators of survival in cirrhosis: a systematic review of 118 studies. J Hepatol 2006; 44(1): 217-231 6. Rimola A, et al. Diagnosis, treatment and prophylaxis of spontaneous bacterial peritonitis: a consensus document. International Ascites Club. J Hepatol 2000; 32(1): 142-153. 7. Runyon BA. Management of adult patients with ascites due to cirrhosis: an update. Hepatology 2009; 49(6): 2087-2107. 8. Gines P et al.: EASL clinical practice guidelines on the management of ascites, spontaneous bacterial peritonitis, and hepatorenal syndrome in cirrhosis. J Hepatol 2010; 53(3): 397-417 9. Ebanna et al.: Fluid level of Calprotectin in chronic liver disease - Malignant and Non Malignant; Bull. Alex. Fac. Med. 44 No.3, 2008 PŘÍLOHA III SYMBOLY Vysvětlení Použijte do Vysvětlení Teplotní limity Katalogové číslo Testovací kazeta Číslo šarže Chase pufr In vitro diagnostický zdravotní prostředek RFID čipová karta Obsahuje složky pro <n> testů Nahlédněte do návodu k použití 7/7