VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY PŘÍPRAVA DNA V KVALITĚ VHODNÉ PRO POLYMERÁZOVOU ŘETĚZOVOU REAKCI DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR Bc. ROBERT ČUTA BRNO 2011

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY PŘÍPRAVA DNA V KVALITĚ VHODNÉ PRO POLYMERÁZOVOU ŘETĚZOVOU REAKCI PREPARATION OF PCR-READY DNA DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR Bc. ROBERT ČUTA doc. Ing. BOHUSLAV RITTICH, CSc. BRNO 2011

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12 Zadání diplomové práce Číslo diplomové práce: FCH-DIP0460/2010 Akademický rok: 2010/2011 Ústav: Ústav chemie potravin a biotechnologií Student(ka): Bc. Robert Čuta Studijní program: Chemie a technologie potravin (N2901) Studijní obor: Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010) Vedoucí práce doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. Konzultanti: Název diplomové práce: Příprava DNA v kvalitě vhodné pro polymerázovou řetězovou reakci Zadání diplomové práce: 1. Vypracujte literární přehled k dané problematice 2. Popište použité experimentální metody 3. Zpracujte získané experimentální výsledky 4. Vyhodnoťte získané výsledky formou diskuse Termín odevzdání diplomové práce: 13.5.2011 Diplomová práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Bc. Robert Čuta doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Student(ka) Vedoucí práce Ředitel ústavu V Brně, dne 15.1.2011 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Bakterie mlé ného kvašení (BMK) jsou ve velké mí e využívány v potraviná ském pr myslu nap íklad p i výrob mlé ných výrobk, sýr a fermentovaných salám, dále se využívají ke konzervaci zeleniny. Krom pr myslového využití jsou u BMK d ležité i mikrobiologické parametry. P i identifikaci bakteriálních rod se v poslední dob velmi asto využívají metody založené na izolaci a amplifikaci DNA. Diplomová práce se zabývá optimalizací lyze bakteriálních bun k rodu Lactobacillus. Jako první byla testována koncentrace lysozymu (3mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml) v lyza ním roztoku a doba jeho p sobení (3, 5 a 10 hodin). Následovalo testování lyza ních roztok p ipravených z komer ních pracích prášk p i lyzi bakteriálních bun k rodu Lactobacillus. K tomuto ú elu byl nejprve použit prací prášek Amway o r zné koncentraci (1%, 2%, 3% a 4%). Dále byly p i optimalizaci testovány další ty i druhy komer ních pracích prášk. Optimalizace lyze byla provád na s bu kami isté kultury r zných druh Lactobacillus. Po prov ení ú innosti pracích prášk pro lyzi bun k isté kultury Lactobacillus byly provedeny lyze bun k v potravinových matricích (Acidofilní mléko, Jogurt mango, Jogurt bílý) b žn dostupných v obchod s potravinami. Všechny postupy byly vyhodnocovány amplifika ní metodou PCR s primery specifickými pro rod Lactobacillus. Izolace DNA pro PCR byla provád na pomocí paramagnetických nosi P(HEMA-co-GMA) a množství DNA bylo kvantifikováno spektrofotometricky. Detekce PCR produkt byla provedena pomocí agarosové gelové elektroforézy. ABSTRACT In these days are probiotic lactic acid bacteria (LAB) very often used in food processing industry, such as milk products, cheese and fermented salami production. As well as the food conservation agent. Except of the industry usage of the LAB there are microbiological aspects. Identification of the bacterial species methods based on the isolation and amplification of DNA are very often used last few years. Diploma thesis deal with the bacterial cell of Lactobacillus species lysis and it s optimalization. At first it was tested the optimal concentration of lysozyme (3mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml) and the exposure times (3, 5 a 10 hours). Another testing was aimed to the use and suitability of washing powder to the bacterial cell of Lactobacillus species lysis. I tested the Amway washing powder optimal concentration (1%, 2%, 3% a 4%). Four of another comercial washing powders were tested too. All these tests were performed at the pure Lactobacillus bacterial culture. To ensure the results I tested the washing powders at the real food matrix (Acidified milk, yogurt mango, yogurt white). All the methods were evaluated at the amplification method PCR with specific primers for the Lactobacillus genus. The DNA isolation was performed with the paramagnetic microsperes P(HEMA-co-GMA) and the amount of the DNA was quantified spectrophotometrically. The PCR products detection was performed with the agarose gel electrophoresis. 3

KLÍ OVÁ SLOVA rod Lactobacillus, lysozym, prací prášek, DNA, paramagnetické mikro ástice P(HEMA-co-GMA), polymerázová et zová reakce (PCR) KEYWORDS Lactobacillus species, lysozyme, washing powder, DNA, paramagnetic microsperes P(HEMA-co-GMA), polymerase chain reaction (PCR) 4

UTA, R. P íprava DNA v kvalit vhodné pro polymerázovou et zovou reakci. Brno: Vysoké u ení technické v Brn, Fakulta chemická, 2011. 82 s. Vedoucí diplomové práce doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc.. PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracoval samostatn a že všechny použité literární zdroje jsem správn a úpln citoval. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brn a m že být využita ke komer ním ú el m jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a d kana FCH VUT... podpis studenta 5

POD KOVÁNÍ Cht l bych pod kovat panu doc. Ing. Bohuslavu Rittichovi, CSc a paní doc. RNDr. Alen Španové, CSc. za odbornou radu a pomoc p i ešení a p i zpracování této práce. Dále bych cht l pod kovat Ing. Michaele Fri ové za pomoc p i práci. 6

OSNOVA Abstrakt... 3 Abstract... 3 Klí ová slova... 4 Keywords... 4 Prohlášení... 5 Pod kování... 6 Osnova... 7 Úvod... 10 1 Teoretická ást... 11 1.1 Bakterie rodu Lactobacillus... 11 1.2 Struktura bakteriálních bun k a funkce jednotlivých struktur... 11 1.2.1 Bun ná st na bakterií... 11 1.2.1.1 Grampozitivní bakterie... 13 1.2.1.2 Gramnegativní bakterie... 14 1.2.1.3 P sobení lysozymu na bun nou st nu bakterií... 16 1.2.2 Cytoplazmatická membrána bakterií... 17 1.2.3 Cytoplazma bakterií... 18 1.2.4 Jaderný materiál bakterií a jeho funkce... 18 1.3 Magnetické nosi e... 21 1.4 Replikace DNA... 24 1.5 Polymerázová et zová reakce... 25 2 Cíl práce... 29 3 Experimentální ást... 30 3.1 Materiál... 30 3.1.1 Použité bakteriální kmeny... 30 3.1.2 Použité mlé né výrobky... 30 3.1.3 Prací prášky... 31 3.1.4 Chemikálie... 31 3.1.4.1 Chemikálie pro p ípravu roztok... 31 3.1.4.2 Magnetické ástice... 32 3.1.4.3 Roztoky... 32 3.1.5 P ístroje a pom cky... 35 3.2 Metody... 36 3.2.1 Kultivace bakterií... 36 3.2.1.1 Stanovení po tu bun k... 36 3.2.1.2 Stanovení po tu bun k kultiva ní metodou... 36 3.2.2 P íprava hrubých lyzát (HL) bun k... 36 3.2.3 Izolace bakteriální DNA... 37 3.2.3.1 Fenolová extrakce... 37 3.2.3.2 Izolace DNA pomocí magnetických nosi... 37 3.2.4 Spektrofotometrické stanovení istoty a koncentrace DNA na NanoPhotometru 38 3.2.5 Polymerázová et zová reakce (PCR)... 39 3.2.5.1 P íprava PCR sm si pro rod Lactobacillus... 39 3.2.6 Elektroforéza hrubých lyzát, bakteriální DNA a PCR produkt... 40 4 Výsledky... 41 4.1 Kultivace bakteriálních kmen... 41 4.1.1 Stanovení optické denzity kultury bakteriálních kmen... 41 7

4.1.2 Stanovení istoty bakteriální kultury... 41 4.1.3 Stanovení po tu bun k kultiva ní metodou... 42 4.2 Testování vlivu koncentrace lysozymu v lyza ním roztoku B na lyzy bun k a výt žnost DNA... 44 4.2.1 Lyze bun k pomocí roztoku B s r znými koncentracemi lysozymu... 45 4.2.2 Izolace DNA metodu fenolové extrakce a magnetickým nosi em z hrubých lyzát bun k... 47 4.2.2.1 Izolace DNA fenolovou extrakcí a spektrofotometrické m ení... 47 4.2.2.2 Izolace DNA pomocí magnetických nosi a spektrofotometrické m ení DNA 48 4.2.3 Srovnání množství DNA izolované metodou fenolové extrakce a pomocí magnetických nosi... 48 4.2.4 PCR rod Lactobacillus... 52 4.2.4.1 PCR s DNA izolovanou metodou fenolové extrakce... 52 4.2.4.2 PCR s DNA izolované pomocí magnetických nosi... 54 4.3 Testování ú innosti lysozymu (3mg/ml), imobilizovaného lysozymu a lysozymu obsaženém v pracím prášku Amway p i p íprav hrubých lyzát bun k... 56 4.3.1 Lyze bun k pomocí roztoku B s lysozymem v roztoku... 56 4.3.2 Lyze bun k pomocí enzymu obsaženého v pracím prášku... 56 4.3.3 Lyze bun k pomocí imobilizovaného lysozymu... 57 4.3.4 Izolace DNA pomocí magnetických nosi z HL bun k získaných pomocí r zných lyza ních inidel... 59 4.3.5 PCR s DNA matricí izolovanou pomocí ástic z HL bun k získaných pomocí r zných lyza ních roztok... 59 4.3.5.1 Použití roztoku B s lysozymem v roztoku pro lyzi bun k... 61 4.3.5.2 Použití imobilizovaného lysozymu pro lyzi bun k... 61 4.3.5.3 Použití pracího prášeku Amway pro lyzi bun k... 61 4.4 Testování r zných koncentrací pracího prášku Amway pro lyzi bun k... 61 4.4.1 Lyze bun k pomocí enzym obsažených v parcím prášku Amway... 61 4.4.2 Izolace DNA z HL p ipravených pomocí r zn koncentroveného pracího prášku Amway... 62 4.4.3 PCR s DNA izolovanou z HL bun k p ipravených práškem Amway... 62 4.5 Testování r zných pracích prášk pro lyzi bun k... 64 4.5.1 Lyze bun k pomocí enzym r zných pracích prášk... 64 4.5.2 Izolace DNA izolované z HL bun k p ipravených pomocí p ti r zných pracích prášk pomocí magnetických nosi... 64 4.5.3 PCR s DNA matricí izolovanou z HL bun k p ipravených pomocí r zných pracích prášk... 65 4.6 Izolace DNA z potraviná ských matric... 67 4.6.1 Lyze bun k obsažených v tekutých mlé ných výrobcích... 67 4.6.2 Lyze bun k obsažených v tekutých jogurtu... 67 4.6.3 Izolace DNA pomocí magnetických nosi získané z hrubých lyzát bun k mlé ných výrobk... 67 4.6.4 PCR s DNA matricí mlé ných výrobk... 68 4.7 P íprava HL bun k z v tšího množství potraviná ských matric s kratším p sobením 4% pracího prášku PER 100%... 70 4.7.1 Lyze bun k pracím práškem PER 100%... 70 4.7.2 PCR s DNA získanou z mlé ných výrobk s 1 l DNA matrice... 70 4.7.3 PCR s DNA získanou z mlé ných výrobk s 3 l DNA matrice... 72 5 Diskuze... 73 8

5.1 Testování vlivu koncentrace lysozymu v lyza ním roztoku B na výt žnost DNA, srovnání metod izolace DNA... 73 5.1.1 Srovnání množství DNA izolované metodou fenolové extrakce a pomocí magnetických nosi... 73 5.2 Vliv asového p sobení lysozymu na výt žnost DNA, srovnání ú innosti lysozymu (3mg/ml), imobilizovaného lysozymu a lysozymu obsaženém v pracím prášku... 74 5.3 Testování r zných koncentrací pracího prášku pro lyzi bun k... 75 5.4 Testování r zných pracích prášk pro lyzi bun k... 75 5.5 Izolace DNA z hrubých lyzát bun k potraviná ských matric... 75 6 Záv r... 77 7 Seznam použitých zdroj... 78 8 Seznam použitých zkratek... 80 Seznam p íloh... 81 9 P ílohy... 82 9

ÚVOD Bakterie rodu Lactobacillus jsou ve velké mí e využívány v potraviná ském pr myslu k výrob fermentovaných výrobk (sýry, kysané mléko a jogurty), fermentované zeleniny (kysané zelí) a p i výrob kvalitních fermentovaných salám a klobás. Rod Lactobacillus pat í mezi probiotické bakterie, které významn ovliv ují zdraví živo ich a lov ka jsou sou ástí gastrointestinálního traktu, kde kladn ovliv ují mikroflóru a znemož ují osidlování traktu patogenními organismy. P i analýze mikroorganism obsažených v potravinách se využívají metody založené na amplifikaci DNA, nap. polymerázová et zová reakce (PCR) a postupy na ní založené. Je ale zapot ebí nejprve vzorek potraviny upravit, aby bylo možné DNA pomocí této metody analyzovat. P i identifikaci bakterií rodu Lactobacillus v potraviná ských matricích se používá ada chemikálií a drahých enzym, které jsou nap. používány k lyzi bun k. Zvlášt enzymy, které jsou náro né na skladování a istotu, jsou jedním z nejnákladn jších komponent p i p íprav vzork. To je také jedním z d vod hledání nových cest jak ušet it a zjednodušit pracovní postupy. V této práci jsem se zam il na využití enzym a detergent, obsažených v pracích prášcích, p i p íprav hrubých lyzát bakteriálních bun k rodu Lactobacillus a následnou izolaci DNA pomocí magnetických nosi. Intaktnost takto izolované DNA byla ov ena pomocí PCR. 10

1 TEORETICKÁ ÁST 1.1 Bakterie rodu Lactobacillus Rod Lactobacillus náleží do domény Bacteria, kmene Firmicutes, t ídy Bacilli, ádu Lactobacillales a eledi Lactobacillaceae. (Klein a kol., 1998). V tšina druh Lactobacillus fermentuje glukosu a laktosu na laktát a odtud pochází název tohoto rodu. (Votava a kol., 2003). Bakterie rodu Lactobacillus jsou katalasa negativní a nepohyblivé aerobní až fakultativn anaerobní ty inkovité bakterie (Merk a kol., 2004). Tvo í robustní nesporulující grampozitivní ty ky, asto etízky. Na kultiva ní p d tvo í kolonie. (Votava a kol., 2003). Ideální pro jejich r st jsou mezofilní až mírn termofilní podmínky, mírn kyselé prost edí ph 5, jsou acidotolerantní až acidofilní. P i fermentaci sacharid vytvá ejí kyselé prost edí tvorbou kyselin, p i poklesu pod ph 4 však utlumují až zastavují sv j r st. Kyselina mlé ná z d vodu snížení ph zastavuje r st hnilobných bakterií. Její vlastnosti jsou s výhodou využívány v potraviná ském pr myslu ke konzervaci potravin - kvašení zelí, okurek a v zem d lství k silážování píce. V mlékárenství se používá nap. druh Lactobacillus delbueckii ssp. bulgaricus p i výrob jogurtu, Lactobacillus acidophilus p i p íprav acidofilního mléka nebo Lactobacillus casei p i p íprav sýr (Votava a kol., 2003). Druhy využívané v pr myslové výrob pat í do skupiny bakterií tzv. obecn pokládaných za bezpe né GRAS (generaly regarded as safe) (Roginski a kol., 2003). V intestinálním traktu lidí a zví at mají velice pozitivní vliv na st evní mikroflóru. N které laktobacily se vyskytují také jako nežádoucí kontaminace ve vina ství a pivovarnictví, kde zp sobují chu ové vady výrobk, a v drož árenství, což vede ke ztrátám výt žnosti. (Šilhánková, 2002). V p írod se lactobacily vyskytují p evážn na rozkládajícím se rostlinném materiálu spolu s dalšími zástupci bakterií mlé ného kvašení. 1.2 Struktura bakteriálních bun k a funkce jednotlivých struktur 1.2.1 Bun ná st na bakterií Každá mikrobiální bu ka je od vn jšího prost edí odd lena silnou, v tšinou neohebnou (rigidní) strukturou, jež se nazývá bun ná st na (Obr. 1). 11

Obr. 1: Srovnání bun né st ny G + a G - bakterií upraveno dle http://water.me.vccs.edu/ Pevnost a neohebnost bun né st ny bakterií je výsledkem p ítomnosti vrstvy peptidoglykan, zvaných též mukopeptidy nebo mureiny (od lat. murus = st na). Vrstva peptidoglykan se vyskytuje v bun né st n všech bakterií. Obsahují polysacharidová vlákna tvo ená molekulami N-acetylglukosaminu a N-acetylmuramové kyseliny (tj. 3-O-D-laktylderivátu N-acetyl-D-glukosaminu). Paraleln položené et zce t chto polysacharid jsou vzájemn spojeny prost ednictvím tetra- nebo pentapeptid, a to peptidovou vazbou p es karboxylovou skupinu muramové kyseliny. V t chto peptidech je p ítomno n kolik typ aminokyselin, z toho vždy alespo jedna s dv ma aminoskupinami v molekule. Peptidoglykanová vrstva, jejíž tlouš ka se u r zných rod bakterií liší, p edstavuje vlastn jednu obrovskou molekulu. Lysozym (glykosidasa) díky bakteriocidním ú ink m a schopnostem št pit glykosidické vazby mezi N-acetylglukosaminovými jednotkami a zbytky N-acetylmuramové kyseliny, rozkládá peptidoglykany a v izotonickém prost edí, tak vzniká protoplast. (Šilhánková, 2002; Rau, 2005; Kaprálek, 1986; Rosypal a kol., 1981). Syntéza peptidoglykan je inhibována penicilinem, který p sobí jako antagonista muramové kyseliny. V p ítomnosti ur itých koncentrací tohoto antibiotika v r stovém prost edí o stejném osmotickém tlaku, jaký panuje uvnit bakteriálních bun k, exkretují bakterie do prost edí deriváty muramové kyseliny a tvo í bu ky neobvyklých tvar, s defektní bun nou st nou. Tyto neobvyklé útvary se nazývají L-formy bakterií a jsou velmi citlivé na snížení osmotického tlaku. Za vhodných r stových podmínek mohou regenerovat v normální bakteriální bu ky. Další složky bun né st ny jsou rozdílné u gramnegativních a grampozitivních bakterií. (Šilhánková, 2002) 12

1.2.1.1 Grampozitivní bakterie Jako grampozitivní se ozna ují ty bakterie, u nichž bun né st ny po obarvení Gramovým barvícím roztokem a mo ení jodovým roztokem neztrácejí toto barvivo p sobením organických rozpoušt del (acetonu nebo ethanolu). U gramnegativních bakterií je toto barvivo z obarvených bun k uvedenými rozpoušt dly vyplavováno, takže se bu ky odbarví. Gramova barvení se používá p i diagnostice bakterií. Grampozitivní bakterie mají adu spole ných fyziologických vlastností, odlišujících je od gramnegativních bakterií (nap. citlivost k n kterým antibiotik m, aniontovým povrchov aktivním látkám a toxickým barviv m). Bylo zjišt no, že všechny tyto vlastnosti jsou odrazem rozdíl složení bun ných st n grampozitivních a gramnegativnívh bakterií. (Šilhánková, 2002) Hlavní složkou bun né st ny grampozitivních bakterií je silná peptidoglykanová vrstva, která je jako tmelem vypln na teichoovou kyselinou (Obr. 2). Základem teichoové kyselin je u n kterých bakterií polyglycerolfosfát, u jiných polyribitolfosfát. Teichoová kyselina je vázána kovalentní vazbou na muramovou kyselinu a p edstavuje až 50% sušiny bun né st ny grampozitivních bakterií. Krom teichoové kyseliny jsou na peptidoglykan grampozitivních bakterií vázány ješt polysacharidy složené z glukosy, galaktosy, mannosy a n kterých dalších monosacharid. Složení t chto polysacharid je specifické pro jednotlivé skupiny bakterií a je zodpov dné za imunochemické reakce, tj. za specifické antigenní vlastnosti jednotlivých skupin bakterií. 13

Obr.2: Bun ná st na grampozitivních bakterií, zdroj internet: http://www.wikiskripta.eu/ 1.2.1.2 Gramnegativní bakterie St na gramnegativních bakterií se skládá z tenké vrstvy peptidoglykan bez teichoové kyseliny a z tzv. vn jší membrány, jež obsahuje fosfolipidy, strukturní i enzymové proteiny, lipoproteiny a lipopolysacharidy. St ny gramnegativních bakterií neobsahují teichoovou kyselinu (viz. Obr. 3), což je z ejm, spolu s pom rn tenkou vrstvou peptidoglykanu, p í inou vyplavování komplexu Gramova barviva z bu ky p sobením acetonu nebo ethanolu. Mezi vn jší membránou a peptidoglykanovou vrstvou je tzv. periplazmatický prostor. N které lipoproteiny tvo í výb žky sm rem k peptidoglykanové vrstv a jsou s ní spojeny kovalentní vazbou. Ve fosfolipidové vrstv jsou hydrofilní tunely (póry), tvo ené triméry bílkoviny zvané porin. Tyto póry zasahují p es periplazmatický prostor až k peptidoglykanu, k n muž je porin pevn, ale nekovalentn vázán. (Šilhánková, 2002) 14

Obr. 3: Bun ná st na gramnegativních bakterií, zdroj internet: http://www.wikiskripta.eu/ Obsah lipid ve st n gramnegativních bakterií je p í inou jejich zvýšené odolnosti k aniontovým povrchov aktivním látkám, jako jsou mýdla, žlu ové kyseliny, alkylsulfáty nebo alkylsulfonáty apod. Tato odolnost ke žlu ovým kyselinám umož uje vysoký výskyt gramnegativních bakterií (hlavn enterobakterií) ve st evním traktu savc. V praxi se této odolnosti využívá p i p íprav selektivních živných p d pro stanovení st evních bakterií v potravinách nebo ve vod. Lipopolysacharidy bun né st ny patogen (nap. p íslušník rodu Salmonella) fungují jako endotoxiny, nebo v t le živo ich vyvolávají charakteristické p íznaky onemocn ní; jsou zodpov dné za somatickou (t lovou) antigenní specifitu, ozna ovanou jako O antigen. Tato specifita spo ívá v tom, že lipopolysacharid ur itého chemického složení vyvolává v krvi savc syntézu specifické protilátky, vedoucí k imunit tj. k odolnosti v i tomuto lipopolysacharidu, a tedy i v i celé bakteriální bu ce. Antigenní specifita je velmi vysoká p edevším u st evních bakterií, takže u n kterých druh je možno rozlišit velké množství sérotyp (nebo sérovar ), odrážející rozdíly ve složení st nových lipopolysacharid. Nap. u patogenního rodu Salmonella, který byl z tohoto hlediska nejlépe prostudován a který má pouze ty i druhy, bylo rozlišeno p es 2000 sérovar. Pro p ípravu protoplast je u gramnegativních bakterií zapot ebí p idat k lysozymu v izotonickém prost edí n jaké chelata ní inidlo, nap. EDTA. Ani pak však nedochází k úplnému odstran ní všech složek bun né st ny, a proto vzniklý kulovitý útvar mnohem snáze regeneruje v normální bu ku, než je tomu u protoplast grampozitivních bakterií. Z t chto d vod se asto protoplast gramnegativních bakterií nazývá nepravý protoplast nebo sféroplast. (Šilhánková, 2002) 15

1.2.1.3 P sobení lysozymu na bun nou st nu bakterií Lysozym hydrolyzuje glykosidickou vazbu, která spojuje N-acetylmuramovou kyselinu se tvrtým atomem uhlíku N-acetylglukosaminu na disacharidové jednotky. Bu ky bakterií, zbavené peptidoglykanu, snadno praskají a lyzují díky osmotickému tlaku a jsou snadno fagocytovány. (Šilhánková, 2002; Kaprálek, 1986). Obr. 4: Struktura lysozymu, zdorj internet: http://upload.wikimedia.org/ 16

1.2.2 Cytoplazmatická membrána bakterií Cytoplazmatická membrána bakterií je velmi jemná a tenká membrána (silná asi 7 nm), která je z etelná pouze v elektronovém mikroskopu. Je složená z fosfolipid a protein (viz. Obr. 5), p i emž proteiny p edstavují 50 až 70 % její sušiny. Z cytoplazmatické membrány bakterií vybíhají do cytoplazmy vychlípeniny, jejichž po et a velikost jsou závislé na druhu bakterií. U n kterých druh jsou tyto vychlípeniny zastoupeny v hojném po tu, u jiných je jen jeden nebo dva. Zvláštním typem t chto vychlípenin jsou mesosomy (viz. Obr. 6), které se vyskytují hlavn poblíž oblasti, kde se p i d lení bu ky tvo í p epážka. Mesosomy jsou tvo eny jedinou membránou, která je však složena do mnoha záhyb a je vychlípeninou cytoplazmatické membrány. Cytoplazmatická membrána je sídlem dýchacích enzym, systému oxida ní fosforylace, enzym syntézy a hydrolýzy fosfolipid a kone né fáze syntézy složek bun né st ny a pouzdrových obal. V membrán fototrofních bakterií je p ítomen také bakteriochlorofyl, nezbytný pro p em nu sv telné energie v energii chemickou, a celý systém uskute ující tuto p em nu. P i r stu na sv tle je veškerá cytoplazma bakterií prostoupena nádobkovitými nebo lamelárními vychlípeninami membrány. V cytoplazmatické membrán bakterií jsou dále p ítomny bílkovinné p enaše e, nutné pro transport látek do bu ky a z bu ky. (Šilhánková, 2002) Obr. 5: Cytoplazmatická membrána bakterií, upraveno dle http://upload.wikimedia.org/ 17

1.2.3 Cytoplazma bakterií Krom b žných složek, p ítomných ve všech mikrobiálních bu kách, obsahuje cytoplazma n kterých bakterií také barviva. Nej ast ji jsou to karotenoidní barviva, která zbarvují bu ky a jejich kolonie žlut, oranžov, r žov, p ípadn až erven. Jako rezervní látky jsou v cytoplazm bakterií p ítomny vedle zrní ek volutinu hlavn kapi ky poly- -hydromáselné kyseliny. Tato slou enina se adí k lipid m, nebo se barví stejnými barvivy jako neutrální tuky, tj. sudanem, šarlachem apod. Neutrální tuky, tj. glyceridy vyšších mastných kyselin, se u bakterií jako rezervní látky nevyskytují. N které bakterie obsahují jako rezervní látky polysacharid granulosu, jehož zrní ka se barví roztokem jodu mod e, nebo polysacharid glykogen, barvící se jodem hn do erven. Ribosomy bakterií jsou pon kud menší než ribosomy eukaryotních mikroorganism a tvo í až 40% sušiny cytoplazmy. Tento mimo ádn vysoký obsah ribosom, v nichž probíhá syntéza bílkovin, umož uje obrovskou rychlost syntézy bu né hmoty bakterií: za optimální teploty, ph a p ísunu živin se bun ná hmoty bakterií zdvojnásobí za 15 až 25 minut. (Šilhánková, 2002) 1.2.4 Jaderný materiál bakterií a jeho funkce Jaderný materiál bakterií tvo í deoxyribonukleová kyselina (DNA) umíst ná p ímo v cytoplazm a doprovázená malým množstvím polyamin. DNA v tšiny bakterií tvo í chromosom, který má uzav enou strukturu, takže si jej zjednodušen m žeme p edstavit jako kružnici. Molekula DNA je ovšem ve srovnání s bakterií nepom rn delší: nap. chromosom Escherichia coli je dlouhý 1,1 až 1,4 mm, zatímco bu ka má délku 1 až 2 µm. Bakteriální chromosom je napojen na vnit ní stranu cytoplazmatické membrány v tšinou prost ednictvím mesosomu (viz. Obr. 6). Obr. 6: Mesosom upraveno dle http://home.earthlink.net/ 18

Molekula DNA má u bakterií, podobn jako u ostatních organism, tvar dvojité šroubovice, tj. šroubovice tvo ené dv ma paralelními et zci, jež jsou vzájemn spojeny vodíkovými m stky. Je to polynukleotid obsahující dv purinové báze (adenin a guanin) a dv pyrimidinové báze (thymin a cytosin). Cukr deoxyribosa (tj. 2-deoxy-D-erythropentosa) je vázán svým prvním uhlíkem na purinovou bázi, ímž se vytvá í nukleosid (viz. Obr. 7). Kyselina fosfore ná spojuje pátý uhlík nukleosidu s t etím uhlíkem dalšího nukleosidu. Obr. 7: Fosfodiesterová vazba v DNA, zdroj internet : http://www.aldebaran.cz/ 19

Po adí bází v et zci je velmi d ležité, nebo udává složení bílkovin a ribonukleových kyselin v bu ce. Protilehlé báze dvou paralelních et zc jsou spolu spojeny vodíkovými m stky, a to tak, že adenin (A) je vždy spojen dv ma vodíkovými m stky s tyminem (T) a guanin (G) t emi m stky s cytosinem (C), takže nastává párování A-T a G-C (viz. Obr. 8). Obr. 8: Struktura DNA, zdroj internet: http://www.sci.muni.cz/ Ur itý úsek DNA p edstavuje informaci o složení ur ité molekuly bílkoviny nebo ribonukleové kyseliny anebo má ur itou regula ní funkci a je ozna ován jako gen. Nap. molekula DNA Escherichia coli obsahuje zhruba 4,6. 10 6 pár bází, což p edstavuje materiál pro asi 3000 gen. Molekula DNA bakterií rodu Lactobacillus obsahuje p ibližn 2. 10 6 pár bází. Jak již bylo e eno, byl v klidové bu ce dosud studovaných bakterií zjišt n vždy jeden chromosom. P i rozmnožování bakterií, tj. p i d lení bun k, dochází nejd íve ke zdvojení molekuly DNA neboli replikaci DNA, takže v bu ce jsou dva chromosomy; pak se teprve bu ka rozd lí ve dv. Je-li d lení bun k poškozeno nebo zpomaleno, avšak replikace DNA není zm n na, vznikají vláknité vícejaderné bu ky. Je-li poškozena nebo inhibována replikace DNA, avšak ostatní syntetické procesy probíhají normáln, vzniká také vláknitý útvar, který však obsahuje jen jeden chromosom. (Šilhánková, 2002) 20

1.3 Magnetické nosi e V oblasti biotechnologie byly magnetické ástice poprvé použity v roce 1973 P. J. Robinsonem (Bruce, 2004). P. J. Robinson použil oxid železitý pokrytý oxidem k emi itým a oxid železitý pokrytý celulózou. Na tyto magnetické nosi e imobilizoval enzymy -chymotrypsin a -galaktosidasu. Následn je používal pro aplikace v bioreaktorech. Separa ní techniky využívající mikro ástice a nano ástice jako magnetické nosi e se stále více prosazují p i separaci biologických molekul a bun k. Zmín né techniky jsou uplat ovány v mnoha v dních oborech biochemie, biologie, biotechnologie a léka ství. Rychlost a jednoduchost separace látek z homogenních i heterogenních materiál jsou hlavními výhodami p i použití magnetických nosi. Další p edností, nap íklad p i izolaci bakteriální DNA, je možnost vyhnout se používání organických toxických látek (fenol). Separaci je možno provád t ve standardn vybavené laborato i, není t eba žádného nákladného instrumentálního vybavení. Techniky separace na magnetických nosi ích je možno pokládat za jednoduché, levné a ú inné (Bruce, 2004; Sakar a kol., 2008). Magnetické materiály se vyzna ují širokým rozsahem magnetických vlastností. V tšina magnetických nosi používaných k separaci má superparamagnetické vlastnosti. Bez p sobení magnetického pole se ástice navzájem nijak nep itahují a tvo í stejnorodou sm s, v p ítomnosti vn jšího magnetického pole jsou však p itahovány ke zdroji (magnetu) a mohou tak být ze sm si izolovány magnetickým separátorem (Šafa íka kol., 1999). Magnetické ástice se skládají z magnetického jadérka, které zajiš uje ástici její magnetické vlastnosti, ochranného obalu - chránící jadérko p ed vn jšími vlivy a z aktivní molekuly podle afinity k vybraným látkám (Obr. 9). Obr. 9: Magnetická ástice pro biotechnologické aplikace, upraveno dle (McBain a kol., 2008) 21

Magnetické jadérko se v tšinou skládá z materiálu na bázi magnetických oxid železa (magnetit - Fe 3 O 4, maghemit - -Fe 2 O 3 ). P ipravené magnetické jadérko by m lo mít požadovanou velikost a magnetické vlastnosti. Pro biologické aplikace je t eba minimalizace nežádoucích nespecifických interakcí kovu s vn jším prost edím a složkami v n m. Toho je dosaženo pokrytím ástic vysoko- nebo nízko-molekulárními polymery. Mezi nej ast ji používané polymery pat í poly(glycidyl methakrylát) (PGMA), poly(2-hydroxyethyl methakrylát) (P(HEMA)), a jejich kopolymery a polystyren. Polymery P(HEMA) a PGMA se adí mezi hydrofilní nosi e, jejichž výhodou jsou: vysoká mechanická stabilita, biokompatibilita, nízká nespecifická adsorpce biologicky aktivních látek a široké využití pro biomedicínské aplikace. PGMA má navíc výhodu p ítomnosti oxiranové skupiny, která sice není p íliš reaktivní, ale lze ji snadno upravit hydrolýzou, aminací, oxidací atd. Polymery založené na polystyrenu mají hlavní nedostatek v tom, že vyvolávají hydrofobní interakce s biomolekulami i p esto jsou v sou asnosti nejvíce používané. Pomocí specifické vazby jsou cílové molekuly ze vzorku navázány na aktivní molekuly tvo ící vn jší vrstvu magnetických ástic. Magnetické ástice lze rozd lit podle typu funkcionalizovaného povrchu a užití (Obr. 10). (Rittich a kol., 2006; Life Technologies Corporation, 2011; Horák a kol., 2004; Kubicz, 2010). 22

Obr. 10: Typy a užití magnetických mikro ástic, upraveno dle http://www.invitrogen.com/ a http://www.biclone.us/ 23

1.4 Replikace DNA Replikace DNA se uskute uje tak, že v ur itém míst se oba paralelní et zce vzdálí a ke každému z nich se za íná syntetizovat doprovodný et zec na principu párování bází. P vodní et zec tedy slouží jako p edloha pro nov vznikající et zec. Tím je zaru eno, že z jedné molekuly DNA vzniknou dv molekuly, jež jsou po chemické stránce totožné. Každá z t chto molekul obsahuje jeden et zec p vodní a jeden nov syntetizovaný. Klí ovým enzymem p i replikaci DNA je DNA polymerasa (viz. Obr. 10). Jedná se o amplifikaci DNA in vivo. Obr. 11: DNA replikace, zdroj internet:http://upload.wikimedia.org/ Tato tzv. semikonzervativní replikace DNA je spole ná všem živým organism m a vyskytuje se i p i replikaci virové DNA. Tento zp sob syntézy DNA, jenž zaru uje p esný p enos genetické informace z mate ské bu ky do bu ky dce iné, je tedy základem d di nosti. Jen velmi vzácn dochází p i replikaci DNA k chyb a pak hovo íme o samovolné neboli spontánní mutaci. Syntéza bakteriální DNA probíhá od tzv. inicia ního bodu, který se nachází v míst napojení chromosomu na cytoplazmatickou membránu, a postupuje ob ma sm ry. Proces replikace, její pr b h a regulaci, zajiš uje n kolik bílkovin enzymové povahy. Celý tento proces je ovládán více než dvaceti geny. 24

1.5 Polymerázová et zová reakce Polymerázová et zová reakce (PCR) a postupy na ní založené jsou ve výzkumných laborato ích nejvíce využívanou molekulárn diagnostickou metodou. Podstatou PCR je cyklicky se opakující syntéza ur itého úseku DNA. Jedná se o amplifikaci DNA in vitro. K vybraným úsek m komplementárních vláken denaturované DNA se hybridizují (p ipojují) krátké syntetické oligonukleotidy (primery), od nichž probíhá syntéza nového et zce DNA. Syntéza je katalyzována termostabilní DNA dependentní DNA-polymerasou. PCR je proces, p i n mž se v závislosti na teplot reak ní sm si pravideln st ídají t i kroky, b hem nichž probíhají t i odlišné d je (viz. Obr. 12): - denaturace dvou et zcových molekul DNA (94 C), - p ipojení primer k odd leným et zc m DNA (50-65 C), - syntéza nových et zc DNA katalyzovaná DNA-polymerasou (65-75 C) 25

Obr. 12: Polymerázová et zová reakce schema, zdroj internet: http://www.wikiskripta.eu/ 26

Postupným opakováním tohoto procesu se exponenciáln (2 n ; n = po et cykl ) syntetizuje až 10 9 kopií vybraného úseku DNA. Optimální po et cykl je závislý na výchozí koncentraci templátové DNA a zpravidla se pohybuje v rozmezí od 25-35 cykl. Reakce se provádí v termocykleru, v n mž se teplota m ní automaticky v naprogramovaných asových intervalech. P i p íliš vysokém po tu cykl se ú innost DNA-polymerasy snižuje. Výsledným produktem PCR jsou amplikony, což jsou úseky DNA definované délky o velikosti obvykle desítky až tisíce pár bází (bp). Jejich p ítomnost se v reak ní sm si prokazuje elektroforézou na agarosovém polyakrylamidovém gelu nebo kvantitativním m ením množství produktu v reálném ase (PCR v reálném ase). Reak ní sm s (obvykle v rozmezí objem 25-100 µl) se skládá z následujících složek: Matrice DNA (DNA templát) - makromolekula DNA, podle které se komplementárn syntetizují nové et zce DNA. Obsahuje cílová místa pro primery. Typická množství bakteriální a plasmidové DNA, p idávané do reakce, jsou 10 a 1 ng a 10 pg. Oligonukleotidové primery - bývají synteticky p ipravené a jsou komplementární k templátové DNA, která má být amplifikována. Primery jsou sekven n specifické a nesmí obsahovat falešná vazebná místa templátu. Typické primery mají 18-30 nukleotid a obsahují 40-60 % GC bází. Teplota tání primer bývá v rozmezí 55-80 C. Primery by nem ly být mezi sebou komplementární, zejména ne na 3 -konci, kde párování dvou nebo t í bází m že vést ke vzniku dimer primer, zejména p i nadbytku primer. Pot ebná koncentrace primeru pro jednu reakci je 0,1-0,5 µm. DNA-polymerasa - syntetizuje novou DNA ve sm ru 5 3 podle sekvence nukleotid v komplementárním et zci DNA od 5 konce primeru. Ke katalýze se používají termostabilní polymerasy, nap. Taq DNA-polymerasa izolovaná z mikroorganismu Thermus aquaticus. 2 -deoxynukleosid-5 -trifosfáty (dntp) - (datp, dctp, dgtp, dttp) - stavební kameny pro syntézou nové DNA. Optimalní koncentrace je 200 µm, toleran ní rozp tí je 20-400 µm. Vysoké koncentrace dntp (od 4 mm a výše) p sobí inhibi n, protože vyvazují ho e naté ionty (Mg 2+ ). Mg 2+ ionty - jsou nezbytné pro aktivitu DNA-polymerasy. Koncentrace Mg 2+ musí být optimalizována pro každou kombinaci primer a DNA templátu. Obvykle se používá koncentrace 1,5 mm Mg 2+. Toleran ní rozp tí je 0,5-8 mm. Vyšší koncentrace iont snižuje specifitu PCR. U primer bohatých na G a C báze je ale použití vyšší koncentrace Mg 2+ vhodn jší. Pufr pro PCR - vytvá í optimální prost edí pro DNA-polymerasu. Standardní reak ní pufr obsahuje 10 mm Tris-HCl (ph 8,3-8,8), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2. P ípadn m že ješt obsahovat acetamid, albumin, želatinu nebo Tween 20. Voda pro PCR - používá se na dopln ní sm si pro PCR na požadovaný objem. Nejvhodn jší je voda o odporu 18 m nebo voda pro injekce SL 4. 27

DNA-polymerasa, sm s dntp, PCR pufr (bez nebo s Mg 2+ ionty) jsou dodávány výrobci (prodejci) DNA-polymerasy. Podmínky amplifikace uvád né v následujícím textu závisí na použitých chemikáliích, p ístrojové technice a spot ebním materiálu. Proto je nutné podmínky amplifikace validovat a v ad p ípad optimalizovat. Doporu uje se používat všechny pufry od stejného výrobce. P i separaci DNA se jako nosi e použivají agarosa (pro separaci molekul o velikosti 200-50 000 bp) a polyakrylamid (pro separaci molekul o velikosti 10-1 000 bp). Vysoká citlivost a specifita PCR zp sobuje, že kontaminace i jedinou molekulou exogenní nebo neznámé DNA posta uje pro získání falešn pozitivního výsledku. (Španová a Rittich, 2010) 28

2 CÍL PRÁCE Cílem práce byla p íprava DNA v kvalit vhodné pro polymerázovou et zovou reakci Pozornost byla zam ena na lyzy bun k pomocí r zných látek: lysozymu v roztoku, imobilizovaného lysozymu a enzym obsaženým v pracích prášcích. DNA byla poté izolována s využitím magnetických nosi. Jako kontrola byla pro izolaci DNA použita fenolová extrakce. Pro p ípravu hrubých lyzátu bun k a izolaci DNA byly použity sbírkové kmeny rodu Lactobacillus a mlé né výrobky. 29

3 EXPERIMENTÁLNÍ ÁST 3.1 Materiál 3.1.1 Použité bakteriální kmeny Použití bakteriální kmeny pocházely z eské sbírky mikroorganism (CCM, Brno. R) a Sbírky mléka ských kultur Laktoflora (CCDM, Tábor, R). Byly použity následující kmeny: Lactobacillus rhamnosus CCM 1825 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7088 Lactobacillus plantarum CCM 7039 Lactobacillus fermentum CCM 7192. 3.1.2 Použité mlé né výrobky Použité mlé né výrobky byly zakoupeny v b žném obchod s potravinami. Acidofilní mléko (mlékárna Valašské Mezi í í) Acidofilní mléko plnotu né. Složení: mléko, mlé né kultury, ABT kultura, (Lactobacillus acidophillus, Bifidobacteria sp., Streptococcus thermophillus). 100g výrobku pr m rn obsahuje: energie 280 kj/ 67 kcal, tuk min. 3,6g hmotnosti. Obsahuje živou mikroflóru. Jogurt ochucený mango (Zott) Složení: mléko, mango, koncentrát manga, glukozo-fruktozový sirup, cukr, sušené mléko, E100 Kurkumin (Cl p írodní žlu 3), aroma, jogurtová kultura Bílý jogurt (Madeta) Složení: plnotu né mléko,sušené mléko, jogurtová kultura 30

3.1.3 Prací prášky Amway - SA8 TM Premium + BIOQUEST prací prášek (Amway TM ) Persil prášek PERSIL color pulver: Gold (Henkel) Persil modrý tekutý - PERSIL Color prací gel pro barevné prádlo (Henkel) Persil zelený tekutý - PERSIL universal: Gold tekutý prací gel (Henkel) PER 100% - univerzální prací gel (Complete) 3.1.4 Chemikálie 3.1.4.1 Chemikálie pro p ípravu roztok Agarosa pro elektroforézu DNA (Serva, Heidelberg, SRN) DNA standard (100 bp) (Malamité, Moravské Prusy, R). Obsahuje fragmenty o délce: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500 bp Ethanol (Lachema, Brno, R) Ethidium bromid (5 mg/ml) (EtBr) (Sigma, St. Lois, USA) Ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA) (Serva, Heidelberg, SRN) Fenol ph 7,8 (Sigma, St. Louis, USA) Hydroxid sodný (Lachema, Brno, R) Chlorid sodný (Lachema, Brno, R) Chlorid draselný (Lachema, Brno, R) Chloroform (Lachema, Brno, R) Isoamylalkohol (Lachema, Brno, R) Kyselina boritá (HBO2) (Lachema, Brno, R) Lysozym (Renal, Budapeš, Ma arsko) Nanášecí pufr (2,5 % Ficoll 400) (Top-Bio, Praha, R) Octan sodný (Lachema, Brno, R) PCR komponenty: 10x reak ní pufr, Taq DNA polymeráza dntp sm s (Top. Bio, Praha, R) Primer LbLMA 1-rev, primer R 16-1 (Generi Biotech s.r.o, R) PEG 6000 (Sigma, St. Louis, USA) Proteinasa K (100 g/ml) (Sigma, St. Louis, USA) RNasa A (Reanal, Budapeš, Ma arsko) dodecylsulfát sodný (SDS) (Sigma, St. Louis, USA) Tris-hydroxymethyl-aminomethan (Tris base) (Amresco, Solon, USA) Ostatní chemikálie byly istoty p.a. a pocházely z b žných komer ních zdroj. 31

3.1.4.2 Magnetické ástice Magnetické neporézní mikro ástice Poly(2-hydroxyethyl methakrylat-co-glycidyl methakrylát) (P(HEMA-co-GMA)) (1:1) o pr m ru ástic 2,2 m, s obsahem železa 6,5 %. ástice byly pokryty karboxylovými skupinami a obsahem -COOH skupin 2,67 mm. ástice byly p ipraveny na Makromolekulárním ústavu Akademie v d R v Praze (ing. D. Horák, CSc.). Imobilizovaný lysozym Poly-(2-hydroxyethyl methakrylat-co-glycidyl methakrylát) (P(HEMA-co-GMA)) (1:1) o pr m ru ástic 2,2 um, s obsahem železa 6,5 % a navázaným lysozymem. ástice byly p ipraveny na Makromolekulárním ústavu Akademie v d R v Praze (ing. D. Horák, CSc.) 3.1.4.3 Roztoky 3.1.4.3.1 Roztoky pracích prášk Do 10 ml sterilní vody byl rozpušt no 0,4 g (400 l) pracího prášku. Poté byl roztok p efiltrován p es bakterilogický filtr (póry 0,4 l). 3.1.4.3.2 Kultiva ní média M R.S. médium MRS médium bylo p ipraveno dle návodu výrobce. V 1 000 ml destilované vody bylo rozpušt noí 52 g MRS média, ph média bylo upraveno na hodnotu 6,2. Médium bylo sterilizováno v autoklávu (121 C/15 minut). M.R.S. agar. MRS médium bylo p ipraveno podle návodu výrobce. Byla p idána agarosa (15 g/l). Médium bylo sterilizováno v autoklávu (121 C/15 minut). Poté bylo médium rozpln no do Petriho misek a uchováváno v ledni ce. 32

3.1.4.3.3 Roztoky pro p ípravu hrubých lyzát 0,5 M EDTA (ph 8,0) Navážka 202,2 g EDTA byla p evedena do 800 ml destilované vody, poté byla nádoba s roztokem umíst na na magnetickou mícha ku, ph bylo upraveno p idáním asi 20 g NaOH v peletkách. Nejprve bylo p idáno 15 g a potom byl p idán zbytek za kontroly ph. Objem byl dopln n destilovanou vodou do 1 l. Roztok je možné p efiltrovat. Sterilizovat v autoklávu (121 C/15 min). Rozplnit do alikvot. 1 M Tris-HCl (ph 7,8) V 80 ml destilované vody bylo rozpust no v 12,1 g Tris-base. Bylo upraveno ph pomocí koncentrované HCl. Objem byl dopln n destilovanou vodou do 100 ml. Roztok byl sterilován v autoklávu (121 C, 15 minut). Lyza ní roztok A (10 mm Tris ph 7,8, 5 mm EDTA ph 8,0) Steriln bylo smícháno 1 ml 1M Tris HCl (ph 7,8), 1 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) a 98 ml destilované vody. Lyza ní roztok B (10 mm Tris ph 7,8, 5 mm EDTA ph 8,0, lysozym 3 mg/ml) Steriln bylo smícháno 1 ml 1M Tris HCl (ph 7,8), 1 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) a 98 ml destilované vody. P ed použitím byl do roztoku p idán lysozym. SDS (10 %, 20 %) 10 (20) g SDS bylo rozpušt no v 90 (80) ml sterilní destilované vod. Bylo upraveno ph na 7,0 n kolika kapkami koncentrované HCl. Objem byl dopln n destilovanou vodou do 100 ml. P i vážení práškového SDS je nutné používat ústenku. Proteinasa K (100 g/ml) 100 µg proteinasy K bylo rozpušt no v 1 ml sterilní destilované vody. Roztok Proteinasy K byl rozpln n do alikvot a uchovánán v - 20 C. CIZ Sm s chloroformu a isoamylalkoholu v pom ru 24:1 1 M NaOH 40 g NaOH bylo rozpušt no v 800 ml destilované vody a dopln no do 1 l. Poté byl roztok NaOH rozpln n do alikvot. Roztoky pro izolaci DNA pomocí magnetických nosi 1 x TE pufr Steriln bylo smícháno 1 ml 1 M Tris (ph 7,8) a 100 µl 0,5 M EDTA (ph 8,0) s 98,9 ml destilované vody (na výslednou koncentraci 0,01 M Tris a 0,001 M EDTA). 33

5 M NaCl 58,4 g NaCl bylo rozpušt no ve 150 ml destilované vody a dopln no destilovanou vodou do 200 ml. Poté byl roztok sterilizován v autoklávu (121 C/15 minut). 40 % PEG 6000 40 g PEG 6000 bylo rozpušt no v 60 ml sterilní destilované vody a dopln no sterilní destilovanou vodou do 100 ml. Roztok byl uchováván p i 4 C. 70 % ethanol Bylo smícháno 70 ml 96 % ethanolu s 26 ml destilované vody. 3.1.4.3.4 Roztoky pro agarózovou gelovou elektroforézu DNA standard (100 bp) Obsahuje fragmenty o délce: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500 bp 5 TBE pufr 54 g Tris-base a 27,5 g kyseliny borité bylo rozpušt no v 600 ml destilované vody. Poté bylo p idáno 20 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) a dopln no destilovanou vodou do 1 l. Lze p efiltrovat a sterilizovat v autoklávu. P ed použitím byl roztok 10 x na ed n na výslednou koncentraci 45 mm Tris, 45 mm kyselina boritá a 1 mm EDTA. Agarosový gel 1,8% 1,8 g agarosy byl rozva en ve 100 ml 0,5 koncentrovaného TBE pufru. Ethidium bromid (0,5 g/ml) 100 l roztoku EtBr o koncentraci 2,5 mg/ml bylo z ed no 500 ml sterilní vody. 34

3.1.5 P ístroje a pom cky Centrifuga (Eppendorf AG, Hamburg, N mecko) Centrifuga MINI Spin 13 400 min-1 (Eppendorf, Hamburg, N mecko) Laboratorní váhy (Kern & Sohn, N mecko) Magnetický separátor Invitrogen Dynal AS (Dynal Biotech, Oslo, Norsko) Mikropipety Discovery HTL o objemu 10 l, 20 l, 200 l, 1000 l (Discovery HTL, Varšava, Polsko) Mikrovlná trouba SMW 5020 (Sencor, R) Minicentrifuga C1301 (Labnet international, Inc., USA) Minicycler PTC 150 (MJ Research, Watertown, USA) NanoPhotometr (Implen, N mecko) Termocycler PTC-200 (BIO-RAD Lab., USA) Termostat Mini incubator (Labnet, USA) Transluminátor TVR 3121 (Spectroline, Paramount, USA) Za ízení pro elektroforézu Easy-Cast, model B1 (Owl Scientific, USA) Zdroj elektrického nap tí Lighting volt Power Supply, model OSP-300 (Owl Scientific, USA) Laboratorní sklo a pom cky 35

3.2 Metody 3.2.1 Kultivace bakterií Bakteriální druhy rodu Lactobacillus byly inokulovány do tekutého média MRS (0,3 ml/10 ml) a následn kultivovány po dobu 48 hodin p i 37 C. Pracovalo se steriln. 3.2.1.1 Stanovení po tu bun k Bakteriální kultury byly 10x na ed ny MRS médiem a byla zm ena absorbance A 600nm tekutého média s narostlou kulturou. Pracovalo se steriln. 3.2.1.2 Stanovení po tu bun k kultiva ní metodou Kultura bakteriálního kmene Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 byla narostlá A 600nm = 5,7. Vzorek o p íslušné absorbanci byl z ed n na 1 10-6, 1 10-7 a 1 10-8. 100 l na ed ného vzorku bylo rozet eno na agarovou plotnu. Vzorky byly uloženy do inkubátoru (37 C) a ponechány r st po dobu 48 hod. Po 48 hod byly spo ítány kolonie vyrostlé na plotnách a stanoven po et bun k (cfu/ml). Pracovalo se steriln. 3.2.2 P íprava hrubých lyzát (HL) bun k Jeden ml bun né suspenze o A 600nm = 3,0 byl centrifugován 3 min p i 15000 ot/min. Následn byl supernatant slit a sediment byl resuspendován v 1 ml roztoku A (10 mm Tris-HCl ph 7,8; 5 mm EDTA ph 8,0). Suspenze byla op t centrifugována za stejných podmínek. Po odst ed ní bun k byl supenratant op t slit a sediment byl resuspendován v 500 l roztoku B s obsahem lysozymu 3 mg/ml. K bu kám s bun nou st nou narušenou lysozymem bylo p idáno 25 l 10 % SDS a 5 l proteinasy K (100 mg/ml). Sm s byla ponechána inkubovat p i 55 C do druhého dne. Takto p ipravené hrubé lyzáty byly použity pro izolaci DNA fenolovou extrakcí a magnetickými nosi i. 36

3.2.3 Izolace bakteriální DNA 3.2.3.1 Fenolová extrakce K 500 µl lyzátu bun k byl p idán stejný objem fenolu (p edestilovaného, ph upraveno na hodnotu 7,8). Poté byla sm s kývavým pohybem opatrn promíchávána 4 minuty. Následn byla sm s odst ed na p i 15 000 ot/min po dobu 5 minut. Pomocí špi ky s ust iženým hrotem byla odebrána vodní fáze s DNA do isté Eppendorfovy zkumavky. Vodní fáze s DNA byla dopln na TE pufrem na objem 500 µl a poté bylo p idáno 700 µl sm si chloroform isoamylalkohol (24:1). Sm s byla opatrn promíchávána kývavým pohybem 4 minuty. Poté byla sm s op t odst ed na p i 15 000 ot/min po dobu 5 minut. Vodní fáze s DNA byla odebrána do isté Eppendorfovy zkumavky. DNA byla následn vysrážena 96% ethanolem. 3.2.3.1.1 Srážení DNA ethanolem Pomocí automatické pipety byl zm en objem vzorku DNA (400 l). Ke vzorku DNA byla p idána 1/20 objemu 3 M octanu sodného (20 µl). Vše bylo dob e promícháno. Následn byl p idán 1 ml (2,5 násobek objemu) ethanolu (96 %) a sm s byla promíchána. DNA byla srážena p i - 20 C po dobu 15-60 min. Sm s byla odst ed na p i 15 000 ot/min po dobu 15 minut (p i 4 C). Supernatant byl opatrn odlit. Sediment byl opláchnut 70 % ethanolem a op t centrifugován p i 15 000 ot/min po dobu 10 minut (p i 4 C). Sediment DNA byl vysušen v exikátoru (asi 15 min) a DNA byla rozpušt na v 50 µl (100 ul) TE pufru. Takto p ipravená DNA byla použita pro agarosovou gelovou elektroforézu a pro spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA. ást DNA byla zmrazena (- 20 C) a pozd ji použita jako DNA matrice pro et zovou polymerázovou reakci. 3.2.3.2 Izolace DNA pomocí magnetických nosi Další metodou izolace bakteriální DNA je izolace pomocí magnetického nosi e P(HEMA-co-GMA). Tato izolace byla provedena ze suspenze hrubých lyzát bun k p ipravených v kapitoly 2.3.2. Separa ní sm s s magnetickými nano ásticemi byla p ipravena podle Tabulky 1. 37

Tabulka 1 : Separa ní sm s pro izolaci DNA pomocí magnetických ástic Komponenta Objem (µl) 1 NaCl (5 M) 400 2 hrubý lyzát (HL) 100 3 PEG 40 % 400 4 magnetické ástice (2 mg/ml) 100 Výsledný objem 1000 Jednotlivé komponenty byly smíchány v daném po adí podle Tabulky 1 a sm s byla inkubována 15 min p i laboratorní teplot. Zkumavky se sm sí ástic s navázanou DNA byly vloženy do magnetického separátoru a ponechány v separátoru s magnetem po dobu 15 minut. Supernatant byl opatrn odpipetován a ástice s DNA byly promyty 70 % ethanolem. Promytí bylo zopakováno ješt jednou. Poté byl odpipetován supernatant a zkumavky s ásticemi s navázanou DNA byly sušeny v sušárn (55 C) do odpa ení zbytku ethanolu. Poté byly magnetické ástice s navázanou DNA resuspendovány ve 100 l TE pufru a DNA ponechána eluovat po dobu 30 min, nebo do dalšího dne p i laboratorní teplot. ástice byly odseparovány magnetem a DNA se odebrala do isté Eppendorfovy zkumavky. Takto izolovaná DNA byla použita jako DNA matrice do PCR. (Španová a Rittich, 2010) 3.2.4 Spektrofotometrické stanovení istoty a koncentrace DNA na NanoPhotometru Pomocí p ístroje NanoPhotometru a speciálních kyvet Label Gard byla zm ena koncentrace a stanovena istota DNA. istota DNA byla vypo ítána z pom ru absorbancí A260nm/A280nm. ( Sambrook., 2001). Do p ístroje byla vložena speciální kyveta ve sm ru procházejícího sv telného paprsku. Byl zvolen program Label Gard Application, analýza Nucleic acid pro ds DNA. Dále bylo vybráno lid ví ko podle p edpokládané koncetrace DNA (viz. Tabulka 2) Tabulka 2: Výb r lid ví ka Ví ko lid 5 lid 10 lid 50 optická dráha (nm) 2 1 0,2 rozsah koncentrace DNA (ng/µl) 7-350 14-700 250-4000 objem vzorku (µl) 6-10 3-5 0,7-4 38

3.2.5 Polymerázová et zová reakce (PCR) Bakterie rodu Lactobacillus byly detegovány pomocí amplifikace fragmentu DNA dlouhého 250 pb, který byl vymezen následujícími primery (Dubenet a kol., 2002): 1. LbLMA 1-rev 5 - CTC AAA ACT AAA CAA AGT TTC 3 Rodov specifický primer, který byl navržen z mezerníkové oblasti mezi 16S a 23S rrna. 2. R16-1 5 - CTT GTA CAC ACC GCC CGT CA 3 Univerzální primer, který odpovídá koncové sekvenci genu pro 16S rrna. 3.2.5.1 P íprava PCR sm si pro rod Lactobacillus P íprava PCR sm si o objemu 25 l je uvedena va Tabulce 3. Pro p ípravu v tšího objemu PCR sm si byl podle množství vzork p ipraven tzv. master-mix do eppendorfovy zkumavky. Dále byla p ipravena pozitivní kontrola s DNA Lactobacillus (10 ng/ml) a negativní kontrola, kde DNA matrice byla nahrazena PCR vodou. P i míchání bylo nutno dodržet po adí komponent a po p idání každé komponenty byla sm s d kladn promíchána. Poté co byla sm s krátce sto ena na centrifuze, byla zkumavka se sm sí umíst na do termocycleru. Po zapnutí p ístroje byl zvolen program s následujícími reak ními podmínkami. Reak ní podmínky: 1. 95 C/ 5 min. 2. 95 C/ 0,5 min. denaturace DNA 3. 55 C/ 0,5 min. hybridizace primer 4. 72 C/ 0,5 min. syntéza DNA et zce 5. 29x opakováné kroku 2. - 4. 6. 72 C/ 10 min. syntéza DNA et zce 7. 10 C/ neomezen dlouhá doba P ed prvním cyklem se PCR sm s zah ívá na teplotu 95 C po dobu 5 min. Jeden cyklus se skládá ze t í krok. V prvním kroku dochází p i 95 C po dobu 0,5 min k denaturaci DNA, v následujícím k hybridizaci primer (0,5 min, 55 C) a v posledním k syntéze et zce DNA (0,5 min, 72 C). První cyklus se opakuje 29x. V posledním cyklu je doba syntézy et zce DNA prodloužena na 10 min. A nakonec byla sm s ochlazena na 10 C. 39