Základy interpretace hmotnostních spekter měřených s použitím měkkých ionizačních technik

Základy interpretace hmotnostních spekter měřených s použitím měkkých ionizačních technik

Pravidlo sudého počtu elektronů (Even-Electron Rule) 1/ E + EE + + R měkké ion.tech tech. 2/ EE + EE + + EI E + + EI E + + R 1/ Fragmentace iontů s lichým počtem e - (E + ) mohou vznikat opět ionty s lichým počtem e - anebo se sudým počtem e - 2/ Fragmentace iontů se sudým počtem elektronů (EE + ) - přednostně vnikají opět ionty se sudým počtem elektronů -vznik kation-radikálů při fragmentaci iontů se sudým počtem elektronů vyžaduje energeticky velmi nevýhodné rozdělení elektronového páru (popsané výjimky)

M - - - - 100 127 I M+2 97.3 81 - - 100 79 Br M+2 32 37 - - 100 35 Cl M+2 4.4 34 0.79 33 100 32 S M - - - - 100 31 P M+2 3.4 30 5.1 29 100 28 Si M - - - - 100 19 F M+2 0.2 18 0.04 17 100 16 M+1 - - 0.37 15 100 14 M+1 - - 1.1 13 100 12 C M - - 0.015 2 100 1 % m/z % m/z % m/z Typ prvku M+2 M+1 M Prvek Zastoupení izotopů běžných organických prvků

Volba ionizační techniky a polarity záznamu Záznam kladných iontů většina sloučenin Záznam záporných iontů sulfonové a karboxylové kyseliny, (poly)hydroxysloučeniny, nitrosloučeniny, (poly)halogensloučeniny, apod.

Dusíkové pravidlo Základní formulace (platí pro M R a E +. ): lichá M R = lichý počet dusíků v molekule sudá M R = sudý počet dusíků v molekule Pro ionty EE + přesně naopak: lichá hodnota m/z znamená sudý počet dusíků, sudá hodnota m/z lichý počet dusíků platí pro běžné organické prvky (C,,,, F, Si, P, S, Cl, Br, I) Počet dusíků 0, 2, 4,... (sudý) m/z lichá EE + m/z sudá E +. 1, 3, 5,... (lichý) E +. EE +

Dusíkové pravidlo Základní formulace (platí pro M R a E +. ): lichá M R = lichý počet dusíků v molekule sudá M R = sudý počet dusíků v molekule Pro ionty EE + přesně naopak: lichá hodnota m/z znamená sudý počet dusíků, sudá hodnota m/z lichý počet dusíků platí pro běžné organické prvky (C,,,, F, Si, P, S, Cl, Br, I) Počet dusíků 0, 2, 4,... (sudý) m/z lichá EE + m/z sudá E +. 1, 3, 5,... (lichý) E +. EE +

Porovnání CID v uspořádání in-source, QqQ a iontové pasti in-source kolizně indukovaná disociace v iontovém zdroji bez možnosti izolace iontu prekurzoru MS/MS izolace iontu prekurzoru a teprve potom jeho kolizní disociace, proto získané spektrum musí obsahovat pouze produktové ionty vzniklé rozpadem iontu prekurzoru a žádné kontaminanty a) QqQ může dojít k opakovaným kolizím iontů s neutrálními částicemi, a proto pozorujeme více fragmentových iontů v celém rozsahu m/z ve srovnání s iontovou pastí, i opakované kolizní rozpady iontů -izolace iontu prekurzoru v prostoru b) iontová past často pouze jednostupňové rozpady, méně fragmentů, snazší na interpretaci, ale zase mohou chybět fragmentové ionty v nízkomolekulární oblasti (tzv. cut-off v 1/3 m/z iontu prekurzoru), možnost měření MS n -izolace iontu prekurzoru v čase

MS/MS spektrum (izolace iontu A) CID 1) Ionizace 2) Izolace 3) Fragmentace F2(A) B A A F1(A) In-source MS (bez izolace)!!! 1) Ionizace CID 2) Fragmentace F2(A) F1(B) B A F1(A) F2(B)

Ukázka MS 6 analýzy s využitím iontové pasti - MS n -velice cenné ve strukturní analýze a studiu fragmentačních cest - obvykle maximálně MS 3 až MS 5, do vyšších stupňů výjimečně 1 2 3 4 5 6

Meření s vysokým rozlišením -lze určit náboj iontu podle diference mezi izotopickými píky, která je 1/X, tedy 1/2 pro dvakrát nabitý ion, 1/3 pro třikrát nabitý, atd. -nelze určit přesnou hmotu, na to je třeba měřit s vysokou přesností určení m/z, tedy vždy s použitím kalibrace, nejlépe interní -iontová past, analyzátory z doby letu (TF), magnetický analyzátor s dvojí fokusací iontů, iontová cyklotronová rezonance Meření s vysokou přesností určení m/z -přesné určení m/z na několik (nejméně 3) desetinných míst, možnost určení elementárního složení iontů anebo alespoň výrazné zúžení potenciálních možností -velmi důležitá přesná kalibrace hmotnostní -analyzátory z doby letu (TF), kvadrupól s hyperbolickým průřezem tyčí, magnetický analyzátor s dvojí fokusací iontů, iontová cyklotronová rezonance -iontová past z principu ELZE

Základní pravidla interpretace ESI/APCI spekter 1/ a) Téměř výhradně ionty se sudým počtem e -, např. [M+] +, [M+a] +, [M+K] +, [M+ 4 ] + při záznamu kladných iontů, resp. [M-] - při záznamu záporných iontů b) Ionty s lichým počtem e - výjimečně, např. organokovy, polyaromáty, záchyt e - za tvorby radikál-aniontu M -. pro nitrosloučeniny, fragmentové ionty se stabilizací nepárového e - na cyklické konjugované struktuře, apod. 2/ Dochází k štěpení menšího počtu labilních vazeb ve srovnání s EI, tzn. molekula fragmentuje po větších logických částech 3/ motnostní spektrum prvního stupně (MS 1 ) většinou obsahuje pouze (de)protonované molekuly a molekulární adukty, minimum nebo absence fragmentových iontů (neplatí vždy!) 4/ Pro získání většího množství fragmentových iontů lze použít CID v iontovém zdroji nebo MS/MS uspořádání 5/ Knihovny ESI/APCI spekter neexistují s výjimkou biomolekul, pro strukturní návrhy nad rámec určení M R nezbytné zkušenosti s daným typem sloučenin, porovnání s literaturou nebo změření většího souboru sloučenin daného typu pro zobecnění pozorovaného fragmentačního chování

Postup interpretace ESI/APCI spekter 1/ Určení M R včetně ověření správnosti návrhu M R podle přítomnosti charakteristických aduktů, např. [M+a] +, [M+K] +, [M+ 4 ] + ; někdy také adukty s mobilní fází typu [M++metanol] + nebo [M++acetonitril] +, popř. zdvojené molekuly typu [2M+] +, [2M+a] +, apod. - většina těchto aduktů má malou až mizivou relativní intenzitu (obvykle nejintenzivnější [M+a] + ),ale přesto mají velký význam pro potvrzení správnosti určení M R, protože uvedené aduktové ionty jsou většinou pozorovány pouze pro molekuly a nikoliv pro fragmenty - u záporných iontů kromě [M-] - lze v závislosti na složení mobilní fáze čekat např. [M+Cl] -, [M+C 3 C] -, [M+C] -, apod. - typ a relativní intenzita aduktových iontů velmi výrazně závisí na složení mobilní fáze a obsahu solí v eluentu či vzorku 2/ Dusíkové pravidlo (předpokládáme pouze EE + ionty) 3/ M+2 prvky: nejdříve určení počtu Cl+Br, pak odhad S+Si, kyslík nelze

Postup interpretace ESI/APCI spekter (pokr.) 4/ U techniky PLC/MS vždy ověřit, zda pozorované ionty patří do spektra daného píků a nepochází z šumu, paměťového efektu předchozích píků či vzorků, kontaminace zdroje nebo neidentifikovaných iontů eluujících se často v průběhu gradientu (zejména u gradientu s velkou strmostí) - rekonstrukcí iontových proudů pro jednotlivé m/z ověřit shodnost časových maxim a profilu píků, potvrzení náležitosti k píku či případné koeluce píků 5/ CID hmotnostní spektra 6/ Sumarizace všech získaných informací včetně informací o původu vzorku a dalších informací zadavatele, UV spekter změřených PDA detektorem, atd. pokus o návrh struktury (ne vždy se podaří) 7/ Je retenční chování sloučeniny v souladu s navrženou strukturou? 8/ V optimálním případě by na závěr mělo dojít k porovnání MS spekter a retenčního chování identického standardu navržené struktury a neznámé sloučeniny měřené za identických podmínek = jednoznačné potvrzení identity

Charakteristické fragmentační chování pro vybrané funkční skupiny v ESI/APCI spektrech

Sulfátová skupina -RS 3 [S 4 ] - m/z 97 - S 3 (- 80) S ESI - S - - 2 S 4 (- 98) -rozsáhlá fragmentace, typicky velmi nízká intenzita nebo absence [M-] - iontu -intenzivní adukty se sodným iontem

Sulfonové kyseliny -RS 3 Karboxylové kyseliny -RC S C - S 3 (- 80) S ESI - - S 2 (- 64) - C ESI - - [S 3 ] -. m/z 80 - C 2 (- 44)

itro - 2-2 (- 46) Azo - 2 Y + 14 Y Y - 14 - (- 16) - X - 14 X X + 14 - (- 30) - - 2 (- 28)

alogeny Cl, Br Cl 100% Poměr izotopů - Cl (- 36) 35 36 32% 37 m/z 35 Cl : 37 Cl = 3 : 1 n * Cl = (3a + b) n Br Poměr izotopů 79 Br : 81 Br = 1 : 1 - Br (- 80) 79 80 81 m/z n * Br = (a + b) n -pro polyhalogenované sloučeniny i opakovaná ztráta [M+-nX] +, což vede k výraznému poklesu [M+] +

Chinony a fenoly 2-2 (- 18) ESI + ESI - - -C (- 28) - C (- 28)

Alkoholy - typická ztráta vody [M+- 2 0] +, často velmi intenzivní a pozorovaná již v MS 1 spektrech; pro polyhydroxysloučeniny opakované ztráty vody, může výrazně poklesnout intenzita [M+] + až k nule, upřednostnění [M+a] + oproti [M+] + Ketony (R 1 CR 2 ) -analogicky α-štěpení u EI vznikají [R 1 C] + a [R 2 C] +, někdy též ztráta vody [M+- 2 0] + (obvykle velmi malá intenzita) Fenyl nebo alkyl substituce na aromatické nebo obecně cyklické struktuře -ztráta benzenu [M+-C 6 6 ] + nebo [M+-C 6 4 ] + pro fenyl -ztráta alkenu [M+-alken] +, méně často alkanu [M+-alkan] + pro alkyl -může být pozorováno už v MS 1, závisí na struktuře a podmínkách ionizace

Dusíkaté sloučeniny -dusíkové pravidlo; dusík je obvykle místem protonace Primární aminy -ztráta amoniaku [M+- 3 ] + (není příliš charakteristické) Sekundární a terciální aminy R 1 R 2 nebo R 1 R 2 R 3 -ionty typu [R 1 3 ] + a [R 2 3 ] + (na aminoskupině dochází obvykle k protonaci apřenosu vodíku), analogicky [R 1 2 R 2 ] + či [R 1 R 2 R 3 ] + ionty -vedle toho mohou být přítomny též ionty [R 1 ] + a [R 2 ] +, většinou méně intenzivní Kvartérní aminy (R) 4 + X - -vysoce stabilní ionty [(R) 4 ] + s vysokou ionizační účinností (např. tetrabutylamoniová ion-párová činidla), velmi silné paměťové efekty

Vliv funkčních skupin na fragmentaci Skupina -S 3 -S 3 -C - 2 -Cl -Br -= - -C - - Typické ionty [M-- 2 S 4 ] -, [M--S 3 ] -,[S 4 ] - [M--S 2 ] -, [M--S 3 ] -,[S 3 ] -. [M--C 2 ] - [M--] -, [M-- 2 ] -, [M--] - [M--Cl] - [M--Br] - [M-- 2 ] - [M--C] - [M-- 2 ] - Komentář Rozsáhlá fragmentace, typicky velmi nízká intenzita [M-] -, adukty se sodným iontem pakované ztráty pro polysulfonované kyseliny, adukty se sodným iontem C 2 je charakteristická první ztráta, pokud nejsou přítomny S 3 nebo S 3 skupiny Radikál-kation M -. může být pozorován místo [M-] -, dusíkové pravidlo Izotopické poměry ( 37 Cl: 35 Cl=3:1 nebo 79 Br: 81 Br=1:1), pro polyhalogenované sloučeniny - následné ztráty Cl/Br a snížená intenzita [M-] - iontu Štěpení vedle azo vazby, přesmyková ztráta 2 z azo skupiny Přesmyková ztráta C pro chinony a fenoly, ztráta vody pro fenoly a alkoholy

ESI-MS of Reactive Black 5 2 3 SC 2 C 2 2 S S 2 C 2 C 2 S 3 3 S S 3-2 sulfate -2 sulfonic groups -2 azo groups -1 hydroxylgroup -1 amino group MW=901 [M-2] 2- = 449.5

egative-ion ESI MS/MS of Mordant Black 15 MW = 389-1 sulfonic acid -1 nitro group -1 azo group -2 hydroxyls

ESI MS/MS of Mordant Red 8 C 2 376 -C 2 332 S 3 MW = 613-1 sulfonic acid -1 carboxylic acid -1 nitro group -C 2-2 azo groups -2 hydroxyl groups -S 3 -S 3 -C 2 -C 2

APCI-MS of Polyaromatic Compounds (-(7-benz[de]anthracen-7-on-3-yl)-3-brompropanamide) MW=379 -Br -C

100% PLC/MS of C.I. Acid Red 118 Impurity 8.00 Acid Red 118 12.72 UV chromatogram Int. Time [min] egative-ion ESI-MS of impurity [M-] - egative-ion ESI-MS of Acid Red 118 [M-]- MW=512 MW=28 MW=540

PLC/MS/MS of C.I. Acid Red 118 and Impurity -S 2 (186) 250 2 IDETICAL 3 C 2 S C 2 C 3 355-2 (327) -S 3 (275) 237 459 S 3-80 -S 2 (186) 250 2 IDETICAL m/z=28 3 C 2 S 355-2 (327) -S 3 (275) 237 431 S 3-80

Identification of dimefluron metabolites Dimefluron (DMF) 3,9-dimethoxy-5-(2-dimethylaminoethoxy)- -7-benzo[c]fluoren-7-one hydrochloride C 3 3 C 3 C C 3 potential antineoplastic agent samples: rat faeces

DMF 3 C C 3 3 C C 3 3 C I.S. C 3 C 3 C 3 1 2 3 C 3 C C 3 3,9--desmethyl DMF 3 C C 3 3--desmethyl DMF 4 3 C 5 3 C C 3 3 C -desmethyl DMF C 3 3 C C 3 DMF -oxide 3 C 3 3 C C 3 9--desmethyl DMF 6 3 C C 3 3 C C 3 reduced DMF

ESI-MS and MS n DMF positive ion ESI-MS [M+] + egative ion ESI-MS -no signal MW = 377 3 C C 3 3 C C 3 MS 2 (378) MS 3 (378-333) [378-C 3 C 3 ] + [333-C] + [333-2 ] + 378

ESI-MS and MS n 9-- or 3--desmethyl DMF (MW = 363) positive-ion ESI-MS negative-ion ESI-MS [M+] + [M-] - [M+a] + [M+K] + [2M-] - MS 2 (364) [364-C 3 C 3 ] + [362-(C 3 ) 2 C 2 C 2 ] - [362-(C 3 ) 2 ] - 364 similar spectra for 3,9--desmethyl DMF (MW = 349)

ESI-MS and MS n positive-ion ESI-MS [M+] + -desmethyl DMF (MW = 363) C 3 3 C 3 C [2M+] + MS 2 (364) [364-C 3 2 ] + [364-C 3 CC 2 ] + negative-ion ESI-MS no signal 364

Standards ESI + ESI - 1 1 PLC/ESI-MS 3-- 3,9-- 9-- 3 2 reduced 2 6 DMF 8 7 I.S. 4 5 -desmethyl -oxide 1 - MW = 349 2 - MW = 363 3 - MW = 363 4 - MW = 379 5 - MW = 363 6 - MW = 393 7 - MW = 377 8 - MW = 391 3 6 Mobile phase: 40-80% A in 20 min (A-acetonitrile, B-buffer C 3 C 4 p=3). Column: Supelco Discovery, 250x4mm; F=1ml/min, T=30 C.

PLC/ESI-MS Samples ESI + 7 8 ESI - 16.6 min 1 3 2 6 4 5 1 3 2 II. phase metabolites ions: [M+a] +, [M- 2 +] + etc.; even MW adducts with glycine or glucuronic acid I. phase metabolites from t r = 16 min

ESI + PLC/ESI-MS and MS n DMF 7 I.S. 8 1 3-- 3,9-- 9-- 3 2 reduced 6 -desmethyl -oxide 4 5

[M+] + 9 MW = 397 (C 3 ) 2-45 derived from standard 2 or 3 + chlorine 3 C Cl 3 C C 3 Cl -36 3- or 9-- desmethyl DMF 7 DMF 8 I.S. 3,9-- 3-- 9-- 1 3 2 reduced 6 -desmethyl -oxide 4 5

derived from standard 4 [M+] + 10 MW = 349 2 C 3-31 C 2 CC3-57 C 2 C 3-43 3 C 7 DMF 8 3 C 3--desmethyl -desmethyl DMF I.S. 3,9-- 3-- 9-- 1 3 2 9 reduced 6 -desmethyl -oxide 4 5

[M+] + [M+] + 11 MW = 349 2 C 3-31 C 2 CC3-57 C 2 C 3-43 derived fromstandard 4 C 3 7 DMF 8 3 C 9--desmethyl -desmethyl DMF I.S. 3,9-- 3-- 9-- 1 3 10 2 9 reduced 6 -desmethyl -oxide 4 5

[M+] + derived fromstandard 4 C 3 [M+] + 13 MW = 379 2 C 3-31 C 2 CC3-57 C 2 C 3-43 3 C C 3 -methyl reduced -desmethyl DMF 7 DMF 8 3 C I.S. 3,9-- 3-- 9-- 1 3 11 10 2 9 reduced 6 -desmethyl -oxide 4 5

[M+] + st. 3 12 MW = 393 derived fromdmf + (signal in negative) C 3 3 C [M+] + C 3 C 3-45 3 C 7 DMF 8 I.S. C 3 3,9-- 3-- 9-- 1 3 13 11 10 2 9 reduced 6 -desmethyl -oxide 4 5

[M+] + 14, 15 MW = 365 C 2 CC 3-57 3 C positional isomers 3 C C 3 C 2-30 C 2 C 3-43 2-18 reduced 3--desmethyl DMF 7 DMF 8 C 3 3 C C 3 I.S. reduced 9--desmethyl DMF 1 13 11 3-- 3,9-- 9-- 3 12 10 2 9 reduced 6 -desmethyl -oxide 4 5

UV spectra DMF C 3 Reduced DMF C 3 3 C 3 C C 3 3 C 3 C C 3 mau 1000 mau 1500 800 600 1000 400 200 500 200 250 300 350 nm 200 250 300 350 nm

I. Phase Metabolites of Dimefluron C 3 C 3 3 C C 3 3 C C 3 3 C C 3 3,9--desmethyl DMF 9--desmethyl DMF reduced 9--desmethyl DMF C 3 C 3 3 C 3 C C 3 3 C 3 C C 3 3 C 3 C C 3 3--desmethyl DMF DMF reduced DMF C 3 C 3 3 C 3 C C 3 3 C 3 C 3 C 3 C C 3 reduced 3--desmethyl DMF -desmethyl DMF C 3 DMF -oxide C 3 3 C 3 C 3--desmethyl -desmethyl DMF 3 C 9--desmethyl -desmethyl DMF 3 C 3 C reduced -desmethyldmf

Biomolekuly a/ peptidy b/ proteiny c/ nukleotidy

ESI MS/MS analýza peptidů Schéma značení fragmentových iontů peptidů z 3 y 3 x 3 z 2 x 2 y 1 y 2 z 1 x 1 R1 R2 R3 R4 2 C C C C C C C C a 1 b 1 c 1 a 2 c 2 a 3 b 3 b 2 c 3

Typy fragmentových iontů ve spektrech peptidů 2 R1 C C + R2 C + C R3 C C R4 C C 2 R1 a 2 x 2 d 2 C C CR' C + 2 R1 C C R2 + C C + 3 R3 C C R4 C C C C R4 C + C b 2 y 2 v 2 2 R1 C C R2 C C + 3 R3 C + C R4 C C CR' C C R4 C C + c 2 z 2 w 2 -terminální fragmenty: a, b, c, d C-terminální fragmenty: x, y, z, v, w

Tvorba iontů typu b a y ve spektrech peptidů Ionty typu b a y jsou většinou nejintenzivnější ionty v ESI-MS/MS spektrech peptidů podle nich můžeme určit sekvenci aminokyselin

ESI-MS/MS spektrum peptidu Série iontů typu b a y

ESI analýza proteinů Příklad lysozym s MW = 17825 Da Příklad výpočtu MW a počtu nábojů (řešení 2 rovnic o 2 neznámých) Experimentálně určeno m/z dvou iontů A (1049.8) a B (991.5) A = 1049.8 = (MW + z) / z B = 991.5 = (MW + z + 1) / (z + 1) - řešením vyjde z = 16.99 = 17 (náboj musí být celočíselná hodnota) - nyní přiřazení náboje všech iontům a výpočet MW z identifikovaných iontů, např.: A: MW = 1049.8 * 17 17 = 17829.6 B: MW = 991.5 * 18 18 = 17829.0, atd. - pak zprůměrování a výpočet MW (tzv. dekonvoluce), vše automaticky softwarově

PLC/MS analýza proteinů (zjištění koeluce píků dekonvolucí) Určení M R proteinů: - řešení dvou rovnic o dvou neznámých: (m/z) 1 = (M R + z) / z (m/z) 2 = (M R + z+1) / (z+1) Ionty typu [M+x] x+ -(m/z) 1 a (m/z) 2 jsou exp. hodnoty, řešením rovnic nejdříve určíme náboj z, pak dopočteme M R -v praxi automaticky softwarově (dekonvoluce)

omenklatura fragmentace nukleotidů

PLC/APCI-MS analýza syntetických polymerů Ethoxylované alkoholy C12, C14, C16 a C18 PLC gradientová eluce v systémech s obrácenými i normálními fázemi APCI kladných iontů pouze [M+] + ionty a méně intenzivní [M+a] + a [M+K] +, fragmentové ionty chybí (platí pro řadu syntetických polymerů, např. PEG, PPG, kopolymery E a P, atd.) ESI kladných iontů spíše [M+a] + nebo [M+K] + ;[M+] + může chybět, fragmenty nejsou MS/MS nebo in-source CID MS fragmenty lišící se počtem ztrát ethoxyskupin (diference 44) RIC zvolených [M+] + při APCI

PLC/APCI-MS analýza syntetických polymerů Kopolymery oxyethylenu (E) a oxypropylenu (P) typ (P) y1 (E) x (P) y2 (ovanik) typ (E) x1 (P) y (E) X2 (Slovanik) PLC (TIC) APCI-MS kopolymeru bez PLC PLC (RIC) P=2 E

Strukturní analýza organocíničitých sloučenin (organokovových) % (rel.) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1,0 Izotopy cínu 0,7 0,4 14,5 7,7 24,2 8,6 32,6 4,6 5,8 112 115 118 120 124 m/z -kovy mají často charakteristické izotopické distribuce = pomůcka při interpretaci

Základní mechanismy vzniku iontů organocíničitých sloučenin 1. AB [A] + + [B] - -hlavní mechanismum pozorovaný pro velkou většinu sloučenin -nejlabilnější vazba Sn X nebo Sn se štěpí nejdříve 2. M + a + [M+a] + nebo M + K + [M+K] + -méně důležité, objevuje se zejména v případě absence labilní Sn X vazby -závisí na koncentraci solí v roztoku, nižší intenzity oproti prvnímu mechanismu 3. M + + [M+] + -na rozdíl od běžných organických sloučenin je pozorováno vzácně a s velmi nízkou intenzitou

Příklad základních mechanismů vzniku iontů Int. 6*10 3 [M+a] + [M+K] + R 1 X 1 =X 2 =X 3 =fenyl X 1 Sn X 2 X 3 R 2 R 1 =R 2 =(C 3 ) 3 C Int. 5*10 6 X 1 =X 2 =fenyl X 3 =Cl [M-Cl- 2x isobuten] + [M-Cl-isobuten] + [M-Cl] + [M-Cl-ethen] +

% 100 80 60 40 20 0 ESI-MS kladných iontů teor. exp. 461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 m/z Sn m/z 465 [C 24 29 2 Sn] + [Cat] +

ESI-MS/MS kladných iontů MS MS 2 m/z 465 [C 24 29 2 Sn] + [Cat] + [Cat-C 6 6 -C 3 =C 2 ] + [Cat-C 6 6 -C 3 C 3 -C 3 =C 2 ] + [Cat-C 6 6 ] + Sn [Cat-C 6 6 -Sn-C 3 =C 2 ] + [Cat] + [Cat-C 6 6 -Sn-C 3 =C 2 (C 3 ) 2 C 2 ] + [Cat-C 3 C 3 ] + [Cat-C 6 6 -Sn] + [Cat-C 6 6 -Sn-C 3 =C 2 -C 3 C 3 ] +

Fragmentační schéma kationické části m/z 465 m/z 387 m/z 344 Sn - C 6 6 - C 3 =C 2 Sn Sn - C 3 C 3 - C 3 C 3 - Sn m/z 299 - Sn m/z 420 m/z 267 m/z 224 Sn - C 3 =C 2 - C 3 C 3 - C 3 C 3 m/z 179 - C 3 =C 2 m/z 375 m/z 166 - C 3. m/z 181 Potvrzení návrhů fragmentace deuterovanými standardy

neznačený m/z 465 D m/z 475 Sn MS 2 m/z 465 MS 2 m/z 475 D Sn D D D D D D D D značený +10 [Cat-C 6 6 -C 3 C 3 - [Cat-C 6 D 5 -C 3 DC 3 - C 3 =C 2 ] + C 3 =C 2 ] + [Cat-C 6 6 ] + [Cat] + +4 +5 +5 +5 +4 +5 [Cat- C 6 D 5 ] + +5 +10 +10 [Cat] +

a/ Alifatické polynitráty používané jako výbušniny (estery kyseliny dusičné, R 2 ) b/ (Poly)sulfatované sloučeniny (estery kyseliny sírové, RS 3 ) c/ ěkteré organokovové sloučeniny... Absence iontů (de)protonované molekuly v ESI/APCI spektrech

Analýza alifatických nitrátů (výbušniny) -bez aditiv v mobilní fázi obvykle absence kvazimolekulárních iontů, pozorovány buď strukturně bezcenné fragmenty (např. 2, 3 ) nebo obtížně intepretovatelné adukty -přídavek CCl 4 (nebo halogenidu či octanu) do MF preferenční a velmi charakteristická tvorba aduktů, např. [M+Cl] +

Přítomnost iontů s lichým počtem elektronů v ESI/APCI spektrech -pro tvorbu radikál-iontů je příznivý (poly)aromatický systém s možností delokalizace e - nebo přítomnost kovového iontu s více oxidačními stavy a/ itrované sloučeniny (záchyt e - při záznamu záporných iontů) b/ Polyaromatické sloučeniny c/ ěkteré organokovové sloučeniny (např. Fe 3+ /Fe 2+ ) d/ Perhalogenované sloučeniny e/ ěkteré fragmenty (zejména ztráta bočního řetězce z cyklického systému)...

Vznik M -. iontů záchytem e - při APCI- -závěry z měření série 13 součenin s různým typem R (alkyl, aryl) 2 S C R S C R -M - ion 100%, [M-] - není pozorován -ionty M - a [M-] - jsou v poměru cca 1:1, pokles celkové intenzity 3 S S C R -ion M - zmizel, pozorován pouze [M-] - ion, nárůst intenzity

Vliv složení mobilní fáze a konstrukce iontového zdroje na odezvu v API-MS

Volba rozpouštědel pro analýzu v API-MS Vždy nejvyšší možná čistota rozpouštědel (pro PLC nebo PLC-gradient) i aditiv, redestilovanou vodu neskladovat (nejméně každý druhý den čistou, pokud není ve směsi s organickým rozpouštědlem), odvzdušnit, filtrace. 1/ Přímá infúze vzorku -lze si zvolit nezávisle rozpouštědla podle rozpustnosti a maximální odezvy v ESI nebo APCI - větší riziko matričních efektů a potlačení odezvy ( ion-suppresion ) 2/ PLC/MS - podmínky jsou diktovány požadavky chromatografie -v případě nutnosti lze použít postkolonový přídavek vhodného eluentu či aditiva T-kusem pro zlepšení odezvy (příspěvek k mrtvému objemu systému = může mít vliv na rozlišení)

Volba rozpouštědel: 1/ přímá infúze vzorku Standardní podmínky - pokud není problém s rozpustností, tak volíme přibližně 50 100% methanolu nebo acetonitrilu s vodou - více než 90% aplikací Problémy s rozpustností -v závislosti na polaritě a MW volíme rozpouštědlo: - (100% voda), aceton, 2-propanol, směs s nepolárními rozpouštědly (např. hexan, heptan, benzen, toluen, chlorovaná rozpouštědla), dioxan, dimethylsulfoxid (DMS), dimethyformamid (DMFA) - pokud lze nalézt jiné řešení, snažit se vyhnout aromatickým a halogenovaným rozpouštědlům a zejména DMS a DMFA - v principu lze měřit i v 100% DMFA či DMS (doporučuji opatrnost, nepoužívat dlouho a raději naředit s méně agresivním rozpouštědlem) Problémy se stabilitou - bezvodé prostředí kvůli hydrolýze, bez alkoholu kvůli reesterifikaci - v mezních případech lze měřit v atmosféře pod dusíkem či argonem

Volba rozpouštědel: 2/ PLC/MS RP-PLC (systémy s obrácenými fázemi) - nejběžnější, obvykle vodný methanol nebo acetonitril (ideální pro API- MS), lze i ethanol, 2-propanol, atd. -nejlepší odezva obvykle při vysoké koncentraci organického rozpouštědla cca 70 90% (nemusí platit univerzálně) -při vysokém až 100% obsahu vody zvýšit průtok a teplotu sušícího a zmlžujícího plynu (nižší citlivost) -100% acetonitril při APCI vyžaduje častější čištění výbojové elektrody (tvorba grafitického uhlíku na elektrodě) P-PLC (systémy s normálními fázemi) - většinou špatně kompatibilní s ESI, lepší kompatibilita s APCI - v mobilní fázi musí být určitý obsah (>5%) proton-donorního rozpouštědla, např. 2-propanol; ve 100% hexanu nelze signál získat - snaha vyhnout se halogenovaným rozpouštědlům (C 2 Cl 2, C 3 Cl, CCl 4 ) kvůli zvýšené kontaminaci a zhoršení stability signálu - u P-PLC může být užitečný přídavek vhodného eluentu (např. 2- propanol, popř. s kyselinou octovou či mravenčí) za kolonou T-kusem

Porovnání ESI-MS spekter měřených: a) přímou infúzí vzorku -ionty nečistot (zejména nízké m/z), vysoká intenzita aduktových sodných iontů kvůli zasolení vzorku b) PLC/MS -minimální intenzita aduktových sodných iontů (soli eluují v mrtvém objemu systému), posun distribuce [M-x] x- k nižším nábojům v důsledku tvorby aduktů s ion-párovým činidlem v mobilní fázi Vzorek: tetrasulfonované azobarvivo, M R = 1222 Da a) b)

Metodika měření vlivu aditiv na ESI odezvu 10 µl vzorku v50% AC/W Intens. x 10 7 0.8 0.6 a/ 30 SCAS EIC 207 100% Infúzní pumpa 10 µl/min 50% AC/W Dávkovací smyčka 0.4 0.2 0.0 Bez aditiv (3 ) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Time [min] MS Intens. x 10 7 0.8 b/ +2.5 mm DAA (3 ) EIC 207 1) Pokles odezvy odpovídá výhradně přidanému ion-párovému činidlu. 2) Metoda je robustní a spolehlivá. 3) Minimální kontaminace systému. 4) Porovnání různých přístrojů a geometrií. 0.6 0.4 0.2 0.0 30 SCAS 28% 0.5 1.0 1.5 2.0 Time [min]

Vliv koncentrace aditiv na ESI odezvu Pokles na 20-30% odezvy při nejnižší chromatograficky použitelné koncentraci! Relative response [%] 100 80 60 40 20 2.5 mm DAA 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 Concentration of DAA [mmol/l] A/ B/ C/ Testovací látky: A/ C/ 3 S S 3 S 3 B/ 3 S 3 S S 3 2 S 3 Relative response [%] 100 80 60 40 20 ctan amonný 5 mm A/ B/ C/ 0 0 5 10 15 20 Concentration of ammonium acetate [mmol/l]

Relativní odezvy sulfonových kyselin (+ 2.5 mm alkylamonium acetátů) Relative res pons e [%] 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 DPAA TEAA DBAA TPAA DAA TBAA TeBAA TeBAS (6) (6) (8) (9) (12) (12) (12) (12) Ion-pairing agent Látka A (1*sulfo) Látka B (2*sulfo) Látka C (4*sulfo)

Typy geometrií iontového zdroje A/ B/ A/ lineární B/ lineární mimo osu C/ úhel 45 stupňů D/ úhel 90 stupňů (orthogonální) E/ dvakrát zalomení 90 stupňů (Z-sprej) C/ E/ D/

A A A A K K A K A K K K A K MS ESI rthogonální konstrukce iontového zdroje

Vliv geometrie iontového zdroje na ESI odezvu -pro všech 50 bodů kromě 1 platí: Z-sprej < orthogonální < lineární -přístroje od 1 výrobce (č. 3 a 4) dávají velmi podobné výsledky = nejde pouze o vliv úhlu elektrospreje, ale o celkové uspořádání přístroje 1/ Z-sprej Q 2/ orthogonální IT 3/ orthogonální Q 4/ lineární IT 5/ lineární Q Relative response [%] Relative response [%] 60 40 20 DAA 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 90 60 30 2.5 mm Concentration of DAA [mmol/l] ctan amonný 5 mm 1 2 3 4 5 0 0 5 10 Concentration of ammonium acetate [mmol/l] 1 2 3 4 5

Soupeření o náboj mezi 2 sulfokyselinami Princip: a) odezva čisté ( cílové ) sloučeniny = 100% (koncentrace 3 mg/l) b) kontaminující sloučenina druhého barviva je přidána do roztoku v definovaném molárním poměru a změřena odezva cílové sloučeniny, jejíž koncentrace je konstantní c) cílová a kontaminující sloučenina se vymění, stejný postup S 3 100 Relative response [%] 80 60 40 20 2 MW = 451 C.I. Acid Blue 40 S 3 CC 3 0 0 10 20 30 40 50 MW = 353 C.I. Acid Yellow 36 Concentration ratio

Závěr Aditiva, která lze použít v PLC/MS Kyseliny: mravenčí, octová, trifluoroctová není příliš vhodná (liší se podle typu analytu) koncentrace co nejnižší, obvykle 0.01 0.1% Báze: hydroxid amonný, triethylamin Soli: octan amonný, octan mravenčí, apod. koncentrace 5 10 mm Aditiva nevhodná pro PLC/MS Cokoliv netěkavého nebo v příliš vysoké koncentraci, např. fosfátový nebo borátový pufr, anorganické kyseliny a báze, tetralkylamoniová ionpárová činidla, cyklodextriny, apod. Konstrukce iontového zdroje Při použití iontových aditiv důležité použití lomených geometrií

Literatura a další informace Interpretace EI spekter (+ spousta dalších): -F.W. McLafferty, F. Tureček, Interpretation of Mass Spectra, Fourth Edition, University Science Books, Mill Valey, CA, USA, 1993 -T.A. Lee, A Beginner s Guide to Mass Spectral Interpretation, J. Wiley&Sons, Chichester, 1998. motnostnostní spektrometrie v češtině (a zdarma): - http://user.upce.cz/~holcapek/ -PDF reprinty článků, přednášek a posterů, předmět motnostní spektrometrie v organické analýze, MS webové odkazy - http://ms.biomed.cas.cz/ -doc. avlíček, plná verze přednášek ze 7. Školy MS na Červenohorském sedle -M. olčapek (editor), Spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (PLC/MS), Univerzita Pardubice, 2001. Konference: -3. ročník školy PLC/MS, 30.8.-4.9.2005, hotel JEF Doubice v Českém Švýcarsku - hlavním tématem bude interpretace hmotnostních spekter -17 th International Mass Spectrometry Conference, Praha, srpen 2006, http://www.imsc2006.org/