ANTIMIKROBIÁLNÍ ÚČINKY ROSTLINNÝCH EXTRAKTŮ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY ANTIMIKROBIÁLNÍ ÚČINKY ROSTLINNÝCH EXTRAKTŮ ANTIMICROBIAL EFFECT OF PLANT EXTRACTS BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR S THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR PATRIK KONDERLA RNDr. MÁRIA VESELÁ, Ph.D. BRNO 2015

ABSTRAKT Cílem této bakalářské práce bylo zkoumání možné antimikrobiální aktivity různých extraktů šípkových čajů a také stanovení antioxidační aktivity a koncentrace biologicky aktivních látek (polyfenolů a flavonoidů) těchto čajů. V teoretické části byly shrnuty základní informace o rostlině růži šípkové a chemickém složení jejich plodů, přehled přírodních biologicky účinných látek a obecné rozdělení čajů. Praktická část je zaměřena na stanovení antimikrobiální aktivity čajových extraktů proti bakteriálním kmenům Serratia marcescens a Bacillus subtilis a také spektrofotometrické stanovení koncentrace polyfenolů, flavonoidů a celková antioxidační aktivity těchto extraktů. Z výsledků vyplývá, že vodné extrakty šípkových čajů mají jistou mikrobiální aktivitu. Rovněž bylo zjištěno, že tyto extrakty mají vysoký obsah polyfenolických a flavonoidových látek. ABSTRACT The purpose of this bachelor thesis was to research the possible antimicrobial activity of various extracts of rosehip tea and also determine the antioxidant activity and the concentration of biologically active compounds (polyphenols and flavonoids) in these tea. Teoretical part describes basic information about plant Rosa canina and chemical composition of rosehips, summary of the natural biologically active compounds and general classification of tea. The practical part is focused on detection of antimicrobial activity of tea extracts against bacterial strains Serratia marcescens and Bacillus subtilis as well as spectrophotometrical determination of concentration polyphenols, flavonoids and overall antioxidant activity of these extracts. From the results flow the testing aqueous extracts rosehips tea analysed antimicrobial effects. Also was found, that these extracts has high content of polyphenols and flavonoids. KLÍČOVÁ SLOVA Růže šípková, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, rostlinné extrakty, čaj, antimikrobiální aktivita, antioxidační aktivita KEYWORDS Rosa canina, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, plant extracts, tea, antimicrobial activity, antioxidant activity 3

KONDERLA, P. Antimikrobiální účinky rostlinných extraktů. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2015. 45 s. Vedoucí bakalářské práce RNDr. Mária Veselá, Ph.D.. PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citoval. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana FCH VUT.... podpis studenta Poděkování: Rád bych poděkoval mé vedoucí práce paní RNDr. Márii Veselé, Ph.D. za odborné vedení, trpělivost a čas, který mi věnovala při řešení této bakalářské práce. 4

OBSAH 1 ÚVOD... 7 2 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY... 8 2.1 Popis přírodních účinných látek... 8 2.2 Charakteristika přírodních látek s antimikrobiálními účinky... 8 2.2.1 Fenoly, polyfenoly a fenolové kyseliny... 8 2.2.2 Flavonoidy... 9 2.2.3 Chinony... 9 2.2.4 Třísloviny... 9 2.2.5 Silice... 10 2.2.6 Terpeny, terpenoidy... 10 2.2.7 Alkaloidy... 10 2.3 Čaje zdroj přírodních antimikrobiálních látek... 11 2.3.1 Chemické složení čaje... 11 2.4 Rozdělení čajů... 12 2.4.1 Nefermentované čaje... 12 2.4.2 Částečně fermentované čaje... 12 2.4.3 Fermentované čaje... 13 2.5 Šípek... 13 2.5.1 Botanický popis... 13 2.5.2 Chemické složení plodu Růže šípkové... 14 2.5.3 Šípkový čaj... 14 2.6 Čajová směs... 14 2.6.1 Aronie... 14 2.6.2 Černý rybíz... 15 2.7 Metody získávání rostlinných extraktů... 15 2.7.1 Konvenční extrakční techniky... 15 2.7.2 Nekonvenčí extrakční techniky... 16 2.8 Mikrobiologické metody... 18 2.8.1 Difuzní stanovení antimikrobiální aktivity... 18 5

2.9 Antioxidační systémy... 19 2.9.1 Stanovení celkového obsahu polyfenolů... 19 2.9.2 Stanovení celkového obsahu flavonoidů... 20 2.9.3 Stanovení celkové antioxidační aktivity rostlinného materiálu... 20 3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 21 3.1 Seznam použitých přístrojů... 21 3.2 Seznam použitých chemikálií... 21 3.3 Použitý software... 21 3.4 Charakteristika použitých mikroorganismů... 21 3.4.1 Serratia marcescens... 22 3.4.2 Bacillus subtilis... 22 3.5 Vzorky čajů podrobené analýze... 22 3.6 Kultivační media a jejich příprava... 23 3.7 Příprava macerátů... 24 3.8 Příprava výluhů... 24 3.9 Ověření antimikrobiálních účinků šípkových čajů... 24 3.10 Stanovení celkových polyfenolů... 25 3.11 Stanovení celkových flavonoidů... 26 3.12 Stanovení celkové antioxidační aktivity... 27 4 VÝSLEDKY A DISKUZE... 29 4.1 Stanovení celkového obsahu polyfenolů... 29 4.2 Stanovení celkového obsahu flavonoidů... 30 4.3 Stanovení celkové antioxidační aktivity... 31 4.4 Antimikrobiální účinky extraktů... 33 4.4.1 Inhibiční účinek extraktů macerátů... 33 4.4.2 Inhibiční účinek extraktů výluhů... 36 5 ZÁVĚR... 39 6 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ... 40 7 ZDROJE... 41 6

1 ÚVOD Díky stále větší dostupnosti dat o zdravé výživě, silně stoupá spotřebitelská poptávka po bezpečných a kvalitních potravinách. Také se zvyšují obavy ohledně bezpečnosti potravin, zapříčiněné nárůstem výskytu nemocí způsobených patogenními mikroorganismy v potravinách, u kterých v poslední době stoupá odolnost vůči syntetickým konzervantům. To vyvolává nedůvěru v používání těchto konzervantů a umělých antimikrobiálních látek k inaktivaci a inhibici růstu patogenních mikroorganismů.[2] V důsledku toho se pozornost obrací k přírodním antimikrobiálním látkám. Přírodní antimikrobiální látky jsou extrahovány především z rostlinných, ale také z živočišných a mikrobiálních zdrojů. Mají značný potenciál pro využití v technologii uchovávání potravin. Léčivé účinky rostlin jsou známy velmi dlouho. Již v dávné minulosti se rostliny používaly jako léčivé přípravky nebo konzervační látky. Přestože antimikrobiální mechanismy těchto látek nejsou zcela známy, roste snaha vyvinout nové účinné metody, které využívají těchto látek ke zvýšení bezpečnosti potravin.[1] Zájem o výzkum antimikrobiálních vlastností přírodních látek v posledních letech také stoupá z důvodu narůstající rezistence mikroorganismů k používaným antibiotikům. Přírodní látky jsou preferovány pro jejich minimální toxicitu, minimální vedlejší účinky, dobrou dostupnost a lepší odbouratelnost ve srovnání s antibiotiky. Také přidáním některých přírodních látek do antibiotik se dá jejich účinnost mnohonásobně zesílit.[2][4] Využívají se jak extrakty z rostlin, tak i jednotlivé složky, které tyto extrakty obsahují. Rostlinné extrakty se získávají pomocí maceračních, destilačních nebo odpařovacích technik.[4] Cílem předložené práce je testování možné antimikrobiální aktivity, rostlinných extraktů výluhů a macerátů, čajových přípravků z plodů růže šípkové na mikroorganismy Serratia marcescens a Bacillus subtilis. Dále také stanovení hlavních složek s antioxidační aktivitou obsažených v použitých čajích a diskuze vlivu těchto látek na antimikrobiální aktivitu. 7

2 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 2.1 Popis přírodních účinných látek Hledání léčivých a konzervačních prostředků z rostlin má velmi dlouhou tradici. Většina rostlin má schopnost vytvářet různé chemické látky, které určitými mechanismy ovlivňují živé organismy. Tyto látky rostliny využívají při obraně proti mikroorganismům, hmyzím škůdcům i býložravcům. Mezi nejvýznamnější skupinu těchto látek patří fenolické a polyfenolické sloučeniny. Tyto chemické sloučeniny mají často také vliv na rostlinnou vůni či zbarvení jako například kapsaicin což je terpenoid obsažený v chilli papričkách. Tato látka je zodpovědná za charakteristickou pálivou chuť chilli papriček. Některé z těchto rostlinných látek mohou mít také léčivé nebo konzervační účinky.[6] Účinné složky mohou být obsaženy v celé rostlině, nebo jen v některé z jejích částí. Nacházejí se v nadzemní části, jako jsou nať, květy, listy, lodyha, pupen, semeno a také podzemní části: kořen, oddenek, hlíza.[5] Účinnost přírodních látek je ovlivněna složením a strukturou daných sloučenin, dále funkčními skupinami a také možnými synergickými nebo antagonickými interakcemi těchto komponent.[7] Mechanismus účinku přírodních látek není zcela znám, nicméně studie dokazují, že terpenoidy a fenoly narušují membrány mikroorganismů a například alkaloidy mají vliv na změny genetického materiálu mikroorganismů. Terpeny také zasahují do enzymatických pochodů buňky tím, že potlačují enzymatickou aktivitu nebo úplně zastavují produkci enzymů a tím může dojít k smrti bakteriální buňky. Některé sekundární metabolity rostlin působí jako vypínače, interferují totiž s translokací protonů přes membránové váčky a tak blokují fosforylaci adenosin-difosfátu jakožto primárního energetického metabolismu. Účinnost antimikrobiálních sloučenin je závislá na hodnotě ph, typu potraviny a počtu kontaminujících mikroorganismů.[4][16] 2.2 Charakteristika přírodních látek s antimikrobiálními účinky 2.2.1 Fenoly, polyfenoly a fenolové kyseliny Fenoly jsou alkoholy, které lze charakterizovat jako látky obsahující jedno nebo více aromatických jader substituovanými hydroxylovými skupinami. Jejich nejjednodušším zástupcem je fenol. K nejvýznamnějším fenolům patří eugenol ze silice hřebíčkové (Oleum caryophylli), thymol ze silice tymiánové (Oleum thymi) a karvakrol ze silice kmínové (Oleum carvi). Fenolické étery jsou např. anetol z plodů anýzu a fenyklu a safrol ze silice badyánové (Oleum anisi stellati).[6][17] Polyfenolové sloučeniny jsou významnou skupinou přírodních látek a jsou obsaženy téměř ve všech vyšších rostlinách. Jedná se o velice obsáhlou skupinu látek, do které patří několik tisíc strukturně velmi různorodých fenolových sloučenin. Polyfenolové látky jsou známé svou vysokou antioxidační a antimikrobiální aktivitu, což dokazuje mnoho studií.[9][17] 8

Poloha a počet hydroxylových skupin ve fenolické struktuře úzce souvisí s antimikrobiální aktivitou. Studie ovšem dokazují, že s přibývajícím počtem hydroxylových skupin se zvyšuje také toxicita těchto sloučenin.[6] 2.2.2 Flavonoidy Flavonoidy tvoří majoritní podíl všech v přírodě se vyskytujících se polyfenolických látek a jsou jednou z nejsledovanějších skupin přírodních látek s antimikrobiální aktivitou. Z chemického hlediska jsou flavonoidy hydroxylované, aromatické, fenolické sloučeniny, jejichž základem je heterocyklická sloučenina flavan, která je tvořena dvěma benzenovými kruhy spojenými heterocyklickým pyranem. Flavonoidy jsou sloučeniny s vysokou antioxidační aktivitou. Na antioxidační účinnost flavonoidů má největší vliv poloha a počet hydroxylových skupin v molekule.[20][21] Předpokládá se, že antimikrobiální aktivitu flavonoidů způsobuje schopnost interakce těchto látek s extracelulárními proteiny v buněčné stěně mikroorganismu, což vede k degradaci buněčné stěny. Lipofilní flavonoidy také mohou rozrušovat cytoplazmatickou membránu mikroorganismů.[6] Nejznámějším flavonoidem je netoxický rutin, který má určitý antimikrobiální význam v zažívacím traktu. Významnými flavonoidy jsou glykosidy morin, quercetin a kemferol. Především quercetin vykazuje silné inhibiční účinky proti Salmonella enteritidis a Bacillus cereus.[18][19] Do skupiny flavonoidů patří také katechiny, které jsou hlavní složkou čajových lístků. Katechiny inhibují růst mikroorganismů a vykazují také dobré výsledky při prevenci některých generačních chorob.[6] 2.2.3 Chinony Chinony jsou nejrozšířenější skupinou přírodních barviv. Chemicky se jedná o deriváty benzochinonů, naftochinonů a antrachinonů.[5] Jsou to aromatické sloučeniny se dvěma oxo skupinami v poloze para, formálně odvozeny od difenolů oxidací příslušných hydroxylových skupin. Chinony jsou vysoce reaktivní sloučeniny. V mikrobiální buňce tvoří ireverzibilní komplexy s nukleofilními aminokyselinami, což má za následek inaktivaci proteinů a ztrátu jejich funkce. Pravděpodobně reagují také s povrchovými adhezidy, polypeptidy buněčné stěny a enzymy vázanými na membránách.[6] 2.2.4 Třísloviny Třísloviny neboli taniny jsou látky známe svou trpkou svíravou chutí. Vyskytují se především v kůře a ovoci celé řady rostlin, především v kůře různých dubů. Chemicky jsou taniny heterogenní a komplexní směs. Třísloviny se obvykle dělí na dvě skupiny: (a) deriváty flavanolů, tzv. kondenzované třísloviny a (b) hydrolyzovatelné třísloviny (významnější skupina), které jsou estery sacharidů, obvykle glukosy, s jednou nebo více molekul kyseliny trihydroxybenzenkarboxylové 9

(gallové), či jejím dimerem kyseliny ellagové. Bohaté na třísloviny jsou především dvouděložné rostliny, jednoděložné naopak velmi chudé.error! Reference source not found.[23] Mezi třísloviny patří například korilagin nebo kaki tanin. Kaki tanin je komplexní sloučenina skládající se z epikatechinu, katechin-gallátu, gallokatechinu a gallokatechin-gallátu.error! Reference source not found. 2.2.5 Silice Silice jsou těkavé lipofilní směsi přírodních látek s intenzivní vůní. Tvoří je bohaté směsi organických sloučenin (terpeny, seskviterpeny a fenylpropanové deriváty). Silice mohou prostupovat celou rostlinu, jako v případě jehličnatých stromů nebo se koncentrují v určitých rostlinných orgánech (květy, plody, listy, kůra a kořeny).[23] Antibakteriální, antifugicidní a antioxidační aktivita silic a jejich složek ještě není zcela prostudována. Antioxidační aktivita je studována především u silic získaných z kořenových částí rostlin. Nejlepších výsledků v inhibici bakteriálních kmenů dosahovaly silice obsahující především carvacrol, cineol, eugenol a thymol.[18] 2.2.6 Terpeny, terpenoidy Jsou významnou složkou rostlinných silic a pryskyřic. Struktura terpenů je založena na pěti uhlíkatém isoprenu, lineárním spojováním této základní jednotky vznikají: monoterpeny, diterpeny, triterpeny a seskviterpeny. Terpeny mohou být i karotenoidy (tetraterpeny). Terpeny, které obsahují heterogenní molekulu kyslíku se nazývají terpenoidy. Nejznámějšími terpenoidy jsou kafr, menthol (monoterpeny), farnesol a artemisin (seskviterpenoidy). Cyklizací triterpenů vzniká další významná skupina látek steroidy (fytosteroly).[25][26] Terpeny a terpenoidy potlačují růst bakterií, virů a prvoků. Například triterpenoid betulin, který je obsažený v pigmentu břízy bělokoré, je již dlouhá léta testován na anti HIV aktivitu. Mechanismus inhibičního působení terpenoidů zatím není zcela objasněn, nicméně je vědecky prokázáno, že terpenoidy narušují cytoplazmatickou membránu mikroorganismů. Toxicita terpenů pro mikroorganismy je založena na lipofilních vlastnostech těchto látek. Jedná se o vazbu na lipidy bakteriálních membrán, narušování iontové rovnováhy a s tím i související poruchy funkce membránových proteinů, což může vést k buněčné smrti.[6][24] 2.2.7 Alkaloidy Alkaloidy jsou látky, které se vyznačují přítomností aminového dusíku heterocyklicky vázaného v molekule s různými farmakologickými účinky, hojně využívané v medicíně. Nejznámějším alkaloidem je morfin, který byl izolovaný již v 19. století z máku. Mezi další alkaloidy patří například diterpenoidní alkaloidy, extrahované z pryskyřníku, které vykazují antibakteriální aktivitu nebo 10

glykoalkaloid solamargin, který je používán při léčbě HIV infekce. Důležitým představitelem skupiny je berberin, který inhibuje růst mikroorganismů vmezeřováním do bakteriální DNA.[6][23] V rostlinách jsou vázány jako soli organických kyselin (kyselina šťavelová, octová, mléčná, jablečná, vinná apod.). Většina alkaloidů jsou bezbarvé pevné látky, bez zápachu, špatně rozpustné ve vodě a naopak dobře rozpustné v alkoholu, chloroformu, éteru a ve směsi chloroformu s éterem.[6] 2.3 Čaje zdroj přírodních antimikrobiálních látek Dlouhá historie čaje jako nápoje je pozoruhodná. Čaj je pěstován na mnoha různých místech po celém světě. Nicméně, všechny skutečné čaje jsou vyrobeny z listů Camellia sinensis, která je původem z Číny. Čaj je na světě po vodě druhým nejoblíbenějším nápojem, který konzumují dvě třetiny světové populace. V roce 2010 dosáhla světová výroba čaje přes 4,52 miliónů tun. Největšími producenty čaje jsou Čína, Indie, Keňa, Srí Lanka a Turecko. Globálně je Indie na druhém místě (991 180 tun) v čajové produkci za Čínou (1 467 467 tun).[15][11][15] 2.3.1 Chemické složení čaje Složení čaje se liší podle odrůdy, sezóny, stáří listu, klimatu a pěstitelských postupech. Na chemické složení má také značný vliv použití fermentačních procesů při dalším zpracování čajových listů. Po chemické stránce je čajový list komplexem jež obsahuje sacharidy, aminokyseliny, bílkoviny, alkaloidy (kofein, theofylin a theobromin), těkavé sloučeniny, polyfenoly, minerály a stopové prvky. V posledních letech se vědecký zájem soustřeďuje pro jejich biologickou aktivitu na polyfenoly a z nich především na flavanoly.[3] Čerstvé zelené čajové lístky jsou bohaté na monomerní flavanoly, známé jako katechiny, ze kterých je nejhojněji a zároveň nejvíce bioaktivní epigalokatechin 3 galát (EGCG) (Obr 1). EGCG představuju 50 80 % z celkového obsahu katechinů v zeleném čaji. Katechiny jsou v rostlině zastoupeny v množství 30 40 % suché hmotnosti čerstvých čajových lístků a dělí se podle stupně polymerizace na monomery, dimery a oligomery. Monomery se označují jako katechiny a patří mezi ně již zmiňovaný EGCG dále epigalokatechin (EGC), epikatechin, galokatechin a katechin. Dimery se obecně nazývají theaflaviny a patří zde theaflavin, theaflavin 3 galát, theaflavin 3 galát a theaflavin 3,3 digalát (TF3). Oligomery jsou polymery vzniklé oxidací EGC a EGCG, tyto látky jsou odvozeny od tříslovin a jejich struktura není přesně známá. Biologická aktivita flavanolů zahrnuje prevenci vzniku volných radikálů, antimutagenní aktivitu, ochranu před kardiovaskulárními chorobami, snižování hladiny cholesterolu v plasmě, zlepšení u diabetu 2. typu, ochranu před neurodegenerativními chorobami a zesilování kapilár ( vitamín P efekt ).[3][15] 11

Obr 1: Struktura epigalokatechin 3 galátu (EGCG) [12] 2.4 Rozdělení čajů Jak již bylo zmíněno výše čaj je jedním z nejoblíbenějších nápojů na světě díky svému aroma, chuti a blahodárným účinkům. Čaj je připravován mnoha různými způsoby, ale v závislosti na výrobním procesu je čaj klasifikován do tří hlavních typů: nefermentované (zelené a bílé čaje), částečně fermentované (oolongy neboli polozelené čaje) a fermentované (černé a tmavé čaje). Přestože jde ve skutečnosti o oxidaci (čajové listy nejsou vystaveny vlivu mikroorganismů, ale kyslíku). Děj je označován jako fermentace z historických důvodů.[3] 2.4.1 Nefermentované čaje Zelený čaj je typickým nefermentovaným čajem. Vyrábí se sušením na pánvích nebo napařováním čerstvých čajových lístků. Tím dochází k inaktivaci enzymu polyfenolické oxidázy a tudíž zastavení oxidace. Už ve starověké Číně byl zelený čaj považován za profylaktický nápoj. Díky tomu, že u zeleného čaje nedochází k oxidaci, je v něm obsaženo nejvíce monomerních katechinů, především EGCG ze všech čajů. To má za následek jeho zdravotní přínos, jako je snížení výskytu kardiovaskulárních onemocnění, inhibice matrix metaloproteináz, stimulační účinky, regulace tělesné teploty, antimikrobiální aktivita, regulace krevního cukru a podpora trávení. U bílého čaje dochází jen k jemné oxidaci, která probíhá během vadnutí listů. Poté je čaj sušen. Během výroby se dbá na co největší minimalizaci oxidace, což činí tento čaj bílý. Ačkoliv extrakty z bílého čaje jsou méně prostudované, je známo, že účinně inhibují adipogenezi a tudíž má potenciál ve využití léčby obezity. Některé odrůdy bílého čaje také vykazují silnou antimutagenní aktivitu a působí jako foto protekční činidla chránící před stimulovaným slunečním zářením, vyvolávajícím oxidační poškození DNA.[11][11] 2.4.2 Částečně fermentované čaje Polozelené čaje jinak nazývané také oolongy tvoří přechod mezi nefermentovaným zeleným čajem 12

a fermentovaným černým čajem. Vyrábí se unikátním procesem, který zahrnuje vadnutí na silném slunci a během, kterého je oxidace v různých fázích přerušena. Poté jsou čajové lístky rolovány a zkrucovány. Polozelené čaje vykazují anti-obezitní efekt a svou úlohu má také v prevenci diabetu.[11] 2.4.3 Fermentované čaje Mezi fermentované čaje patří černé a tmavé čaje. Černý čaj se vyrábí tak, že po sběru se lístky mechanicky naruší, oxidační proces poté probíhá při teplotě okolo 30 C a velice vysoké vlhkosti. Zpracování trvá týden i déle. Během těchto procesů dochází k oxidaci a kondenzaci monomerních katechinů, ze kterých vznikají větší polyfenolické molekuly (oligomery a polymery). Tyto polymery jsou zodpovědné za silnou hořkou chuť černého čaje a jeho černou barvu. Podle některých výzkumů má černý čaj pozitivní vliv na pokles krevního tlaku, prevenci vzniku ischemické cévní mozkové příhody a snížení rizika vzniku kardiovaskulárních chorob.[3] Tmavý čaj neboli Pu erh se vyrábí z vybraných listů vysokých a starých čajovníků. Tmavé čaje se také označují jako dvakrát fermentované, protože u druhé fermentace se používají mikroorganismy. První fermentační proces je stejný jako u čaje černého, ale fermentace probíhá mnohem delší dobu. Doba fermentace tmavých čajů je přímo úměrná jejich kvalitě. V porovnání se všemi ostatními druhy čajů, má tmavý čaj nejvyšší obsah kofeinu.tmavý čaj má příznivý vliv na snižování cholesterolu v krvi. Vodné výluhy tmavých čajů také vykazují antimikrobiální aktivitu proti gram pozitivním kmenům Staphylococcus aureus a Bacillus subtilis.[11] 2.5 Šípek 2.5.1 Botanický popis Rosa canina patří do čeledi růžovité (Rosaceae). Růže šípková je rozložitý a někdy šplhavý keř, který dorůstá výšky 1 3 m, má převislé větve se silnými, hákovitě dolů zahnutými ostny. Listy jsou lichozpeřené. Tato rostlina kvete od června do srpna bílými, lehce narůžovělými květy. Tyto květy jsou složené z 5 korunních plátků a baňkovité číšky s velkým množstvím pylových tyčinek. Z oplozených květů se vyvíjí nepravý plod šípek. Plody jsou červené elipsoidního až kulatého tvaru a zrají na konci léta. Uvnitř šípku se nacházejí pravé plody, tvrdé nažky.[27][28][29] Růže šípková se vyskytuje v Evropě, na Madeiře, Kanárských ostrovech, severozápadní Africe i Blízkém východě. Roste jak v nížinách, tak v horských oblastech, kde se vyskytuje mezi hranicí lesa a kosodřevinou. Preferuje humózní půdy bohaté na živiny, nepříliš suché na slunných či polostinných místech.[29][30] 13

2.5.2 Chemické složení plodu Růže šípkové Plody šípku obsahují vysoké množství vitamínu C, a to 417 mg ve 100 g plodů. To je 6krát více než v pomeranči, kde je ve 100 g 76 mg vitamínu C. Tento vitamín se vyskytuje ve formě kyseliny askorbové, která je bez zápachu. Šípkové plody obsahují největší množství kyseliny askorbové po dosáhnutí zralosti, kdy jsou plně vybarvené a tvrdé. Poté se obsah této kyseliny v plodech pomalu snižuje. Při skladování natrhaných plodů se obsah kyseliny askorbové sníží za rok o 50 %.[32][34] Dalšími aktivními látkami obsaženými v šípkových plodech jsou flavonoidy, které mají synergický účinek s kyselinou askorbovou takže zesilují celkový antioxidační efekt šípkových extraktů. Také je známo, že šípkové plody obsahují vitamín B 1, B 2, provitamin A, kyselinu nikotinovou a karotenoidy (lykopen, karoten, rubixanthin, xantofyl, taraxanthin), sacharidy, třísloviny a slizy.[23][31] V plodech šípkové růže pěstované v Turecku bylo zjištěno 2,365 2,712 g vitaminu C ve 100 g plodů, 3,97 4,67 mg kg -1 sodíku, 890,5 1 023,9 mg kg -1 draslíku a 1 850 2 200 mg kg -1 fosforu. Dále byly ve stopovém množství stanoveny prvky: železo, zinek, mangan, hořčík a vápník a také byla zjištěna přítomnost organických kyselin jako například kyselina citronová, jablečná, betulinová, olejová, linolová a α linolenová.[33] 2.5.3 Šípkový čaj Růže šípková byla již v dávné minulosti častým prostředkem používaným v lidovém léčitelství. Pro své léčivé vlastnosti byly a jsou používány především nepravé plody a okvětní lístky.[28] Například odvar z květů se používá k obkladům na zmírnění zánětu spojivek. Nálev z korunních plátků také napomáhá trávení po požití těžkých jídel.[29] Plodové kyseliny a pektiny obsažené v šípcích povzbuzují činnost střev tak, že čaj nemá projímavé, ale spíše regulační účinky na střeva a zároveň také působí močopudně. V čajových směsích se šípek často vyskytuje v čajích proti chřipce a urologických čajích. V lidovém léčitelství je také známý čaj z šípkových jader, jenž má pomáhat při problémech ledvin, močového měchýře, revmatizmu a dně. Kyselina askorbová obsažená v šípcích posiluje celkovou obranyschopnost organismu a napomáhá při léčbě hojení ran.[30] 2.6 Čajová směs 2.6.1 Aronie Aronie je 2 až 3 metry vysoký ovocný keř, jinak též nazývaný temnoplodec nebo černý jeřáb. Původně pochází z východní části severní Ameriky a Kanady. Kolem roku 1900 byla tato rostlina dovezena do Německa, odkud se poté rozšířila do zemí východní Evropy, Skandinávie a Ruska. Rozlišují se dva hlavní druhy Aronie, Aronii černou (Aronia melanocarpa) a Aronii Červenou (Aronia arbutifolia). V potravinářském průmyslu využívají pouze plody Aronie černé. Aronie se běžně používá k výrobě ovocných šťáv, sirupů, marmelád, želé a čajů. V čajích se obvykle vyskytuje ve směsích s dalšími více 14

aromatickými složkami, často s černým rybízem. Nicméně vzhledem k silně kyselé až svíravé chuti plodů, dochází pouze k omezenému použití v průmyslové výrobě šťáv a nektarů. Mnohem častěji se používá v ovocných šťávách v kombinaci s dalšími druhy ovoce. Plody aronie mají vysoký obsah anthokyanových pigmentů, díky čemuž se používaly jako přírodní barvivo. Dále je také Aronie známá vysokým obsahem sorbitolu a polyfenolických látek.[35] 2.6.2 Černý rybíz Černý rybíz je odrůdou rybízu obecného, který patří do rodu Ribes. Je to planě rostoucí keř, vyskytující se v celé oblasti severní a střední Evropy. Jedná se o ovocný keř dorůstající výšky až 2 m, s hrozny střední velikosti, které mají černé nebo tmavě fialové bobule. Mezi další odrůdy rybízu patří rybíz červený a rybíz bílý. Plody černého rybízu mají vysoký obsah vitamínů, především vitaminu C. Také obsahuje velké množství minerálních látek především draslíku. Z antimikrobiálního hlediska patří mezi důležité látky zastoupené v plodech rybízu anthokyanová barviva a organických kyselin.[36][37] 2.7 Metody získávání rostlinných extraktů S ohledem na velké rozdíly ve struktuře bioaktivních látek a ohromnou rozmanitost rostlinných druhů, existuje také velké množství separačních technik získávání těchto látek. V minulosti byly vypracovány postupy pro zpracování rostlin s účinnými látkami, od pojmenování rostliny až po komercializaci produktu, jež zahrnují: hodnocení toxicity, přípravu vzorků a elementární analýzu, biologické testy, izolaci účinné látky a in vivo analýzu. U většiny z těchto postupů je nejprve nutné identifikovat a charakterizovat bioaktivní látky a následně ze zjištěných informací zvolit vhodný typ extrakce. Nastavením přesných extrakčních podmínek, se dají selektivně extrahovat bioaktivní látky z rozmanitých přírodních zdrojů. U některých extrakčních technik se jejich postup nezměnil stovky let.[49] Všechny extrakční techniky mají některé společné cíle, (a) extrakci cílené bioaktivní sloučeniny z komplexního vzorku rostliny, (b) zvýšení selektivity analytických metod, (c) zvýšení koncentrace cílené látky (d) převedení bioaktivní sloučeniny do formy vhodnější pro detekci a separaci, (e) vytvoření silné reprodukovatelné metody, která je nezávislá na změně matrice vzorku.[49] 2.7.1 Konvenční extrakční techniky Existuje několik klasických extrakčních technik používaných pro získávání bioaktivních látek z rostlinného materiálu. Většina z těchto metod je založena na využití extrakční síly různých rozpouštědel v kombinaci s aplikací tepla,a nebo míchání. Mezi klasické extrakční techniky získávání biologicky aktivních látek patří: soxhletova extrakce, macerace a hydrodestilace.[49] 15

Soxhletova extrakce byla navržena především pro extrakci lipidů, ale dá se použít také pro extrahování bioaktivních látek z přírodních zdrojů. Používá se jako model pro srovnání nových alternativních extrakčních technik.[49] Macerace je jednoduchý a levný způsob získávání rostlinných extraktů, který se běžně používá také pro domácí výrobu. Základní macerace se skládá ze tří kroků. Za prvé se rostlinný materiál nadrtí na malé části pro zvýšení povrchové plochy a usnadnění míchání s rozpouštědlem. Za druhé přidání vhodného rozpouštědla pro macerační proces, které se nazývá menstruum a vložení macerační směsi do uzavřené nádoby. Za třetí lisování získaného macerátu z vyextrahovaného rostlinného vzorku. Příležitostné třepaní v maceraci usnadňuje extrakci zvýšenou difuzí.[4] Hydrodestilace je tradiční metodou extrakce bioaktivních látek a esenciálních olejů z rostlin. Existují dva typy hydrodestilace: destilace vodou a přímá parní destilace. V prvním případě je vzorek zalit vodou, která se poté přivede k varu a v druhém případě se pára přímo vstřikuje do vzorku rostlin. Hydrodestilace zahrnuje tři hlavní fyzikálně chemické procesy: difuzi, hydrolýzu a tepelný rozklad. Při vysoké extrakční teplotě mohou být ztraceny některé těkavé složky. Tento nedostatek omezuje použití hydrodestilace pro tepelně labilní sloučeniny.[4] 2.7.2 Nekonvenční extrakční techniky Hlavními nedostatky konvenčních extrakčních technik jsou dlouhá doba extrakce, nákladné požadavky na vysokou čistotu rozpouštědel, nízká extrakční selektivita a ztráta tepelně labilních sloučenin během extrakce. K překonání těchto omezení konvenčních extrakčních metod, jsou zaváděny nové extrakční techniky. Tyto nové metody jsou označovány jako nekonvenční extrakční techniky. Nejslibnějšími z těchto technik jsou ultrazvuková extrakce, enzymově asistovaná extrakce, mikrovlnná extrakce, extrakce pulzním elektrickým polem a tlaková extrakce. U těchto nových metod je kladen také velký důraz na používání bezpečnějších chemikálií a rozpouštědel, energetickou účinnost a využívání obnovitelných surovin. To je také důvodem proč se některé z těchto metod označují jako zelené techniky.[49] 2.7.2.1 Ultrazvuková extrakce Ultrazvuk je speciální typ zvukového vlnění nad hranicí slyšitelnosti lidského ucha. V chemii se obvykle využívá zvukové vlnění o frekvenci od 20 khz do 100 MHz. Při použití tohoto vlnění v extrakci dochází k opakovanému stlačování a expanzi média, což vede k jevu zvanému kavitace. Kavitace je děj při, kterém vznikají uvnitř kapaliny bubliny způsobené lokálním poklesem tlaku. Po vymizení podtlaku tyto bubliny implodují za vzniku rázových vln. Studie uvádějí, že uvnitř kavitačních bublin je dosahováno teplot asi 5000 K a tlaku 1000 MPa. Princip ultrazvukové extrakce je založen na využití energie těchto kavitačních bublin. 16

Ultrazvuková extrakce zintenzivňuje přestup hmoty a urychluje přístup rozpouštědla k buněčnému materiálu rostlinných částí, to vede k usnadnění loužení organických a anorganických sloučenin z rostlinné matrice. Extrakce ultrazvukem zahrnuje především dva fyzikální jevy, (a) difuzi látek přes buněčnou stěnu a (b) vyplachování buněčného obsahu po rozrušení buněčné stěny. Hlavními faktory ovlivňujícími výsledek ultrazvukové extrakce jsou teplota, tlak, frekvence, velikost rostlinných částí a doba působení ultrazvuku. Ultrazvuková extrakce se také používá ve spojení s některými klasickými technikami, protože je známo, že zvyšuje jejich účinnost.[49] 2.7.2.2 Extrakce pulzním elektrickým polem Principem využití pulzního elektrického pole (PEP) je destrukce struktur buněčných membrán za účelem zvýšení extrakce. Pro PEP jsou citlivé ty části buněčných membrán, které fungují na dipólovém charakteru. Při překročení kritické hodnoty přibližně 1 V transmembránového potenciálu, vzniká mezi látkami s dipólem odpor, což vede ke tvorbě pórů v membráně a to zapříčiní uvolňování intracelularních sloučenin z rostlinné tkáně zvýšením propustnosti membrány. Pro PEP se používá jednoduché zařízení sestávající z komory obsahující elektrody, do které se vkládá rostlinný materiál. Účinnost PEP extrakce závisí na síle vstupního pulsu, teplotě a také vlastnostech rostlinné matrice. Použitím PEP dochází k rozrušení buněčných membrán aniž by docházelo k razantnímu zvýšení teploty. Z tohoto důvodu se dá PEP použít při extrakci tepelně labilních sloučenin.[49] 2.7.2.3 Enzymově asistovaná extrakce Určité fytochemikálie jsou v rostlinných matricích vázány do polysacharidů pomocí hydrofóbních vazeb, které jsou při použití běžných extrakčních technik a rozpouštědel neextrahovatelné. Použití enzymů během extrakčního procesu se ukázalo jako efektivní způsob jak uvolňovat výše zmíněné sloučeniny a zvýšit tím celkový výtěžek extrakce. Pro hydrolýzu strukturních polysacharidů se používají specifické enzymy jako je celuláza, α amyláza a pektináza. Enzymy se používají především pro extrakci olejů, například při extrakci olejů ze semen lisovaných za studena. Bylo zjištěno, že oleje získané metodami s enzymovou asistencí obsahují vyšší množství volných mastných kyselin a fosforu než běžně hexanem extrahované oleje. Enzymově asistovaná extrakce je uznávaná jako ekologicky šetrná technologie pro extrakci bioaktivních látek a olejů, protože používá vodu jako rozpouštědlo namísto organických chemikálií.[49] 2.7.2.4 Mikrovlnná extrakce Mikrovlnná extrakce je jednou z dalších nových extrakčních technik používaných pro extrakci rozpustných materiálů. Mikrovlny jsou elektromagnetické vlny s kmitočtovým pásmem od 300 MHz 17

do 300 GHz. Působením mikrovln na rostlinnou matrici dochází k přeměně elektromagnetické energie v tepelnou energii. To je způsobeno neustálým otáčením polárních molekul, což vede ke kolizím těchto molekul, které generují teplo. Mikrovlnná extrakce má tři fáze: za prvé oddělení rozpustných látek z aktivních míst matrice za zvýšené teploty a tlaku, za druhé difuzi rozpouštědla přes matrici vzorku a za třetí uvolňování rozpuštěných látek z matrice vzorku do rozpouštědla. Mikrovlnná extrakce se používá především pro extrakci organických a organokovových sloučenin.[49] 2.7.2.5 Tlaková extrakce rozpouštědlem Tato moderní extrakční technika je založena na využití vysokého tlaku během extrakce, který udržuje rozpouštědlo při vysoké teplotě, ale v kapalném stavu. Díky současné automatizaci technik dochází k velkému rozvoji tlakové extrakce (PSE). Výhodou PSE je malá spotřeba rozpouštědla a vyšší rychlost extrakce než u běžných technik. PSE je také považována za alternativní techniku pro extrakci kapalinou v nadkritickém stavu. PSE se používá pro extrakci organických znečišťujících látek, které jsou stabilní při vysokých teplotách. Pro svou nízkou spotřebu rozpouštědla je PSE také řazena mezi ekologicky šetrné technologie pro extrakci.[49] 2.8 Mikrobiologické metody Antimikrobiální látky jsou schopné potlačit růst určitého patogenního mikroorganismu. Pro jejich detekci slouží několik metod, které jsou založeny na stejném principu. Z toho důvodu se výsledky liší podle typu použitého mikroorganismu, sloučenin vykazujících antimikrobiální aktivitu, způsobu jejich extrakce nebo rozpustnosti.[38] 2.8.1 Difuzní stanovení antimikrobiální aktivity Difuzní metoda patři mezi kvalitativní a semikvantitativní metody stanovení citlivosti mikroorganismů k antimikrobiálním látkám. Tato metoda využívá tuhé agarové medium, ve kterém je naočkovaný citlivý mikroorganismus a testovaná látka difunduje mediem, čímž způsobuje vznik inhibičních zón; velikost zóny je závislá na koncentraci testované látky, na složení kultivační půdy, vlhkosti půdy, tloušťce kultivační půdy, ph půdy, doby inkubace a stability látky.[39] Podle způsobu nanášení testované látky se difuzní metoda dělí na jamkovou difuzní metodu a diskovou difuzní metodu. Při všech uvedených metodách je důležité, aby vrstva kultivačního media byla rovnoměrně vysoká, aby mikroorganismus byl rovnoměrně naočkovaný po celém povrchu (v celém objemu) a aby jednotlivé vzorky byly dostatečně vzdálené od okrajů plotny a navzájem se nedotýkaly. [39] 18

Disková difuzní metoda Disková metoda je založena na difuzi antimikrobiální látky do agarové plotny, naočkované testovaným mikroorganismem skrz papírové disky ve, kterých je napuštěna.[14] Jamková difuzní metoda U jamkové metody se testovací látky pipetují do jamek vyhloubených sterilním korkovrtem přímo do naočkované ztuhlé agarové vrstvy.[14] 2.9 Antioxidační systémy Aerobní organismy jsou existenčně závislé na kyslíku, současně však jsou vystaveny negativním účinkům reaktivních forem kyslíku tzv. volným radikálům a dalším sloučeninám vznikajícím jako vedlejší produkty oxidačního metabolismu. Živé organismy disponují komplexním systémem antioxidační ochrany. Rostlinná tkáň je velmi bohatá na většinu typů antioxidantů, které posilují náš antioxidační systém.[13] S antioxidační aktivitou v bylinách jsou nejčastěji spojovány skupiny látek známe jako vitamíny především vitamin E a C, polyfenoly, flavonoidy a také pigmenty mezi, které patří karotenoidy a anthokyany. Antioxidanty i v nízkých koncentracích výrazně zpomalují nebo zabraňují oxidačním reakcím citlivých složek jako jsou například lipidy. Kromě toho je antioxidační aktivita spojena se snížením poškození DNA a peroxidace lipidů, což zvyšuje úroveň imunity při ochraně a redukci zhoubných proměn v buňkách. Některé studie uvádějí fenolické sloučeniny jako hlavní bioaktivní fytochemikálie s antioxidační aktivitou. S přihlédnutím k výsledkům získaných různými výzkumy se dá dojít k závěru, že polyfenoly jsou pravděpodobně nejhojněji zastoupenými a nejdominantnějšími antioxidanty bylinných výtažků.[1][10][12] 2.9.1 Stanovení celkového obsahu polyfenolů Díky své jednoduchosti a nízkým ekonomickým nákladům se ke stanovení celkových polyfenolů používají především spektrofotometrické metody. Poskytují užitečné informace a charakterizaci jak jednotlivých strukturních tříd polyfenolů, tak i celkové stanovení těchto komponent v rostlinném materiálu.[40] Jednou z nejvyužívanějších metod je Folin Ciocalteuho spektrofotometrická metoda. Metoda je založena na reakci látek směsi Folinova činidla a fosfomolybdenanu a fosfowolframanu s fenoly obsažených v rostlinném vzorku. Principem je redukce fenolů za současného vzniku chromogenů, modrých produktů. Rozsah zabarvení, spektrofotometricky měřený při vlnové délce 750 nm, představuje celkový obsah fenolů. Výsledná hodnota koncentrace fenolových sloučenin ve vzorku je pak získána přepočítáním na ekvivalentní množství kyseliny gallové. Ve světě se Folin Ciocalteuho spektrofotometrická metoda označuje názvem GAE (Gallic Acid Equivalent method).[41] 19

2.9.2 Stanovení celkového obsahu flavonoidů Jednou z nejpoužívanějších analytických metod pro běžné stanovení celkového obsahu flavonoidů v rostlinných extraktech je Christ Müllerova metoda. Principem metody je spektrofotometrická detekce barevných komplexů Al 3+ s hydroxylovou a karbonylovou skupinou v alkalickém prostředí. Praktické provedení zahrnuje reakci s hlinitou solí a dusitanem a následným zalkalizováním vzorku. Výsledný roztok je v přítomnosti flavonoidů žlutě zabarvený a měří se u něj absorbance při 510 nm. Hodnota koncentrace flavonoidů ve vzorku je poté získána pomocí přepočtu vycházejícího z kalibrační křivky katechinu.[13][42] 2.9.3 Stanovení celkové antioxidační aktivity rostlinného materiálu Pro hodnocení antioxidační aktivity biologického materiálu byly vypracovány některé metody a postupem času i jejich modifikace. Nejpoužívanější metodou pro stanovení celkové antioxidační aktivity je metoda ABTS. Tato metoda využívá činidla, které za účasti iniciace jiné látky přechází ve svou radikálovou formu, která je barevná a relativně stabilní. V přítomnosti látek s antioxidační aktivitou se redukuje a tím i odbarvuje. Principem metody je sledování schopnosti vzorku zhášet kation radikál ABTS + (2,2 azinobis (3 ethylbenzothiazol 6 sulfonát)). Zhášení radikálu ABTS + antioxidanty, které se chovají jako donory vodíku, měříme spektrofotometricky při vlnové délce 734 nm. Výpočet koncentrace antioxidačních látek ve vzorku vychází z rozdílů absorbance vzorku v čase 0 a 10 minut a také z kalibrační křivky vytvořené ze standardního roztoku troloxu (kyselina 6 hydroxy 2,5,7,8 tetramethylchroman 2 karboxylová), což je derivát vitamínu E. Díky tomu je tato metoda také označována jako metoda TEAC (Trolox Equivalanet Antioxidant Capacity). Metoda je velmi rychlá, jednoduchá a umožňuje široké hodnocení antioxidační aktivity různých látek i směsných vzorků.[13][43] Obr. 2: Struktura ABTS [43] 20

3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 Seznam použitých přístrojů Spektrofotometr UV/VIS HELIOS DELTA Thermospectronic, Anglie Vortex Reax Top, Heidoplh, Německo Laboratorní váhy KERN, EMB, spol. s. r. o., Kyjov Analytické váhy AND GR 202 EC, Japonsko Fotoaparát Nikon D50 Mikropipety Biohit Proline Centrifuga Ependorf 5417 R Biologický inkubátor P100 U, BioTech a. s., Praha Autokláv Vaposteri BMT, Brno 3.2 Seznam použitých chemikálií Destilovaná voda Ethanol 96 % (VWR) Folin-Ciocalteho činidlo (Sigma Aldrich Chemie GmbH) Uhličitan sodný (LACHEMA) Kyselina gallová (PENTA) Dusitan sodný (PENTA) Katechin (LACHEMA) Chlorid hlinitý (PENTA) Hydroxid sodný (LACHEMA) 3.3 Použitý software osobní počítač operační systém windows MS Word MS Excel program Lucia NET Lucia je program obrázkové analýzy navržený pro zachycování, archivaci obrazů, pro měření různých znaku obrazu a automatické zachycování rozsáhlých sekvencí obrazů.[44] 3.4 Charakteristika použitých mikroorganismů Kmeny mikroorganismů použitých v tomto měření pocházejí ze sbírky Masarykovy univerzity přírodovědecké fakulty v Brně. Serratia marcescens CCM 303, Bacillus subtilis CCM 1999. 21

3.4.1 Serratia marcescens Serratia marcescens je gramnegativní bakterie z čeledi Enterobacteriaceae. Buňky této bakterie mají tvar velmi krátkých tyčinek o průměru do 1 µm. Vyskytuje se jednotlivě nebo v krátkých řetízcích. Serratia marcescens je fakultativně aerobní bakterie a jejím charakteristickým znakem je tvorba červeně pigmentovaných kolonií. Toto zbarvení je způsobeno červeným pigmentem prodigiosinem. Optimální teplota růstu bakterie Serratia marcescens je mezi 20 a 25 C. Při teplotách nad 37 C přestává růst. Serratia marcescens dobře roste na všech základních půdách.[47] Všechny bakterie rodu Serratia jsou v přírodě velmi rozšířené. Vyskytují se především ve vodě a v zemědělských produktech. Tato bakterie je hlavním původcem červených skvrn na potravinách obsahujících škrob.[47] 3.4.2 Bacillus subtilis Bacillus subtilis, jinak též nazývaný senný bacil, je grampozitivní bakterie, jejíž buňky mají tvar tyčinek se zaoblenými konci. Velikost těchto buněk je 0,3 až 1,5 2 až 3 µm. Vyskytují se jednotlivě i v řetízcích a jsou peritrichně obrvené.bacillus subtilis je aerobní bakterie, ale za určitých podmínek může růst i anaerobně (dýchání pomocí dusičnanů, jako donorů elektronů nebo fermentací v nepřítomnosti elektronových donorů) patří tedy mezi fakultativní anaeroby. Za nepříznivých podmínek tvoří teplotně rezistentní, dormantní spory. Bacillus subtilis zkapalňuje želatinu, hydrolyzuje škrob a z dextrinů tvoří kyseliny.[48] Teplotní rozmezí růstu bakterie Bacillus subtilis je 10 až 55 C a ideální teplota růstu je 37 až 40 C. Sporulace začíná při teplotách nad 44 C, v závislosti na bakteriálním kmenu a zvoleném kultivačním médiu. Spóry vydrží teploty až 150 C po dobu 6 hodin. Tato bakterie je v přírodě velmi rozšířená, vyskytuje se především v půdě, v seně a v asociaci s rostlinami. S touto bakterií se můžeme často setkat při mikrobiologické kontrole v celém potravinářském průmyslu. Bacillus subtilis patří s Escherichia coli k nejlépe prozkoumaným prokaryotním mikroorganismům.error! Reference source not found. 3.5 Vzorky čajů podrobené analýze K testování inhibičního účinku u vybraných mikroorganismů byly použity připravené výluhy a maceráty ze dvou druhů čajů firmy Valdemar Grešík Natura s. r. o. Šípek oplodí plod zbavený semen a chloupků 22

Obr. 3: Použitý Šípkový čaj firmy Valdemar Grešík Natura s. r. o.[45] Směs šípek oplodí 50 %, aronie plod 40 %, černý rybíz plod 10 % Obr. 4: Použitá čajová směs firmy Valdemar Grešík Natura s. r. o.[46] 3.6 Kultivační media a jejich příprava Jako kultivační médium pro uchování a pomnožení testovaných mikroorganismů jsme použili živné médium firmy Himedia: Nutrient agar No. 2. Složení a příprava: Živočišná tkáň..10 g Hovězí extrakt..10 g Chlorid sodný (NaCl).5 g Agar..15 g Destilovaná voda.. 1000 ml ph..7,2 40 g živného média se rozpustilo v 1000 ml destilované vody. Živné médium bylo poté vysterilizováno v autoklávu při teplotě 121 C po dobu 15 minut. 23

3.7 Příprava macerátů Příprava vodného macerátu 10 g zvoleného vzorku čaje bylo zalito 100 ml destilované vody o teplotě 25 C a macerováno 7 dní bez přístupu světla při laboratorní teplotě (25 C). Čajový macerát byl poté zfiltrován a filtrát byl uchováván v lednici při teplotě 4 C. Příprava ethanolového macerátu 10 g zvoleného vzorku čaje bylo zalito 100 ml 99,8% ethanolu o teplotě 25 C a macerováno 7 dní bez přístupu světla při laboratorní teplotě (25 C). Čajový macerát byl poté zfiltrován a filtrát byl uchováván v lednici při teplotě 4 C. 3.8 Příprava výluhů Příprava vodného výluhu 10 g zvoleného vzorku čaje bylo zalito 100 ml destilované vody o teplotě 100 C a poté byl extrakt vložen do vodní lázně, kde byl extrahován 30 min při teplotě 100 C. Čajový výluh byl poté zfiltrován a filtrát byl uchováván v lednici při teplotě 4 C. Příprava ethanolového výluhu 10 g zvoleného vzorku čaje bylo zalito 100 ml 99,8% ethanolu o teplotě 50 C a poté byl extrakt vložen do vodní lázně, kde byl extrahován 30 min při teplotě 50 C. Čajový výluh byl poté zfiltrován a filtrát byl uchováván v lednici při teplotě 4 C. 3.9 Ověření antimikrobiálních účinků šípkových čajů Na ověření inhibičních účinků čajových extraktů a macerátů byla použita difúzní jamková metoda na agarových plotnách. Pro ověření byly použity Petriho misky o průměru 9 cm a korkovrt o průměru 1 cm. Do zkumavky se 4,5 ml sterilního živného bujónu č. 2 byla naočkována kultura mikroorganismů, která byla inkubována v termostatu 24 hodin při 30 C. Za 24 hodin bylo odpipetováno 1,5 ml do 150 ml vysterilizovaného agaru, který byl ochlazen na 42 45 C. Takto připravené zaočkované medium bylo rozléváno na plastové Petriho misky (37 ml). Do tuhého agaru bylo sterilním korkovrtem vyhloubeno šest jamek. Do pěti jamek bylo pipetováno po 100 µl testovaného výluhu nebo macerátu (dest. voda a etoh), který byl uchováván při 4 C, do šesté jamky bylo napipetováno 100 µl čistého rozpouštědla bez aktivní látky tzv. blank. Petriho misky byly poté inkubovány při 30 C po dobu 48 hodin v termostatu. Nakonec byla zhotovena fotografická dokumentace jednotlivých Petriho misek a změřena velikost inhibičních zón v programu Lucia NET. 24

3.10 Metody měření inhibičních zón metoda měření délky metoda měření plochy metoda měření jamky délkou a zóny plochou Ze známé velikosti jamky (10 mm) byly všechny naměřené velikosti délky v pixelech (px) či plochy px 2, přepočteny na milimetry. Obr: 5: Zobrazení jednotlivých metod měření inhibičních zón v programu Lucia NET 3.11 Stanovení celkových polyfenolů Příprava standardu Byla připravena kalibrační křivka kyseliny gallové o koncentracích 100, 200, 300, 400, 500 a 600 mg l 1. Pro její stanovení byl použit stejný postup jako u extraktu, kdy byly k reakční směsi přidávány připravené koncentrace kyseliny gallové. Absorbance jednotlivých koncentrací byla měřena při vlnové délce λ = 750 nm. Byla sestrojena kalibrační křivka v závislosti absorbance na koncentraci kyseliny gallové (mg l 1 ). Tabulka 1: Jednotlivé objemy použitých činidel pro metodu FCM Činidlo V [ml] Folin Ciocaltauovo 1 Extrakt čaje 0,1 Uhličitan sodný 1 Destilovaná voda 1 25

1,2 1 0,8 y = 0,0014x + 0,038 R² = 0,9988 A 750 0,6 0,4 0,2 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 c [mg/l] Obr. 6: Kalibrační křivka kyseliny gallové Celkový obsah fenolů u extraktů čajů byl stanoven pomocí Folin Ciocaltauova činidla. Do zkumavky bylo napipetováno 1 ml zředěného Folin Ciocaltauova činidla, 1 ml destilované vody a 100 µl extraktu vzorku. Každý vzorek byl analyzován ve třech paralelních stanoveních. Roztok ve zkumavkách byl promíchán a ponechán stát. Po pěti minutách bylo do zkumavky přidáno 1 ml nasyceného roztoku uhličitanu sodného a roztok byl opět promíchán. Reakcí fenolických sloučenin s činidlem vzniklo modré zbarvení, jehož intenzita byla po dvou hodinách změřena na spektrofotometru, při vlnové délce 750 nm proti slepému vzorku (kde namísto 100 µl extraktu bylo použito 100 µl destilované vody). Celkové množství polyfenolů bylo vypočteno pomocí kalibrační křivky. 3.12 Stanovení celkových flavonoidů Příprava standardu Byla připravena kalibrační křivka katechinu o koncentracích 50, 100, 150, 200, 250 a 300 mg l 1. Pro její stanovení byl použit stejný postup jako u extraktu, kdy byly k reakční směsi přidávány připravené koncentrace katechinu. Absorbance jednotlivých koncentrací byla měřena při vlnové délce λ = 510 nm. Byla sestrojena kalibrační křivka v závislosti absorbance na koncentraci standardu katechinu (mg l 1 ). 26

Tabulka 2: Jednotlivé objemy použitých činidel pro stanovení flavonoidů Činidlo V [ml] extrakt čaje 0,5 destilovaná voda 2,5 dusičnan sodný 5% 0,2 chlorid hlinitý 10% 0,2 hydroxid sodný 1,5 0,9 0,8 0,7 0,6 y = 0,0026x + 0,0051 R² = 0,9985 A 510 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 50 100 150 200 250 300 350 c [mg/l] Obr. 7: Kalibrační křivka katechinu Celkový obsah flavonoidů u extraktů čajů byl stanoven pomocí hlinité soli a dusitanu. Do zkumavky bylo napipetováno 0,5 ml extraktu, 1,5 ml destilované vody a 0,2 ml 5% roztoku dusičnanu sodného. Roztok ve zkumavce byl důkladně promíchán a ponechán stát 5 minut. Poté bylo do zkumavky přidáno 0,2 ml 10% roztoku chloridu hlinitého, roztok byl opět promíchán a ponechán stát 5 minut. Nakonec bylo do zkumavky přidáno 1,5 ml roztoku hydroxidu sodného a 1 ml destilované vody. Po 15 minutách byly vzorky analyzovány pomocí spektrofotometru při vlnové délce 510 nm proti slepému vzorku (200 µl destilované vody). Celkové množství flavonoidů bylo vypočteno pomocí kalibrační křivky. 3.13 Stanovení celkové antioxidační aktivity Radikál kationtu ABTS byl připraven reakcí ABTS diamonné soli s peroxodisíranem draselným. Byl připraven roztok ABTS o koncentraci 7 mm, rozpuštěním ABTS v destilované vodě. Radikálový 27

kationt z ABTS byl poté získán reakcí s 2,45 mm peroxodisíranem draselným. Vzniklý roztok byl ponechán stát ve tmě při laboratorní teplotě 16 hodin. Před použitím byl ABTS + zředěn ethanolem na absorbanci 0,70 při 734 nm proti ethanolu. Do zúžené kyvety bylo napipetováno 1 ml ABTS + a 10 µl použitého extrakčního rozpouštědla (dest. voda nebo ethanol) a byla změřena absorbance A 0 v čase t = 0. Poté bylo do další kyvety napipetováno 1 ml ABTS + a 10 µl extraktu vzorku. Kyveta byla na 10 minut uložena do tmy a poté byl změřen pokles absorbance A 10. Pro výpočet celkové antioxidační aktivity byla použita kalibrační rovnice troloxu : A 1, 389 c. Kalibrační rovnice troloxu byla připravena v rozmezí koncentrací 50 400 ng ml 1. 28

4 VÝSLEDKY A DISKUZE Hlavním předmětem této studie byly čajové směsi ve, kterých obsahově převládaly plody Růže šípkové. Obchodní řetězce nabízejí velké množství čajových směsí s různým obsahem léčivých bylin. Pro naše měření byly zvoleny čaje firmy Valdemar Grešík Natura s. r. o.. Prvním z nich byl čaj Šípek oplodí. Jedná se o sypaný čaj s hrubě nadrcenými sušenými plody Růže šípkové a druhým byla čajová směs Aronie & Šípek & Černý rybíz. Tato čajová směs byla jemně nadrcená a zabalena ve formě čajových sáčků. Při analýze těchto směsí jsme měli dva hlavní cíle. V prvé řadě posouzení antimikrobiálního vlivu na zvolené mikroorganismy Serratia marcescens a Bacillus subtilis. Za druhé stanovení koncentrace biologicky aktivních sloučenin (polyfenolů, flavonoidů) a také celkové antioxidační aktivity vybraných směsí. 4.1 Stanovení celkového obsahu polyfenolů Celkový obsah polyfenolů byl stanoven za použití Folin Ciocalteho činidla. Principem metody je redukce fenolických sloučenin obsažených ve výluzích a macerátech šípkového čaje a směsi v destilované vodě a ethanolu. Každý vzorek byl třikrát změřen a získané hodnoty obsahu polyfenolických látek byly zprůměrovány. Tabulka 3 zobrazuje naměřené výsledky. Z rovnice lineární regrese kalibrační křivky kyseliny gallové (Obr. 6) byl vypočítán obsah polyfenolů. Výsledky jsou vyjádřeny v mg kyseliny gallové/ 1 l vzorku (mg GA dm 3 ). Z (Obr. 8) lze vyčíst, že vodné extrakty obsahují mnohem vyšší obsah polyfenolů než ethanolové extrakty. Úplně nejvyšší obsah polyfenolů byl stanoven ve vodném výluhu směsi. Také si můžeme povšimnout, že vyšší hodnoty polyfenolů byly více zaznamenány v čajové směsi než v šípkovém čaji a to v případě obou extrakčních technik i obou rozpouštědel. Tabulka 3: Průměrné hodnoty celkového obsahu polyfenolů proměřených extraktů (* u hodnoty absorbance znamená, že roztok byl 10krát zředěn) Extrakt Absorbance ± SD FCM [mg GA dm 3 ] ± SD šípek voda *0,386 ± 0,028 2483,3 ± 202 macerát šípek ethanol 0,247 ± 0,005 149,3 ± 3,5 směs voda *0,412 ± 0,003 2671,4 ± 23 směs ethanol 0,962 ± 0,067 660,0 ± 48 šípek voda *0,399 ± 0,020 2576,2 ± 141 výluh šípek ethanol 0,351 ± 0,011 223,6 ± 7,6 směs voda *0,433 ± 0,007 2819,0 ± 50 směs ethanol *0,117 ± 0,003 564,3 ± 20 29

M ŠV M ŠE M SV M SE V ŠV V ŠE V SV V SE 3000 2500 mg GAE dm -3 2000 1500 1000 500 0 Obr. 8: Stanovení celkových polyfenolů v jednotlivých extraktech metodou FCM 4.2 Stanovení celkového obsahu flavonoidů Stanovení celkového množství flavonoidů v rostlinných extraktech bylo provedeno pomocí spektrofotometrické metody reakcí s hlinitou solí a dusitanem. Za přítomnosti flavonoidů ve vzorku vznikalo oranžovočervené zbarvení, u kterého byla změřena absorbance při 510 nm. U každého vzorku bylo měření třikrát zopakováno a pro výpočet obsahu flavonoidů byla použita průměrná hodnota těchto měření. Celkový obsah flavonoidů byl získán dosazením naměřené absorbance do rovnice kalibrační křivky (Obr. 7) získané ze standardu katechinu. Výsledky jsou vyjádřeny v mg katechinu/ 1 l vzorku (mg C dm 3 ). Tabulka 4 uvádí přehled těchto výsledků. Stejně jako u stanovení celkových polyfenolů je i u stanovení flavonoidů koncentrace aktivních látek mnohem vyšší ve vodných extraktech, než v extraktech ethanolových (Obr. 9). Nejvyšší koncentrace flavonoidů byla stanovena v macerátu šípkového čaje, na rozdíl od stanovení polyfenolů je koncentrace flavonoidů ve vodných výluzích a macerátech vyšší u šípkového čaje než směsi. Rozdíl je navíc mnohem markantnější. 30

Tabulka 4: Průměrné hodnoty celkového obsahu flavonoidů proměřených extraktů Extrakt Absorbance ± SD ChMM [mg C dm 3 ] ± SD šípek voda *0,705 ± 0,011 2691,9 ± 44 macerát šípek ethanol 0,099 ± 0,001 36,2 ± 0,5 směs voda *0,356 ± 0,018 1348,3 ± 70 směs ethanol 0,543 ± 0,003 206,8 ± 1,0 šípek voda *0,510 ± 0,018 1940,6 ± 71 výluh šípek ethanol 0,058 ± 0,006 20,3 ± 2,2 směs voda *0,435 ± 0,010 1653,5 ± 37 směs ethanol 0,401 ± 0,009 152,3 ± 3,6 3000 2500 2000 mg C dm -3 1500 1000 500 0 M ŠV M ŠE M SV M SE V ŠV V ŠE V SV V SE Obr. 9: Stanovení celkových flavonoidů v jednotlivých extraktech spektrofotometricky 4.3 Stanovení celkové antioxidační aktivity Pro vyhodnocení celkové antioxidační aktivity vzorku byla použita metoda ABTS, jenž spočívá v měření schopnosti vzorku zhášet kation radikál ABTS +. Tento radikál byl připraven smícháním peroxodisíranu draselného s diamonnou solí ABTS. Zhášení radikálu bylo sledováno spektrofotometricky na základě změn absorpčního spektra ABTS +. Výsledná absorbance A vzorku byla vypočtena pomocí vzorce: A vz A0 A A 0 10 31

kde A 0 je absorbance ABTS + v čase t = 0 a A 10 je absorbance extraktu vzorku s ABTS + změřená po 10 minutách. Měření bylo pro každý vzorek třikrát zopakováno a pro výpočet byla použita průměrná hodnota. Takto získaná hodnota absorbance byla použita pro výpočet celkové antioxidační aktivity vzorku dosazením do kalibrační rovnice troloxu: A 1, 389 c. Výsledky jsou vztaženy na ekvivalentní množství troloxu a jsou vyjádřeny v µg troloxu/ 1 l vzorku (µg T dm 3 ). Výsledky jsou uvedeny v (Tabulka 5). Nejvyšší koncentrace antioxidačně aktivních látek byla stanovena ve vodném výluhu šípkového čaje, ale všechny vodné extrakty dosáhly velice podobných výsledků (Obr. 10). Na rozdíl od stanovení polyfenolů a flavonoidů byla zjištěna poměrně vysoká koncentrace antioxidačně aktivních látek také v ethanolovém macerátu a výluhu čajové směsi. Tabulka 5: Průměrné hodnoty celkové antioxidační aktivity proměřených extraktů Extrakt Absorbance ± SD ABTS [µg T dm 3 ] ± SD šípek voda 0,961 ± 0,015 0,692 ± 0,011 macerát šípek ethanol 0,250 ± 0,013 0,180 ± 0,009 směs voda 0,963 ±0,014 0,693 ± 0,010 směs ethanol 0,727 ±0,040 0,523 ± 0,028 šípek voda 0,982 ± 0,004 0,707 ± 0,003 výluh šípek ethanol 0,173 ± 0,013 0,124 ± 0,009 směs voda 0,934 ± 0,044 0,673 ± 0,032 směs ethanol 0,719 0,039 0,517 ± 0,028 0,8 0,7 0,6 0,5 µg T dm -3 0,4 0,3 0,2 0,1 0 M ŠV M ŠE M SV M SE V ŠV V ŠE V SV V SE Obr. 10: Stanovení celkové antioxidační aktivity v jednotlivých extraktech metodou ABTS 32