FRAKCIONACE BUNĚK / SEPARAČNÍ A ANALYTICKÉ TECHNIKY / PROTEINY / LIPIDY / NÍZKOMOLEKULÁRNÍ LÁTKY / HOMOGENIZACE TKÁNÍ, BUNĚK, CENTRIFUGAČNÍ TECHNIKY KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE, SEPARACE A ANALYTICKÁ STANOVENÍ, MALDI TOF PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE
HOMOGENIZACE TKÁNÍ / BUNĚK
CENTRIFUGACE / ULTRACENTRIFUGACE: úhlový rotor výkyvný rotor
DIFERENCIÁLNÍ CENTRIFUGACE: izolace subcelulárních frakcí
CENTRIFUGACE V SACHARÓZOVÉM GRADIENTU (např. izolace nukleárního receptoru s navázaným ligandem)
Kapalinová chromatografie (LC, HPLC) PUMPA DÁVKOVÁNÍ KOLONA DETEKTOR
HPLC /LC/SPE: typy stacionárních a mobilních fází REVERSNÍ FÁZE nepolární stacionární fáze (C18, C8, fenyl) vs. mobilní fáze se snižující se polaritou (voda/metanol, voda/acetonitril/thf) NORMÁLNÍ FÁZE / IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE polární stacionární fáze (amino-, OH-) vs. mobilní fáze se zvyšující se polaritou GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE specifické zakončení stacionární fáze (protilátka, SH- apod.), rozdělení na základě specifických interakcí
HPLC /LC: typy detektorů FOTOMETRICKÝ (změna absorpce, jedna vln. délka nebo diode array detektor spektrum analytu) FLUORIMETRICKÝ (změna fluorescence, jedna excitační a jedna emisní vln. délka nebo diode array) RADIOMETRICKÝ (sloučeniny značené 3 H, 13 C, 32 P, 33 P) HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR (stanovení m/z) další detektory
Uspořádání spektrofotometrického a fluorimetrického detektoru zdroj světelného paprsku absorpce světla emise fluorescence
Hmotnostní spektrometrie generování iontů (ionizace elektronovým paprskem aj.) separace iontů podle poměru hmotnost / náboj (m/z) nejčastěji ionizace, vznik pozitivních iontů (M+) a event. specifická fragmentace molekul; - chemická ionizace (nepřímá ionizace reakčním plynem jako je metan, amoniak) vznik intenzívního iontu M+1; - separace iontů, např. kvadrupólový analyzátor měření množství jednotlivých iontů hmotnostní spektrum v daném časovém bodě; chromatogram: osa x: čas, osa y: vybraný parametr, např. m/z.
Typické spektrum z MS
MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry): základní uspořádání konverze dat: TOF spektrum ( t = (m/z) 1/2 hmotnostní spektrum
MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry): ionizace vzorku (matrix + analyt)
Gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
nízkotlaká LC, SPE: separace bílkovin a nízkomolekulárních látek (nukleotidy, metabolity, xenobiotika)
Gelová filtrace: separace standardních bílkovin / spektrofotometrická detekce
Gelová filtrace s radiometrickou detekcí specifickou pro značený substrát a metabolity
Iontová chromatografie
Ionexová HPLC: rozdělení proteinů zvyšující se iontovou silou mobilní fáze
Afinitní chromatografie Na sorbentu navázaný substrát, protilátka, koenzym apod.
PŘÍKLADY HPLC ANALÝZ Koncentrace steroidního hormonu, stanovení aktivity CYP3A isoenzymů (6beta-OH-T), CYP19 (T E2) Koncentrace mastných kyselin, stanovení aktivity PLA, COX, LOX apod. Stanovení cizorodých látek, které se obtížně zplyňují nebo jsou termolabilní (vysokomolekulární PAHs) Preparativní HPLC (izolace nukleotidů, metabolitů, peptidů, protilátek atd.) MALDI-TOF (LC-MS velkých molekul fragmentovaných bílkovin)
Reversní HPLC analýza PAHs: detekce pomocí diode-array detektoru (DAD) chromatogr. záznam při vybraných vlnových délkách
HPLC analýza hydroxylovaných metabolitů testosteronu (spektrofotometr. det.) 6 -hydroxytestosteron
HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci pyrenyldiazomethanem AA
HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci PDAM (fluor. detekce) AA
Stanovení aromatázové aktivity (HPLC analýza koncentrace produktu - E2) E2
MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry): příklad stanovení peptidových fragmentů Fragmenty po rozštěpení vazeb peptidů Iontová fragmentace peptidu (ion decay mass spectrum): -přesné stanovení mol. hmotnosti; - primární sekvence
UŽITÍ LC PRO FRAKCIONACI VZORKŮ -PŘÍKLAD STANOVENÍ ORGANICKÝCH CIZORODÝCH LÁTEK SAMPLING EXTRACTION GPC HIGH-MOLECULAR FRACTION PAH FRACTION hexane Silica gel fractionation DCM/ hexane DCM methanol ALIPHATIC FRACTION GC NEUTRAL AROMATIC FRACTION Aminopropyl silica column SEMIPOLAR FRACTION NPAHs, oxy- PAHs GC POLAR FRACTION carboxy-, aldehydes etc. GC HPLC, GC PAHs<252 PAHs>252 HPLC
Uspořádání plynového chromatografu (GC) Detektory: FID ECD (chlor. látky) MS (rozdělení podle hmotností fragmentů)
GC: Přechod látek mezi stacionární a mobilní fází
GC/ECD (electron capture detector): princip detekce anoda e - e - Cl + e - Cl - vychytávání elektronů chlorovanými látkami, snížení el. proudu Ni 63 Ni 63 = -zářič nosný plyn + analyty
GC/MS: Chromatogram Plots Plot 1: c:\... \saze_2_25.10.2004_2 µl z 300_ric.sm s R IC all Plot 2: c:\... \saze_2_25.10.2004_2 µl z 300_202.sm s Ion: 202 all Plot 3: c:\... \saze_2_25.10.2004_2 µl z 300_228.sm s Ion: 228 all Plot 4: c:\... \saze_2_25.10.2004_2 µl z 300_252.sm s Ion: 252 all Plot 5: c:\... \saze_2_25.10.2004_2 µl z 300_242.sm s Ion: 242 all M Counts 7 6 5 4 3 2 1 0 M Counts RIC all saze_2_25.10.2004_2 µl z 300_ric.sms Naphthalene Acenaphthylene Acenaphthene Fluorene Phenanthrene Anthracene Fluoranthene Benz[a]anthracene Chrysene Benzo[b]fluoranthene Benzo[k]fluoranthene Benzo[a]pyrene Benzo[c]chrysene + Pyrene Indeno[1,2,3-cd]pyrene Dibenz[a,h]anthracene Benzo[ghi]perylene analýza PAHs (SIM fragmenty M + = různé MW) Ion: 202 all saze_2_25.10.2004_2 µl z 300_202.sm 4 Fluoranthene PAH 202_2 Pyrene MW 202 3 2 1 0 kc ounts Ion: 228 all saze_2_25.10.2004_2 µl z 300_228.sm 500 Benzo[c]phenanthrene Benz[a]anthracene Chrysene + Triphenylene PAH 228_1 MW 228 400 300 200 100 0 kc ounts Ion: 252 all saze_2_25.10.2004_2 µl z 300_252.sm 125 Benzo[b]fluoranthene Benzo[k]fluoranthene Benzo[j]fluorathene Benzo[a]fluoranthene MW 252 100 Benzo[e]pyrene Benzo[a]pyrene 75 Perylene 50 25 0 kc ounts Ion: 242 all saze_2_25.10.2004_2 µl z 300_242.sm 30 20 2-MePy 4-MePy 1-MePy 242 No. 1 242 No. 2 242 No. 3 242 No. 4 242 242 No. No. X15 2-MeBaA7 1+4+6-MeBaA 3-MeChry 7-MeBaA 9-MeBaA 3+5-MeBaA 2-MeChry 5-MeChry 6-MeChry 4-MeChry 1-MeChry 242 10-MeBaA No. X2 MW 242 10 0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 m inutes
STANOVENÍ ENZYMATICKÉ AKTIVITY / ENZYMOVÁ KINETIKA E + ES [ES] E + P Stanovení produktu: koncentrace produktu / čas. prot. = pmol produktu / min. (mg prot./ml) Příklady stanovení: - fluorimetrické stanovení produkce resorufinu (EROD, MROD, PROD, BROD); - HPLC stanovení metabolitů mastných kyselin, např. 5-OH-FA (5-LOX); - chemiluminiscenční stanovení luciferázy
Enzymová kinetika: ustálený stav (steady state) E + S [ES] P + E
SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍ spektrofluorimetrická detekce produktu enzymové reakce silně flureskujícího resorufinu (exc. 530-570, em. 585 nm)