Vybrané imunologické metody Ing. Petra Šandová Klinická imunologie a alergologie laboratoř ÚKBLD a 1. LF UK VFN
Laboratorní imunologická vyšetření Humorální imunita proteiny krevního séra (Ig, C, CRP), IK paraproteiny, kryoglobuliny specifické IgE, ECP autoprotilátky Buněčná imunita subpopulace lymfocytů - imunofenotypizace intracelulární cytokiny fagocytóza HLA B27
Laboratorní imunologická vyšetření Periferní krev Humorální imunita - sérum, plazma Buněčná imunita - plná krev s antikoagulačním činidlem Tělní tekutiny - likvor, BAL, punktáty, výpotky
Indikace laboratorních vyšetření v klinické imunologii Určení diagnózy Diferenciální diagnostika Potvrzení diagnózy Monitorování terapie Screening rodin
Imunologické laboratorní metody 1. volby Hladiny imunoglobulinů - IgG, IgA, IgM event. IgE Cirkulující imunokomplexy metodou PEG C3, C4 složka komplementu Antinukleární protilátky (ANAb) metodou NIF ENA screening Stanovení povrchových znaků lymfocytů (CD3, CD4, CD8), B lymfocytů (CD19, CD20), NK buněk (CD3-CD16+56+) U dětí vyšetření fagocytózy
Imunologické laboratorní metody 1. volby Součástí kompletního imunologického vyšetření je vždy: kompletní krevní obraz t.j. včetně diferenciálního rozpočtu leukocytů FW (ev. CRP zejména u dětí)
Imunologické laboratorní metody 2. volby Autoprotilátky orgánově nespecifické (dsdna, ENA typizace, ANCA, APLA, SMAb, AMAb a další) Orgánově specifické protilátky (anti-ttg, ASCA, anti-tg, anti-tpo, LKM a další) Další ukazatele buněčné imunity např. znaky aktivace T lymfocytů, adhezívní molekuly Funkční testy T a B lymfocytů (blastická transformace) Vyšetření fagocytárních funkcí včetně oxidativního vzplanutí granulocytů
Imunologické laboratorní metody 2. volby Stanovení specifických IgE ECP C1 inhibitor, C1inh funkční test Stanovení sekrečního IgA Stanovení podtříd IgG1, IgG2, IgG3, IgG4
Principy laboratorních imunochemických metod Antigen + protilátka imunitní komplex detekce protilátky pomocí antigenu detekce antigenu pomocí protilátky Principy detekce přímá detekce nepřímá detekce detekce založená na značení antigenu nebo protilátky
Přímá detekce Ag nebo Ab Imunonefelometrie Imunoturbidimetrie Radiální imunodifúze Imunoelektroforéza Protisměrná imunoelektroforéza Imunofixační elektroforéza
Imunonefelometrie Ig, složky komplementu, CRP, CIK-C1q Měření světla rozptýleného na komlexech Ag-Ab
Imunonefelometrie Dade Behring BN II
Radiální imunodifúze C1q Kruhová difúze roztoku Ag z kruhové jamky do vrstvy gelu s obsahem protilátky
CH100 Funkční test stanovení celkové hemolytické aktivity komplementu V gelu ovčí ery s navázanou Ab proti ovčím ery. Séra se pipetují do aplikačních jamek Komplement se aktivuje při 37 0 C (klasická cesta) Lýza ery - projasnění
Protisměrná imunoelektroforéza ENA screen Migrace antigenu a protilátky při elektroforéze proti sobě
Imunofixační elektroforéza Gamapatie Elektroforetická separace proteinů na gelu Imunoprecipitace s monospecifickými antiséry
Nepřímá detekce Ag nebo Ab Latex fixační test Nepřímá (pasivní) hemaglutinace Aglutinační inhibiční test Komplement fixační reakce
Latex fixační test RF Latexová částice Ab + Ag aglutinace
Nepřímá hemaglutinace Protilátky proti zona pellucida Antigen je adsorbován na erytrocytech Protilátka je přítomna ve vzorku V případě nepřítomnosti hledané protilátky nedojde k hemaglutinaci
Detekce založená na značení antigenu nebo protilátky Enzymy EIA Flurochromy FIA Chemiluminiscenční látky CLIA Radionuklidy - RIA
Enzymová imunoanalýza Stanovení autoprotilátek ELISA enzymová imunoanalýza na pevné fázi
Enzymová imunoanalýza Imunoblotting WB Dot blot ENA typizace Anti-gangliosidy AMAb II Jaterní blot
Protilátky proti extrahovatelnému nukleárnímu antigenu Anti-SSA/Ro Anti-SSB/La Anti-Sm (B B) Anti-Sm (D) Anti-Scl 70 Anti-RNP Anti-Pm-Scl Anti-NuMA Anti-Ku Anti-Jo Anti-histon ACA SLE, Sjögrenův syndrom SLE, Sjögrenův syndrom SLE SLE systémová sklerodermie smíšená choroba pojiva SLE polymyositida, dermatomyositida Sjögrenův syndrom, SLE, RA sklerodermie dermatomyositida, polymyositida léky indukovaný SLE, SLE, RA CREST syndrom, sklerodermie
Fluorescenční imunoanalýza Stanovení autoprotilátek Nepřímá imunofluorescence
Fluorescenční imunoanalýza Typy substrátů Tkáňovéřezy krysí - LKS Tkáňovéřezy opičí - ovaria, ledviny, mozeček, nadledvinky, endomýzium Suspenze - prvok Crithidia luciliae - lidské granulocyty Tkáňové kultury - HEp-2, HUVEC
Tkáňovéřezy krysí AMAb GPCAb SMAb
Tkáňovéřezy opičí Protilátky proti bazální membráně glomerulů (GBM)
Suspenze: lidské granulocyty canca panca
Suspenze: prvok Crithidia lucilae Protilátky proti dsdna
Tkáňové kultury: HEp-2 buňky Antinukleární protilátky (ANAb)
Antigenní cíle v buňce Antigenní cíle v buňce Jaderné autoantigeny polynukleotidy histony ribonukleoproteiny antigeny jadérek centroméra další antigeny Antigeny asociované s dělením buňky centriola dělící vřeténko separační zóna buňky Orgánově nespecifické antigeny cytoplazmy buněčné organely antigeny cytoskeletu další antigeny Jaderná membrána s póry
Průtoková cytometrie Technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množství částic (např. buněk) v suspenzi Buňky lze rozlišit dle jejich velikosti (FSC), granularity (SSC), obsahu DNA, značením monoklonálními Ab,
Průtoková cytometrie SSC 0 200 400 600 800 1000 Eosinofily Neutrofily Monocyty Lymfocyty a 0 200 400 600 800 1000 Bazofily Trombocyty, erytrocyty a debris FSC
Průtoková cytometrie CD19 PE CD3 FITC
Průtoková cytometrie Průtokový cytometr BD FACS Canto
Chemiluminiscenční imunoanalýza Stanovení specifických IgE, ECP Immulite 2000 Alkalická fosfatáza - detekce tímto enzymem vyvolaného luminiscenčního záření
Chemiluminiscenční imunoanalýza Stanovení specifických IgE Advia Centaur Acridium ester emitace světla při oxidaci H 2 O 2 v alkalickém prostředí
Kryoglobuliny Imunoglobuliny precipitující v chladu Speciální odběr 3 typy: Typ I. monoklonální kryoglobuliny, paraproteiny IgG, IgM, IgA Typ II. smíšené kryoglobuliny, kombinace paraproteinu s polyklonálním Ig Typ III. polyklonální imunoglobuliny
Děkuji za pozornost!