Význam metalothioneinu v maligním potenciálu nádorových buněk Diplomová práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Význam metalothioneinu v maligním potenciálu nádorových buněk Diplomová práce Vedoucí práce: doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D. Vypracoval: Bc. Markéta Sztalmachová Brno 2013

ZADÁNÍ

Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Význam metalothioneinu v maligním potenciálu nádorových buněk vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a byla zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně dne... Podpis diplomanta...

Experimentální část této diplomové práce byla realizována na výzkumné infrastruktuře vybudované v rámci projektu CZ.1.05/2.1.00/03.0072 Centrum senzorických, informačních a komunikačních systémů (SIX) operačního programu Výzkum a vývoj pro inovace. Finanční podpora byla poskytnuta Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky.

Poděkování Chtěla bych poděkovat doc. RNDr. Vojtěchu Adamovi, Ph.D., vedoucímu své diplomové práce. Velké díky patří především RNDr. Michalovi Masaříkovi, Ph.D, za odborné vedení a pomoc při vypracování této práce, dále MUDr. Jaromíru Gumulcovi, Mgr. Martině Raudenské, Ph.D. a všem dalším kolegům z ústavu patologické fyziologie LF MU, kde tato práce vznikla. Díky patří také Dr. Vladimíru Pekaříkovi, Ph.D., za přípravu plazmidu. Obrovské díky patří mému příteli Tomášovi za obrovskou trpělivost a podporu. Také bych ráda poděkovala své mamince a celé rodině, za to že mě vedli správným směrem. Tato práce byla podpořena projekty NanoBioMetalNet CZ.1.07/2.4.00/31.0023 a CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Abstrakt Cílem této práce byla především analýza MT a ověření jeho vlivu v patogenezi nádorových onemocnění. Práce je zaměřena na nádorová onemocnění prsu a prostaty a roli metalothioneinu (MT) v jejich patogenezi. Experimenty byly prováděny na buněčných liniích (PNT1A, PC-3, 4T1, 4T1 se zvýšenou expresí MT), ale také na zvířecím experimentálním modelu (myši kmene Balb/c). Analýza byla provedena jak na úrovni expresí genů MT1 a MT2, tak na proteinové úrovni. U zvířecích modelů byla navíc provedena analýza exprese genů p53 a MTF-1. Bylo využito MTT testů, systému xcelligence RTCA DP a real-time PCR. Z výsledků vyplývá, že exprese genů MT1, MT2, p53 a MTF-1 i hladina MT1 a MT2 na proteinové úrovni je ovlivněna typem tkáně. V jaterní tkáni u zvířat s indukovaným nádorem a suplementovaných zinkem je zvýšená exprese MT1 a MT2 genů. Byl prokázán vliv suplementace zinku na velikost nádorů. Klíčová slova Metalothionein, buněčné kultury, Balb/c myši, zinek, karcinomy prsu, metastázy Abstract The aim of this work was mainly MT analysis and verification of its influence in the pathogenesis of cancer. I focused on breast cancer and prostate cancer and the role of metallothionein (MT) in their pathogenesis. Experiments were performed on cell lines (PNT1A, PC-3, 4T1, 4T1 overexpressing MT), but also in an animal experimental model (mice Balb / c). Analysis was performed at the level of gene expression of MT1 and MT2, and at the protein level. In animal models were also analyzed gene expression of p53 and MTF-first We used MTT assays, the xcelligence RTCA DP and real-time PCR. The results show that the expression of genes MT1, MT2, p53 and MTF-1 and the level of MT1 and MT2 at the protein level is affected by the type of tissue. In liver tissue in animals with induced tumors and supplemented with zinc is overexpression MT1 and MT2 gene. The effect of the supplementation of zinc on tumor size has been shown. Keywords Metallothionein, Cell lines, Balb/c mouse, zinc, breast cancer, metastasis

Obsah 1 Úvod... 9 2 Literární přehled... 10 2.1 Metalothionein (MT)... 10 2.1.1 Struktura metalothioneinu... 10 2.1.2 Izoformy metalothioneinu... 11 2.1.3 Biologické funkce metalothioneinu... 13 2.1.4 Genová exprese a syntéza metalothioneinu... 16 2.1.5 Metabolizmus těžkých kovů a MT... 18 2.1.6 Role metalothioneinů v karcinogenezi... 19 2.2 Nádorová onemocnění prsu... 20 2.2.1 Biomarkery používané v diagnostice karcinomu prsu... 20 2.2.2 Mutace supresorových genů BRCA1, BRCA2 a p53... 21 2.2.3 Prediktivní faktory léčebné odpovědi... 21 2.2.4 Metalothionein jako nový biomarker v diagnostice karcinomu prsu?... 23 3 Cíle práce... 24 4 Materiál a metodika... 25 4.1 Materiál... 25 4.1.1 Chemikálie... 25 4.1.2 Přístrojové vybavení... 25 4.1.3 Plazmid... 25 4.2 Metody... 26 4.2.1 Buněčné kultivace... 26 4.2.2 MTT... 27 4.2.3 Real-time monitoring pomocí systému xcelligence RTCA DP... 27 4.2.4 Transfekce prsní linie 4T1... 27 4.2.5 Buněčná invazivita a migrace s použitím systému xcelligence RTCA DP... 28 4.2.6 Izolace RNA z buněk a reverzní transkripce... 29 4.2.7 Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (q-pcr)- cdna z buněk... 29 4.2.8 Pokusná zvířata... 29 4.2.9 Aplikace nádorových buněk 4T1 zvířatům... 30 4.2.10 Sledování růstu nádoru a ukončení experimentu... 31

4.2.11 Izolace RNA z tkání a reverzní transkripce... 32 4.2.12 Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (q-pcr)- cdna z tkání... 32 4.2.13 Příprava buněčných lyzátů... 32 4.2.14 Stanovení proteinů... 33 4.2.15 Stanovení MT pomocí Dot Blotu... 33 4.2.16 Statistická analýza... 34 5 Výsledky... 35 5.1 Výsledky MTT testů... 35 5.2 Real-time monitoring pomocí xcelligence systému... 35 5.3 Invazivita a migrace buněčných linií... 37 5.4 Stanovení exprese MT1 amt2 z buněčných lyzátů... 41 5.5 Stanovení exprese MT1, MT2, MTF-1, p53 z tkáňových lyzátů... 43 5.6 Stanovení MT z tkáňových lyzátů na proteinové úrovni... 44 5.7 Zobecnění efektu suplementace zinkem a indukce tumoru na všechny tkáně. 45 5.8 Vliv suplementace zinkem, typu tkáně a indukce nádoru... 46 6 Diskuze... 53 7 Závěr... 56 8 Přehled použité literatury... 57 9 Seznam obrázků... 66 10 Seznam tabulek... 67 11 Přílohy... 68

Seznam zkratek MT metalothionein AMK aminokyselina GSH redukovaný glutathion GSSG oxidovaný glutathion ATP adenozintrifosfát GTP guanozintrifosfát ROS reaktivní formy kyslíku (reactive oxygen species) DNA/RNA deoxyribonukleová/ribonukleová kyselina mrna mediátorová ribonukleová kyselina MTF-1 metal regulační transkripční faktor MRE metal responzivní element GIF růstový inhibiční faktor (growth-inhibitory factor) CA 15-3 nádorový antigen (cancer antigen 15-3) CEA karcinoemryonální antigen (carcinoembryonic antigen) ER estrogenový receptor PR progesteronový receptor HER2 lidský receptor epidermálního růstového faktoru 2 (human epidermal growth factor receptor 2)

1 ÚVOD Co stojí za vznikem nádorového onemocnění? Dá se mu účinně předcházet? Pokud už se tato nemoc objeví, jakou léčbu zvolit a jakou má člověk šanci, že léčba u něj bude účinná? Existuje mnoho nezodpovězených otázek na toto téma. Je jasné, že se ve většině případů nejedná o onemocnění vyvolané jediným faktorem, ale jedná se o multifaktoriální onemocnění. Není proto divu, že se dnes výzkumem na toto téma zabývá mnoho pracovišť. Těžko říci, zda se této chorobě dá předcházet, ale je důležité najít účinnou léčbu. V případě, že již u člověka rakovina propuknula, je velice důležité diagnostikovat tuto nemoc včas. Tímto problémem se dnes zabývá velké množství vědeckých pracovišť a mnoho z nich se zaměřilo na hledání markerů, které na nemoc upozorní. V praxi se již některé z těchto markerů používají, ale i přesto se stále nedaří boj s touto nemocí vyhrát. Z markerů, které se již zavedly do praxe, bych mohla zmínit prostatický specifický antigen (PSA), který se využívá v diagnostice karcinomu prostaty. U karcinomů prsu se jako prognostické markery používají estrogenový receptor, progesteronový receptor či HER2 receptor. U karcinomu prsu hraje ve vzniku tohoto onemocnění velkou roli také genetika, a proto se do praxe zavedlo genetické testování genů BRCA1 a BRCA2. Ženy s mutací v tomto genu mají zvýšené riziko vzniku této nemoci. Toto testování je také jednou z možností jak preventivně předcházet vzniku karcinomu prsu. V této diplomové práci se zabývám metalothioneinem, jakožto potenciálním markerem v karcinogenezi. 9

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Metalothionein (MT) Metalothioneiny (MT) jsou nízkomolekulární intracelulární proteiny bohaté na cystein, jejichž hmotnost se pohybuje v rozmezí 6-10 kda. [28, 31, 59, 80, 101] Cystein zaujímá až 30 % hmotnosti molekuly. [59, 91, 96, 97] Díky thiolovým skupinám cysteinu tvoří metalothionein vazby s atomy kovů, proto má důležitou roli v přenosu těžkých kovů a jejich detoxikaci. [2, 24, 28, 58, 60, 64, 91] MTs jsou termostabilní proteiny [16, 94] a obvykle se nachází v intracelulárním prostředí, ale můžeme je nalézt také v krvi, plazmě či mozkomíšním moku. [13] Nejvyšší koncentrace MT v těle jsou v játrech, ledvinách, střevech a slinivce břišní. [22] MT byl poprvé popsán v roce 1957, kdy ho při hledání látek zodpovědných za akumulaci dvojmocných kovů v buňkách ledvin izolovali M. Margoshes a B. L. Vallee. [65] Následně byl identifikován téměř ve všech organizmech, a to jak u bakterií, rostlin, bezobratlých, tak i u obratlovců. [63, 80, 91] Díky zvýšené akumulaci MT v organizmu, který byl vystaven působení těžkých kovů, je MT používán jako biomarker při sledování znečištění životního prostředí. [76, 81, 103] 2.1.1 Struktura metalothioneinu Molekula MT je složena ze dvou domén, značených jako α a β domény. [30, 32, 59, 60, 95] β-doména obsahuje devět cysteinových zbytků a má tři vazebná místa. α-doména má 11 cysteinových zbytků a je schopna vázat 4 dvojmocné ionty (Obrázek č. 1). [33, 91, 95] Jedna molekula MT může navázat až 12 monovalentních iontů nebo 7 dvojmocných iontů kovů. Afinita k jednotlivým kovům klesá v pořadí Hg-Ag-Cu-Cd-Zn. [22, 59, 60] MT se obvykle vyskytuje v komplexu se zinkem či mědi (ZnMT a CuMT) nebo jako smíšená forma několika kovů (např. Zn, CuMT). U savců je dominantní především ZnMT forma. [91] Tento termostabilní protein je složen z 61 68 aminokyselin (AMK), 20 z nich jsou cysteiny a nenajdeme zde žádnou aromatickou aminokyselinu či histidin. [22, 33, 82, 95] Koordinace kovových iontů pak určuje trojrozměrnou strukturu. [16] Jako apo-mt je označována molekula, která neobsahuje kovy. [16] Je charakteristická šestkrát opakující se repeticí C-X-C (C značí cystein, X může být libovolná AMK) a jednou odlišnou sekvencí K-X(1,2)-C-C-X-C-C-P-X(2)-C. [28, 82] 10

Obrázek 1: Struktura metalothioneinu MT složený ze dvou domén (α-doména a β-doména). Tečkovaně jsou naznačeny vazby mezi cysteiny obsahující SH skupiny (žlutě) a kovem (zeleně). Převzato z http://www.protein.pl [cit. 2012-03-28]. 2.1.2 Izoformy metalothioneinu Metalothionein má čtyři izoformy: MT1 až MT4 (Obrázek č. 2). Zatímco izoformy 1 a 2 se vyskytují v řadě tkání a dominantně vážou kovy, izoformy 3 a 4 se vyznačují buněčnou specifičností. [25, 38, 91, 95] Izoformy MT1 a MT2 se nachází především v játrech, slinivce, střevech a ledvinách. [6] Izoforma MT3, též nazývaná jako neuronový růstový inhibiční faktor (GIF- growth-inhibitory factor), se vyskytuje především v mozkové tkáni [69] a byla pozorována i v glomerulech ledvin. [25] Podílí se na vzniku, ale také na průběhu apoptózy mozkových buněk. [94] MT4 se nachází v epitelech a to hlavně v ústní dutině, horní části gastrointestinálního traktu a v kůži. [57, 82, 91, 99] Zapojuje se do regulace žaludečního ph a také chrání kůži před spálením a jinými kožními traumaty. [94] 11

Obrázek 2: Izoformy metalothioneinu a jejich lokalizace v savčím organismu. Upraveno dle [24] Exprese MT1 a MT2 může být vyvolána mnoha faktory, jako jsou kovy, glukokortikoidy, cytokiny či oxidační stres. Exprese MT3 a MT4 je přísně tkáňově specificky regulována. [91] I přes různorodost výskytu jednotlivých izoforem v tkáních jsou mezi nimi patrné sekvenční shody, jako například vysoký podíl cysteinu (obrázek č. 3). [80] Izoformy MT1 a MT2 mají roli převážně v detoxikaci kovů, zatímco MT3 se podílí na udržování homeostázy zinku v neuronech. [28, 70, 82] Exprese genů MT1 a MT2 v orgánech může být mimo jiné ovlivněna pohlavím a věkem. [82] U dospělých savců byly MT1 a MT2 lokalizovány převážně v cytoplazmě, ale i v lysozomech, mitochondriích a v jádrech. Tyto dvě izoformy se vyskytují nejčastěji a byly rozsáhle studovány zejména ve vztahu k jejich roli v homeostáze kovů a detoxikaci. [38, 82] U lidí bylo detekováno osm funkčních (MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1X a MT2A) a sedm nefunkčních (MT1C, MT1D, MT1I, MT1J, MT1K, MT1L a MT2B) izoforem MT1 a MT2. [36, 62]. 12

MT1 MDPN-CSCSTGGSCTCTSSCACKNCKCTSCKKSCCSCCPVGCSKCAQGCVCKG...AADKCTCCA 61 MT2 MDPN-CSCASDGSCSCAGACKCKQCKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCSQGCICKE.ASDKCSCCA 61 MT3 MDPETCPCPTGGSCTCSDKCKCKGCKCTNCKKSCCSCCPAGCEKCAKDCVCKGEEGAKAEAEKCSCCQ 68 MT4 MDPGECTCMSGGICICGDNCKCTTCSCKTCRKSCCPCCPPGCAKCARGCICKG.GSDKCSCCP 62 Obrázek 3: Porovnání sekvencí AMK izoforem MT1 až MT4 u myši. Na konci sekvence je uveden počet AMK v daném proteinu. Červeně je vyznačen cystein. Upraveno dle [34] 2.1.3 Biologické funkce metalothioneinu Metalothionein je považován za víceúčelový protein. [13, 16] Jedna z nejdůležitějších funkcí MT je detoxikace kovů, udržování jejich hladiny v buňkách (zachycení, skladování, distribuce a vyloučení kovu) a také ochrana před buněčným stresem. [9, 40, 76, 80, 83, 91, 99] MT má vysokou afinitu k zinku a je tedy silným akceptorem zinečnatých iontů, které do buňky vstupují z extracelulárního prostředí přes cytoplazmatickou membránu, z lysozomů po degradaci molekul obsahujících zinek nebo po vyloučení Zn 2+ z jiných vnitrobuněčných struktur. Zinek má zásadní význam pro zachování zdraví a je nezbytný pro fungování řady enzymů a transkripčních faktorů. [15, 38, 55, 99] Pět až dvacet procent zinku nacházejícího se v buňce je asociováno s MT. Díky tomuto vychytávání je intracelulární koncentrace volného zinku nízká. [90, 91] Význam MT je stále zřetelnější především ve schopnosti udržovat homeostázu. [9, 69] Mnoho studií poukazuje na to, že MT je jeden z hlavních proteinů vázajících zinek. [99] I přes vysokou stabilitu komplexu ZnMT mohou být zinečnaté ionty uvolněny z molekuly a vznikne apo-mt a naopak, kdy se zinek naváže na apo-mt za vzniku molekuly ZnMT. Toto je možno sledovat u redoxních reakcí prostřednictvím redukovaného (GSH) a oxidovaného glutathionu (GSSG), které jsou katalyzovány proteiny obsahujícími selen. GSSG oxiduje ZnMT, dochází ke zvýšenému uvolňování Zn 2+ z molekuly a ke vzniku apo-mt. Tato forma MT může být degradována nebo použita v prostředí s vysokým obsahem GSH s pomocí selenu jako katalyzátoru. Pokud převládá GSH, váže se s MT a snižuje uvolňování zinečnatých iontů z molekuly. MT může být rychle regenerován s rostoucí koncentrací zinečnatých iontů (obrázek č. 4). [16, 23] Zatímco zvýšená koncentrace GSH snižuje koncentraci volného Zn 2+, ROS a GSSG zvyšují uvolňování zinku ze ZnMT a jeho přenos do různých jaderných proteinů, které mají antioxidační působení. [82] Ve výše uvedených mechanizmech je redoxní stav jedním z hlavních regulátorů výměny Zn 2+ mezi MT a dalšími intracelulárními molekulami. 13

[97] Extracelulární MT s navázaným kovem může být internalizován endocytózou následně vstupuje do lysozomů. V lysozomech je kov uvolněn a apo-mt je hydrolyzován. [82] Obrázek 4: Zapojení MT v redoxním cyklu. Při zvýšené koncentraci Zn2+ dochází k jejich navázání na molekulu apo-mt. V oxidačním prostředí jsou zinečnaté ionty uvolňovány z molekuly MT a využity proteiny, jako jsou transkripční faktory či metaloenzymy. Oxidovaná forma apo-mt ox může podlehnout degradaci nebo může být využita v redukčním prostředí s pomocí selenu jako katalyzátoru. MT se následně regeneruje při zvýšení koncentrace Zn 2+. Upraveno dle [23] Metalothionein, který váže zinek či měď je důležitým úložištěm těchto kovů, které jsou kofaktory enzymů a jsou nezbytně důležité pro růst buněk. [74, 93] V případě potřeby jsou z MT uvolněny a použity pro syntézu apoenzymů [1, 28, 91]. Poskytování zinku a mědi je zásadní pro buněčnou proliferaci, diferenciaci a vývoj v prenatálním i perinatálním období. [54, 71] Zinek se významně podílí na imunitních reakcích, v signalizačních drahách, rakovině a stárnutí, a změny v jeho hladinách byly pozorovány také při nervových onemocněních. [44] Díky vlivům na hospodaření s kovy může tedy MT působit jako významné neuroprotektivum. [13] Uvádí se, že MT se podílí i na regeneraci po částečném odstranění orgánu, ochraně před neurodegenerativními onemocněními, ale v některých případech byly pozorovány též genotoxické a karcinogenní účinky MT. [28, 55, 82]. Kromě funkce uvolňování zinku z molekuly má MT i silné antioxidační vlastnosti, a to díky vysokému obsahu thiolových skupin, které z něj činí molekulu ideální pro interakci s reaktivními formami kyslíku (ROS). [51, 91] MT odstraňuje volné radikály vzniklé při běžném metabolizmu či oxidačním stresem, snižuje jejich účinek 14

v cytoplazmě a je považován za stresový biomarker. [76] Dále se váže s GSH, který bojuje proti produkci volných radikálů v cytoplazmě. [60, 93] Metalothionein se též podílí na translokaci zinku do mitochondrií a jádra. [2, 58, 60, 70, 82] V mitochondriích byl MT detekován v mezimembránovém prostoru a předpokládá se, že sem vstupuje z cytoplazmy ve formě ZnMT přes vnější mitochondriální membránu. Mechanizmus zůstává prozatím neznámý. V závislosti na přítomnosti zinku v mitochondriích reguluje ZnMT aktivitu zinek-dependentních metaloenzymů a reguluje rychlost dýchání. [20] Rychlost uvolňování zinku z ZnMT může být podpořena a posílena vazbou ATP či GTP k metaloproteinu. Kovy rychle se hromadící v mitochondrii, případně i přes Ca 2+ uniport ve vnitřní mitochondriální membráně, se váží na proteiny přenášející elektrony a zablokují oxidační fosforylaci, což má za následek nadprodukci ROS. Velká produkce ROS snižuje vazbu kovů na MT, jeho redoxní funkce a narušuje tvorbu ATP. Nadprodukce ROS může aktivovat mitochondriální proteiny zprostředkovávající signalizační kaskádu vedoucí buňky k apoptóze nebo nekróze. [82] V jádře je zinek potřebný pro normální funkci histonů a nehistonových proteinů, metaloenzymů (RNA a DNA polymerázy), transkripčních faktorů, zvláště pak pro zink-finger proteiny, které regulují aktivitu jednotlivých genů. MT zde představuje hlavní donor zinku. Bylo zjištěno, že v játrech dospělých zvířat a lidí je na rozdíl od plodu či novorozence velmi nízký obsah jaderného MT. U rostoucích zvířat byl rovněž nalezen vysoký obsah MT v jádrech, což odráží zvýšenou potřebu zinku v rychle rostoucích buňkách či v reparačních procesech. [47] Jaderný MT pochází z cytozolu, ale přesný mechanizmus jeho přesunu do jádra není zatím znám. Díky své malé velikost může MT procházet jadernými póry, ale molekula nacházející se v cytoplazmě musí být aktivována zatím neidentifikovaným cytozolovým faktorem. V aktivaci by mohly hrát roli malé G-proteiny a perinukleární cytoskelet. [20] Následně může být molekula MT přepravována a uchovávána v jádře. Podnětem pro translokaci MT může být obecně redoxní stav v buňce. Transport do jádra je posílen při oxidačním stresu souvisejícím se zvýšenou produkcí ROS. [82] V poslední době se ukazuje, že zvýšená exprese MT v buňkách indukuje antiapoptotické účinky. [16, 86, 99] S antiapoptotickým účinkem souvisí aktivace transkripčního jaderného faktoru (NF-kB), který může být aktivován různými podněty (tumor nekrotizující faktor, interleukin 1, hypoxie či ROS). Molekula NF-kB vyskytující se v cytoplazmě se skládá z podjednotek p50 a p65 a dále z inhibiční podjednotky. Pouze 15

doména p65 obsahuje transaktivační doménu, která aktivuje transkripci genů. [96, 97] Aktivace NF-kB je uskutečněna disociací její molekuly, degradací inhibiční podjednotky a následně translokaci NF-kB z cytoplazmy do jádra, kde se váže na DNA a indukuje transkripci řady genů zapojených do buněčné transformace, proliferace a angiogeneze. Zajímavé je, že tyto podněty aktivují zároveň MT, který zajišťuje stabilizaci NF-kB na DNA (obrázek č. 5). [52, 99] V souvislosti s aktivací NF-kB v procesu karcinogeneze se jako karcinogeny a nádorové promotery uvádějí toxické kovy, UV záření, azbest, benzopyren, ROS a další. V některých studiích byla zdokumentována aktivace NF-kB v nádorových buňkách. Aktivace NF-kB byla následována proliferací těchto buněk. [96, 97] Obrázek 5: Antiapoptotická role MT zprostředkovaná interakcí s NF-kB: NF-kB je složena ze dvou podjednotek P50 a P65, které jsou v cytoplazmě asociovány s inhibiční podjednotkou I-kB. Oxidací jsou aktivovány proteinkinázy a dochází k odštěpení inhibiční podjednotky I-kB od NF-kB. Inhibiční podjednotka je následně fosforylována a degradována. Disociační komplex NF-kB nyní může být translokován do jádra, kde se váže na DNA a aktivuje transkripci řady genů. MT zde působí jako stabilizátor vazby NF-kB na DNA. Upraveno dle [99] 2.1.4 Genová exprese a syntéza metalothioneinu V savčím genomu se nachází více genů pro MT, které ho kódují. U hlodavců je MT řízen čtyřmi geny nacházející se na chromozomu 8 (MT1 až MT4). Lidský MT je kódován 17 geny, které se nachází na chromozomu 16. [9, 22, 29, 56] Z nichž 13 genů kóduje izoformu MT1, 2 geny izoformu MT2, jeden gen je určen pro izoformu MT3 a jeden 16

pro MT4. [69] U těchto genů byl zjištěn výrazný polymorfizmus a každá forma má také více izoforem, které se mohou vyskytovat v různých částech tkání. [16, 82, 95] Jejich přesné fyziologické role a funkční charakteristiky jsou zatím nejasné. V regulaci genové exprese MT má klíčovou roli metal regulační transkripční faktor (MTF-1), který aktivuje transkripci MT v reakci na přítomnost kovů či oxidační stres (obrázek č. 6). [92, 97, 99, 101] Za normálních okolností se MTF-1 v buňce nachází v inaktivním stavu s navázaným MTI, což je inhibitor bránící navázání MTF-1 na MRE. [42, 91] MRE je sekvence DNA nutná pro navázání MTF-1 a následné spuštění transkripce a nachází se v několika kopiích v promotoru všech genů pro MT. [38, 54, 62, 101] Po vstupu iontu kovu do buňky se tento iont naváže na MTI a uvolní se tím MTF-1, který může zahájit transkripci MT. Vzrůstající koncentrace těžkých kovů tak může indukovat syntézu MT. [39, 42] MTF-1 je kovy vázající protein složený z šesti zinkových prstů a vyskytuje se u mnoha živočišných druhů od hmyzu až po savce. [29, 74] Transkripční faktory, které jsou ovlivňovány kovovými ionty a regulují expresi genů, patří mezi metal-regulační proteiny. Metal-regulační proteiny mohou regulovat transkripci nebo stabilitu mrna a následnou translaci. [38] Obrázek 6: Schéma regulace genové exprese MT. Vstup zinečnatých iontů do buňky je zajištěn pomocí zinkového transportéru ZIP-1. MTF-1 aktivován zinečnatými ionty se váže na MRE v promotoru a spouští transkripci apo-mt. Volné zinečnaté ionty se poté vážou na molekulu apo-mt za vzniku komplexu ZnMT. Upraveno dle [22] 17

Biosyntéza MT je řízená několika faktory. Zvýšená syntéza MT je pozorována v reakci na poranění tkání, při infekci, zánětech či nádorových onemocněních. [22] Jedním z hlavních faktorů je indukce syntézy kovy. [81, 92, 95] Při zvýšeném příjmu zinku či mědi se zvýší syntéza MT, především v játrech a ve střevech, což je jeden z přímých mechanismů detoxikace těžkých kovů. Carey a kol. [17] zjistili, že syntéza MT je indukována také při reakci na lipopolysacharidy, které jsou uvolněny při potratech a také při působení teratogenních faktorů. Metabolizmus MT je velice citlivý na hormonální regulaci realizovanou prostřednictvím glukokortikoidů, katecholaminů, glukagonu, steroidů, interleukinu-6, angiotensinu-2 a různých stresových faktorů. [37, 92, 95] Syntéza MT je zvýšená u rychle proliferující tkáně, což má důležitou roli u normálních, ale i u nádorových buněk. Zvýšená koncentrace MT u proliferujících buněk je přičítána vyšší hladině zinku a mědi a byla zaznamenána u různých nádorových onemocnění. [28, 71] Některé studie ukazují zvýšenou syntézu MT1 a MT2 u proliferujících a diferencujících se buněk oproti buňkám nedělícím se. Za těchto podmínek byla zvýšená hladina MT jak na úrovni mrna, tak na proteinové úrovni. [71, 87, 89, 99] Z těchto výsledků bylo navrženo, že MT buňku chrání před vysokou dávkou zinku vznikem ZnMT. [90] Metalothionein může být poměrně rychle degradován, přičemž hlavním místem odbouráváním jsou lysozomy. [95] Absence MT není smrtelná ani nijak škodlivá v případech, kdy není organizmus vystaven nadměrnému působení kovů. V případě absence MT je pozorována snížená tolerance ke kovům, vyšší citlivost k oxidačnímu stresu, náchylnost k zánětlivým procesům či infekcím. [16] 2.1.5 Metabolizmus těžkých kovů a MT Těžké kovy se do organizmu dostávají absorpcí kůží, inhalací či ingescí. Vdechnutá látka, která se nerozpustí v mukózních hlenech přechází do alveol a následně se dostává do krve. Při ingesci toxicitu kovu ovlivňuje jeho forma, rychlost průchodu trávicím traktem a množství proteinů, jako jsou právě metalothioneiny. V obou těchto případech se uplatňují mechanizmy difúze či aktivního transportu vazbou na specifické bílkoviny. [1] Detoxikace kovů probíhá převážně v játrech a ledvinách, ovšem ke kumulaci kovů dochází i v mozku a kostech. Těžké kovy navázané na MT jsou tedy transportovány do ledvin a jater a následně vyloučeny močí a stolicí. [46, 84, 92, 100] Schéma metabolizmu těžkých kovů a zapojení MT v něm je uvedeno na obrázku č. 7. 18

Obrázek 7: Metabolizmus těžkých kovů. Těžké kovy se do organizmu dostávají inhalací, absorpcí nebo ingescí a dále se dostávají do krevního oběhu. Krví se šíří do jater či ledvin a následně jsou vyloučeny v komplexu s MT. Upraveno dle [67] 2.1.6 Role metalothioneinů v karcinogenezi V posledních letech je MT zkoumán jako možný diagnostický marker progrese nádorů. Některé studie ukazují na zvýšenou hladinu MT v séru pacientů s karcinomem prsu, plic, trávícího systému, melanomu či urogenitálního traktu. [37, 40] Mezi expresí MT u jednotlivých typů nádorů existují rozdíly, což je projevem fenotypové rozmanitosti MT. [37] Obecně je zvýšená hladina MT spojena s horší prognózou. [6, 47] Zdá se, že MT může chránit nádorové buňky před apoptózou a zvyšovat tak odolnost nádorových buněk vůči radioterapii a chemoterapii. [13, 37, 86] Předpokládá se, že léky používané při nádorové terapii či jejich metabolity interagují s MT, čímž je inhibována přímá interakce léků s jejich cílem a snížená účinnost terapie. [47, 93, 98] MT také slouží jako dárce zinku pro transkripční faktory a může tak podporovat nádorovou buněčnou proliferaci či metastázování. [47] Na druhé straně některé studie zabývající se například karcinomem tlustého střeva nebo močového měchýře nepotvrdily významnou korelaci mezi expresí MT a karcinomy. [48, 73] Použití MT jako potenciálního markeru nádorové diferenciace a proliferace je ve stádium intenzivního výzkumu. [28] Biomedicínské aspekty MT byly zkoumány v onkologických studiích v souvislosti s cisplatinou, jakožto chemoterapeutikem. [27] Cisplatina je jedním z nejsilnějších protinádorových léků a je účinná u velké škály nádorů. Používá se také v kombinaci s radioterapií nebo spolu s chirurgickou léčbou. [53] Cytotoxické účinky cisplatiny jsou dány její vazbou na jadernou DNA. Narušením struktury DNA způsobí inhibici tran- 19

skripce a oprav jejího poškození [53] a také způsobuje okamžitou indukci syntézy MT. [16] 2.2 Nádorová onemocnění prsu Karcinom prsu je nejčastějším nádorovým onemocněním vyskytujícím se u žen a představuje 23 % z celkového počtu výskytu nádorových onemocnění. [49] I přes zvýšený výskyt se díky lepší terapii povedlo za posledních dvacet let snížit úmrtnost. [43] Karcinom prsu je komplexní genetické onemocnění charakterizované nahromaděním několika molekulárních změn. [79] Mezi faktory, které přispívají k rozvoji karcinomu prsu, patří postmenopauzální hormonální terapie, užívání perorální antikoncepce, pozdní věk při prvním porodu, konzumace alkoholu či obezita, ale také genetické či vrozené faktory. [3, 49, 75] Riziko vzniku karcinomu prsu roste v případě, pokud má žena blízkou příbuznou s tímto onemocněním nebo také pokud má více než jednoho vzdáleného příbuzného s tímto onemocněním. [68] K základním vyšetřovacím technikám patří mamografické vyšetření prsu, které se používá jako screeningová metoda. [14] V České republice se dle vyhlášky Ministerstva zdravotnictví ČR č. 3/2010 Sb. o stanovení obsahu a časového rozmezí preventivních prohlídek provádí mamografické vyšetření u žen od 45 let věku ve dvouletých intervalech. Nicméně senzitivita mamografie se pohybuje v rozmezí 63 až 87 % a dochází k falešným negativitám. Je tedy na místě doplnit mamografické vyšetření například stanovením biomarkerů pro daný typ karcinomu. Každopádně je v dnešní době mamografie stále nejúčinnějším nástrojem pro časnou detekci karcinomu prsu. [61] 2.2.1 Biomarkery používané v diagnostice karcinomu prsu Vyšetření biomarkerů je neinvazivní metoda a může omezit množství žen, které musejí podstoupit zbytečné bioptické vyšetření. Vyšetření nádorových markerů se v hojné míře používá při kontrole pacientů po léčbě, a tímto způsobem je možno včas rozeznat více než 50 % případů recidiv. [4] K rutinnímu vyšetření na přítomnost karcinomu prsu se dnes ve většině diagnostických center používá několik biomarkerů. Prvním markerem používaným v diagnostice karcinomu prsu byl Cancer antigen 15-3 (CA 15-3). Jedná se o cirkulující mucinový glykoprotein, jehož hladina v krvi se u zdravých jedinců pohybuje pod 30 U/ml. Senzitivita tohoto markeru dosahuje 50 80 %. [4] Dalším používaným markerem je karcinoembryonální antigen (CEA). Tento marker se používá i u ji- 20

ných typů nádorových onemocnění, přičemž u karcinomu prsu se jeho senzitivita pohybuje kolem 54 %. Používá se tedy společně s CA 15-3 jako marker druhé řady. U zdravých lidí se jeho hodnota v krvi pohybuje v koncentraci do 3 ng/ml. [4] CEA se vyskytuje ve 40 50 % případů s přítomností vzdálených metastáz, zatímco CA 15-3 je zvýšen především v případě lokálních karcinomů. [3] 2.2.2 Mutace supresorových genů BRCA1, BRCA2 a p53 U žen s významnou rodinnou anamnézou nádorového onemocnění prsu se používá genetické testování pro mutace v tumor supresorovém genu BRCA1 (breast cancer 1) nebo BRCA2 (breast cancer 2). [68] Gen BRCA1 je lokalizován na 17. chromozomu a je zapojen do řízení a kontroly buněčného cyklu a reparace poškozené DNA. Gen BRCA2 se nachází na 13. chromozomu a je zapojen do procesu homologní rekombinace. [72] Pacientky, u kterých byla zjištěna některá z těchto mutací, mají až devadesátinásobně zvýšené riziko vzniku karcinomu prsu. [3] Nositelem BRCA mutace je přibližně 25 % pacientek a i přes negativní výsledek mutačního testu může toto onemocnění propuknout. U nositelek těchto mutací se doporučuje běžné mamografické vyšetření, ale také preventivní odstranění prsu a chemoprevence. [85] Gen p53 je klíčový faktor v buněčné odezvě na poškození DNA a jeho mutací může dojít k rozvoji nádorových onemocnění. [45] Mutace genu p53 způsobuje zvýšené riziko onemocnění různými nádorovými onemocněními, včetně karcinomu prsu. [3, 93] Mutace genu p53 byla nejčastěji identifikována právě u tohoto onemocnění a je spojena s horší prognózou. Bylo prokázáno, že mutace v tomto genu je spojena s rezistencí k endokrinní terapii, radioterapii i k chemoterapii. [11] Dále byla také prokázaná pozitivní korelace mezi mutací genu p53 a zvýšenou hladinou MT1 a MT2 u nádorových onemocnění. [78] 2.2.3 Prediktivní faktory léčebné odpovědi K hodnocení prognostických a prediktivních informací o reakci na léčbu pacientky se používají následující faktory: estrogenový receptor (ER), progesteronový receptor (PR) a HER2 (human epidermal growth factor receptor 2). [79]. V současně době se uznává především kombinace těchto faktorů pospolu. V tomto případě se nejedná o cirkulující markery, ale stanovují se přímo z izolované tkáně. [77] 21