Základní techniky práce s tkáňovými kulturami Výzkum v lékařské biochemii ani v dalších biomedicínských oborech se v současnosti a změnu nelze v dohledné době vůbec očekávat neobejde bez experimentů na živých organismech. Pokusy na laboratorních zvířatech jsou však nákladné a z mnoha důvodů náročné (časově, personálně, požadavky na vybavení, komplikují je interindividuální rozdíly mezi zvířaty, ale i intraindividuální proměnlivost celého organismu např. cirkadiánní a roční biologické rytmy). Pominout nelze ani diskutovanou etickou stránku pokusů se živými zvířaty. V některých případech také není výhodné dělat pokus na celém organismu, orgánu či tkáni, ale je třeba zkoumat vlastnosti pouze určitého typu buněk. V posledních desetiletích si proto nelze základní medicínský výzkum představit bez dalšího experimentálního nástroje: tkáňových kultur. Úkolem tohoto praktického cvičení je seznámit se s některými technikami běžnými při práci s buněčnými kulturami. Historie tkáňových kultur začíná už na konci devatenáctého století: kolem roku 1885 Roux dokázal po určitou dobu udržet živé explantované kuřecí embryonální buňky v uměle připraveném médiu a několik dalších autorů dosáhlo v té době podobných výsledků. Nedařilo se však, aby se buňky dělily jako za podmínek in vivo. Ještě na konci 19. století se také podařilo zmrazit živé buňky a opět je rozmrazit, čehož se začalo využívat při inseminaci dobytka. Na přelomu 19. a 20. století dokázal Ross Harrison, že z nervové tkáně vyňaté z žabích embryí a uzavřené do komůrky s lymfou žáby vyrůstají nově vytvořené axony. Konečně ve čtyřicátých letech 20. století se objevily první úspěšné pokusy o založení buněčné kultury, v níž by se buňky množily a která by přežívala po delší, byť omezenou dobu. Techniky tkáňových kultur se postupně zdokonalovaly a výsledky začínaly být stále spolehlivější. Od osmdesátých let se tak tkáňové kultury staly běžným nástrojem nejen pro výzkum, ale začaly se používat i průmyslově k výrobě protilátek, některých léků a chemikálií. Zcela nepostradatelné jsou tyto metody pro molekulární biologii, vývoj nových léčiv apod. Práce s tkáňovými kulturami se v některých ohledech liší od ostatních technik používaných v biochemii. V první řadě je nutné, aby veškeré používané pomůcky a chemikálie byly sterilní a aby neobsahovaly některé toxické látky, které je jinak ve stopových množstvích běžně kontaminují. Kromě obvyklého vybavení jsou navíc nutné některé speciální přístroje a pomůcky. Proto jsou tyto techniky poměrně nákladné a vyžadují zvlášť vybudované laboratoře a vyškolený personál. Principiálně má práce s každou buněčnou linií několik fází: 1. izolace buněčného kmene 2. udržování buněčné linie a její expanze 3. využití namnožených buněk v pokusu. Většina buněčných linií má omezenou životnost, tj. podléhá stárnutí a po určité době se buňky přestanou dělit. Pouze některé tkáňové kultury jsou nesmrtelné zpravidla jde o buňky získané z nádorů nebo uměle imortalizované vnesením vhodných genů. V tom případě se hovoří o kontinuálních buněčných liniích. I v nich si buňky obvykle zachovávají schopnost regulace buněčného dělení. Pokud ji ztratí a dělí se nekontrolovaně, mluvíme o transformované buněčné linii. Velká většina buněčných linií vyžaduje k růstu vhodný povrch (dnes nejčastěji polystyren) adherentní kultury, jen některé typy buněk dokáží přežívat a dělit se v suspenzi. Buňky se pěstují v kultivačních nádobách (lahvích, Petriho miskách apod.) ve speciálních kultivačních médiích. Ta obsahují potřebné ionty, pufry, zdroje energie, aminokyseliny, vitamíny, růstové faktory a další pomocné látky. Směs potřebných růstových faktorů, stopových prvků a dalších látek potřebných v nízkých koncentracích se obvykle dodává přídavkem fetálního telecího séra. Pro optimální růst je třeba tkáňové kultury pěstovat ve sterilním prostředí se stálou teplotou kolem 37 C a zvlhčenou atmosférou se zvýšeným obsahem oxidu uhličitého. Nasazením buněk izolovaných z pokusného zvířete (nebo vzácněji např. z bioptického vzorku) vzniká tzv. primokultura. Buňky se postupně dělí, až v ideálním případě vytvoří na povrchu kultivační nádoby souvislou (konfluentní) jednoduchou vrstvu (monolayer). Pokud nejde o buňky transformované, přestane se konfluentní kultura déle rozrůstat. Je-li potřeba s buněčnou linií dále pracovat, uvolní se zpravidla krátce před dosažením konfluence buňky od povrchu kultivační nádoby (mechanicky, pomocí některých enzymů trypsinu, kolagenázy, dispázy, nebo pomocí chelátorů dvojmocných iontů EDTA, citrát), vzniklá suspenze se naředí a nasadí do nových kultivačních nádob. Celý postup se označuje jako pasáž, nové kultuře se říká subkultura.
Izolace buněk Je zřejmé, že první podmínkou pro založení tkáňové kultury je izolace buněk, které se budou pěstovat. Výchozím materiálem přitom bývá orgán sterilně odebraný z pokusného zvířete, vzácněji bioptický vzorek či např. punktát kostní dřeně nebo vzorek periferní krve. Je-li výchozím materiálem solidní orgán, jsou v zásadě dvě možnosti, jak z něj vytvořit buněčnou kulturu: 1. tkáň se rozřeže na malé částečky, které se ponoří do kultivačního média. Buňky pak z částeček vyrůstají a šíří se po povrchu kultivační nádoby 2. tkáň se rozvolní na jednotlivé buňky, ať už mechanicky homogenizátorem, nebo šetrněji např. enzymatickým natrávením (trypsinem, kolagenázou, pronázou, dispázou, elastázou apod.). Oběma způsoby však vzniká směs mnoha buněčných typů, ze které je nutné žádanou subpopulaci izolovat. Buď lze využít různé odolnosti jednotlivých typů buněk vůči různým podmínkám, jejich náročnosti na složení kultivačního média, citlivosti vůči toxickým látkám apod., nebo lze buňky rozdělit podle jejich fyzikálních vlastností, nejčastěji podle hustoty nebo rychlosti sedimentace. K izolaci buněk podle hustoty (izopyknická sedimentace) se používá centrifugace buněčné suspenze ve zkumavce naplněné médiem, které má v různých vzdálenostech ode dna různou denzitu tzv. dělení na gradientu hustoty. Hustota gradientu se může měnit buď plynule (spojité gradienty), nebo skokem (nespojité gradienty). K vytvoření spojitého gradientu se dnes nejčastěji používá částeček oxidu křemičitého potažených polyvinylpyrrolidonem (obchodní název Percoll ). Pokud se směs částic o různé velikosti centrifuguje při vysokých otáčkách, rozdělí se podle denzity. Médium u dna zkumavky má pak vyšší hustotu než médium u hladiny. Na povrch gradientu se nanese buněčná suspenze a celý sloupec se znovu centrifuguje, tentokrát při podstatně nižších otáčkách. Buňky klesnou až na úroveň, kde mají stejnou hustotu jako médium. Odebráním vhodné části sloupce lze izolovat jeden určitý buněčný typ. Jinou možností, jak připravit spojitý gradient, je postupné míšení dvou roztoků, jednoho s vyšší a druhého s nižší hustotou, přičemž poměř obou roztoků se plynule mění a výslednou směsí se plní centrifugační zkumavka. Technicky jednodušší je příprava nespojitých gradientů. V tomto případě se na sebe jednoduše navrství roztoky o různých hustotách. Další vrstvu opět tvoří buněčná suspenze. Po centrifugaci se buňky rozdělí mezi jednotlivá rozhraní roztoků tak, že každý buněčný typ zůstane mezi roztokem s vyšší a nižší hustotou, než je hustota buněk. K přípravě diskontinuálních gradientů se používá celá řada chemikálií. Nejčastěji jde o sacharidy, od snadno dostupné sacharózy až po polysacharidy (např. mnohočetně rozvětvený kopolymer sacharózy a epichlorhydrinu s přesně definovanou molekulární hmotností, obchodní název Ficoll ). Lepší dělení buněk i výtěžek než izopyknická sedimentace poskytuje tzv. centrifugační elutriace, která umožňuje pomocí speciálního zařízení rozdělit buňky podle rychlosti sedimentace, tj. nejen podle hustoty, ale i objemu. Tato metoda je však technicky mnohem složitější a vyžaduje zvláštní vybavení. Identifikace buněk Po založení nové buněčné linie je zpravidla nutné ověřit, že kultura skutečně obsahuje požadovaný typ buněk některé buněčné typy, které by eventuálně kontaminovaly primokulturu třeba jen v malém množství, mohou ostatní buňky tzv. přerůst a zcela je vytlačit. Prvním krokem při identifikaci buněk je nepochybně sledování morfologie buněk, to však nebývá zcela spolehlivé: jednak většina buněk mění vzhled v průběhu růstu kultury, jednak řada buněčných typů vypadá velmi podobně a prakticky je od sebe nelze mikroskopicky odlišit. Proto je nutné použít dalších metod: 1. imunochemické metody průkaz antigenů specifických pro určitý typ buněk patří mezi nejspolehlivější a měly by být metodou volby
2. analýza exprimovaných enzymů a izoenzymů některé buňky vykazují typickou enzymatickou aktivitu, případně obsahují určité specifické izoenzymy. K průkazu se používají charakteristické reakce, specifické inhibitory, imunochemické, elektroforetické a chromatografické metody. U zavedených kultur je čas od času nutné ověřit, že se stále pracuje s původní linií jednak může v důsledku stárnutí linie dojít k výrazné změně kultivovaných buněk (dediferenciace či naopak diferenciace, různé transformace buněk), jednak může být při nesprávné laboratorní praxi kultura kontaminována jinou linií, která ji následně přeroste. Takové ověření se označuje jako autentizace tkáňové kultury a používají se k ní kromě metod zmíněných výše i některé molekulární techniky (DNA-fingerprinting, analýza mikrosatelitních sekvencí apod.). Stanovení počtu buněk, jejich viability a metabolické aktivity Řada postupů při práci s tkáňovými kulturami vyžaduje přesné stanovení počtu buněk ve vzorku. V praxi se běžně používají dvě metody přímého stanovení počtu buněk: ruční počítání v kalibrované komůrce pod světelným mikroskopem a poloautomatické počítání pomocí průtokového počítače částic. Počítání buněk v komůrce je nejjednodušší a mnohdy i nejpřesnější metoda. U nás se obvykle používá Bürkerova komůrka. Na jednom mikroskopickém sklíčku jsou vybroušená dvě pole hluboká přesně 0,1 mm, na jejichž dně je síťovitý obrazec (vzdálenosti jednotlivých čar jsou uvedeny na obrázku). Bürkerova komůrka počítací pole a pohled z boku 0,2 mm 1 mm 0,05 mm Je-li třeba znát počet živých a mrtvých buněk ve vzorku, přidá se k buněčné suspenzi před počítáním barvivo, které neprochází intaktní buněčnou membránou, nebo je z intracelulárního prostoru aktivně transportováno ven. Nejčastěji se používá roztoku trypanové modři. Živé buňky zůstanou bezbarvé, zatímco mrtvé buňky, u nichž je porušena integrita buněčné membrány a jejích transportních mechanismů, se rychle zbarví na modro. Trypanová modř Při použití průtokového počítače částic lze přístroj doplnit dalšími čidly, která blíže určí charakter buněk. Nejčastěji se měří elektrické vlastnosti částic nebo se sleduje jejich interakce s laserovým paprskem. Tyto techniky se označují jako průtoková cytometrie a rutinně se používají v klinické biochemii a hematologii např. ke stanovení krevního obrazu, vyšetření kostní dřeně nebo močového sedimentu.
Používají se i další metody určení počtu buněk: denzitometrie obarvené buněčné kultury (barviva užívaná v histologii, metylénová modř, Janusova zeleň) stanovení DNA ve vzorku stanovení celkové bílkoviny ve vzorku stanovení aktivity některých enzymů (hexózaaminidáza) Zvláštní postavení mezi těmito technikami zaujímá MTT test. MTT (3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5- difenyltetrazolium bromid) je mitochondriálními dehydrogenázami redukováno na barevný formazan. Rychlost tvorby formazanu odpovídá aktivitě dýchacího řetězce a odráží tak metabolickou aktivitu buňky. MTT oxidovaná forma MTT formazan
Praktické úlohy Izolace agranulocytů z periferní krve Izotonický roztok sacharózy 1083 g.l -1 (osmolarita nastavena chloridem sodným na 300 mosm.l -1, zahuštěno přídavkem 3 % želatiny, obarveno na modro potravinářským barvivem E-132) Izotonický roztok sacharózy 1077 g.l -1 (osmolarita nastavena chloridem sodným na 300 mosm.l -1, zahuštěno přídavkem 3 % želatiny, obarveno na žluto potravinářským barvivem E-102) Fyziologický roztok (chlorid sodný 0,9 g.l -1 ) LeucoPHAN Heparinizovaná krev ředěná 1:1 fyziologickým roztokem Princip: Na diskontinuálním gradientu s médii o hustotě 1083 a 1077 g.l -1 se krvinky při centrifugaci rozdělí tak, že erytrocyty sedimentují na dno zkumavky, granulocyty klesnou na rozhraní obou médií a agranulocyty s destičkami zůstanou nad méně hustým roztokem. Přítomnost leukocytů v izolované suspenzi prokážeme pomocí komerčního testu LeukoPHAN. Leukocytární esterázy štěpí ester indoxylu, který následně reaguje s diazotovanou solí za vzniku barevného konjugátu. Postup: 1. Do polypropylenové centrifugační zkumavky se odměří 3 ml roztoku s hustotou 1083 g.l -1. Nad něj se opatrně převrství 3 ml roztoku s hustotou 1077 g.l -1. Oba roztoky se nesmějí smíchat. 2. Nad gradient se opatrně nanese 6 ml ředěné krve 3. Centrifugace 20 minut při 2000 ot/min. 4. Plastovou Pasteurovou pipetou se odsaje plazma nad gradientem, přičemž se ponechá asi 7 mm vrstva plazmy nad horním okrajem gradientu. 5. Do skleněné zkumavky se plastovou Pasteurovou pipetou odebere část sloupce mezi 7 mm nad a 7 mm pod okrajem gradientu. Tato frakce obsahuje agranulocyty a trombocyty. 6. Přítomnost leukocytů ve frakci se prokáže pomocí LeukoPHANu políčko po ponoření zfialoví. 7. Frakce agranulocytů s destičkami se ponechá pro další pokusy.
Stanovení počtu buněk a jejich viability Trypanová modř 0,4 % v izotonickém fosfátovém pufru ph 7,4 (jed!) Princip: Trypanová modř je z živých buněk aktivně transportována přes buněčnou membránu. Po smísení buněčné suspenze s roztokem tohoto barviva proto živé buňky zůstávají světlé, zatímco mrtvé se obarví na modro. Postup: 1. K 0,5 ml dobře promíchané buněčné suspenze se přidá 0,5 ml roztoku trypanové modři. 2. Po 5 až 15 minutách se suspenze dobře promíchá a pomocí 50 µl automatické pipety se jí naplní obě poloviny Bürkerovy komůrky. Je třeba aplikovat takové množství vzorku, aby se komůrka právě naplnila, roztok nesmí přetékat do okolních žlábků. 3. Pod světelným mikroskopem se při nejmenším zvětšení počítají zvlášť živé (bezbarvé) a mrtvé (modré) buňky. Počítá se nejprve 5 čtverců (4 rohové a středový) 1 1 mm v jedné polovině komůrky. Je-li celkový počet buněk menší než 100, počítají se buňky i v dalších 5 čtvercích ve druhé polovině komůrky. Za hranici čtverce se považuje prostřední linka z trojité čáry. Z buněk, které leží na okraji čtverce, se počítají ty, které se i jen dotýkají levého nebo horního okraje, a naopak se nepočítají buňky, které se i jen dotýkají pravého nebo dolního okraje. 4. Počet buněk se vypočítá podle vzorce P = (N D 1000) / (H S) kde P je počet buněk na 1 ml suspenze N je celkový počet buněk D = 2 (ředění suspenze) H = 0,1 (hloubka komůrky v mm) S je počet čtverců 5. Vypočítá se podíl živých buněk v procentech.
Stanovení metabolické aktivity buněk MTT testem MTT (3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid) 5 g.l -1 v izotonickém fosfátovém pufru ph 7,4 (zdraví škodlivé) extrakční pufr (20 % lauroylsíran sodný v 50% dimetylformamidu, ph 4,7, zdraví škodlivé) Princip: Žluté MTT se mitochondriálními enzymy dýchacího řetězce redukuje na fialový formazanový derivát, který zůstává uvnitř buněk ve formě nerozpustných granulí. Po přidání detergentu (lauroylsíran sodný, SDS) a okyselení se barvivo z buněk uvolní a rozpustí, takže vznikne čirý roztok vhodný k fotometrickému stanovení. Postup: 1. K 0,5 ml promíchané buněčné suspenze se přidá 100 µl roztoku MTT a inkubuje se 45 minut při 37 C. 2. K suspenzi se přidá 0,5 ml extrakčního pufru, směs se promíchá a inkubuje se 10 minut při 37 C. 3. Změří se absorbance při 595 nm proti destilované vodě.