Pfiíruãka QIAamp DSP Virus Kit

1050717_CS 16.04.2008 8:57 Uhr Seite 1 Listopad 2007 Pfiíruãka QIAamp DSP Virus Kit Verze 1 Σ 50 IVD Souprava QIAamp DSP Virus Kit je generický systém, který využívá technologii QIAamp pro izolaci a purifikaci virových nukleových kyselin ze vzorků lidské plazmy nebo lidského séra pro in vitro diagnostické účely. Pouze pro in vitro diagnostické účely. REF 60704 H B 1050717CS 11/2007 QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden, Tel: +49-2103-29-0 R1 MAT 1050717CS Sample & Assay Technologies

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 2 Ochranné známky: QIAGEN, QIAamp, QIAvac, MinElute (QIAGEN Group); AMPLICOR HBV MONITOR, AMPLICOR HCV MONITOR, AMPLICOR HIV-1 MONITOR (Roche Molecular Systems, Inc.); artus, RealArt (artus GmbH); COBAS (Roche Diagnostics Systems, Inc.); Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Registrované názvy, ochranné známky, atd. používané v tomto dokumentu, dokonce ani pokud nejsou jako takové označeny, nelze považovat za nechráněné právními předpisy. Technika PCR je chráněna U.S. Patenty 4,683,195 a 4,683,202 a ekvivelntními zahraničními patenty ve vlastnictví firmy Hoffmann-La Roche AG. 2004 QIAGEN, všechna práva vyhrazena.

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 3 Obsah SloÏení soupravy 4 Symboly 5 Uchovávání 6 ízení jakosti 6 Zam lené pouïití 6 Omezení pro pouïití produktu 7 Bezpeãnostní informace 7 Úvod 9 Princip a popis metody 9 Vybavení a reagencie, které má zajistit uïivatel. 14 DÛleÏité poznámky 15 Důležité body před zahájením 15 Příprava RNA 15 Uchovávání vzorků 16 Příprava reagencií a pufrů 16 Eluce virových nukleových kyselin 19 Výtěžek a kvalita virových nukleových kyselin 19 Nastavení vakuového systému QIAvac 24 Plus 19 Protokol Izolace a purifikace virov ch nukleov ch kyselin z plazmy a séra 22 Distributofii firmy QIAGEN 27 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 3

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 4 SloÏení soupravy Pfiíruãka QIAamp DSP Virus Kit Katalogové ãíslo 60704 Poãet stanovení 50 QIAamp MinElute Kolonky QIAamp MinElute COL s promývacími zkumavkami (WT) (2 ml) 50 EXT Nástavce kolonky (3 ml) 50 ET Eluční zkumavky (1,5 ml) ELU TUBE 50 VC Vakuové konektory (VacConnectors) VAC CON 50 LT Lyzační zkumavky (2 ml) LYS TUBE 50 WT Promývací zkumavky (2 ml) 50 AL Lyzační pufr* LYS BUF 33 ml AW1 Promývací pufr 1* (koncentrát) WASH BUF 1 CON 19 ml AW2 Promývací pufr 2 (koncentrát) WASH BUF 2 CON 13 ml AVE Eluční pufr (purpurový uzávěr) ELU BUF 4 x 2 ml PS Roztok pro ředění proteáz QPROT SOLV 4,4 ml Nosičová RNA Nosičová RNA (červený uzávěr) 310 g QP QIAGEN Proteáza QPROT 1 lahvička CD H B 1 Příručka H B 1 COL WASH CAR EXT TUBE RNA * Obsahuje guanidin hydrochlorid. Není kompatibilní s dezinfekčními přípravky obsahujícími bělící prostředky. Bližší informace: viz strana 7. Obsahuje azid sodný jako konzervační látku. Rozpouštěcí objem 4,4 ml. 4 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 5 2 C 8 C Symboly Σ 50 i IVD REF LOT MAT COMP VOL i Souprava obsahuje reagencie pro přípravu 50 vzorků Viz informace v příručce Použít do (datum exspirace) Prostředky zdravotnické techniky pro in vitro diagnostiku Katalogové číslo Číslo šarže Číslo materiálu Komponenty Objem Teplotní meze Oprávněný výrobce Při doručení Důležitá poznámka Po provedení daného kroku protokolu s tímto označením si vyměňte rukavice Otevřít při převzetí; uchovávejte kolonky QIAamp MinElute při 2 8 C? EtOH ADD CONT LYOPH RCNS EtOH GuHCI SUBT Zapište datum přidání ethanolu do lahve Přidání Obsahuje Lyofilizováno Rozpusťte v Ethanol Guanidin hydrochlorid Subtilisin Pokračujte směrem k Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 5

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 6 Uchovávání Kolonky QIAamp MinElute je nutné po převzetí uchovávat při teplotě 2 8 C. Všechny pufry mohou být uchovávány při laboratorní teplotě (15 25 C). Lyofilizovaná nosičová RNA může být uchováván při laboratorní teplotě (15 25 C). Nosičová RNA se může rozpouštěná pouze v elučním pufru (AVE); rozpuštěná nosičová RNA se musí okamžitě přidat do lyzačního pufru (AL) podle popisu na straně 16. Tento roztok se připravuje čerstvý a při teplotě 2 8 C je stabilní po dobu 48 hodin. Nespotřebovaná nosičová RNA rozpuštěná v elučním pufru (AVE) má být zamražena v alikvotech při 20 C. Lyofilizovaná proteáza QIAGEN (QP) může být uchovávána při laboratorní teplotě (15 25 C) až do data exspirace, aniž by došlo ke snížení její účinnosti. Rozpuštěná proteáza QIAGEN (QP) uchovávaná při teplotě 2 8 C je stabilní po dobu jednoho roku. Rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1) a rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2) jsou stabilní po dobu 1 roku, pokud jsou uchovávany při laboratorní teplotě (15 25 C). ízení jakosti V souladu s certifikovaným systémem řízení jakosti firmy QIAGEN Total Quality Management System je každá šarže soupravy QIAamp DSP Virus Kit podrobena testům předem definovaných parametrů, které zajišťují odpovídající jakost produktů. Zam lené pouïití Souprava QIAamp DSP Virus Kit je generický systém, který využívá technologii QIAamp pro izolaci a purifikaci virových nukleových kyselin ze vzorků lidské plazmy nebo lidského séra pro in vitro diagnostické účely. Veškeré diagnostické výsledky získané pomocí postupu pro přípravu vzorků v souladu s jakoukoliv následnou diagnostickou NAT analýzou musí být interpretovány s přihlédnutím k ostatním klinickým a laboratorním nálezům. Produkt je určen k použití profesionálními pracovníky, např. techniky nebo lékaři školenými v technikách molekulární biologie. Je určen k použití v jakékoliv další následné aplikaci využívající enzymatickou amplifikaci nebo jinou enzymatickou modifikaci DNA nebo RNA, která je následována detekcí nebo amplifikací signálu. Izolované a purifikované virové nukleové kyseliny mohou být použity v kvalitativních (např. screening krevních parametrů) i v kvantitativních (např. monitorování zátěže způsobené viry) diagnostických NAT analýzách. Aby bylo možné minimalizovat odchylky diagnostických výsledků, je produkt určen k použití s interní kontrolou a s pozitivní a negativní kontrolou během procesu přípravy vzorku, amplifikace vzorku a detekce v závislosti na použitém následném testu. Produkt je určen k použití s vakuovým systémem QIAvac 24 Plus nebo s jinýmekvivalentním vakuovým systémem. 6 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 7 Omezení pro pouïití produktu Souprava není určena k použití se vzorky krve, tkáně, kostní dřeně nebo s buněčnými kulturami. Souprava není rovněž určena k izolaci nebo purifikaci bakteriálních, fungálních nebo parazitárních nukleových kyselin. Účinnost soupravy při izolaci a purifikaci virových nukleových kyselin z jiných nebuněčných tkáňových tekutin, například z moči nebo cerebrospinální tekutiny (CSF), není stanovena. Bezpeãnostní informace Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné brýle. Další informace jsou uvedeny v odpovídajících bezpečnostních listech. Bezpečnostní listy jsou k dispozici online v pohodlném a kompaktním formátu PDF na stránkách www.qiagen.com/ts/msds.asp, kde můžete nalézt, zobrazit a vytisknout příslušný bezpečnostní list pro každou soupravu QIAGEN a pro každou komponentu těchto souprav. POZOR: NEP IDÁVEJTE roztoky bûlících prostfiedkû nebo kyselin pfiímo do odpadu z pfiípravy vzorku. Lyzační pufr (AL) a promývací pufr 1 (AW1) obsahují guanidin hydrochlorid, který může v kombinaci s bělícími prostředky tvořit vysoce reaktivní látky. V případě rozlití tekutin obsahujících tyto pufry vyčistěte kontaminované místo vhodným laboratorním detergentem a vodou. Pokud rozlitá tekutina obsahuje potenciálně infekční látky, vyčistěte zasaženou oblast nejprve laboratorním detergentem a vodou a poté 1% (vol) roztokem chlornanu sodného. Jestliže jsou lahve s pufrem poškozeny nebo prosakují, použijte při likvidaci těchto lahví rukavice a ochranné brýle, abyste zabránil/a poškození vašeho vlastního zdraví nebo zdraví jiných osob. Firma QIAGEN netestuje tekutý odpad vzniklý použitím metody QIAamp DSP Virus na přítomnost reziduálních infekčních materiálů. Kontaminace odpadní tekutiny reziduálními infekčními materiály je vysoce nepravděpodobná, nelze ji však zcela vyloučit. Tekutý odpad musí být proto považován za infekční a je nutné s ním nakládat a likvidovat jej v souladu s místními bezpečnostními předpisy. Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 7

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 8 Pro komponenty soupravy QIAamp DSP Virus Kit platí tyto R-věty a S-věty: Lyzaãní pufr (AL) a prom vací pufr 1 (AW1) Obsahuje guanidin hydrochlorid: zdraví škodlivý, dráždivý R-věty a S-věty:* R22-36/38, S13-26-36-46 Proteáza QIAGEN (QP) Obsahuje subtilisin: senzitizující, dráždivý R-věty a S-věty:* R37/38-41-42, S22-24-26-36/37/39-46 24hodinová nouzová linka Nouzové lékařské informace je možné získat v anglickém, francouzském a německém jazyce 24 hodin denně na telefonním čísle: Poison Information Center Mainz, Německo Tel: +49-6131-19240 * R22: Zdraví škodlivý při požití; R36/38: Dráždí oči a kůži; R37/38: Dráždí dýchací orgány a kůži; R41: Nebezpečí vážného poškození očí; R42: Může vyvolat senzibilizaci při vdechování; S13: Uchovávejte odděleně od potravin, nápojů a krmiv; S22: Nevdechujte prach; S24: Zamezte styku s kůží; S26: Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc; S36: Používejte vhodný ochranný oděv; S36/37/39: Používejte vhodný ochranný oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle nebo obličejový štít; S46: Při požití okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc a ukažte tento obal nebo označení. 8 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 9 Úvod Souprava QIAamp DSP Virus Kit používá dobře zavedenou technologii pro simultánní izolaci a purifikaci virové DNA a RNA. Metoda QIAamp DSP Virus využívá selektivní vazebné vlastnosti membrán na bázi křemíku při použití minimálních elučních objemů 20 µl nebo 60 µl. Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus je stanoven pro HIV RNA a HBV DNA v několika dalších následných diagnostických testech (Tabulka 1, Obrázek 1 a 2). Tabulka 1. Následné diagnostické testy, v nichï byl testován lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus. Test Souprava Real-time RT-PCR pro stanovení HIV RNA TaqMan test a COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test Real-time PCR pro stanovení HBV DNA TaqMan test COBAS AMPLICOR HBV MONITOR Test Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus pfii TaqMan testech A log result IU/ml 8 6 4 y = 1.0042x + 0.0832 2 R 2 = 0.9974 0 1 2 3 4 5 6 7 8 log input IU/ml B 6 5 4 3 2 1 0 log result IU/ml y = 0.9725x + 0.0982 R 2 = 0.9984 1 2 3 4 5 6 log input IU/ml Obrázek 1 Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus při elučním objemu 60 µl je stanoven pomocí testů TaqMan pro A HIV RNA a B HBV DNA. Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 9

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 10 Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus pfii pouïití COBAS AMPLICOR A B log result IU/ml 6 5 4 3 2 1 y = 1.0098x + 0.1234 R 2 = 0.9982 2 3 4 5 log input IU/ml log result IU/ml 4 3 2 1 0 y = 0.8839x + 0.1718 R 2 = 0.984 1 2 3 4 5 log input IU/ml Obrázek 2 Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus při elučním objemu 60 µl je stanoven pomocí testů COBAS AMPLICOR MONITOR pro A HIV RNA a B HBV DNA. Daný postup je vhodný k použití s plazmou nebo sérem (Obrázek 3); Vzorky plasmy i séra mohou obsahovat buď citran sodný nebo EDTA. Vzorky mohou být buď čerstvé, lyofilizované nebo zamražené, za předpokladu, že nebyly zmraženy a rozmraženy více než jednou. Danou metodu lze použít k izolaci virové DNA nebo RNA z široké řady DNA nebo RNA virů. Metoda je navržena tak, aby zamezila křížové kontaminaci mezi vzorky a umožnila bezpečné zacházení s potenciálně infekčními vzorky. Metoda se výborně hodí pro simultánní zpracování několika vzorků. Virové nukleové kyseliny jsou eluovány v elučním pufru (AVE) a jsou hotové k použití v amplifikačních reakcích nebo k uchovávání při -20 C. Princip a popis metody Metoda QIAamp DSP Virus zahrnuje 4 kroky: Lyze virových částic ve vzorku Vázání virových nukleových kyselin v lyzátu k membráně kolonky QIAamp MinElute Promytí membrány Eluce virových nukleových kyselin z membrány Tato metoda se provádí pomocí kolonky QIAamp MinElute s využitím vakuového systému. 10 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 11 Objem vzorku Detekční limit (DL) a kvantifikační limit (QL) byl stanoven podle směrnic ICH 2QA a 2QB pro metodu QIAamp DSP Virus (s počátečním objemem vzorku 500 µl a elučními objemy 20 µl a 60 µl) pomocí různých následných diagnostických testů (Tabulka 2 a 3). Tabulka 2. Detekãní limit metody QIAamp DSP Virus Test Eluãní objem 95% cut off artus TM RealArt TM HBV DNA 20 µl 2,31 IU/ml (n=240) artus RealArt HCV RNA 20 µl 24,31 IU/ml (n=192) AMPLICOR manual HIV RNA 60 µl 90,92 IU/ml (n=209) TaqMan HBV DNA 60 µl 4,73 IU/ml (n=192) Tabulka 2. Kvantifikaãní limit metody QIAamp DSP Virus Test QL CV TaqMan HBV DNA 5,7 IU/ml < 70% (n=88) TaqMan HCV RNA 52 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HIV RNA 100 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HBV DNA 30 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HCV RNA 700 IU/ml < 60% (n=66) Lyze virov ch ãástic Vzorky jsou lyzovány za denaturačních podmínek při zvýšených teplotách. Lyze se provádí v přítomnosti proteázy QIAGEN (QP) a lyzačního pufru (AL), které společně zajišťují inaktivaci RNasis. Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 11

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 12 Vázání nukleov ch kyselin k membránû kolonky QIAamp MinElute Pro optimalizaci vázání virové DNA a RNA k membráně kolonky QIAamp MinElute se nejprve přidá k lyzátům ethanol. Poté se každý lyzát nanese na kolonku QIAamp MinElute a virové nukleové kyseliny jsou adsorbovány na silikagelovou membránu při průchodu lyzátu indukovaném působením podtlaku. Odstranûní reziduálních kontaminant Zatímco virové nukleové kyseliny zůstávají vázány na membránu kolonky QIAamp MinElute, kontaminanty se účinně vymývají nejprve promývacím pufrem 1 (AW1), poté promývacím pufrem 2 (AW2) a poté ethanolem. Eluování ãist ch nukleov ch kyselin Virové nukleové kyseliny jsou eluovány z membrány kolonky QIAamp MinElute pomocí elučního pufru (AVE). Kolonky QIAamp MinElute umožňují získat eluční objemy 20 µl nebo 60 µl. V závislosti na použitém následném testu může eluát nukleové kyseliny obsahovat až 50 % reakčního objemu bez jakéhokoliv inhibičního účinku. 12 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 13 Metoda QIAamp DSP Virus Sample Lyse Pfied zahájením si peãlivû proãtûte protokol (strana 22) Do LT přidejte 75 µl QP, 500 µl vzorku a 500 µl AL Míchejte 15 s na vortexu Inkubujte 15 min (±1 min) při 56 C (±1 C) Přidejte 600 µl ethanolu Míchejte 15 s na vortexu Inkubujte 5 min (±1 min) při laboratorní teplotě (15 25 C) Bind Přeneste lyzát na kolonku QIAamp MinElute s připojeným nástavcem EXT Vacuum Vacuum Wash (AW1) Remove EXT before vacuum is applied Přidejte 600 µl rozpuštěného AW1 Odstraňte EXT Vacuum Vacuum Wash (AW2) Wash (ethanol) Přidejte 750 µl rozpuštěného AW2 Přidejte 750 µl ethanolu Dry spin Elute Pure viral nucleic acids Vložte kolonku QIAamp MinElute do WT Centrifugujte 1 minutu při 14 000 rpm Vložte kolonku QIAamp MinElute do WT Inkubujte 3 min při 56 C Vložte kolonku QIAamp MinElute do WT Přidejte 20 µl nebo 60 µl AVE Inkubujte 3 min při laboratorní teplotě (15 25 C) Centrifugujte 1 minutu při 14 000 rpm Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 13

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 14 Vybavení a reagencie, které má zajistit uïivatel. Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné brýle. Další informace jsou uvedeny v odpovídajících bezpečnostních listech, které lze získat od dodavatele produktu. Ethanol (96 100%) Pipety* a pipetovací špičky (pro zamezení křížové kontaminace doporučujeme používat pipetovací špičky s aerosolovými bariérami) Rukavice na jedno použití Termoblok* pro lyzi při 56 C (doporučujeme Eppendorf Thermomixer comfort s termoblokem pro 2,0 ml mikrozkumavky ) Mikrocentrifuga* Odměrný válec (50 ml) Vortex (třepačka)* QIAvac 24 Plus vakuový systém (QIAvac 24 Plus, kat. č. 19413, QIAvac Connecting System, kat. č. 19419, a vakuová pumpa Vacuum Pump, kat. č. 84020), nebo ekvivalentní standardní laboratorní vakuový systém * Pro zajištění správného zpracování vzorků při provádění metody QIAamp DSP Virus doporučujeme použití nástrojů (tj. pipet a zahřívacích bloků) kalibrovaných podle doporučení výrobce. Uvedený výčet není úplný a nezahrnuje řadu důležitých materiálů a pomůcek používaných v biologické laboratoři. v prodeji od druhého pololetí roku 2004. Více informací na www.qiagen.com/products/accessories 14 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 15 DÛleÏité poznámky DÛleÏité body pfied zahájením Po obdržení soupravy zkontrolujte, zda nejsou její komponenty poškozeny. V případě poškození blistrového obalu kontaktujte oddělení technických služeb QIA- GEN Technical Services nebo místního distributora. V případě rozlití postupujte podle bezpečnostních pokynů (strana 7). Nepoužívejte poškozené komponenty soupravy, použití poškozených komponent by mohlo negativně ovlivnit účinnost soupravy. Používejte vždy vybavení a materiály bez RNázy. Během pracovního postupu uchovávejte ethanol (96 100%) na ledu. Před každým přenosem kapalných materiálů vyměňte pipetovací špičku. Pro zamezení křížové kontaminace doporučujeme použít pipetovací špičky s aerosolovou bariérou. Všechny kroky centrifugace se provádějí při laboratorní teplotě (15 25 C). Používejte vždy rukavice na jedno použití a pravidelně kontrolujte, zde nedošlo k jejich kontaminaci testovaným vzorkem. Vyhoďte rukavice do odpadu v případě jejich kontaminace a minimálně před každým krokem označeným symbolem rukavic. Pro zamezení křížové kontaminace neotevírejte více zkumavek současně. Při práci se soupravou nepoužívejte komponenty jiných souprav, pokud nemají stejné číslo šarže. Zamezte mikrobiální kontaminaci reagencií soupravy. Pro zajištění ochrany před potenciálně infekčními materiály doporučujeme pracovat za podmínek laminárního proudění až do lyze vzorků. Tuto soupravu smí používat pouze personál školený v in vitro laboratorních metodách. Metoda obsahuje pokyny pro zpracování jednoho vzorku plazmy nebo séra. Pomocí vakuového systému QIAvac 24 Plus je však možné zpracovávat až 24 vzorků současně. Pfiíprava RNA Při přípravě virové RNA pracujte rychle během všech manuálních kroků dané metody. Eluční pufr (AVE) obsahuje azid sodný *, antimikrobiální prostředek, který brání růstu organismů produkujících RNázu. Protože však tento pufr neobsahuje žádné chemikálie degradující RNázu, není schopen aktivně inhibovat RNázy zanesené nesprávným zacházením. Při manipulaci s elučním pufrem (AVE) je nutné vynaložit maximální úsilí k zamezení kontaminace RNázami. * Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné brýle. Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 15

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 16 Uchovávání vzorkû Po odběru a centrifugaci je možné uchovávat plazmu a sérum nejvýše 6 hodin při teplotě 2-8 C. Pro dlouhodobé skladování se doporučuje zamražení v alikvotech při 20 C nebo 80 C. Zmražené vzorky plazmy nebo séra nesmí být rozmraženy více než jednou. Opakované zmrazení a rozmražení vede k denaturaci a precipitaci proteinů a k následnému snížení virových titrů a tím i výtěžku virových nukleových kyselin. Kryoprecipitáty vytvořené během zmrazování a rozmrazování navíc ucpávají membránu kolonky QIAamp MinElute. Pokud jsou patrné kryoprecipitáty, musí být odděleny centrifugací při 6800 x g po dobu 3 minut. Pročištěný supernatant je nutné ihned odsát a zpracovat bez porušení peletu. Pfiíprava reagencií a pufrû Pfiíprava QIAGEN proteázy Přidejte celý obsah lahvičky obsahující 4,4 ml roztoku pro ředění proteáz (PS) do lahvičky s lyofilizovanou QIAGEN proteázou (QP) a pečlivě promíchejte. Je nutné zamezit tvorbě pěny, proto míchejte několikanásobným převrácením lahvičky. Ujistěte se, že je QIAGEN proteáza (QP) zcela rozpuštěná. i Nepřidávejte QIAGEN proteázu (QP) přímo do lyzačního pufru (AL) Pfiidání nosiãové RNA a interní kontroly do lyzaãního pufru Nosičová RNA slouží dvěma cílům. Za prvé: zvyšuje vázání virových nukleových kyselin na membránu kolonky QIAamp MinElute, zvláště pokud vzorek obsahuje malé množství cílových molekul. Za druhé: přidání velkých množství nosičové RNA snižuje možnost degradace virové RNA ve vzácných případech, kdy RNázové molekuly nejsou denaturovány chaotropními solemi a detergenty v lyzačním pufru (AL). Nepřidání nosičové RNA do lyzačního pufru (AL) může vést ke snížení výtěžku virové RNA nebo DNA. Nosičová RNA může být také přítomna v některých reagenciích pro interní kontrolu komerčních diagnostických testů. V těchto případech se prosím podívejte na odpovídající návod k použití od výrobce diagnostického testu. Použití interní kontroly se doporučuje, pokud se souprava QIAamp DSP Virus Kit používá v kombinaci s diagnostickými amplifikačními systémy. Interní kontrola RNA nebo DNA a rozpuštěná nosičová RNA musí být přidány k lyzačnímu pufru (AL) a důkladně promíchány desetinásobným převrácením zkumavky. Nemíchejte na vortexu; zamezíte tím tvorbě pěny. Pro určení optimální koncentrace interní kontroly se řiďte pokyny výrobce. Použití jiné než doporučené koncentrace může vést k nesprávným výsledkům. Při výpočtu správného množství používané interní kontroly vezměte v úvahu počáteční množství vzorku a eluční objem. Mějte na paměti, že souprava QIAamp DSP Virus Kit používá startovací vzorek o velikosti 500 µl. 16 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 17 Pro přípravu roztoku nosičové RNA přidejte 310 µl elučního pufru (AVE) do zkumavky, která obsahuje 310 µg lyofilizovaného nosiče RNA, získáte tak roztok o koncentaraci 1 µg/µl. Nosič RNA důkladně rozpusťte, rozdělte jej do vhodných alikvotů a uchovávejte při 20 C. Nerozmrazujte alikvoty nosičové RNA více než dvakrát. Nosičové RNA se nerozpouští v lyzačním pufru (AL). Musí být nejdříve rozpuštěna v elučním pufru (AVE) a poté přidána k lyzačnímu pufru (AL). Ujistěte se, že je nosičová RNA úplně rozpuštěna ve správném množství elučního pufru (AVE) dříve, než ji smícháte s lyzačním pufrem (AL). i Pro následné testy vždy používejte správnou interní kontrolu. Další informace jsou uvedeny v pokynech výrobce. Vypočítejte objem směsi lyzačního pufru (AL)/nosičové RNA potřebný pro danou šarži vzorků tak, že z tabulky 4 (strana 18) zvolíte počet vzorků, které mají být simultánně zpracovány. Objemy jsou kalkulovány podle následujích vzorců: n x 0,55 ml = y ml y ml x 11,2 µl/ml = z µl kde: n = počet vzorků, které mají být simultánně zpracovány y = vypočítaný objem lyzačního pufru (AL) z = objem nosičové RNA/elučního pufru (AVE), který má být přidán k lyzačnímu pufru (AL) Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 17

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 18 Tabulka 4. Objemy lyzaãního pufru (AL) a nosiãové RNA/eluãního pufru (AVE), které jsou zapotfiebí pro metodu QIAamp DSP Virus âíslo Objem AL Objem nosiãové âíslo Objem AL Objem nosiãové vzorkû (ml) RNA/AVE (µl) vzorku (ml) RNA/AVE (µl) 1 0.55 6.2 13 7.15 80.0 2 1.10 12.3 14 7.70 86.0 3 1.65 18.5 15 8.25 92.4 4 2.20 24.6 16 8.80 98.6 5 2.75 30.8 17 9.35 104.7 6 3.30 37.0 18 9.90 110.9 7 3.85 43.1 19 10.45 117.0 8 4.40 49.3 20 11.00 123.2 9 4.95 55.0 21 11.55 129.4 10 5.50 61.6 22 12.10 135.5 11 6.05 67.8 23 12.65 141.7 12 6.60 73.9 24 13.20 147.8 Pfiíprava prom vacího pufru 1 Pomocí odměrného válce přidejte 25 ml ethanolu (96 100%) do lahve obsahující 19 ml koncentrátu promývacího pufru 1 (AW1). Rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1) uchovávejte při laboratorní teplotě (15 25 C). i Před zahájením procedury vždy promíchejte rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1) několikanásobným převrácením lahve. Pfiíprava prom vacího pufru 2 Pomocí odměrného válce přidejte 30 ml ethanolu (96 100%) do lahve obsahující 13 ml koncentrátu promývacího pufru 2 (AW2). Rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2) uchovávejte při laboratorní teplotě (15 25 C). i Před zahájením procedury vždy promíchejte rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2) několikanásobným převrácením lahve. Pfiíprava eluãního pufru Souprava obsahuje čtyři zkumavky elučního pufru (AVE). Dbejte na to, aby nedošlo ke kontaminaci pufru RNázami. Při provádění 4 (nebo menšího počtu) purifikačních procedur pomocí jedné soupravy doporučujeme vyhodit zkumavku s elučním pufrem (AVE) do odpadu na konci každé procedury. 18 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 19 Eluce virov ch nukleov ch kyselin Pro následné aplikace, které vyžadují malé startovací objemy (např. některá vyšetření PCR a RT-PCR), může být zvýšena citlivost testu použitím virových nukleových kyselin eluovaných v 20 µl elučního pufru (AVE). Objem virových nukleových kyselin eluovaných z kolonky QIAamp MinElute může být až o 5 µl nižší než objem elučního pufru (AVE) naneseného na kolonku. Například vymývání nukleových kyselin pomocí 60 µl elučního pufru (AVE) vede k eluci přibližně 55 µl, zatímco eluování pomocí 20 µl dává přibližně 15 µl eluátu. Objem získaného eluátu závisí na povaze vzorku. Je-li objem získaného eluátu příliš nízký pro následný test, zvyšte jeho objem přidáním elučního pufru (AVE). Eluované virové nukelové kyseliny se jímají do elučních zkumavek (ET). Pro uchovávání virových nukleových kyselin po dobu do 24 hodin doporučujeme teplotu skladování 2 8 C. V tûïek a kvalita virov ch nukleov ch kyselin Výnosem a kvalitou jsou izolované nukleové kyseliny vhodné pro všechny typy následných detekčních metod používaných v molekulární diagnostice. Diagnostické testy musí být prováděny podle pokynů výrobce. Nastavení vakuového systému QIAvac 24 Plus Dbejte na správné nastavení nástavce Column Extender (EXT), kolonky QIAamp MinElute, vakuového konektoru (VacConnector VC) a vakuového ventilku (VacValve) (viz Obr. 3). 4 3 2 1 Obrázek 3 Sestavení komponent soupravy QIAamp DSP Virus Kit pro vakuové zpracování vzorků: 1: Vakuový ventilek (VacValve) (dodává se s vakuovým systémem) 3: Kolonka QIAamp MinElute 2: Vakuový konektor (VacConnector VC) 4: Nástavec kolonky (Column Extender EXT) Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 19

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 20 Doporučujeme označit lyzační zkumavky (LT), eluční zkumavky (ET) a kolonky QIAamp MinElute k použití ve vakuovém systému QIAvac 24 Plus podle schématu na obrázku 4, tímto značením se zamezí záměně vzorků. Obrázek je možné oxeroxovat a označit názvy vzorků. 01 02 03 04 05 06 13 14 15 16 17 18 20 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 21 Datum: UÏivatel: Pracovní ID ãíslo: 07 08 09 10 11 12 19 20 21 22 23 24 Obrázek 4 Schéma značení pro lyzační zkumavky (LT), eluční zkumavky (ET) a kolonky QIAamp MinElute Columns pro použití ve vakuovém systému QIAvac 24 Plus. Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 21

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 22 Protokol Protokol: Izolace a purifikace virov ch nukleov ch kyselin z plazmy a séra Pro izolaci a purifikaci virových nukleových kyselin z 500 µl plazmy nebo séra ošetřeného EDTA nebo citratem. Co je nutné provést pfied zahájením Vytemperujte vzorky na laboratorní teplotu (15 25 C) a důkladně je promíchejte. Přidejte nosičovou RNA rozpuštěnou v elučním pufru (AVE) nebo interní kontrolu do lyzačního pufru (AL) podle pokynů na straně 16. Promývací roztok 1 (AW1), Promývací roztok 2 (AW2) a proteáza QIAGEN (QP) musí být připraveny podle pokynů v důležitých poznámkách na straně 15. Vytemperujte eluční pufr (AVE) na laboratorní teplotu (15 25 C) pro použití v kroku 18. Pokud to bude možné, použijte čerstvý eluční pufr (AVE) pro každou proceduru (4 zkumavky jsou součástí soupravy). Nastavte zahřívací blok na teplotu 56 C pro použití v kroku 4 a 17. Pro zamezení křížové kontaminace vložte vakuový konektor (VacConnector VC) do každého luer adaptéru vakuového systému. Zkontrolujte, zda je prázdná nádoba na odpadní materiály a zda jsou všechny spoje řádně propojeny. Podrobné informace o provozu vakuového systému, zejména informace o údržbě, jsou uvedeny v příručce přiložené k tomuto systému. Postup 1. Pomocí pipety naneste 75 µl proteázy QIAGEN (QP) do lyzaãní zkumavky (LT). i Před použitím zkontrolujte datum exspirace rozpuštěné proteázy. 2. Pfiidejte 500 µl plazmy nebo séra do lyzaãní zkumavky (LT). 3. Pfiidejte 500 µl lyzaãního pufru (AL) (obsahuje 11,2 µg/ml nosiãové RNA) do lyzaãní zkumavky (LT), uzavfiete víãko a míchejte po dobu 15 s na pulsním vortexu. Pro zajištění účinné lyze je nezbytné důkladně promíchat vzorek a lyzační pufr (AL) do homogenního roztoku. i Lyzační pufr (AL) obsahuje interní kontrolu. Vzhledem k vysoké viskozitě lyzačního pufru (AL) dbejte na přidání správného množství lyzačního pufru (AL) pečlivým odpipetováním nebo použitím vhodné pipety, například vícekrokové pipety Eppendorf nebo ekvivalentního zařízení. i Nepřidávejte QIAGEN proteázu (QP) přímo do lyzačního pufru (AL) 4. Inkubujte 15 min (±1 min) pfii 56 C (±1 C). 22 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 23 5. Centrifugujte lyzaãní zkumavku (LT) po dobu minimálnû 5 sekund pfii maximální rychlosti, tímto krokem se odstraní kapky z vnitfiní strany víãka. 6. VymûÀte si rukavice a opatrnû otevfiete lyzaãní zkumavku (LT). 7. Pfiidejte do lyzaãní zkumavky (LT) 600 µl ethanolu (96 100%), zavfiete víãko a promíchejte dûkladnû na pulsním vortexu po dobu minimálnû 15 sekund. Inkubujte po dobu 5 min (±1 min) pfii laboratorní teplotû (15 25 C). 8. Centrifugujte lyzaãní zkumavku (LT) po dobu minimálnû 5 sekund pfii maximální rychlosti, tímto krokem se odstraní kapky z vnitfiní strany víãka. 9. VloÏte kolonku QIAamp MinElute do vakuového konektoru (VacConnector VC) vakuového systému (viz Obrázek 3, strana 19). VloÏte nástavec kolonky (Column Extender EXT) do otevfiené kolonky QIAamp MinElute. i Ponechte si promývací zkumavku (WT) pro centrifugaci k vysušení kolonky v kroku 16. 10. VymûÀte si rukavice; otevírejte vïdy pouze jednu zkumavku. 11. Opatrnû naneste ve ker lyzát z kroku 7 na nástavec (EXT) kolonky QIAamp MinElute, dbejte na to, aby nedo lo ke zvlhãení okraje. Nedot kejte se membrány kolonky QIAamp MinElute pipetovací piãkou. 12. Zapnûte vakuovou pumpu. Po prûchodu lyzátu pfies kolonku QIAamp MinElute otevfiete ventilek vakuového systému a uvolnûte podtlak. Při souběžném zpracování několika kolonek QIAamp MinElute doporučujeme po průchodu lyzátu uzavřít vakuový ventilek (VacValve) každé kolonky, tímto postupem se sníží doba potřebná k uskutečnění tohoto kroku. i Pokud veškerý lyzát neprojde membránou do 15 minut, vyhoďte kolonku QIAamp MinElute Column do odpadu a zopakujte celý postup s použitím nového vzorku. i Pro rychlé uvolnění podtlaku se má používat ventilek vakuového systému. 13. Naneste na kolonku QIAamp MinElute 600 µl prom vacího pufru 1 (AW1). Opatrnû sejmûte nástavec Column Extender (EXT) a vyhoìte jej do odpadu, zavfiete ventilek vakuového systému. Po prûtoku prom vacího pufru 1 (AW1) pfies kolonku QIAamp MinElute otevfiete ventilek a uvolnûte podtlak. i Pro zamezení křížové kontaminace dbejte na to, abyste při odstraňování nástavců (EXT) nemanipulovali s nástavci nad sousedními kolonkami QIAamp MinElute. 14. Naneste na kolonku QIAamp MinElute 750 µl prom vacího pufru 2 (AW2), aniï by do lo k navlhãení okraje kolonky. Nedot kejte se membrány kolonky QIAamp MinElute pipetovací piãkou. Nechte víãko kolonky otevfiené a uzavfiete ventilek vakuového systému. Po prûtoku prom vacího pufru 2 (AW2) pfies kolonku QIAamp MinElute otevfiete ventilek a uvolnûte podtlak. Protokol Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 23

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 24 Protokol 15. Naneste na kolonku QIAamp MinElute 750 µl ethanolu (96 100%), aniï by do lo k navlhãení okraje kolonky. Nedot kejte se membrány kolonky QIAamp MinElute pipetovací piãkou. Nechte víãko kolonky otevfiené a uzavfiete ventilek vakuového systému. Po prûtoku ethanolu pfies kolonku QIAamp MinElute otevfiete ventilek a uvolnûte podtlak. i K aplikaci ethanolu na kolonku QIAamp MinElute použijte špičky s aerosolovou bariérou. 16. Uzavfiete víãko kolonky QIAamp MinElute, odstraàte kolonku z vakuového systému a vyhoìte vakuov konektor (VacConnector VC) do odpadu. VloÏte kolonku QIAamp MinElute Column do prom vací zkumavky (WT) uschované z kroku 9 a centrifugujte pfii maximální rychlosti (pfiibliïnû 20 000 x g, nebo 14 000 rpm) po dobu 1 minuty, pfii centrifugaci dojde k úplnému vysu ení mambrány. Vyhoìte prom vací zkumaku (WT) obsahující filtrát do odpadu. i Vynechání této centrifugace, při niž dochází k vysušení kolonky, může vést k inhibici následného testu. 17. VloÏte kolonku QIAamp MinElute do nové prom vací zkumavky (WT) a inkubujte ji s otevfien m víãkem pfii 56 C po dobu 3 minut, bûhem této doby dojde k evaporaci ve keré zb vající tekutiny. 18. VloÏte kolonku QIAamp MinElute do ãisté eluãní zkumavky (ET) a vyhoìte prom vací zkumavku (WT) do odpadu. Opatrnû otevfiete víãko kolonky QIAamp MinElute a naneste 20 µl nebo 60 µl eluãního pufru (AVE) (v závislosti na daném následném testu) na stfied membrány. Zavfiete víãko a inkubujte pfii laboratorní teplotû (15 25 C) po dobu 3 minut (± 30 s). Centrifugujte pfii maximální rychlosti (pfiibliïnû 20 000 x g, nebo 14 000 rpm) po dobu 1 minuty, bûhem centrifugace dojde k eluci virov ch nukleov ch kyselin. i Po provedení tohoto protokolu proveďte údržbu vakuového systému (bližší informace: viz příručka dodávaná s vakuovým systémem). 24 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 25 Poznámky Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 25

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 26 Poznámky 26 Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 27 Poznámky Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 27

1050717_CS 16.04.2008 8:58 Uhr Seite 28 www.qiagen.com Australia Orders 03-9840-9800 Fax 03-9840-9888 Technical 1-800-243-066 Austria Orders 0800/28-10-10 Fax 0800/28-10-19 Technical 0800/28-10-11 Belgium Orders 0800-79612 Fax 0800-79611 Technical 0800-79556 Canada Orders 800-572-9613 Fax 800-713-5951 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China Orders 021-51345678 Fax 021-51342500 Technical 021-51345678 Denmark Orders 80-885945 Fax 80-885944 Technical 80-885942 Finland Orders 0800-914416 Fax 0800-914415 Technical 0800-914413 France Orders 01-60-920-926 Fax 01-60-920-925 Technical 01-60-920-930 Offers 01-60-920-928 Germany Orders 02103-29-12000 Fax 02103-29-22000 Technical 02103-29-12400 Hong Kong Orders 800 933 965 Fax 800 930 439 Technical 800 930 425 Ireland Orders 1800-555-049 Fax 1800-555-048 Technical 1800-555-061 Italy Orders 02-33430411 Fax 02-33430426 Technical 800-787980 Japan Telephone 03-5547-0811 Fax 03-5547-0818 Technical 03-5547-0811 Korea (South) Orders 1544 7145 Fax 1544 7146 Technical 1544 7145 Luxembourg Orders 8002-2076 Fax 8002-2073 Technical 8002-2067 The Netherlands Orders 0800-0229592 Fax 0800-0229593 Technical 0800-0229602 Norway Orders 800-18859 Fax 800-18817 Technical 800-18712 Singapore Orders 65-67775366 Fax 65-67785177 Technical 65-67775366 Sweden Orders 020-790282 Fax 020-790582 Technical 020-798328 Switzerland Orders 055-254-22-11 Fax 055-254-22-13 Technical 055-254-22-12 UK Orders 01293-422-911 Fax 01293-422-922 Technical 01293-422-999 USA Orders 800-426-8157 Fax 800-718-2056 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) 1050717CS 11/2007 Sample & Assay Technologies