UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmakologie a toxikologie

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmakologie a toxikologie Bakalářská práce Laboratorní stanovení onkologických markerů a jejich využití Vedoucí bakalářské práce: Vedoucí bakalářské práce specialista: Prof. PharmDr. Ing. Milan Lázníček, CSc. Ing. Vlasta Dudková Hradec Králové, 2012 Kateřina Loudilová

Prohlašuji, že tato bakalářská práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, řádně cituji. Tato práce nebyla použita k získání jiného či stejného titulu. V Hradci Králové dne podpis

Ráda bych poděkovala mé vedoucí bakalářské práce Ing. Vlastě Dudkové za odborné vedení, cenné rady a ochotu, se kterou mi pomáhla při zpracování této práce. Další poděkování patří Prof. Ing. PharmDr. Milanu Lázníčkovi, CSc. za vstřícnost a pomoc při závěrečných úpravách.

Obsah 1. Úvod a zadání bakalářské práce.8 2. Všeobecná charakteristika nádorových markerů...9 2.1. Charakteristika nádorových markerů..9 2.2. Dělení nádorových markerů...9 2.3. Obecné využití nádorových markerů 12 3. Laboratorní stanovení onkologických markerů...14 3.1. Charakteristika laboratorních metod pro stanovení onkologických markerů...14 3.1.1. Princip imunoanalýzy 14 3.1.2. Dělení a principy imunoanalytických metod se značenými reaktanty...16 3.2. Radioaktivita, zákony a předpisy, ochrana 18 3.3. Materiál pro laboratorní stanovení onkologických markerů.20 3.3.1. Zpracování biologického materiálu a jeho uchovávání..20 3.3.2. Chemikálie, reagencie 21 3.4. Faktory ovlivňující vyšetření a výsledky..23 3.4.1. Chyby při zpracování biologického materiálu...23 3.4.2. Chyby při používání chemikálií.23 4. Charakteristika vybraných onkologických markerů, jejich laboratorní stanovení a využití diagnostice..24 4.1. Nádorové markery stanovované metodou IRMA.26 4.1.1. Charakteristika a využití PSA a fpsa 29 4.1.2. Charakteristika a využití NSE 30 4.1.3. Charakteristika a využítí CYFRA 21-1..31 4.1.4. Charakteristika a využítí TPA 31 4.1.5. Charakteristika a využítí CA 72-4. 32 4.1.6. Charakteristika a využítí CA 15-3..33 4.1.7. Charakteristika a využítí CA 125...33 4.1.8. Charakteristika a využítí CA 19-9. 34 4.1.9. Charakteristika a využítí CEA 35 4.1.10. Charakteristika a využítí AFP..35 4.1.11. Charakteristika a využítí hcg..36

4.1.12. Charakteristika a využítí TG 36 4.2. Nádorové markery stanovované metodou RIA 37 4.2.1. Charakteristika a využítí TATI..40 4.2.2. Charakteristika a využítí ICTP. 40 4.3. Nádorové markery stanovované metodou CMIA.41 4.3.1. Charakteristika a využití HE4 42 4.3.2. Charakteristika a využití SCCA.42 5. Kazuistiky..43 5.1. Sledování hladin CA 125 u pacientky ve věku 52 let s diagnózou karcinomu vaječníků..43 5.2. Sledování hladin CA 125 u pacientky ve věku 48 let s diagnózou karcinomu vaječníků..45 5.3. Krátkodobé sledování hladin PSA u pacienta ve věku 68 let s diagnózou karcinomu prostaty...46 5.4. Dlouhodobé sledování hladin PSA u pacienta ve věku 70 let s diagnózou karcinomu prostaty...47 6. Závěr. 48 Literatura 49

Použité zkratky: Ab protilátka Ab + značená protilátka AFP Alfa-1-fetoprotein Ag antigen Ag + značený antigen B 2 M beta-2-mikroglobulin CA carbohydráty CEA karcinoembryonální antigen CMIA Chemiluminescenc Microparticle Immunoassay (Chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích) CT počítačová tomografie CYFRA 21-1 fragment Cytokeratinu 19 EIA Enzymo Immuno Assay (Enzymová imunoanalýza) FER ferritin FIA Fluorescens Immuno Assay (Fluorescenční imunoanalýza) fpsa volný prostatický specifický antigen hcg choriový gonadotropin HE4 lidský epididymální protein 4 IA imunoanalytická laboratoř ICTP C-terminální telopeptid kolagenu typu I ILMA Immuno Lumino Metric Assay (Imunoluminometrická analýza) IRMA Immuno Radio Metric Assay (Imunoradiometrická analýza) LD laktátdehydrogenáza LIA Lumino Immuno Assay (Luminoimuno analýza) NNH Nemocnice na Homolce NSE neuronspecifická enoláza PAP prostatická kyselá fosfatáza PET/CT hybridní pozitronová emisní tomografie s počítačovou tomografií PSA prostatický specifický antigen (celkový) PTH parathormon

REA RIA SCCA SOP SÚJB TATI TG TK TPA Radio Enzymo Assay (Radioenzymová analýza) Radio Immuno Assay (Radioimuno analýza) antigen skvamózních buněk standardní operační postup Státní úřad pro jadernou bezpečnost tumor asociovaný tripsín-inhibitor tyreoglobulin tymidínkináza tkáňový polypeptidický antigen

1. Úvod a zadání bakalářské práce Bakalářskou práci s tématem Laboratorní stanovení onkologických markerů a jejich využití jsem si vybrala ve spojitosti s touto oblastí v zaměstnání. Pracuji v imunonalytické laboratoři, kde právě stanovení onkologických markerů zaujímá převážnou část všech vyšetřovacích metod. Onkologie je lékařský obor, který v posledních desetiletí značně pokročil ve vývoji jak po stránce diagnostické tak léčebné. Snad právě proto, že diagnostické metody jsou v dnešní době mnohem rozšířenější a spolehlivější, přibylo bohužel velké množství onkologických pacientů. Správná a rychlá diagnostika pomáhá k účinnější léčbě s lepší prognózou. Cílem mé práce je popsat nejpoužívanější onkologické markery, jejich laboratorní stanovení a využití v onkologické diagnostice. Ráda bych zahrnula některé poznatky z praxe, jako problematiku stability biologického i chemického materiálu, nebo sledování hladin onkologických markerů v závislosti na léčbě. Tato práce zdaleka nezahrnuje popis všech známých onkologických markerů, které je možno stanovit v tělních tekutinách. Je zaměřena především na ty, které vyšetřujeme v naší laboratoři. V některých tabulkách a přehledech se vyskytují i další onkologické markery bez popisů a to pouze pro získání celkového přehledu o obsáhlé problematice tohoto tématu. 8

2. Všeobecná charakteristika nádorových markerů 2.1. Charakteristika nádorových markerů Nádorové markery jsou látky produkované specifickými buňkami organismu. V odborné literatuře lze najít i jiné názvy, avšak tento je nejvíce výstižný. Označení nádorové markery se používá především pro jejich hlavní souvislost s nádorovými změnami v organismu. Mohou být produkovány přímo maligními buňkami, nebo zdravými tkáněmi jako odpověď na přítomnost malignity v organismu. Jejich přítomnost může být v některých případech i fyziologická (1). Z hlediska struktury jsou velice rozmanité. Velký počet řadíme mezi glykoproteiny, glykolipidy nebo polypeptidy. Stanovit se dají také uhlohydrátové determinanty glykoproteinových a glykolipidových antigenů označované zkratkou CA (carbohydráty). Některé nádorové markery pronikají do tělních tekutin, kde lze kvantitativně stanovit jejich koncentrace. Jiné je možné pomocí imunohistochemických metod stanovit v nádorových tkáních. Mnohdy pronikají do tělních tekutin v nepatrném množství a ještě se mísí s látkami strukturně podobnými. Dnešní vysoce citlivé a specifické metody umožňují stanovení nanogramových až femtogramových koncentrací (1). 2.2. Dělení nádorových markerů Velká různorodost nádorových markerů ztěžuje jednoznačné dělení. Literatura uvádí mnohé způsoby. Autoři biochemici se zaměřují na strukturu, lékaři zase na biologické funce, druhy onemocnění, typy tkání, atd. Navíc, mnoho markerů nelze zařadit do jedné skupiny, jejich vlastnosti se prolínají. Základním dělením lze řadit nádorové markery do dvou velkých skupin. Nádorově specifické antigeny, jejichž přítomnost je prokázána výlučně na nádorových buňkách. Druhou skupinou jsou nádorem asociované antigeny, které jsou za určitých okolností prokazatelné i jinde, a jejich přítomnost je pro organismus fyziologická. Jsou produkovány zdravými tkáněmi a do tělních tekutin pronikají na základě nespecifické odpovědi na přítomnost malignity v organismu (2). 9

Dále je možné nádorové markery dělit podle jejich biologické funkce. Do skupiny onkofetálních antigenů lze zařadit ty, jež hrají důležitou roli v průběhu vývoje plodu. Příkladem je karcinoembryonální antigen (CEA). Některé z onkofetálních látek fungují jako hormony a mají imunosupresivní účinky. To platí pro choriový gonadotropin (hcg). Jiné, např. alfa-1-fetoprotein (AFP) se podílejí na transportu biologicky důležitých látek v organismu. Se zvýšenou proliferační aktivitou buněk souvisí například tkáňový polypeptidický antigen (TPA) (1). Další skupinou nádorových markerů z hlediska jejich biologické funkce jsou hormony, látky fyziologicky produkované v průběhu vývoje plodu i během života dospělých jedinců. Pokud dojde k maligní přeměně tkání, schopnost produkce hormonů bývá zachována a ve většině případů kvantitativně roste. Příkladem je zvýšená tvorba kalcitonínu při karcinomu štítné žlázy (1). Rovněž enzymy katalyzující různé biochemické procesy v organismu se řadí do skupiny nádorových markerů. Ovlivňují například glykolýzu (neuronspecifická enoláza, NSE), jiné patří do skupiny transferáz (tymidínkináza, TK), nebo hydroláz (prostatická kyselá fosfatáza, PAP). Většina enzymů je stejně jako hormony produkována fyziologicky při vývoji plodu a je zachována i v dospělosti. Při maligní přeměně tkání kvantitativně stoupá produkce enzymů a zvyšují se také jejich koncetrace v tělních tekutinách (1). Poslední skupinou jsou ostatní tkáňové produkty, které nelze zařadit mezi hormony ani enzymy. Přesto jsou to látky se specifickými funkcemi v průběhu vývoje plodu i v období dospělosti. Fungují jako zásobní bílkoviny (ferritin, tyreoglobulin), nebo proteiny akutní fáze s ochrannou funkcí při poškození tkání (tumor asociovaný tripsín- inhibitor, TATI). Důvodem jejich zvýšené koncentrace v tělních tekutinách může být maligní přeměna tkání fyziologicky produkujících tyto látky, nebo nespecifická produkce zdravými tkáněmi v důsledku reakce na malignitu v organismu (1). Přehled vybraných nádorových markerů a jejich rozdělení dle biologické funkce je v tabulce č.1. Zvýrazněné markery jsou podrobně popsány v kapitole 4. Ostatní jsou uvedeny pro přehlednost. 10

Nádorové markery a jejich rozdělení dle biologické funkce (3). Skupina Název markeru Zkratka Onkofetální antigeny Karcinoembrionální antigen CEA Alfa-1-fetoprotein AFP Tkáňový polypeptidický antigen TPA Muciny a glykoproteiny Antigen skvamozních karcinomů SCCA CYFRA 21-1 CA 19-9 CA 125 CA 72-4 CA 15-3 Antigen mucinozních karcinomů Hormony Choriový gonadotropin hcg Adrenokortikotropní hormon Kalcitonin Parathormon PTH Gastrín Prolaktin Enzymy Neuron specifická enoláza NSE Prostatický specifický antigen PSA Volná frakce PSA fpsa Prostatická kyselá fosfatáza PAP Tymidinkináza TK Laktát-dehydrogenáza LD Ostatní tkáňové produkty Tyreoglobulin TG Tumor asociovaný trypsín- inhibitor TATI Lidský epididymální protein 4 HE4 Telopeptid kolagenu C terminální typu I ICTP Beta-2-mikroglobulin B 2 M Ferritin FER Tabulka č.1. 11

2.3. Obecné využití onkologických markerů Nádorové markery, jak už jejich název napovídá, se týkají především diagnostiky v onkologii. V posledních desetiletích počet diagnostikovaných maligních onemocnění mnohonásobně vzrostl. Tento nárůst má jistě příčinu v dnešním životním stylu, prostředí a v mnoha dalších faktorech spojených se současností. Nárůst počtů maligních onemocnění je ovlivněn i stále se zdokonalujícími diagnostickými metodami. To, co jsme dnes schopni přesnými laboratorními metodami diagnostikovat, byla v minulém století ještě hudba budoucnosti. Zvyšující se počet vyšetření nejpoužívanějších nádorových markerů v NNH udává graf č. 1. počet vyšetření 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 Počet vyšetření nádorových markerů v letech 2000-2010 39190 41637 42122 35154 31907 33026 32023 23629 26443 27147 16794 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 rok Graf č.1. (zdroj: Laboratorní informační systém, IA laboratoř, Nemocnice na Homolce) Nejrozšířenější využití nádorových markerů je sledování účinnosti protinádorové léčby. Uplatňuje se zvláště při sledování účinku chemoterapeutických léčiv. Porovnání koncentrací nádorových markerů je důležitou součástí před a pooperačních vyšetření. Hladiny nádorových markerů se po úspěšné léčbě v tělních tekutinách stabilizují na své fyziologické hodnoty. Normalizace hodnot je závislá na biologickém poločase markerů (viz tabulka č. 2) (4). Neúčinnost léčby lze snadno odhalit v závislosti na zvýšené či rostoucí hladině markerů. Některé nádorové markery vykazují přechodný vzestup hladin v začátcích léčby a to i přesto, že je léčba úspěšná. Tento stav nastává v důsledku náhlého vyplavení markerů z maligních tkání poškozených léčbou. 12

Biologický poločas nádorových markerů v tělesných tekutinách (4). Nádorový marker Poločas [hod] CEA 340 TPA 170 CA 15-3 170 AFP 120 CA 19-9 120 CA 125 96 TG 60 PSA 48 hcg 24 NSE 24 fpsa 7 CYFRA 21-1 3 SCCA 0,3 TATI 0,1 Tabulka č. 2. Hladiny nádorových markerů jsou vhodným prognostickým ukazatelem u maligních onemocněních. Koncentrace markerů v tělních tekutinách korelují s růstem a invazivitou nádorové tkáně. Stanovení hladin markerů po chirurgickém zákroku pomáhá upřesnit klinické stádium onkologického onemocnění. Snížení až úplná normalizace hodnot po chirurgickém výkonu svědčí o kompletním odstranění maligních tkání. Naopak přetrvání vyšších hodnot nebo zvýšení koncentrací markerů v tělních tekutinách ukazuje na zhoršení či recidivu onemocnění (5). Využití v oblasti rozlišení malignit od nemaligních onemocnění je stejně jako u screeningu omezené. Stanovené hodnoty ať již pozitivní nebo negativní není možné považovat jako důkaz přítomnosti či nepřítomnosti malignity v organismu. Z diferenciálního hlediska lze nádorové markery považovat jen za doplňující vyšetření k dalším diagnostickým vyšetřením. Screeningem malignit se rozumí záchyt nádorových onemocnění u zdravé populace bez výskytu příznaků. Využití nádorových markerů v této oblasti je dnes stále velmi omezené. Vysoké nároky na specifitu a senzitivitu omezují výběr markerů pro tuto oblast diagnostiky na 13

minimum. Příkladem nádorového markeru využitelného při screeningu, i když v omezené míře, je prostatický specifický antigen (PSA) (5). 3. Laboratorní stanovení onkologických markerů Stanovení hladin nádorových markerů se provádí in vitro kalibrovanými soupravami. Schválené postupy jsou v souladu s Nařízením vlády č.453/2004 Sb., kterým se stanoví technické požadavky a sledování vnitřní kontroly kvality (4). Laboratoř musí být vybavena vhodným přístrojovým vybavením a taktéž disponovat příslušným odborným personálem. Pro dlouhodobá sledování pacientů musí laboratoř zajistit výsledky o stejné analytické nejistotě a vysoké reprodukovatelnosti. Veškerá analýza nádorových markerů se řídí standardními operačními postupy (SOP) laboratoře. Jsou to vnitřní dokumenty analytické laboratoře, které obsahují veškeré potřebné informace k dané analýze (4). 3.1. Charakteristika laboratorních metod pro stanovení onkologických markerů Hlavní metodou při měření hladin nádorových markerů je imunoanalýza. Stanovení se provádí in vitro s různými možnostmi detekce. Při sledování pacientů je potřeba zajistit takovou technologii, která bude vysoce reprodukovatelná a bude poskytovat výsledky se stejnou mírou nejistot. Pro stanovení jednotlivých markerů se v laboratoři používají automatické analyzátory nebo komerčně dodávané soupravy pro manuální zpracování. Soupravy obsahují všechna chemická činidla, standardy pro kalibrační křivku, kontrolní vzorky a zkumavky potřebné pro vyšetření daného markeru. 3.1.1. Princip imunoanalýzy Princip imunoanalýzy je založen na interakci protilátky (Ab) s antigenem (Ag). Protilátky jsou heterogenní glykoproteinové molekuly, které jsou tvořeny lidským imunitním systémem. Antigeny jsou makromolekuly přirozeného nebo syntetického původu. V případě 14

imunoanalýzy je antigenem analyzovaná látka v biologickém vzorku a zároveň standard používaný ke kvantifikaci analýzy (6). Imunitní systém člověka umí antigeny rozpoznat jako tělu cizí látky a reaguje na ně tvorbou protilátek. Antigen schopný vyvolat tvorbu protilátek je nazýván kompletním antigenem. Naopak nekompletní antigen, neboli hapten, je nízkomolekulární látka, která vyvolá tvorbu protilátek až po navázání na vhodný nosič. Při reakci antigenu s protilátkou vzniká imunokomplex, který je následně detekován (6). Výhodou imunoanalytických metod je jejich vysoká specifita a citlivost, která umožňuje stanovení i nepatrných množství analytů bez předchozí izolace.viz tabulka č.3. Vybrané imunoanalytické metody a jejich dosahovaná citlivost stanovení analytu (7). Metoda Citlivost stanovení FIA- Fluorescens Immuno Assay EIA- Enzymo Immuno Assay 10-9 [ g ] RIA- Radio Immuno Assay REA- Radio Enzymo Assay 10-12 [ g ] IRMA- Immuno Radio Metric Assay LIA- Lumino Immuno Assay 10-15 [ g ] ILMA- Immuno Lumino Metric Assay Tabulka č.3. Imunoanalytické metody zaznamenaly v posledních letech značný rozvoj. Ke stanovení onkologických markerů se využívají některé metody imunoanalýzy se značenými reaktanty (protilátek i antigenů). Tyto níže uvedené vybrané metody se liší principem detekce a meřící technikou (7). 15

3.1.2. Dělení a principy imunoanalytických metod se značenými reaktanty V dnešní době se využívá velké množství různých obměn imunoanalytických metod se značenými reaktanty. Toto rozdělení slouží pro přehlednost. Nejčastěji využívané metody ke stanovení hladin onkologických markerů jsou popsány níže. Dělení imunoanalytických metod se značenými reaktanty (7): Radiometrické: IRMA- Immuno Radio Metric Assay (Imunoradiometrická analýza), RIA- Radio Immuno Assay (Radioimunoanalýza), REA- Radio Enzymo Assay (Radioenzymová analýza), RRA- Radio Receptor Assay (Radioreceptorová analýza), Enzymové na fotometrických principech: EIA- Enzymo Immuno Assay (Enzymová imunoanalýza), ELISA- Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (Imunoanalýza s enzymem vázaným na sorbentu) EIMA- Immuno Enzymo Metric Assay (Imunoenzymometrická analýza), Fluorescenční: FIA- Fluorescens Immuno Assay (Fluorescenční imunoanalýza), FPIA- Fluorescens Polarization Immuno Assay (Fluorescenčně polarizační imunoanalýza) Luminiscenční LIA- Lumino Immuno Assay (Luminiscennční imunoanalýza), ILMA- Immuno Lumino Metric Assay (Imunoluminometrická analýza), ECL- Electrochemiluminiscent (Elektrochemiluminiscence), CMIA- Chemiluminescent Microparticle Immuno Assay (Chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích). Radiometrické metody, nebo-li radioanalytické metody, jsou založené na detekci látek značených radioaktivními izotopy. Tyto kvantitativní metody jsou vysoce citlivé a specifické, nicméně práce s radioaktivním materiálem vyžaduje speciální pracoviště a přísná bezpečnostní opatření. Nejvíce využívanou metodou ke stanovení onkologický markerů je imunoradiometrická analýza (IRMA). Je to nekompetitivní metoda, kde je radionuklidem značena specifická 16

protilátka, která je v nadbytku. Dochází ke vzniku komplexu značená protilátka-antigen (Ab + Ag). Množství analyzovaného antigenu je přímo úměrné množství značeného komplexu. Nejužívanějším izotopem pro značení je 125 I. Pro měření signálu (gama záření) je používán scintilační detektor (7). Podrobný popis laboratorní metody IRMA viz kapitola 4.1. Další radiometrickou metodou je radioimunoanalýza (RIA). RIA je kompetitivní metoda založená na reakci specifické protilátky jako vazebného reagentu a antigenu. Na rozdíl od IRMA metod, je u RIA značen radionuklidem antigen. Protilátka je použita v limitovaném množství (je jí méně než značeného vzorku). Při reakci dochází k soutěži značeného a neznačeného antigenu o omezený počet vazebných míst protilátky. Vznikají dva typy komplexů. Prvním komplexem je protilátka se značeným antigenem (AbAg + ), druhým je protilátka s neznačeným antigenem (AbAg). Izotopem značený antigen umožňuje následné kvantitativní vyhodnocení pomocí vhodného detektoru. Množství značeného komplexu AbAg + je nepřímo úměrné množství analyzovaného antigenu. Výhodou RIA metod je stanovení haptenů, které se mohou navázat na specifické protilátky přímo bez nosiče (7). Podrobný popis laboratorní metody RIA viz kapitola 4.2. Laboratoře, které podmínky bezpečnosti práce s radionuklidy nesplňují, vyšetření nahrazují jinak značenými neizotopovými metodami, např. enzymovými, fluorescenčními a luminiscenčními. Metody dle principu opět dělíme na kompetitivní (soutěž značeného a neznačeného antigenu o omezený počet vazebných míst protilátky) a nekompetitivní (nadbytek vazebných míst) (7). Principem enzymových metod je detekce konjugátu, který vznikl navázáním enzymu na reaktant (protilátku nebo antigen). Enzym katalyzuje reakci, při které vznikají barevné nebo fluoreskující sloučeniny. K měření signálu se využívají fotometrické či fluorimetrické detektory. Nejčastěji používaným enzymem je peroxidaza nebo alkalická fosfatáza. Enzymové metody dále dělíme na homogenní a heterogenní. Homogenní enzymové metody (EIA) jsou takové, při kterých se aktivita enzymu mění (klesá) nebo úplně zaniká. Při těchto metodách není potřeba oddělovat volný značený reaktant od značeného reaktantu, který je navázán v imunokomplexu. Naopak u heterogenních enzymových metod (ELISA), které jsou více citlivé, se aktivita enzymu po navázání na imunokomplex nemění a oddělení volné 17

a vázané frakce je nezbytné. Princip je stejný jako u RIA, ale radionuklid je nahrazen enzymem (7). Principem luminoanalytických metod (LIA) je detekce elektronů. Luminiscence je schopnost molekul absorbovat energii (excitace molekuly ze základního do nestabilního stavu), kterou poté vyzáří ve formě fotonů (návrat do stabilního stavu vyzářením energie ve formě elektromagnetického záření). Pokud dojde k luminiscenci při chemické reakci vhodné chemické sloučeniny (nejčastěji oxidaci), je tento typ reakce nazýván chemiluminiscencí (7). Do luminiscenčních metod řadíme také metodu CMIA (chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích). Principem je detekce signálu chemiluminiscenčního záření optickou metodou. Paramagnetické mikročástice jsou potažené protilátkou na něž se váže antigen ze vzorku. Přidáním druhé protilátky spolu s akridiniem vzniká reakční směs. Množství antigenu ve vzorku je přímo úměrné detekovanému signálu (8). Fluorescenční metody (FIA) jsou principem stejné jako LIA. Liší se ve způsobu měření signálu. O fluorescenci se jedná v případě, že látka emituje záření pouze po dobu absorbce energie (7). 3.2. Radioaktivita, zákony a předpisy, ochrana Vzhledem k využití radionuklidů v metodách používaných ke stanovení některých nádorových markerů, bych se v této kapitole zmínila o principech radioaktivity, zákonech a vyhláškách povolujících práci s ionizujícím zářením. Radioaktivita je schopnost některých chemických prvků vysílat při přeměně svého jádra záření. Toto neviditelné radioaktivní záření je schopno vysílat asi 50 přírodních radionuklidů, jejichž atomová jádra jsou nestálá a samovolně se přeměňují. Radionuklidy lze získat také uměle, ozářením stálých nuklidů různých prvků. Radioaktivní záření známe trojího druhu, alfa, beta a gama. Liší se od sebe především intenzitou průniku a charakterem částic, které záření tvoří. Charakteristickou vlastností radionuklidů je poločas rozpadu. Je to doba, za kterou se přemění právě polovina výchozího počtu atomů. Rozmezí poločasu rozpadu u radioaktivních prvků je velmi široké. Pohybuje se od 10-11 sekundy do 10 10 let. Rychlostí přeměny (počet přeměn za sekundu) je definovaná aktivita vzorku udávaná v becquerelech (Bq) (9). 18

V naší laboratoři se ke značení v RIA a IRMA metodách využívá výhradně radionuklid 125 I, který je ve formě roztoku (většinou růžové nebo červené barvy, na první pohled výrazně odlišný od ostatních chemických činidel) součástí komerčně dodávaných souprav. Imunoanalytická laboratoř v Nemocnici na Homolce, je vzhledem k používání radioaktivních látek, zařazena pod oddělení nukleární medicíny. Celé oddělení je držitelem rozhodnutí SÚJB (Státního úřadu pro jadernou bezpečnost) o povolení nakládání se zdroji ionizujícího záření. Oddělení je povinno dodržovat platnou legislativu, do které patří v první řadě Zákon č. 18/1997 Sb. ze dne 24. ledna 1997 o mírovém využívání jaderné energie a ionizujícího záření (atomový zákon). Tento zákon mimo jiné upravuje způsob a využití jaderné energie a ionizujícího záření, podmínky vykonávání činností souvisejících s využíváním jaderné energie a činností vedoucích k ozáření. Dále upravuje systém ochrany osob a životního prostředí před nežádoucími účinky ionizujícího záření (10). Do legislativy, kterou se oddělení nukleární medicíny řídí, dále patří vyhlášky SÚJB. Vyhláška č. 307/2002 Sb. o radiační ochraně, Vyhláška č. 132/2008 Sb. systém jakosti při činnostech souvisejících s využíváním jaderné energie a Vyhláška č.146/1997 Sb. činnosti které mají bezprostřední vliv na jadernou bezpečnost (10). Radioaktivní materiál mohou přijímat, skladovat a zpracovávat pouze ta pracoviště, která splňují výše uvedený zákon a vyhlášky. Imunoanalytická laboratoř se řídí také svými vnitřními předpisy, např. SOP Shromažďování radioaktivního odpadu na úseku in vitro. Při práci s radioaktivními látkami je nutné dodržovat základní pravidla: - všechny radioaktivní látky musí být uchovávány v originálních obalech a na místech k tomu určených, - evidovat příjem a spotřebu radioaktivních látek, - práci provádět pouze ve vyhrazených prostorách, - v laboratoři nejíst, nepít a nekouřit, - zamezit přímému kontaktu s pokožkou, - používat ochranné oděvy a rukavice, - v případě kontaminace pracovních ploch provést dekontaminaci a následnou kontrolu, - všechny kontaminované obaly a pracovní pomůcky skladovat odděleně v nádobách nebo igelitových pytlích označených radioaktivním znakem v prostorách k tomu určených (11). 19

Zásady radiační ochrany nalezneme ve vyhlášce č. 307/2002 Sb. vydané SÚJB, jejímž obsahem je například odstavec o limitech pro radiační pracovníky. Cílem radiační ochrany je vystavení pracovníků co nejnižším dávkám během pracovní činnosti a snížení negativních vlivů radioaktivního záření na zdraví pracovníků (10). Limity pro radiační pracovníky jsou definovány jako součet efektivních dávek, které může být radiační pracovník vystaven při všech pracovních činnostech, které vykonává. Dávky jsou sledovány osobními a prstovými dozimetry, které je každý pracovník povinen během pracovní doby nosit. Osobní dozimetr musí být umístěn v levé horní části hrudníku a prstový dozimetr na ukazováčku více exponované ruky směrem do dlaně. Dozimetry se vyhodnocují v pravidelných intervalech jednou za měsíc. Na našem pracovišti se o sledování dávek pracovníků stará radiologický fyzik. Případné překročení dávek je hlášeno a pracovník musí být z provozu na čas vyřazen (10). Obecnými zásadami v ochraně při práci s radioaktivními látkami jsou vzdálenost, čas a stínění. V praxi to znamená snížení dávek pro pracovníky na co možná nejnižší možné hodnoty. Pracujeme tedy efektivně, rychle a zároveň přesně, s předem promyšleným postupem. Se zvyšující se vzdáleností klesá síla radioaktivity, tudíž pokud je to možné zdržujeme se v blízkosti aktivity co nejkratší možnou dobu. Pro skladování radioaktivních látek používáme oddělené místnosti, případně olověná stínění. 3.3. Materiál pro laboratorní stanovení onkologických markerů 3.3.1. Zpracování biologického materiálu a jeho uchovávání Zpracování a uchovávání biologického materiálu se řídí standardními operačními postupy dané laboratoře. V imunoanalytické laboratoři (IA laboratoř) Nemocnice na Homolce (NNH) se vyšetření všech onkologických markerů provádíme ze séra. Odebraný materiál přichází do IA laboratoře z centrálního odběrového místa. Primárním materiálem je venózní krev odebraná do zkumavek bez přidaných aditiv. Biologický materiál považujeme za potencionálně infekční a veškerou manipulaci s ním provádíme v rukavicích. Obecné zásady strategie bezpečnosti práce s biologickým materiálem vycházejí z příslušných směrnic a právních předpisů. Především z vyhlášky MZ ČR č. 195/2005 Sb a jejích příloh. 20

Sérum získáme centrifugací krve. Centrifugaci provádíme v laboratorních centrifugách typu JOUAN B4i 10 minut při otáčkách 2300 za minutu. Po centrifugaci oddělíme sérum od krevního koláče do předem označených (přidělené laboratorní číslo, datum, jméno a rodné číslo pacienta) zkumavek. Žádné další speciální úpravy vzorků před vyšetřením není třeba provádět (12). Ve zkumavkách séra uchováváme do doby zpracování. Doba a teplota uchovávání sér závisí na stabilitě daného markeru v séru. Většinu sér je možné uchovávat maximálně 24 hodin při teplotě 2-8 C. Při delší době skladování vzorky zamrazíme a uchováváme při teplotě menší než -18 C. Pro případ opakovaného použití vzorku připravujeme alikvoty, protože je nutné vyhnout se opakovanému rozmrazování vzorku (12). 3.3.2. Chemikálie, reagencie Komerční soupravy pro jednotlivá vyšetření jsou dodávány do imunoanalytické laboratoře nasmlouvanými dodavately. Soupravy obsahují veškeré chemikálie a reagencie potřebné k provedení analýzy. Pro zajištění stability vyšetřovací soupravy je nutné zachování skladovací teploty (většinou 2-8 C) určené výrobcem a dodržení používání maximálně do data expirace uvedeného na obalu (12). To představuje obvykle zkumavky, protilátky/antigeny značené radionuklidem, kalibrátory, kontrolní vzorky, diluent, pufr a promývací roztok. Příklad komerční soupravy viz obrázek č.1 a 2. 21

Souprava pro vyšetření PSA Obr. č. 1. Souprava pro vyšetření TATI Obr. č. 2. 22

3.4. Faktory ovlivňující vyšetření a výsledky 3.4.1. Chyby při zpracování biologického materiálu Existuje řada faktorů, jež nepříznivě ovlivňují výsledky analýzy. Zkreslení výsledku může být ve směru pozitivity i negativity. Jedním z těchto vlivů je hemolýza krve, která vzniká vyplavením hemoglobinu z červených krvinek. Je to nejčastější chyba vzniklá při odběrech krve. Může být vyvolána mechanickými, termickými nebo jinými vlivy (13). Hemolýza u onkologických markerů je zcela nežádoucí především u vyšetření PSA, TPA, CYFRY 21-1 a především NSE. Dalšími nepříznivými vlivy jsou lipemická séra, obsah fibrinových vláken, erytrocyty a jiné pevné částice a vzduchové bublinky. Tyto faktory ovlivňují především vyšetření prováděná automatickými analyzátory (12). Stabilita analytů je dána časovým intervalem v němž může být analýza ještě bezpečně provedena. Je to doba, po kterou se počáteční obsah analytu ve vzorku nemění při skladování za definovaných podmínek. Některé analyty jsou nestabilní zejména před centrifugací a oddělením krevních elementů, proto je nutno vzorky dodat do laboratoře co nejdříve. Stabilitu biologického materiálu též ovliňuje teplota, doba skladování a případné opakované rozmrazování. Hladina analyzovaného markeru v séru většinou klesá a výsledky jsou ovlivněny falešně negativní chybou (12). 3.4.2. Chyby při používání chemikálií a reagencií Spolehlivost soupravy je zajištěna dodržováním zásad práce popsané v návodu, který je součástí soupravy. Možnost vzniku chyb při nesprávném používání soupravy můžeme snížit, budeme-li se řídit následujícími pravidly. Největší chybou je použítí soupravu s prošlou dobou exspirace. Nejčastěji používaný radionuklid 125 I má poločas rozpadu 60 dnů. V případě použití soupravy s pokleslou aktivitou je možné očekávat nižší impulsy při měření záření a tudíž zkreslené výsledky. K vyšetření proto používáme jen soupravy s aktuální dobou exspirace a skladované dle předpisů. Před použitím soupravy veškeré reagencie vytemperujeme na laboratorní teplotu. Dodržujeme instrukce v návodu. Nemícháme reagencie ze souprav různých šarží. Ke každé řadě stanovení vždy stanovujeme novou kalibrační závislost a k rozpouštění reagencií používáme redestilovanou vodu (14). 23

4. Charakteristika vybraných onkologických markerů, jejich laboratorní stanovení a využití v diagnostice V následující části bakalářské práce se zaměřím na charakteristiku jednotlivých onkologických markerů. Vybraná vyšetření stanovujeme v imunoanalytické laboratoři v NNH dle týdenního plánu, který je vnitřním řádem laboratoře. Je přizpůsobený počtu vyšetření vzhledem k finanční stránce a také k délce prováděné analýzy. Například požadavků na vyšetření PSA je denně desítek. Proto je možné v rámci zdravé ekonomiky, provádět tato vyšetření každý den. Naopak žádostí na stanovení CYFRA 21-1 je znatelně méně, proto se provádí jednou maximálně dvakrát v týdnu. Ekonomika laboratoře je věcí jednou, naproti tomu jsou mnohdy hodnoty laboratorních vyšetření zásadní informací při rozhodování v dalším postupu diagnózy či léčby pacienta a proto doba odezvy nesmí být příliš dlouhá. Přehled využití nádorových markerů je uveden v následujících tabulkách č. 4 a č. 5. Zvýšené hladiny nádorových markerů u nemaligních onemocnění (4). Nádorový marker Nemaligní onemocnění Jiná příčina AFP jaterní cirhóza, chronická hepatitida, zánětlivé procesy těhotenství CA 125 ovariální cysty, choroby jater, pankreatu, žlučníku těhotenství CA 15-3 jaterní cirhóza, akutní hepatitida, poškození glomerulů CA 19-9 cirhóza jater, chronická hepatitida, chronická a akutní pankreatitida, choroby žlučových cest, diabetes CA 72-4 benigní nádory prsu, choroby GIT CEA zánětlivé choroby jater, ledvin, jaterní cirhóza kouření CYFRA 21-1 urologický trakt, myomy, ovariální cysty FER záněty obecně, poruchy metabolismu železa NSE jaterní a plicní onemocnění hemolýza ve vzorku PSA benigní hyperplazie prostaty, záněty prostaty mechanické dráždění prostaty Tab. č. 4. 24

Nádorové markery vhodné pro monitorování nádorové choroby a účinnosti léčby (4). Lokalizace nádoru Základní markery Doplňkové markery Hlava, krk SCCA CYFRA 21-1 CNS neuroblastomy NSE - gliomy CEA - Plíce CEA, NSE, CYFRA 21-1 - Jícen horní třetina SCCA CYFRA 21-1 dolní třetina CA 72-4, CEA - Žaludek CA 72-4, CEA - Střeva CA 19-9, CEA - Slinivka břišní CA 19-9, CEA - Játra AFP, CEA, CA,19-9 - Mléčná žláza CA 15-3, CEA TPA Vaječníky nemucinózní CA 125 TPA mucinózní CA 19-9, CA 72-4 CEA germinativní AFP, hcg - Ledviny TPA, CEA NSE Močový měchýř TPA CYFRA 21-1 Prostata PSA, fpsa - Varlata hcg, AFP NSE Tab. č. 5. Nádorové markery v imunoanalytické laboratoři v NNH analyzujeme za použití různých principů. Nejběžněji používáme metody IRMA, RIA a CMIA. Přehled jednotlivých markerů a princip jejich stanovení je uveden v následující tabulce č. 6. Laboratorní postup stanovení jednotlivých markerů v dané skupině je téměř shodný, proto v následujícím textu uvádím od každého principu vždy jeden konkrétní postup pro vybraný marker. Případné obměny v pipetovaném objemu, době inkubace, chemických činidel, počtem a objemem promývání jsou uvedeny v SOP a příbalovém letáku jednotlivých markerů. 25

Nádorové markery rozdělené dle principu jejich stanovení v IA laboratoři NNH Metoda Nádorový marker Analýza CA 72-4 ruční metoda CA 15-3 ruční metoda TPA ruční metoda CYFRA 21-1 ruční metoda NSE ruční metoda PSA ruční metoda IRMA fpsa ruční metoda AFP ruční metoda hcg ruční metoda TG ruční metoda CEA analyzátor Stratec SR 300 CA 19-9 analyzátor Stratec SR 300 CA 125 analyzátor Stratec SR 300 RIA TATI ruční metoda ICTP ruční metoda CMIA HE4 analyzátor Architect 1000 SR SCCA analyzátor Architect 1000 SR Tab. č. 6. 4.1. Nádorové markery stanovované metodou IRMA Obecný princip IRMA metody je uveden v kapitole 3.1.2. Následující laboratorní postup pro stanovení PSA zde uvádím, jako příklad markeru stanovovaného metodou IRMA. Koncentrace PSA se stanovuje v séru skladovaného maximálně 24 hodin při teplotě 2-8 C, nebo delší dobu při -20 C. Stanovení je založeno na radioimunoanalytické metodě používající dvě monoklonální protilátky proti dvěma různým epitopům molekuly PSA. První protilátka je navázána na stěnách zkumavky, druhá protilátka značená 125 I se přidává ve formě roztoku. Odečítání koncentrací jednotlivých vzorků se provádí z kalibrační křivky, která je součástí každé série vyšetření. Kalibrační křivka se stává z nulového kalibrátoru (blank), pěti kalibrátorů (standardy) se známou koncentrací a kontrolního vzorku. 26

Přesné koncentrace lidského PSA rozpuštěného v pufru s azidem sodným jsou uvedeny na štítku každé lahvičky. Součástí každé vyšetřované kalibrační křivky je zkumavka obsahující pouze doporučený objem radioindikátoru sloužící ke stanovení celkové aktivity tzv. total (15). Veškeré reagencie před zahájením práce vytemperujeme na laboratorní teplotu. Do předem připravených a označených zkumavek napipetujeme přesné objemy roztoků. Obsah zkumavek promícháme na vibračním míchadle a inkubujeme 2 hodiny při laboratorní teplotě za stálého třepání. Po inkubaci obsah všech zkumavek s výjimkou totalu odsajeme a promyjeme dvakrát 2ml promývacího roztoku Tween 20. Roztok používaný k promývání zkumavek je součástí vyšetřovací soupravy. Před použitím ho naředíme dle návodu (9ml Tween 20 a 3l destilované vody). Takto naředěný roztok je při teplotě 2-8 C stabilní patnáct dní (15). Promytím odstraníme nenavázanou značenou protilátku. Aktivitu navázané značené protilátky ve zkumavkách změříme na gama-čítači po dobu jedné minuty. V imunoanalytické laboratoři NNH používáme detektor firmy BERTHOLD Multi- Crystal Gamma Counter LB 2111. Výstupem jsou počty impulsů odpovídající koncentraci vzorku. Počítačový software sestaví kalibrační křivku (viz obrázek č. 3), z které se odečítají hodnoty koncentrací analyzovaných vzorků. Při této metodě dochází k soutěži značeného (radioindikátor) a neznačeného antigenu (analyzovaný vzorek) o vazebná místa protilátky na stěnách zkumavky. Množství značeného antigenu je přímo úměrné množství analyzovaného antigenu (15). Příklad typické kalibrační křivky PSA Obr. č. 3. 27

Schéma pracovního postupu (tabulka č. 7 a 8) (15). 1. krok: pipetace Označení zkumavky Roztok Radioindikátor [µl] Zkumavka T - 300 bez navázané protilátky B0 50µl nulový kalibrátor 300 S1 50µl standard 1 300 S2 50µl standard 2 300 ze soupravy S3 50µl standard 3 300 potažená S4 50µl standard 4 300 monoklonální S5 50µl standard 5 300 protilátkou KS 50µl kontrolní vzorek 300 vz1 50µl analyzovaný vzorek 1 300 vz2 50µl analyzovaný vzorek 2 300 Tab. č. 7. 2. krok: inkubace, promytí a měření Označení zkumavky Inkubace Promytí Měření T - B0 S1 S2 18-25 C S3 odsátí a promytí měření četnosti po dobu 2 hodiny S4 2x 2ml promývacím 1minuty za stálého třepání S5 roztokem KS vz1 vz2 Tab. č. 8. 28

4.1.1. Charakteristika a využití PSA a fpsa PSA je glykoprotein s molekulovou hmotností 34000 Daltonů. Z hlediska biologické funkce ho řadíme do skupiny enzymů. Je to serinová proteáza, jejíž fyziologickou funkcí je zkapalnění spermatu (16). Je produkován epiteliálními buňkami žlázových vývodů prostaty. Vyskytuje se především ve spermatu ( ve vysoké koncentraci 0,2-0,5mg/ ml) a do tělních tekutin přechází v limitovaném množství (17). V séru existuje PSA ve dvou formách, jako volná frakce (fpsa) nevázaná na bílkovinu, nebo v komplexu s alfa-1-antichymotrypsinem či alfa-2-makroglobulinem. Laboratorně lze stanovit PSA pouze v komplexu s alfa-1-antichymotrypsinem (16). PSA je jedním z nejvýznamnějších onkologických markerů. Důvodem je jeho vysoká specifičnost k prostatickým tkáním. Tato skutečnost přisuzuje PSA možnost využití jako screeningového markeru. Důkazem toho je stále se zvyšující počet požadavků na vyšetření v laboratořích. Růst počtu vyšetření PSA+fPSA v NNH za posledních 10 let ukazuje graf č. 2. počet vyšetření Počty vyšetření PSA a fpsa v letech 2000-2011 10000 9000 8241 9089 9383 8000 7000 6288 7076 6515 7169 6000 5000 4000 3000 2000 3971 1833 5211 5048 4779 2438 2402 2462 3152 3707 3782 4297 4853 5519 5161 1000 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 rok počet vyšetření PSA počet vyšetření fpsa Graf č. 2. 29

Zvýšené sérové hladiny jsou charakteristickým znakem karcinomu prostaty, benigních hyperplazií prostaty, akutních zánětů prostatické žlázy, nebo kostních metastáz prostatického původu. Další využití stanovení koncentrací PSA je při sledování průběhu léčby a remisi onemocnění (15). Fyziologická hladina PSA v séru se pohybuje od 0,0 do 3,50 ng/ ml. Horní hranice koncentrace PSA je velice diskutovaným číslem. Někteří lékaři považují hodnotu 3 ng/ml za zcela normální, jiní ji hodnotí již jako zvýšenou. Hodnoty PSA jsou závislé na mnoha faktorech. Jedním z nich je věková hranice. S rostoucím věkem vzrůstá úměrně i koncentrace PSA v séru. Referenční hodnota zdravého dospělého muže ve věku padesáti let je kolem 2,5 ng/ml, ve věku nad sedmdesát let se již pohybuje do hodnot 6,5 ng/ml. Obecně se považuje za vhodné pravidelně vyšetřovat hladinu PSA od 45. roku života. Rizikovou skupinou jsou pacienti s familiárním výskytem karcinomu prostaty (17). Dalším faktorem ovlivňující sérovou hladinu PSA je zvýšený přestup markeru do cirkulace v důsledku mechanického podráždění prostaty (palpační vyšetření prostaty, jízda na kole, nebo sexuální aktivita). Stanovení volné frakce PSA se provádí při hodnotách celkového PSA 3,5-15 ng/ml. Vypočítaná hodnota poměru volného PSA a celkového PSA vyjádřená v procentech se využívá k rozlišení pacientů s benigní hyperplazií a karcinomem prostaty. Hodnota vyšší než 25% souvisí s benigní hyperplazií (15). 4.1.2. Charakteristika a využití NSE Neuronspecifickou enolázu řadíme do skupiny enzymů. Fyziologicky se enolázy tvoří zejména v nervových a plicních tkáních plodu a také v tkáních neuroendokrinního původu u dospělých lidí. V případě NSE rozlišujeme tři izoenzymy. Alfa je produktem gliálních struktur mozku, beta se vyskytuje ve svalových buňkách a gama je přítomen v neurónech mozku, periferních nervových tkáních a v neuroendokrinních tkáních. Izoenzym gama byl nalezen v neurónech ve velmi vysokých koncentracích a právě díky tomu se nazývá enolázou specifickou pro neurony, tedy neuronspecifickou enolázou (18). Význam stanovení spočívá především ve sledování pacientů s neuroblastomy a malobuněčnými plicními karcinomy. Zvýšené sérové hodnoty lze naměřit také při karcinomech ledvin, seminomech, melanoblastech a nemaligních onemocnění plic. U maligních nádorů centrálního nervového systému je koncentrace v séru málokdy zvýšena v důsledku sníženého přechodu do cirkulace. Doporučuje se tedy stanovit enzym v likvoru. 30

NSE je protein vyskytující se v cytoplazmě buněk. Obsažen je i v červených krvinkách a krevních destičkách. Falešně pozitivní hodnoty mohou být naměřeny také v hemolytickém séru. Nezbytně nutná je co možná nejrychlejší separace od krevních elementů. Referenční hodnoty NSE v séru jsou 4,7 14,7 ng/ml (19). 4.1.3. Charakteristika a využití CYFRA 21-1 Fragment cytokeratin 19 patří do skupiny středních filament proteinů cytoskeletárních struktur buňky, jehož fyziologická funkce není známá (20). CYFRA 21-1 se nachází v tkáních plic, dělohy a trávicího ústrojí, specificky v epiteliálních buňkách skvamózního typu. Díky tomu je nádorovým markerem s vyšší orgánovou specifitou než TPA. Zvýšené hodnoty se v tělních tekutinách nachází při destrukci tkání, což slouží jako ukazatel stupně degradace maligních buněk. Je produkována tkáněmi určitých typů maligních nádorů plic, močového měchýře a nádorů v oblasti hlavy a krku. CYFRA 21-1 je odbourávána játry a vylučována ledvinami, proto se ve vyšších koncentracích vyskytuje v séru při benigních onemocněních jako je jaterní cirhóza, chronické selhání ledvin, astma, nebo infekce respiračního traktu. Hladina koncentrace v séru obvykle koreluje se stadiem onemocnění. Hlavním přínosem stanovení CYFRY 21-1 je určení prognózy, klinického stádia a monitorování průběhu onemocnění (4). Obvyklá Cut-off hodnota se pohybuje kolem 3,3 µg/l u obou pohlaví. Rozdíl v hodnotách koncentrací nebyl zaznamenán ani při rozdílu věku nebo u kuřáků (20). 4.1.4. Charakteristika a využití TPA Tkáňový polypeptidický antigen je polypeptid složený ze směsi fragmentů cytokeratinů 8, 18 a 19. Fyziologicky je produkován trofoblastem placenty plodu, především v intenzivně se dělících epiteliálních buňkách. Nejvyšší hladiny TPA lze naměřit ve třetím trimestru těhotenství. Po porodu se hladina rychle normalizuje. U dospělých zdravých jedinců ho lze detekovat v nízkých koncetracích. Patologicky zvýšené hladiny TPA nalézáme v séru u většiny karcinomů spojených s intenzivní proliferací (21). TPA je nespecifický marker, jehož použití v klinické praxi poslední dobou klesá (4). Dokazuje to i klesající počet vyšetření v imunoanalytické laboratoři NNH (viz graf č. 3). Produkce je spojena s nádory epiteliálního původu různých lokalizací. Jsou to především karcinomy močového měchýře, mléčné žlázy, tlustého střeva a konečníku, žaludku, plic 31

a ženských pohlavních orgánů. Nelze ho tedy využít ke stanovení diagnózy či screeningu. Je vhodný zejména k monitorování průběhu onemocnění a reakce pacienta na léčbu. Z nemaligních onemocnění je zdrojem zvýšené hladiny TPA hepatitida, zápal plic nebo selhání ledvin. Cut-off hodnota TPA se pohybuje okolo 80 U/l (21). počet vyšetření 1600 Počet vyšetření TPA v letech 2000-2010 1523 1400 1200 1145 1236 1112 1000 901 904 902 943 937 800 701 693 600 400 200 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 rok Graf č. 3. 4.1.5. Charakteristika a využití CA 72-4 CA 72-4 je uhlohydrátový determinant (carbohydrát, CA) glykoproteinového antigenu TAG 72 (tumor-asociovaný antigen). Za fyziologického stavu je produkován epiteliálními buňkami zažívacího traktu v embryonálním období. U dospělých jedinců ho můžeme nalézt v tkáních plic, genitálním traktu a zažívacích orgánech. Zvýšené sérové hladiny jsou spojené především s maligním onemocněním žaludku, kdy CA 72-4 prokazuje vyšší senzitivitu k těmto tkáním než CEA nebo CA 19-9 (22). Stanovení koncetrace v séru se používá především k monitorování průběhu onemocnění u karcinomu dolní třetiny jícnu, tlustého střeva a pankreatu a také u ovariálního karinomu mucinového typu. Příčinnou zvýšení hladiny CA 72-4 v séru může být i nemaligní onemocnění, obvykle jaterní cirhóza, vředová choroba žaludku, nemaligní onemocnění mléčné žlázy, nebo zánětlivá onemocnění gastrointestinálního traktu (22). 32

Každá laboratoř má své vlastní referenční meze. Hodnota cut-off pro CA 72-4 je v IA laboratoři v NNH 4,0 U/ml. 4.1.6. Charakteristika a využití CA 15-3 CA 15-3 je glykoproteinový antigen polymorfního epiteliálního mucinu (MUC1). Je syntetizován v epiteliálních buňkách vývodů mléčných a slinných žláz a bronchů. U zdravých jedinců není hodnota antigenu zvýšena (4). Slouží k monitorování onemocnění adenokarcinomů ovárií, plic a dělohy. Není vhodný pro screeningu a stanovení diagnózy. Jeho hlavní využití je sledování vývoje onemocnění karcinomu prsu u žen. Hladiny korelují se stadiem onemocnění. Při předpovědi návratu onemocnění se koncentrace CA 15-3 zvýší s předstihem několika měsíců (4). Cut-off hranice se pohybuje kolem 40 U/ml. Zvýšené hodnoty se vyskytují také u benigních gynekologických onemocnění a onemocnění prsu, pankreatitidě a jaterní cirhóze (23). 4.1.7. Charakteristika a využití CA 125 Antigen Ca 125 je vysokomolekulární glykoprotein s vysokým obsahem sacharidů. Ve fetálním období je produkován epiteliálními tkáněmi coelomového původu, v dospělosti omezeně epitelem vejcovodů, bronchů, endometria, ale i mezotelem pleury, perikardu a peritonea. Patologicky zvýšenou hodnotu nad 30 U/ml nacházíme především u karcinomů ovárií nemucinózního typu. Již 1-8 měsíců před klinickou diagnózou lze pozorovat nárůst hladiny CA 125 v séru (4). Nádory vaječníku a endometria jsou jedny z nejčastěji se vyskytujících maligních onemocnění u žen. Například v roce 2007 bylo v USA zaznamenáno 40 000 nových případů karcinomu endomatria a 25 000 případů ovariálních karcinomů. Stejně jako u ostatních nádorových onemocnění platí, čím včasnější diagnóza, tím lepší prognóza. Při posuzování pozitivity či negativity ovariálních karcinomů se často využívá kombinace transvaginální vyšetření ultrazvukem doplněné právě o stanovení nádorového markeru CA 125 (42). Při zvýšené hladině byly epiteliální nádory vaječníku potvrzeny chirurgicky v 90 % případů. Koncentrace markeru koreluje s rozsahem onemocnění. Stanovení CA 125 je důležité zejména při sledování léčby, především před revizí a po operaci, kdy nadále zvýšené hladiny ukazují na přetrvávající zbytky karcinomu (24). 33

Po úplném odstranění primárního nádoru klesá koncetrace o 75-90% během prvního týdne. V následujících 2-3 týdnech se hodnoty normalizují (4). U karcinomů mléčné žlázy, žaludku, pankreatu, plic, žlučových cest a u nenádorových změn jako zánět serózních blan a endometria je typické zvýšení hladiny CA 125 pouze středního stupně. Fyziologicky zvýšenou hladinu nacházíme v séru těhotných žen (24). 4.1.8. Charakteristika a využití CA 19-9 CA 19-9 je determinant antigenu vyskytujícího se ve tkáni jako glykolipid a v séru jako mucin. Ve fetálním období je produkován epitelem žaludku, tenkým i tlustým střevem, játry a pankreatem. V dospělosti je fyziologicky syntetizován tkáněmi pankreatu, žlučníku, plic a jater. Patologicky je výskyt charakteristický pro adenokarcinomy žaludku, tlustého střeva, pankreatu, jater a u mucinózních karcinomů vaječníků (25). CA 19-9 je především marker karcinomu střev a pankreatu. Koncetrace v séru je závislá na velikosti nádoru, proto je vhodný k monitorování onemocnění. Často se stanovuje spolu s CEA v případě diagnostiky biliárního karcinomu, kolorektálního karcinomu a jaterních metastáz (26). Prognóza pro pacienty s karcinomem pankreatu je dobrá v případě časného záchytu. Stanovení hladiny CA 19-9 slouží v případě nespecifických symptomů k rozlišení karcinomu pankreatu od chronických onemocnění slinivky. Specifita CA 19-9 není však tak vysoká. K elevaci CA 19-9 dochází pouze u 65% pacientů s karcinomem a u 40 % pacientů s chronickou pankreatitidou. Proto jako většina nádorových markerů není CA19-9 vhodná ke screeningu. Primárně slouží k monitorování léčby a ne jako diagnostický marker. Využití ke screeningu karcinomu pankreatu připadá v úvahu pouze u pacientů s familiárním výskytem nádorového onemocnění slinivky (41). Zvýšené hladiny nacházíme také u mucinózních karcinomů vaječníků, benigních a zánětlivých onemocnění žaludku, střev, pankreatu a jater. Dále u akutních i chronických hepatitid, cystické fibrózy a revmatických poruch. Obvyklá hraniční hodnota CA 19-9 se pohybuje okolo 40 U/ml. Při karcinomech pankreatu je tato hodnota výrazně překročena. Stejně tak u metastáz koncetrace exponencálně roste (4). Hladiny u hematogenních metastáz dosahují hodnot až 10000 U/ml (26). 34