ACTA ENVIRONMENTALICA UNIVERSITATIS COMENIANAE (BRATISLAVA) Vol. 19, Supplement (2011): 275 280 ISSN 1335-0285 TOXICITA KADMIA, BIOAKUMULACE A INDUKCE METALOTHIONEINŮ U LAREV PAKOMÁRŮ CHIRONOMUS RIPARIUS PŘI DESETIDENNÍ EXPOZICI V ARTIFICIÁLNÍM SEDIMENTU Zuzana Rábová 1, Klára Hilscherová 1, Jan Kuta 1, René Kizek 2, Luděk Bláha 1 1 Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Přírodovědecká fakulta, Masarykova Univerzita, Kamenice 126/3, 625 00 Brno, Česká republika, e-mail: zuzana.rabova@seznam.cz 2 Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika Abstract: Cadmium toxicity, bioaccumulation and metallothionein induction in Chironomus riparius larvae exposed to contaminated artificial sediment in a 10-day test. Cadmium toxicity, its bioaccumulation and rate of metallothionein induction was studied in the larvae of fresh water midges Chironomus riparius in 10-day sediment test with individuals of distinct age (2 nd vs. 3 4 th instar) and distinct culture line. Klíčová slova: Chironomus, sediment, kadmium, bioakumulace, metalothionein ÚVOD Kontaktní sedimentové testy s larvami pakomárů Chironomus riparius jsou nástrojem ekotoxikologického posouzení kvality této komplexní matrice, která je obvykle zatížená značnou akumulací znečišťujících látek z vodního prostředí (Bervoets et al. 2004). Desetidenní testy jsou vhodným modelem pro sledování účinků toxických látek včetně kadmia jako modelové toxické látky (Potsma et al. 1996). METODIKA Desetidenní testy s larvami pakomárů Chironomus riparius, dle standardizované metodiky OECD (OECD 2004), byly realizovány v provzdušňovaných skleněných kádinkách (40 g suché váhy artificiálního sedimentu doplněno na 200 ml testovou vodou, ph 6 9, teplota (19 24 C), rozpuštěný kyslík min. 60 % ASV, krmení 0,05 mg tetraminu/larvu a den). V testech byly použity larvy ze dvou chovných linií ( RECETOX Brno, 275
% přežití ČR; linie 2 Univerzita Tübingen, Německo). Toxicita kadmia (zásobní roztok CdCl 2. 2,5 H 2 O) byla testována v koncentrační řadě 0; 1; 10; 100 a 1000 μg/g suché váhy sedimentu, vždy v 5 opakováních. Do každého opakování bylo nasazeno 20 malých larev 2. instaru (2 3 dny staré larvy) nebo velkých larev 3. 4. instaru, které byly po 10 dní předinkubovány v čistém křemenném písku. Po deseti dnech byl test ukončen, larvy byly vybrány ze sedimentu, stanoveno procento přežití, délka těla larev (binokulární lupa s kamerou Zeiss Stemi 2000-C a program QuickPHOTO MICRO), hmotnost lyofilizované tkáně, obsah kadmia a metalothioneinů v larvách. Kadmium v sedimentu a tkáni larev bylo stanoveno hmotnostní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (ICP- MS), (Kuta 2009), hladina metalothionenů v larvách pak užitím metody diferenčně pulsní voltametrie na principu Brdičkovy reakce (Fabrik et al. 2008). Výsledky byly vyhodnoceny softwarem STATISTICA 8. VÝSLEDKY Obrázky 1 3 graficky znázorňují výsledky následujících sledovaných parametrů: procento přežití (obr. 1), růst jako délka těla (obr. 2) a obsah metalothioneinů (obr. 3). Tabulka 1 pak prezentuje míru bioakumulace kadmia larvami ve vztahu k naměřené koncentraci v kontaminovaném artificiálním sedimentu. 120 100 80 60 40 20 0 0 1 10 100 1000 Koncentrace Cd [μg/g dw sedimentu] linie 2 3-4.instar Obr. 1: Procento přežití u různě starých larev a larev z různých chovných linií (hvězdička značí statisticky významný rozdíl oproti kontrole t. j. koncentraci 0. Výsledky ukazují průměr z 5 opakování po 20 jedincích a směrodatnou odchylku) 276
MTs [μg/g celkoveho proteinu] Délka těla larev [mm] 20 16 12 8 linie 2 4 0 0 1 10 100 1000 Koncentrace Cd [μg/g dw sedimentu] 3-4.instar Obr. 2: Růst vyjádřený jako délka těla larev u různě starých jedinců a jedinců z různých chovných linií (hvězdička značí statisticky významný rozdíl oproti kontrole t. j. koncentraci 0. Výsledky ukazují průměr z 5 opakování po 20 jedincích a směrodatnou odchylku) 25 20 16,40 19,39 linie 2 15 10 5 5,10 4,24 5,21 7,22 4,80 4,81 3-4.instar 0 0 1 10 100 1000 Koncentrace Cd [μg/g dw sedimentu] Obr. 3: Obsah metalothioneinů v tkáni larev různých instarů vztažený na obsah celkového proteinu (hvězdička značí statisticky významný rozdíl oproti kontrole t. j. koncentraci 0. Výsledky ukazují průměr z 5 opakování po 20 jedincích a směrodatnou odchylku) 277
Tab. 1: Obsah kadmia v uměle kontaminovaném artificiálním sedimentu a míra bioakumulace u různě starých larev a larev z různých chovných linií. (Výsledky ukazují průměr z 5 opakování po 20 jedincích a směrodatnou odchylku) Cd μg/g 0 1 10 100 1000 0,25 1,29 10,21 101,96 736,36 sediment (± 0,09) (± 0,05) (± 1,10) (± 6,06) (± 260,84) larvy 7,30 17,80 107,37 linie 2 2,55 45,07 222,69 larvy (± 0,80) (± 6,32) (± 49,41) 3 4.instar 0,04 0,86 6,90 74,44 522,12 sediment (± 0,01) (± 0,14) (± 1,90) (± 8,33) (± 155,30) 3 4.instar 21,74 20,03 189,05 222,14 1022,49 larvy (± 12,38) (± 11,68) (± 13,22) (± 38,03) (± 295,76) DISKUZE Z výsledků je patrné, že v parametru přežití jsou malé larvy nejméně 100krát citlivější, kdežto velké larvy přežívají na úrovni kontroly i při nejvyšší testované koncentraci kadmia 1000 μg/g. Vyšší citlivost larev nižších instarů byla popsána v několika studiích (Ristola 2000; Naylor 1997). U přežití nebyl mezi různými chovnými liniemi významný rozdíl. Sledujeme-li růst larev (délka těla), pak je citlivost u různých instarů i chovných linií podobná, avšak absolutní hodnoty růstu larev se mezi chovnými liniemi statisticky významně liší (viz grafy, statistické významnosti rozdílů mezi liniemi nejsou vyznačeny). Obdobně je tomu také u suché váhy. Růst se tedy jeví jako vhodnější sledovaný parametr, jak bylo diskutováno i dalšími autory (Watts et al. 2000). Růst byl až 10krát citlivější než přežití malých a alespoň 100krát citlivější než přežití velkých larev. Sledování růstu umožňuje také práci s velkými, dobře viditelnými larvami vyšších instarů. Z výsledků v tabulce 1 vyplývá, že míra bioakumulace kadmia postupně klesala s rostoucí dávkovanou koncentrací, což je v souladu s výsledky jiných obdobných studií (Gillis et al. 2002). Pozorovaný jev může souviset s postupným vyčerpáním vazebných míst pro dvojmocné ionty kadmia (Besser et al. 1995; Harrahy et al. 1997; Ogendi et al. 2007). Problematické jsou hodnoty kadmia pozorované v kontrolních variantách; k jejich kontaminaci mohlo dojít např. během analýzy nebo přidáváním některé ze složek sedimentu či potravy s neznámým obsahem kadmia. Hodnoty bioakumulovaného kadmia vykazují podobnou korelační závislost jak u larev různého stáří, tak u larev z různých chovů. Indukce metalothioneinů, které jsou subletálním biomarkerem expozice kovům (Mouneyrac 2002), má v případě velkých larev 10krát nižší citlivost než 278
růst, v případě malých larev pak byla citlivost obou parametrů srovnatelná. Tento rozdíl však může dále souviset s odlišností chovných linií. Koncentrace kadmia v reálných přírodních sedimentech se zpravidla pohybují v rozmezí od 0 do 10 μg/g (velmi znečištěné lokality); (Bervoets et al. 2004). Svou citlivostí při koncentraci kadmia 10 μg/g se ekotoxikologické testy s pakomáry tedy nacházejí na hranici environmentální relevance. Uvedené testy se tak zdají být vhodné spíše pro provádění základní ekotoxikologické charakterizace znečišťujících látek v artificiálním systému. Při hodnocení výsledků je lépe dbát na relativní než na absolutní hodnoty sledovaných parametrů, protože ty se mohou lišit v různých chovných kulturách nebo v závislosti na vnějších faktorech (Lacey 1999; Ineichen 1979). ZÁVĚR Desetidenní kontaktní testy s larvami pakomárů Chironomus riparius s hodnocením různých cílových parametrů jsou nástrojem posouzení toxicity chemických látek v sedimentu. Larvy vykazují v různých sledovaných parametrech různou citlivost, s různou variabilitou a různou opakovatelností výsledků. Důležitým faktorem citlivosti je stáří larev vyšší instary jsou v některých parametrech až 100krát méně citlivé než instary nižší (procento přežití). Jako nejcitlivější a nepraktičtější parametr vyhodnocení se jeví měření délky těla larev, které má zpravidla nízkou variabilitu a shodnou citlivost u malých i velkých larev, což umožňuje spolehlivější práci s většími larvami. Larvy pakomárů bioakumululují škodliviny ze sedimentu a lze jich využít při bioakumulačních studiích podobně jako kroužkovců Annelida (Gillis 2002). Míra indukce metalothioneinů se svou citlivostí zdá být na stejné úrovni jako růstové parametry. PODĚKOVÁNÍ Výzkum je podporován výzkumným záměrem MSM0021622412 "INCHEMBIOL" a projektem CETOCOEN ze strukturálních fondů EU (OP VaVPI CZ.1.05/2.1.00/01.0001). LITERATURA Besser J. M., Kubitz J. A., Ingersoll C. G., Braselton W. E., Giesy J. P. 1995. Influences on copper bioaccumulation, growth, and survival of the midge, Chironomus tentans, in metal-contaminated sediments. Journal of Aquatic Ecosystem Health 4, pp. 157-168. Bervoets L. et al. 2004. Caged midge larvae (Chironomus riparius) for the assessment of metal bioaccumulation from sediments in situ. Environmental Toxicology and Chemistry, 23 (2), pp. 443-454. 279
Fabrik I. et al. 2008. A Determination of Metallothionein in Larvae of Freshwater Midges (Chironomus riparius) Using Brdicka Reaction. Sensors 8, pp. 4081-4094. Gillis P. L. et al. 2002. Cadmium-induced production of a metallothioneinenlike protein in Tubifex tubifex (Oligochaeta) and Chironomus riparius (Diptera): correlation with reproduction and growth. Environmental Toxicology and Chemistry 21 (9), pp. 1836-1844. Harrahy E. A., Clements W. H. 1997. Toxicity and bioaccumulation of a mixture of heavy metals in Chironomus tentans (Diptera: Chironomidae) in synthetic sediment. Environmental Toxicology and Chemistry 16 (2), pp. 317-327. Ineichen H., Riesen-Willi U., Fischer J. 1979. Experimental Contributions to the Ecology of Chironomus (Diptera). II. The Influence of the Photoperiod on the Develpment of the Chironomus plumosus in the 4 th Larval Instar. Oecologia 39, pp. 161-183. Lacey R., Watzin M. C., McIntosh A. W. 1999. Sediment organic matter content as a confounding factor in toxicity tests with Chironomus tentans. Environmental Toxicology and Chemistry 18 (2), pp. 231-236. Kuta J. 2009. SOP stanovení kadmia v půdách a sedimentech. Mineralizace a stanovení kadmia v biologických vzorcích. Unpublished data, Brno, pp. 1-4. Mouneyrac C., Amiard J. C., Amiard-Triquet C., Cottier A., Rainbow P. S., Smith B. D. 2002. Partitioning of accumulated trace metals in the talitrid amphipod crustacean Orchestia gammarellus: a cautionary tale on the use of metallothionein-like proteins as biomarkers. Aquatic Toxicology 57, pp. 225-242. Naylor C., Howcroft J. 1997. Sediment bioassays with Chironomus riparius: understanding the influence of experimental design on test sensitivity. Chemosphere 35 (8), pp. 1835-1845. OECD 2004. Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Sediment. OECD Test Guideline 218, pp. 1-21. Ogendi G. M., Brumbaugh W. G., Hannigan R. E., Farris J. L. 2007. Effects of acidvolatile sulfide on metal bioavailability and toxicity to midge (Chironomus riparius) larvae in black shale sediments. Environmental Toxicology and Chemistry 26 (2), pp. 325-334. Postma J. F., Von Nugteren P., Buckert-de Jong M. 1996. Increased cadmium excretion in metal-adapted populations of the midge Chironomus riparius (Diptera). Environmental Toxicology and Chemistry 15 (3), pp. 332-339. Ristola T. 2000. Assessment of sediment toxicity using the midge Chironomus riparius (Diptera: Chironomidae). PhD Dissertations in Biology, Joensuu. Watts M. M., Pascoe D. 2000. Comaparison of Chironomus riparius Meigen and Chironomus tentans Fabricius (Diptera: Chironomidae) for assessing the toxicity of sediments. Environmental Toxicology and Chemistry 19 (7), pp. 1885-1892. 280