Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Genetická analýza narkolepsie u koní

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Genetická analýza narkolepsie u koní Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Libor Stehlík, Ph.D. Vypracovala: Adéla Velebová Brno 2012

Mendelova univerzita v Brně Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Agronomická fakulta 2011/2012 ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Autorka práce: Studijní program: Obor: Konzultant: Adéla Velebová Zootechnika Zootechnika Ing. Irena Vrtková Název tématu: Genetická analýza narkolepsie u koní Rozsah práce: 30-40 Zásady pro vypracování: 1. Prokázat schopnost vyhledávat literaturu a vybírat podstatné informace k zadanému tématu a tvůrčím způsobem je setřídit tak, aby výstupem byl ucelený přehled dané problematiky. 2. Popsat výskyt a průběh narkolepsie se zaměřením na koně. 3. Analyzovat genetické zaloţení narkolepsie zejména u koní. Seznam odborné literatury: SNUSTAD, P. -- SIMMONS, M. Genetika. Brno: Masarykova univerzita Brno, 1. 2009. 871 s. ISBN 978-80-210-4852-2. Bathen-Nothen, A., et al. Hypocretin Measurement in an Icelandic Foal with Narcolepsy. J Vet Intern Med. 2009, 23, s. 1299 1302. 2. Shimada, M., et al. An approach based on a genome-wide association study reveals 3. candidate loci for narcolepsy. Hum Genet. 2010, 128, s. 433 441. Datum zadání bakalářské práce: říjen 2010 Termín odevzdání bakalářské práce: duben 2012 Adéla Velebová Autorka práce prof. MVDr. Zbyšek Sládek, Ph.D. Vedoucí ústavu Ing. Libor Stehlík Vedoucí práce prof. Ing. Ladislav Zeman, CSc. Děkan AF MENDELU

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Genetická analýza narkolepsie u koní vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne podpis

PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucímu bakalářské práce Ing. Stehlíkovi, Ph.D. za cenné rady, pomoc při hledání zdrojů informací a metodické vedení práce. Dále bych chtěla poděkovat MVDr. Ludvíkové, za konzultace a za poskytnutí mnoha pramenů, ze kterých jsem mohla čerpat odborné informace, a jejímu kolegovi MVDr. Jahnovi za to, ţe se věnují narkolepsii a ţe stanovili diagnózu u mojí klisny Rozity. V neposlední řadě patří poděkování za pomoc s mnohdy sloţitými překlady mé kamarádce a mému bratrovi, kterému děkuji také za úpravu textu. Děkuji také své rodině a příteli za podporu po celou dobu mého studia i v ţivotě.

ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá spánkovou poruchou narkolepsií. Cílem je shromáţdit dostupné informace a vyvodit z nich, jestli by mohla být narkolepsie u koní genetické onemocnění. V práci je popsán fyziologický spánek, jeho řízení biologickými hodinami, stádia spánku a genetická a negenetická regulace spánku. V další kapitole jsou stručně popsány spánkové poruchy idiopatická a rekurentní hypersomnie, které se svými projevy podobají narkolepsii. Následuje podrobný popis klinického obrazu narkolepsie u lidí, psů a koní a dále prokázané i diskutabilní příčiny tohoto onemocnění. Diskuze je zaměřena na příčiny a dědičnost narkolepsie u koní. KLÍČOVÁ SLOVA: HLA, hypokretin, kůň, narkolepsie, spánek, spánková porucha ABSTRACT Bachelor thesis describes sleep disorder narcolepsy. The goal is to gather available information and conclude, whether the narcolepsy in horses could be genetic disease. The physiological sleep is described, its control by biological hours, sleep phases and genetical and non-genetical sleep regulation. A short description of sleep disorders idiopathic and recurrent hypersomnia, which resemble narcolepsy by their symptoms, is presented. A detailed description of the clinical symptoms of narcolepsy in humans, dogs and horses and proved as well as questionable causes of this disease follows. Causes and heredity of narcolepsy in horses are presented in discussion. KEY WORDS: HLA, horse, hypocretin, narcolepsy, sleep, sleep disorder

OBSAH 1 ÚVOD... 7 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 9 2.1 Fyziologický spánek... 9 2.1.1 Biologické hodiny... 9 2.1.2 Fáze spánku... 10 2.1.2.1 Hypnagogický stav... 10 2.1.2.2 Spánek non-rem... 10 2.1.2.3 Spánek REM... 11 2.1.3 Spánek koní... 11 2.1.4 Spánek psů... 12 2.1.5 Regulace spánku... 13 2.1.5.1 Genetická regulace spánku... 13 2.1.5.2 Negenetická regulace spánku... 16 2.2 Spánkové poruchy... 17 2.2.1 Idiopatická hypersomnie... 18 2.2.2 Rekurentní (periodická) hypersomnie... 19 2.2.3 Narkolepsie... 20 2.2.3.1 Klinický obraz... 20 2.2.3.2 Příčiny... 24 3 CÍL PRÁCE... 30 4 DISKUZE... 31 5 ZÁVĚR... 34 6 PŘEHLED POUŢITÉ LITERATURY... 35 7 PŘÍLOHY... 39

1 ÚVOD Poruchu spánku narkolepsii, jsem si vybrala jako téma své práce proto, ţe vlastním klisnu lipického koně Rozitu, která trpí tímto onemocněním. Typické příznaky se u ní vyskytovaly ve velké míře uţ od narození (r. 2002), přesto se diagnózu podařilo určit teprve ve stáří šesti let, protoţe jde o velmi vzácné onemocnění. Po zjištění, ţe Rozita trpí narkolepsií, jsem se o toto onemocnění začala blíţe zajímat. Dosud není znám přesný mechanismus ani příčiny onemocnění, diskutuje se mnoho moţností a pravděpodobnost, ţe jde o dědičné onemocnění je vysoká. Vzhledem k úzkému vzorku postiţených koní je však výzkum omezený. Narkolepsie je jednou z nejstarších klinicky popsaných poruch spánku, vyznačujících se nadměrnou spavostí. První případ byl popsán jiţ v roce 1877. Název onemocnění je odvozen z řečtiny a navrhl ho Gélineau (NEVŠÍMALOVÁ 2006). Nemoc bývá často charakterizována čtveřicí příznaků: nadměrná ospalost během dne, kataplexie (coţ je náhlá ztráta svalového napětí během nějaké aktivity, obvykle vyvolaná nějakou emocí), spánková obrna a hypnagogické halucinace (ALDRICH 1993; NISHINO,MIGNOT 1997). Narkolepsie se projevuje nadměrnou spavostí přes den. Nemoc postihuje lidi i zvířata. Byla popsána u psů, koní, ale také u hlodavců. Byly popsány případy, kdy se narkolepsie vyskytovala sporadicky i v rodinách, a to u lidí, psů i u koní (BILLIARD 2007;NISHINO, RIPLEY 2002). Typické jsou velmi náhlé a důrazné záchvaty spánku, které postiţený nemůţe překonat a usíná. Můţe se to stát při jakékoli činnosti, často se záchvaty objevují při emočním vypětí, zejména pokud se jedná o narkolepsii-kataplexii, kdy jedince při záchvatu postihne svalová slabost, coţ můţe vést k pádu. U lidí je nejčastější spouštěcí emocí smích, ale můţe to být i hněv, koně postiţení narkolepsií mají obvykle záchvat spavosti při vyvádění z boxu nebo sedlání, u psích pacientů se záchvaty dostavují při nasazování vodítka nebo krmení. Lidé s narkolepsií mají problémy v práci i v osobním ţivotě, často také proto, ţe své problémy podceňují a nemoc ani není správně diagnostikována. Osud zvířat narkoleptiků bývá bohuţel velmi často tragický, i kdyţ nemoc samotná není ţivot ohroţující, ani se s přibývajícím věkem nezhoršuje, spíše naopak. Pouze péče o tato zvířata je poněkud problematičtější a bohuţel si majitelé velmi často vykládají chování 7

zvířat špatně a někdy ani veterinární lékař nedokáţe určit správnou diagnózu. Koně bývají často utraceni ještě jako hříbata, u malých štěňat se onemocnění nejčastěji ani nepozná, protoţe je normální, ţe velmi často spí a neudrţí rovnováhu, jejich osud je pak v rukou nových majitelů. Přes všechny obtíţe, které tato nemoc způsobuje, mohou postiţená zvířata při správné péči ţít plnohodnotný ţivot (LUDVÍKOVÁ pers. comm.; NISHINO, RIPLEY 2002). Narkolepsie jako taková není bolestivá, ale mohou se objevit odřeniny a modřiny, způsobené pády při narkolepsii-kataplexii. Pacienti mohou mít po záchvatu nepříjemné pocity, protoţe někdy se dostavují hypnagogické halucinace nebo spánková obrna (NISHINO, RIPLEY 2002; NEVŠÍMALOVÁ 2006). Po skončení záchvatu, který trvá do 15 minut, se organismus velmi rychle vrací do normálního stavu, obnovení funkcí je kompletní. Nemoc se prakticky ničím jiným neprojevuje, a pokud narkoleptik zrovna nemá záchvat, okolí vůbec nepozná, ţe je nemocný, to platí jak u lidí, tak i u koní a psů (NEVŠÍMALOVÁ 2000; ALEMAN, COLETE, HOLLIDAY 2008). Příčina vzniku narkolepsie není přesně známá, diskutuje se dědičnost spolu s vlivem prostředí a pravděpodobně se jedná o autoimunitní onemocnění. Jistá je souvislost narkolepsie-kataplexie s neuropeptidem hypokretinem/orexinem, jehoţ hladina je u postiţených jedinců velmi nízká (NEVŠÍMALOVÁ 2006). U lidí se narkolepsie léčí podáváním centrálních stimulancií a antidepresiv, sníţit neţádoucí spavost ve dne mohou i krátké plánované spánky (NEVŠÍMALOVÁ 2000). 8

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Fyziologický spánek K porozumění problematice poruch spánku je důleţité nejprve znát fyziologický průběh spánku. Nejvíce se toho ví o lidském spánku, zkoumat spánek zvířat je problematické a jsou o něm jen omezené informace. Soudí se však, ţe zásadní fakta jsou shodná u většiny ţivočišných druhů (SEHGAL, MIGNOT 2011). 2.1.1 Biologické hodiny Biologické organismy podléhají mnohým biorytmům, střídání spánku a bdění patří mezi cirkadiánní rytmy, protoţe se opakuje kaţdých 24 hod. Nejdůleţitější úlohu při řízení cyklu spánku a bdění mají suprachiasmatická jádra, tzv. biologické hodiny, coţ jsou dva malé shluky nervových buněk, nacházející se na spodině hypotalamu. Pro jejich správnou funkci je nezbytné střídání světla a tmy, přijímají totiţ informace o světle posílané zrakovými nervy. Kromě suprachiasmatických jader ovlivňuje světlo a tma také epifýzu, která má rovněţ velmi důleţitou úlohu. Vylučuje hormon melatonin, který navozuje ospalost, sděluje organismu, ţe je tma, ale kdyţ světlo dopadne na sítnici, vylučování melatoninu se minimalizuje a jedinec zůstává vzhůru (KASSIN 2007). Kromě tohoto cirkadiánního mechanizmu ovlivňuje spánek a bdění ještě homeostatický mechanizmus, při nedostatku spánku totiţ vzniká spánkový deficit, který si organismus potřebuje kompenzovat. V bdělém stavu vzniká spánkový tlak, který se uvolní aţ ve spánku. Podstata spánkového tlaku je pravděpodobně humorální (NOVÁK, KUNČÍKOVÁ 2011). 9

2.1.2 Fáze spánku Spánek lidský má celkem pět různých stadií a je důleţité vystřídání kaţdého z nich. Rozlišení těchto stadií se provádí pomocí elektroencefalogramu, který zaznamenává změny elektrického potenciálu způsobené mozkovou aktivitou. Rozlišujeme spánek nrem, tj. bez rychlých pohybů očí, který má čtyři stadia a REM, doprovázený rychlými pohyby očních bulev za zavřenými víčky. 2.1.2.1 Hypnagogický stav Stav před usnutím a upadnutím do první fáze nrem se nazývá hypnagogický, často se projevuje trhnutím končetinou, coţ můţe někdy usínajícího probudit, trvá velmi krátce, pouze jednu aţ dvě 1 2 minuty a záznam EEG ukazuje poměrně pomalé a rytmické alfa vlny, které se typicky za bdělého stavu objevují při uvolnění a kdyţ člověk nemyslí na nic konkrétního. 2.1.2.2 Spánek non-rem Následuje první stadium nrem, fáze velmi lehkého spánku. Zpomaluje se aktivita mozku, dech je pravidelný, krevní tlak je niţší a srdeční tep se zpomaluje. Jedinec se v této fázi velmi snadno probudí. EEG zaznamenává théta vlny, které jsou o něco pomalejší neţ alfa vlny předchozího hypnagogického stavu. Druhé stadium přichází asi po 10 minutách. EEG ukazuje tzv. spánková vřeténka, jsou to krátké periodické známky aktivity. K probuzení uţ nedojde tak snadno, případné zvuky ovšem mozek zaznamená. Tato fáze trvá přibliţně 20 minut a pak nastává třetí stadium (COTE et al. 2002). Třetí stadium se od čtvrtého liší pouze intenzitou delta vln, které zaznamenává EEG, jsou velmi pomalé a rytmické s ostrými vrcholky. Spánek je ve třetím a čtvrtém stadiu velmi hluboký. Objevuje se případné mluvení ze spaní nebo náměsíčnost. 10

Zhruba po hodině od usnutí se člověk vrací zpět do třetího a potom do druhého stadia. K návratu do stadia jedna uţ nedojde, protoţe nastává specifické páté stadium, fáze REM. 2.1.2.3 Spánek REM Ve fázi REM dochází ke zrychlování tepu a dechu, zvyšuje se krevní tlak, dostavuje se pohlavní vzrušení a EEG ukazuje krátké rychlé beta vlny, záznam se velmi podobá tomu, který se objevuje za bdělého stavu. Paradoxně se však ztrácí tonus kosterní svaloviny, z tohoto důvodu se fáze REM někdy označuje jako paradoxní spánek, mysl je aktivní, ale tělo naprosto uvolněné a téměř nehybné, kromě občasného cukání končetinami. Objevují se jiţ zmíněné rychlé pohyby očí, odtud také název stadia, REM = Rapid Eyes Movements, oční bulvy rychle a zběsile těkají ze strany na stranu, víčka však zůstávají zavřená. V této fázi se objevuje nejvíce snů a je nezbytné k tomu, aby se člověk po probuzení cítil odpočatý. Probuzení v této fázi je velmi obtíţné a je doprovázeno nepříjemnými pocity. Celý cyklus trvá asi minut, a pokud člověk spí celou noc, (průměrně 8 hodin) opakuje se 4 aţ 6krát (KASSIN 2007). 2.1.3 Spánek koní Koně potřebují mnohem méně spánku neţ většina lidí, průměrně 3 aţ 3,5 hodiny denně. Hříbata spí déle, stejně jako děti, a mají tedy i více REM spánku. Mají přerušované fáze odpočinku, většina spánku se odehrává v noci, ale spí i přes den. Přesným detailům koňského spánku lze stěţí porozumět, většina studií se totiţ spoléhá jen na pozorování chování, protoţe výzkum pomocí EEG je problematický. Svaly a pohyby zamlţují EEG, koně jsou poplašení a to znesnadňuje identifikaci přechodu mezi bdělostí a spánkem. U koní také chybí alfa vlny, které při usínání zaznamenává EEG u lidí. Pro popsání stavu odpočívajícího koně se pouţívají termíny jako uvolněná bdělost, rozptylující se bdělost, ospalost dřímota. Postoj koně v tomto stavu je velmi 11

uvolněný, váhu drţí na předních končetinách a jedné zadní, druhou má uvolněnou, hlavu drţí poměrně vysoko. Hlubší spánek se objevuje, kdyţ kůň spí vleţe na hrudi nebo pokud zaujímá stejný postoj jako při dřímotě, ale hlavu má níţ. EEG zaznamenává delta vlny, podobně je tomu u lidí ve třetím a čtvrtém stadiu. Fáze REM je podobná jako u lidí, tráví v ní však mnohem méně času, pouhých 15 % z celkové doby spánku, to je jen asi 30 minut denně. Projevy jsou podobné, objevují se rychlé pohyby očí a uvolnění svalů, u koní je však aktivní zdvihač hlavy. Koně mohou leţet na hrudi, častěji však na boku. Při tom se můţe objevovat cukání končetin nebo uší, či rozšiřující se nozdry. Byly zdokumentovány určité části REM spánku ve stoje, doprovodná ztráta svalového napětí však znemoţňuje delší pozorování. Koně, kteří stojí ve fázích lehčího spánku, si lehli a okamţitě přešli do REM. Část kdy kůň leţí, je nezbytná pro jeho zdravý spánek (ALEMAN, WILLIAMS, HOLLIDAY 2008) 2.1.4 Spánek psů Pes má mnohem větší potřebu spánku neţ kůň i neţ člověk, spí průměrně asi 14 hodin denně. Tato doba se můţe lišit v závislosti na plemeni nebo věku. 70 80% této doby spí pes lehkým spánkem, kdy leţí se zavřenýma očima, ale je v pohotovosti a probudí ho jakýkoli zvuk. Pokud není pes rušen, přechází do stadia hlubokého spánku, kdy je zcela uvolněný a budí se jen obtíţně. Fázi REM provází stejně jako u lidí i koní rychlé oční pohyby za zavřenými víčky, objevuje se cukání končetinami, cvakání čelistmi, psi můţou kňučet i tlumeně štěkat. Podle chování psů ve fázi REM se soudí, ţe se psům mohou, stejně jako lidem, zdát sny (HEGEWALD-KAWICH 1996). 12

2.1.5 Regulace spánku 2.1.5.1 Genetická regulace spánku Je prokázáno, ţe spánek je regulován geneticky, přeţil mnoho let evoluce, a proto se předpokládá, ţe k jeho výzkumu mohou slouţit jednoduché modelové organismy. V současné době je čím dál častější aplikace molekulární biologie a pouţití těchto modelů při studiu spánku. Někteří vědci zpochybňují význam těchto modelových organismů pro výzkum spánku savců, avšak funkce a regulace spánku jsou pravděpodobně zachovány napříč evolucí a bylo by nesprávné omezit výzkum jen na několik málo druhů. Někteří argumentují, ţe například spánek červa, skládající se z období klidu, je výrazně odlišný od lidského spánku, avšak spánek se velmi liší i mezi savčími druhy. Pravdou je, ţe genetické modelové systémy pro studium spánku nemusí nutně splňovat všechny aspekty lidského spánku, předpokládá se, ţe některé klíčové funkce jsou zachovány. Tyto modelové systémy ve skutečnosti jiţ pomáhají odhalovat regulační mechanismy spánku, které jsou zachovány od červů po savce. Myšlenka pouţít modelové systémy pro pochopení biologických procesů není nová, ale ještě před deseti lety byly studie spánku omezeny na výzkum na základě výsledků měření změn elektrické činnosti mozku pomocí EEG, coţ nešlo moc dobře aplikovat na širší spektrum druhů. EEG odhalí tři hlavní stavy chování: bdělost, REM a nrem. EEG definice spánku je zaloţena na elektrické aktivitě mozku na kortikální úrovni, to brání jeho studiu na zvířatech, která nemají přesně stanovenou kůru. Několik vědců se snaţilo identifikovat stavy spánku u ryb, chobotnic a bezobratlých, pomocí konkrétních vzorců chování těchto ţivočichů, které navrhli pro definování spánku, ale tento postup nebyl široce přijat. Nyní se přistupuje ke studiu spánku pomocí jednoduchých zvířecích modelů, zejména cirkadiánní biologie je často citována jako příklad oblasti, ve které se ukázalo, ţe molekulární mechanismy fungující u hub a much jsou udrţeny i u člověka. Je dobře známo, ţe cirkadiánní hodiny jsou ovlivněny geny, dalo by se tedy očekávat, ţe mutace budou ovlivňovat spánkové fenotypy. Na druhou stranu, 13

cirkadiánní a humorální regulace mohou být do jisté míry nezávislé, takţe mutace pro jeden nebo druhý systém jsou pravděpodobně specifické. Mutace cirkadiánních hodin proto mohou narušit průběh spánku, ale nemusí měnit celkové mnoţství spánku, které je měřítkem regulace humorální (SHEGAL, MIGNOT 2011). Hlavní známý mechanismus cirkadiánních hodin sestává z cyklické tvorby proteinu ve zpětnovazebné smyčce. Podstatu cirkadiánního rytmu napomáhá rozřešit pouţití jednoduchých modelových organismů v molekulární biologii, zejména octomilky Drosofila melanogaster a chlebové plísně Neurospora crassa. U octomilek byly pozorovány dva cirkadiánní rytmy, jednak pravidelné střídání aktivity ve dne a pasivity v noci a dále pravidelné líhnutí z kukel, které probíhalo vţdy velmi brzy ráno. Oba rytmy jsou ovlivňovány jedním genem, který kóduje produkci proteinu, který má na starosti determinaci denní periody. Tento gen byl pojmenován per gen (protoţe ovlivňuje 24 hodinovou periodu). Bílkovina, kterou per-gen kóduje, se ze stejného důvodu jmenuje per-protein. Gen per byl úspěšně izolován a sekvenován. Mutace jediné z jeho bází, způsobí následně změnu jedné z 1200 aminokyselin, které obsahuje per-protein, coţ můţe vést ke zkrácení nebo prodlouţení denní periody. Perprotein vzniká v hlavě octomilky a jeho produkce kolísá se změnou aktivity nebo líhnutí. Nejvíce se ho vytváří ke konci noci. Ozařováním nebo chemickou cestou byly vytvořeny cirkadiánní mutanti mušek: per O, per S a per l. Gen per O způsobuje ztrátu rytmu, kolísání aktivity ve dne a v noci, u těchto mutantů nebylo pozorováno ani pravidelné líhnutí a produkce per-proteinu se během 24 hodin nemění. Gen per S u mušek vyvolává zkrácení denní periody z 24 hodin na 19, gen per l naopak prodlouţení na 29 hodin a produkce per-proteinu se tedy mění v průběhu 19 hodinové periody u per S a během 29 hodinové periody u per l. Aby docházelo k pravidelným změnám koncentrace per-proteinu, musí nejprve dojít ke změně příslušné mrna, která je transkribována z DNA per-genu v jádře buňky. Jelikoţ je protein per jaderný, existovala teorie, ţe by mohl mít v jádře buňky vliv na transkripci vlastní mrna, bylo však zjištěno, ţe per-protein se neváţe na DNA per-genu, proto nemůţe být přímým regulačním faktorem. Dalším zkoumáním však bylo zjištěno, ţe by přece jen mohl působit na svou mrna, pokud by vytvořil dimery s jiným proteiny, které by mohly být schopny navázat se na DNA a působit tak na transkripci. 14

Obr. 1. Molekulární cirkadiánní hodiny (ILLNEROVÁ 1994). Při cyklické transkripci genu per vzniká mrna, která se ve větším množství vyskytuje jen v určitou denní dobu. Protein, vzniklý na matrici této mrna je tedy také přítomen periodicky. Pokud je přítomen, působí negativně na přepis svého vlastního genu, jako transkripční faktor a zpětnovazebná smyčka se uzavírá. Upravený protein by také mohl ovlivňovat přepis jiných genů, které kontrolují hodiny. Cyklické transkripce těchto genů na konec vede v měřitelné cirkadiánní rytmy (ILLNEROVÁ 1994). U vláknité houby druhu Neurospora crassa, je podstata genetické regulace cirkadiánních hodin pravděpodobně velmi podobná. Biologické hodiny u ní řídí opakující se produkci bezpohlavních spor konidií. Hodiny obsahují gen frq, který kóduje FRQ-protein. Jako u octomilek i u tohoto modelového organismu byli izolováni mutanti, kteří měli zkrácenou nebo prodlouţenou cirkadiánní periodu a mutanti postrádající periodu. Bylo prokázáno, ţe na frq-genu se tvoří frq-mrna, která je překládaná do FRQ-proteinu, který má dále schopnost potlačovat transkripci svojí mrna (ILLNEROVÁ 1994). 15

2.1.5.2 Negenetická regulace spánku Neurotransmitery a neuropeptidy Kromě genů je spánek ovlivňován také neurotransmiterovými a neuropeptidovými systémy, tato regulace byla objevena ještě před příchodem moderních genetických technologií, díky farmakologii. Jako hlavní molekula podporující spánek, se uţ dlouho nabízí adenosin, který působí především u savců (SHEGAL, MIGNOT 2011). Je důleţitý pro mnoho pochodů v těle, zejména pro metabolismus energie. Co se spánku týče, podílí se adenosin velkou měrou na udrţení nrem spánku. V bdělém stavu je koncentrace adenosinu vysoká, naopak ve spaní klesá (ŠONKA 2005). Povzbudivé účinky kofeinu jsou způsobeny jeho antagonistickou reakcí na receptory adenosinu, kofein tyto receptory blokuje, a proto podporuje bdělost. Myši s mutací na adenosinovém receptoru A2A vykazují nedostatečnou reakci na kofein, nicméně mutace dalších adenosinových receptorů mají jen omezený dopad na spánek. BJORNESS et al. (2009) zjistili, ţe narušení adenosinového receptoru A1 pouze v centrálním nervovém systému sice redukuje pomalé vlny (zjištěno elektrofyziologickým měřením, pomalé vlny se vyskytují ve třetím a čtvrtém stadiu spánku nrem) v reakci na omezení spánku, ale nemá to ţádný vliv na výchozí hodnoty. Toto zjištění naznačuje, ţe adenosin je pouze jedním z mnoha neurotransmiterů, které ovlivňují spánek. Další neurotransmitery, zapletenými do spánku savců jsou spánek-podporující histamin, dopamin, acetylcholin, noradrenalin a bdělost-podporující gama-aminomáselná kyselina. Sloţitější vliv má serotonin, který sice potlačuje spánek REM, ale jeho účinky na spánek nrem jsou nejasné a mohou být i podporující. Genetická analýza u myší obecně podporuje teorii, ţe tyto neurotransmitery mají své role při regulaci spánku, i kdyţ jejich účinky jsou někdy malé a komplikované. 16

Neuropeptidy také hrají velkou roli v regulaci spánku, neznámější je hypokretin/orexin, který je základní pro poruchy spánku, jako je narkolepsie (SHEGAL, MIGNOT 2011). Regulace spánku a bdění je jeho hlavní funkcí, ale podílí se i na regulaci příjmu potravy a na udrţení energetické rovnováhy organismu. Rozlišují se dva podobné polypeptidy hypokretin1 a hypokretin 2 (nebo také orexin A a orexin B). Jsou významné pro potlačení spánku REM a tím pádem zajišťují udrţení bdělosti. Jsou deficitní u narkolepsie, pravděpodobně to je způsobeno autoimunitní poruchou (ŠONKA 2005; NEVŠÍMALOVÁ 2002). Mutace genu hypokretinového receptoru Hcrtr-2 je příčinou narkolepsie u psů, jak dokázal LIN et al. (1999). Intracelulární signální molekuly Vzhledem k významné roli neuropeptidů a neurotransmiterů je logické, ţe pro regulaci spánku jsou velmi důleţité také intracelulární signalizační molekuly, které zajišťují přenos informací. Například protein kináza A (PKA) podporuje bdělost u octomilek a transkripční faktor CREB (camp response element-binding) totéţ dělá u savců. (GRAVES et al. 2003; HENDRICKS et al. 2001) Steroidní hormony Steroidní hormony regulují mnoho biologických procesů a spánek není výjimkou. U drozofil podporuje spánek steroidní hormon ecdosyne, u savců přirozeně se vyskytující 3alfa, 5alfa-tetrahydrodeoxykortikosteron. Význam této regulace není přesně znám, ale předpokládá se, ţe u savců by mohla zahrnovat stimulaci receptorů gama-aminomáselné kyseliny, která podporuje spánek (SHEGAL, MIGNOT 2011). 2.2 Spánkové poruchy K nejčastějším projevům spánkových poruch patří nadměrná potřeba spánku v průběhu dne. Nejvíce se na zvýšené potřebě spánku během dne podílí poruchy nočního spánku, nazývané insomnie, jako je například syndrom spánkové apnoe nebo syndrom neklidných nohou. Aţ v další řadě se vyskytují poruchy udrţení bdělosti hypersomnie a narkolepsie (NEVŠÍMALOVÁ 2000). 17

Existuje několik poruch spánku vyznačujících se zvýšenou potřebou spánku během dne. Vznikají z různých, někdy i neobjasněných příčin a odlišit je od sebe bývá dosti obtíţné. Jejich rozdělením se zabývá Americká akademie spánkových medicín AASM, která vytvořila mezinárodní rozdělení těchto spánkových poruch ICSD (International Classification of Sleep Disorders). Podle této klasifikace se spánkové poruchy vyznačující se nadměrnou spavostí rozlišují na hypersomnii idiopatickou a rekurentní a na narkolepsii s a bez kataplexie (BILLIARD 2007). Z výskytu familiárních případů se předpokládá, ţe vznik těchto poruch je ovlivňován geneticky. S výjimkou narkolepsie však nebyly objeveny ţádné konkrétní geny. Diskutuje se souvislost všech těchto poruch se systémem HLA. 2.2.1 Idiopatická hypersomnie Idiopatická hypersomnie je funkční hypersomnie, která není organického původu a jejíţ vznik neovlivňují metabolické, toxické ani psychogenní vlivy. Charakterizuje ji nadměrně dlouhý a velmi hluboký spánek noční a zvýšená potřeba spánku přes den, která v extrémních případech dosahuje 16 18 hod za 24 hod. Průměrně je to 12 14 hodin. Nevyskytuje se kataplexie ani hypnagogické halucinace. Denní spánek nepřichází tak rychle a důrazně jako u narkolepsie, nastupuje při výkonu monotónních a klidných činností. Spánek můţe trvat 1 2 hodiny, nebo i celé odpoledne. Po probuzení se však pacienti necítí odpočatí. U více neţ poloviny nemocných se projevují výrazné obtíţe při ranním probouzení. Vstávání je pro ně velmi obtíţné, a kdyţ uţ se jim podaří vstát, objevuje se na 15 20 minut porucha rovnováhy s nestabilitou při chůzi a v některých případech je narušena i funkce jemné motoriky. Většinou jsou celé ráno ve stavu polospánku a opravdové probuzení se dostaví aţ venku. Pouţívají různé metody k urychlení probuzení, nejvíce spolehlivou je asi několikaminutová ranní sprcha a dále podání centrálních stimulancií (NEVŠÍMALOVÁ 2000). Podle délky nočního spánku se idiopatická hypersomnie podle současné klasifikace rozlišuje na dvě formy. Polysymptomatickou formu, označovanou jako idiopatickou hypersomnii s dlouhým nočním cyklem spánku, kdy noční spánek je delší neţ deset hodin, ranní probouzení je velmi obtíţné a přes den se vyskytuje zvýšená 18

spavost. Druhá forma je monosymptomatická, označovaná také jako idiopatická hypersomnie bez dlouhého nočního spánku, kterou charakterizuje pouze zvýšená denní spavost (NEVŠÍMALOVÁ 2000; BILLIARD 2007). Rozdíl mezi narkolepsií bez kataplexie a idiopatickou hypersomnií je velmi malý, odlišení obou chorob je proto obtíţné. Kontinuitu lze najít i s narkolepsiíkataplexií, u které se vyskytuje genetická vazba na HLA systém, typizace DBQ1*0602. Výskyt u idiopatické hypersomnie je však o hodně niţší a činí asi 40%, u narkolepsiekataplexie je to 70 100% a běţně se tento haplotyp vyskytuje i u zdravé populace v 12 38% (MIGNOT et al. 2002). 2.2.2 Rekurentní (periodická) hypersomnie Označovaná také jako Kleineho-Levinův syndrom, podle muţů, kteří tuto formu poprvé popsali. Jde o velmi vzácné onemocnění, pro které jsou charakteristické opakující se ataky spánku, které mohou trvat téměř celých 24 hodin. Spánek je přitom jen povrchní a přerušovaný opakovanými probuzeními. Takovýto stav obvykle trvá od 3 do 21 dnů a jeho opakování není výjimkou. Podle Rotha (ROTH 1980 in NEVŠÍMALOVÁ 2006) se rozlišuje na monosymptomatickou a polysymptomatickou formu. Monosymptomatická forma rekurentní hypersomnie je charakterizována pouze periodickou denní spavostí. Forma polysymptomatická je doprovázena dalšími příznaky, jakými můţe být bulimie, polydipsie, poruchy chování (např. agresivita nebo hypersexualita), zmatenost nebo halucinace (ŠONKA 2005; NEVŠÍMALOVÁ 2006). Nedávné studie ukazují jistou náchylnost onemocnění ke genetickým faktorům. 5 ze 105 pacientů má stejně postiţeného člena rodiny. To naznačuje geneticky danou citlivost na zatím neznámý spouštěč z vnějšího prostředí. Asociace na systém HLA byla navrţena, zatím však nebyla opakována v dalších studiích.(arnulf et al. 2008). 19

2.2.3 Narkolepsie 2.2.3.1 Klinický obraz Narkolepsie je poměrně vzácné onemocnění. V Evropských zemích a USA se výskyt pohybuje od 0,02% do 0,05%. Celosvětově jsou však v četnosti výskytu značné etnické rozdíly, například v Izraeli se onemocnění takřka nevyskytuje a dosahuje pouze 0,0002%, naproti tomu v Japonsku je onemocnění docela časté a postihuje 0,16% populace (INTERNATIONAL CLASSIFIKATION OF SLEEP DISORDES 2005; WILNER et al. 1988; TASHIRO et al. 1992). Jak jiţ bylo uvedeno v úvodu, nejvýznamnějším příznakem narkolepsie je akutní patologická potřeba spánku ve dne. Rozlišuje se narkolepsie s kataplexií a bez kataplexie. Pokud je jedinec postiţen narkolepsií s kataplexií, při záchvatu spánku ho postihne svalová slabost, coţ vede k podklesnutí v kolenou aţ k pádu. Tyto stavy mohou být popisovány jako mrákoty, či mdloby (NEVŠÍMALOVÁ 2000). Záchvat se můţe dostavit kdykoli, při jakékoli činnosti, coţ je pro pacienty velmi nepříjemné a můţe je to vyřazovat ze společenského ţivota. Lidé s touto chorobou bývají často obviňováni z lenosti nebo nezájmu. To se týká zejména dětí, u kterých záchvaty zprvu nejsou tak důrazné a také kataplektické záchvaty, kterým děti ani nevěnují pozornost, se vykytují obvykle v menší míře neţ u dospělých. Často se vyskytující zhoršování prospěchu ve škole a děsivé sny provázející noční spánek situaci narkoleptických dětí ještě zhoršuje. Kataplexie se u lidí můţe projevit jen uvolněním obličejových svalů a poklesnutím brady, pocitem slabosti v kolenou nebo aţ celkovou paralýzou, kdy postiţený upadne. (KASSIN 2007;NISHINO, RIPLEY 2002; NEVŠÍMALVÁ 2000). Zvířecí narkolepsie je té lidské velice podobná. Psi narkoleptici stejně jako lidé bývají méně aktivní přes den, ve srovnání se zdravými psy stejného věku a plemene. Je obtíţné rozpoznat narkolepsii u štěňat, protoţe většinu času spí i zdravá štěňata. U starších psů se záchvaty objevují při hře se sourozenci, při krmení nebo nasazování vodítka. Záchvaty psů často začínají vybočením pánevních končetin, to je doprovázeno svěšením krku. Často se stává, ţe psi bojují proti záchvatu a snaţí se chodit jakýmsi opilým způsobem. Psovi podklesávají končetiny a nakonec se můţe zhroutit na zem a zůstat nehybný několik sekund aţ několik minut. 20

Během dlouhých kataplektických záchvatů se mohou objevit rychlé pohyby očí, svalové záškuby, anebo pomalý opakovaný pohyb končetin. Tyto jevy jsou spojeny s fází REM spánku. Svaly jsou vţdy ochablé, ne ztuhlé, jak je tomu u většiny ostatních záchvatovitých stavů (např. u epilepsie). Psi zůstávají při vědomí, zejména na začátku ataků, a mají otevřené oči. Pokud záchvat trvá delší dobu, pes můţe upadnout do reţimu spánku, často rovnou do spánku REM. Psi se dají ze záchvatu probrat hlukem (voláním jejich jména) nebo dotekem (NISHINO, RIPLEY 2002). Obr. 2. Kataplexie u čivavy (TONOKURA, FUJITA, NISHINO 2007). U koní se dá narkolepsie rozpoznat jiţ u nejmladší věkové kategorie. Autorkou této práce byla pozorována klisna lipického koně, která jiţ od narození vykazovala příznaky narkolepsie, podobné těm, jaké se vyskytují u lidské a psí narkolepsie. Hříbě se snaţilo následovat matku na pastvině, ale v době záchvatu se sotva se udrţelo na nohou, motalo se a muselo přemáhat spánek, občas spadlo na kolena. U dospělých koní se záchvat nejčastěji vyskytuje při vyvádění z boxu nebo sedlání, protoţe to u nich způsobuje spouštěcí emoce. Koně klopýtají, zakopávají, často upadnou na kolena, v případě silného kataplektického záchvatu mohou upadnout na bok. To můţe být nebezpečné pro ošetřovatele. 21

Koně se mohou snaţit bojovat proti záchvatu. Byly pozorovány dvě klisny postiţené narkolepsií, které se snaţily přejít z kroku do klusu, jakmile na ně začala útočit ospalost, a překonat tak počínající záchvat. To ale nutně neznamená, ţe se záchvat v rychlejším tempu nemůţe objevit. Jedna z těchto klisen byla později pozorována, jak ospale cválá ve výběhu, její cval byl oproti ostatním koním nekoordinovaný, s občasným zakopnutím a tento stav nakonec skončil upadnutím klisny na zem. Navzdory těmto příznakům jsou narkoleptičtí koně schopní výcviku a dá se na nich jezdit. Podobně jako se psi dají vytrhnout ze záchvatu voláním jejich jména nebo dotykem, lze i koně vzbudit důraznou pobídkou. V případě velmi silného záchvatu, alespoň zmírnit jeho průběh. Kromě pobídky můţe pomoct i jiţ zmíněné zrychlení tempa. Pozorované klisny zpravidla neusínaly pod sedlem v klusu ani ve cvalu, záchvat se dostavoval pouze v kroku. U těchto klisen bylo také patrné zlepšení zdravotního stavu při pravidelné kaţdodenní práci. Pravděpodobně záleţí i na způsobu ustájení, pastevní ustájení se zdá být vhodnější neţ boxové. Odpadá dlouhé stání a také chybí spouštěcí emoce, která se dostavuje při vyvádění z boxu a způsobuje narkoleptický záchvat, při vyvádění z pastvin se záchvat obvykle nedostavuje. Tyto skutečnosti poukazují na to, ţe pro narkoleptické koně je pravděpodobně nejhorší dlouhé pobývání v boxu bez pravidelného tréninku a bez moţnosti pohybu, např. ve výběhu. Vztah ostatních koní ke koni s narkolepsií se nevyznačuje ničím neobvyklým, přestoţe je všeobecně známé, ţe zvířata slabší jedince šikanují nebo je jen obtíţně přijímají do skupiny. Pozorovaná klisna lipicána byla přesunuta z boxového ustájení na pastvinu mezi ustálenou skupinu deseti koní, kteří ji bez problémů přijali. Dokonce si velmi brzy vydobyla dominantní postavení ve stádě (LUDVÍKOVÁ pers. comm. 2010). 22

Obr. 3. Hříbě islandského poníka při záchvatu narkolepsie (BATHEN-NÖTHEN et al. 2009). Narkolepsie je porucha REM spánku a abnormální regulace REM spánku je pravděpodobně klíčový faktor pro její patofyziologii (NISHINO et al. 2000). Narkolepsii charakterizuje výrazná penetrace REM spánku, tzv. sleep onset REM spánek (SOREM), coţ doslova znamená usnutí do spánku REM, jinak také iniciální REM spánek. A jeho nález při polysomnografickém vyšetření je charakteristický pro narkolepsii (VOGEL 1960 in NEVŠÍMALOVÁ 2006). Následkem porušení REM fáze je negativní ovlivnění celého spánkového cyklu. Je narušeno pravidelné střídání nrem a REM spánku, takţe noční spánek narkoleptiků je velmi nekvalitní, roztříštěný a doprovázený děsivými sny. Objevuje se ztráta koncentrace a paměti a rozmazané vidění. (AKINTOMIDE, RICKARDS 2011; NEVŠÍMALOVÁ 2000). Jako doprovodné příznaky narkolepsie se také často vyskytují hypnagogické halucinace a spánková obrna, tyto se mohou vyskytovat i u zdravých jedinců, ale pouze vzácně. Oba fenomény doprovází velmi nepříjemné pocity postiţených jedinců a vyskytují se u 40 80% nemocných narkolepsií. Hypnagogické halucinace se objevují při usínání a mohou být zrakové, sluchové, hmatové nebo pohybové. Spánková obrna je spojena s usínáním nebo probouzením a dostavuje se náhle. Během záchvatu, který trvá několik sekund aţ několik minut, není jedinec schopen ţádného pohybu, dechová a 23

tepová frekvence je nepravidelná. Tento stav lze přerušit jiným výraznějším podnětem další osoby. Narkolepsii často doprovází také automatické jednání, jde o stav, kdy jedinec vykonává mechanicky nějakou nesmyslnou činnost a později si na to nevzpomíná (BILLIARD 2007; NEVŠÍMALOVÁ 2006; NEVŠÍMALOVÁ 2000). Hypnagogické halucinace a spánková obrna se pravděpodobně mohou vyskytovat i u zvířat, ale v současnosti neexistuje ţádný objektivní způsob, jak to prokázat (NISHINO, RIPLEY 2002). 2.2.3.2 Příčiny Přesná příčina vzniku narkolepsie není známá, pravděpodobně je to spojení genetické predispozice s vlivy vnějšího prostředí. Nástup onemocnění můţe být spojen např. s traumatem hlavy, cévní mozkovou příhodou nebo dokonce se streptokokovou infekcí či působením těţkých kovů a insekticidů (AKINTOMIDE, RICKARDS 2011). Deficit hypokretinu Předpokládá se, ţe narkolepsii u lidí a psů způsobuje abnormalita v hypokretinovém systému. Bylo prokázáno, ţe příčinou narkolepsie s kataplexií je nízká hladina hypokretinu, vyskytující se u 90% lidí postiţených narkolepsií-kataplexií, ale pouze u 10% s narkolepsií bez kataplexie. U některých jedinců se však kataplexie nemusí nikdy projevit, přestoţe genotyp mají stejný jako narkoleptici s kataplexií. Co způsobuje deficit hypokretinu, není dosud jasné (ALDRICH 1996;BILLIARD 2007;NEVŠÍMALOVÁ2006, RIPLEY et al. 2001). Pouze u psí narkolepsie bylo prokázáno, ţe u dobrmanů a labradorů můţe za nedostatek hypokretinu v centrálním nervovém systému genová mutace hypokretinového receptoru 2 (Hcrtr-2) (LIN et al. 1999). Tato mutace je recesivní, to znamená, ţe ji musí mít oba rodiče, aby potomci mohli být postiţení. Např. dvěma rodičům, kteří jsou pouze nositelé, se narodí 25% štěňat postiţených narkolepsií, pokud by ale oba rodiče byli narkoleptici, budou postiţená všechna štěňata (NISHINO, RIPLEY 2002). 24

Přestoţe u lidí se ţádná podobná mutace zatím nepotvrdila, riziko, ţe člověk onemocní narkolepsií, je 10 40 krát vyšší, pokud má příbuzného narkoleptika, neţ u běţné populace (AKINTOMIDE, RICKARDS 2011). Mechanismus onemocnění u psů se mírně liší, pokud jde o familiární a sporadickou formu narkolepsie. Zatímco u sporadické formy se téměř ve všech případech objevuje nízká hladina hypokretinu, u familiární formy jde o nedostatek hypokretinových receptorů. Hladina hypokretinu je normální ale informace sdělující, aby jedinec zůstal bdělý, se nepředává na další neurony. Konečný důsledek je potom u obou forem stejný, hypokretinový signál se nedostane k cílovým neuronům, a protoţe je nezbytný pro zdravý cyklus spánku a bdění, je tento celkově narušen (NISHINO, RIPLEY 2002). Familiární forma narkolepsie u koní byla popsána u miniaturních koní v Severní Americe. Byli zkoumáni dva jedinci z jednoho chovu, vykazující příznaky narkolepsie. Diagnóza byla potvrzena na základě neurologického vyšetření a farmakologického testování. Bylo provedeno vyšetření mozkomíšního moku, aby mohla být stanovena hladina hypokretinu, nebyly však zaznamenány prokazatelné změny, hladina hypokretinu byla přibliţně stejná, jako u zdravých jedinců. Proběhl průzkum v mnoha dalších chovech miniaturních koní v Severní Americe a výsledky poukazují na to, ţe narkolepsie je sice velice vzácné onemocnění, ale u miniaturních koní se prokazatelně vyskytuje (LUNN et al. 1993). Narkolepsie byla dokumentována také u islandských poníků a u plemene quorter horse (BATHEN-NÖTHEN et al. 2009; SWEENEY et al. 1983). U narkoleptického hříběte islandského poníka bylo provedeno kompletní vyšetření. Nebyl nalezen ţádný příbuzný islandský pony postiţený narkolepsií, familiární forma byla tedy v tomto případě vyloučena. Bylo provedeno vyšetření mozkomíšního moku a měření koncentrace hypokretinu, hodnoty však byly podobné jako u zdravých poníků. U tohoto hříběte nebyla ale pozorována kataplexie, to můţe vysvětlovat, ţe hladina hypokretinu byla v normálu. Jak bylo uvedeno výše, deficit hypokretinu u lidí s narkolepsií bez kataplexie se vyskytuje jen asi u 10% postiţených jedinců (BATHEN-NÖTHEN et al. 2009; BILLIARD 2007; RIPLEY et al. 2001) V České Republice bylo měření koncentrace hypokretinu provedeno u dvou příbuzných klisen lipického koně postiţených narkolepsií s kataplexií. Jeho deficit rovněţ nebyl prokázán (LUDVÍKOVÁ pers. comm. 2010). 25

Human Leukocyte Antigen V současné době se předpokládá, ţe destrukce hypokretinových neuronů je autoimunitní. Nasvědčuje tomu spojení narkolepsie-kataplexie se systémem HLA (Human Leukocyte Antigen), nástup onemocnění nejčastěji ve druhé dekádě ţivota a vzácnost mutací hypokretinových genů u lidí (AKINTOMIDE, RICKARDS 2011; NEVŠÍMALOVÁ 2006). HLA systém je skupina genů pro hlavní histokompatibilní komplex, neboli MHC (Major Histocompability Complex), který má klíčový význam pro imunitu. Geny HLA předkládájí peptidy cizorodých antigenů T-lymfocytům, pomocí T buněčného receptoru. T buněčný receptor, neboli TCR (T Cell Receptor) je nepostradatelný pro rozpoznání antigenu a jeho zničení. HLA geny se nachází na šestém chromozomu, je jich více neţ 200 a jsou nesmírně polymorfní, mají více neţ 1400 alel. To si ţádá odpovídající označování, alely se nejprve definují písmeny, které označují lokus (např. HLA DQA1*), následuje hvězdička a poté čtyři číslice, alely jsou seskupeny do širších podtypů na základě podobnosti sekvencí, první dvě číslice vyjadřují sérologickou specifitu, druhé dvě číslice představují drobné odchylky mezi aminokyselinami (MIGNOT et al. 2001; PETŘEK 2002). Nedostatek hypokretinu u narkolepsie souvisí téměř ve všech případech se dvěma specifickými a úzce vázanými alelami: HLA DQA1*01:02 a HLA DQB1*06:02. (AKINTOMIDE, RICKARDS 2011; MIGNOT et al. 2001). Přestoţe se HLA DQB1*06:02 vyskytuje u více neţ 85% pacientů postiţených narkolepsií s kataplexií, není to jasným důkazem onemocnění. Výskyt této alely totiţ není striktně vázán na narkolepsii-kataplexii, ale vyskytuje se i u zdravé populace a to dokonce u 12 38%. (MIGNOT et al. 2001). Navíc existují i pacienti, kteří zcela jistě trpí narkolepsií s kataplexií, ale HLA DQB1 se u nich nevyskytuje (HONG et al. 2006). U narkolepsie bez kataplexie se nevyskytuje ani deficit hypokretinu, ani vazba na systém HLA (NEVŠÍMALOVÁ 2006). TCR alfa gen (TCRA) je také důleţitým faktorem náchylnosti k narkolepsii. TCR spouští imunologickou reakci, kdyţ reaguje s peptid vázajícími antigeny HLA. Podobně jako imunoglobulin,tcra podstupuje somatické buněčné přeskupení mezi 46 proměnnými (V) a 49 spojujícími (J) segmenty. 26

VJ genetická rekombinace spojuje náhodně vybrané segmenty genů, které kódují specifické proteiny imunitního systému. Vzniká tak mnoho rozmanitých molekul TCR, které následně mohou rozpoznat velké mnoţství antigenů. Geny TCR se skládají z alfa řetězců, které obsahují V (variable) a J (joining) segmenty, a z beta řetězců, obsahujících navíc D (diversity) segment. Tyto se mohou různě přeskupovat a tak můţe vzniknout vysoce specifický receptor (WWW1). Jednotná nukleotidní polymorfní (SNP) varianta v J segmentu vykazuje významné spojení u bělochů a jiných etnických skupin (HALLMAYER 2009) na toto spojení bylo poukazováno ve více studiích. Existuje hypotéza, ţe DQB1*0602/DQA1*0102 HLA heterodimer reaguje s TCR individuálním genotypem v němţ je specifická VJ kombinace spojena s přítomností rs1154155 (přímo či nepřímo). V souvislosti s vybraným antigenním spouštěčem by toto mohlo vést k další imunitní reakci končící destrukcí buněk produkujících hypokretin. Ve většině autoimunitních onemocnění hraje velkou roli velké mnoţství HLA rizikových faktorů. Jednou z největších záhad autoimunitního procesu v narkolepsii je mimořádná specifita autoimunitního cíle, kdy buňky imunitního systému ničivě působí právě na velice specifické hypokretinové buňky. Navíc typické příznaky autoimunitního procesu zmizí rychle po tom, co choroba hypokretinové buňky zničí, jsou-li vůbec přítomny (OVEREEM et al., 2008). Infekce horních cest dýchacích jako streptokok v krku a chřipka byly implikovány jako spouštěče narkolepsie způsobené okolím. Na začátku onemocnění byly zaznamenány vyšší hodnoty diagnostikovaných infekcí krku a vysoké koncentrace anti-streptolysin O (značí streptokokovou infekci) (LONGSTRETH et al. 2009). H1N1 vakcíny obsahující AS03 a H1N1 infekce jsou vzácnými spouštěči narkolepsie (DAUVILLIERS et al., 2010). Další místa náchylná k narkolepsii byla identifikována prostřednictvím metody Genom-Wide Association Studies (GWAS), neboli celogonemová asociační studie. Tato analýza se pouţívá ke zkoumání vztahu mezi konkrétní alelou, genotypem, či haplotypem a onemocněním. Metoda spočívá v porovnávání dvou skupin, kdy jedna je sloţena ze zdravých jedinců, zatímco jedinci z druhé skupiny vykazují zkoumané onemocnění. Na základě nalezené asociace lze předpokládat spojení s daným onemocněním. Výsledky se musí opakovat minimálně v jedné nezávislé studii, aby 27

mohly být povaţovány za průkazné a stále je tu riziko falešné pozitivity. Je proto nutné zachovat obezřetnost při interpretaci výsledků (WWW2). SNP marker, umístěný mezi klesající expresi karnitin palmitoyltransferázy 1B (CPT1B) a cholin kinázy B (CHKB), byl spojen s narkolepsií u japonského vzorku, spojitost byla zopakována u druhého vzorku Japonců, ale ne u bělochů (MIYAGAWA et al. 2008). Oba geny jsou pravděpodobnými regulátory REM spánku. CHKB metabolizuje cholin, prekurzor acetylcholinu, regulátor REM spánku.cpt1b je součástí karnitinového cyklu a také beta oxidace v mitochondriích, která ovlivňuje regulaci theta vln během REM (TAFTI et al. 2003). Moţnost, ţe tento polymorfismus reguluje REM nezávisle na ztrátě hypokretinu byla nedávno podloţena nálezem esenciální hypersomnie, mírnější formy narkolepsie, která typicky není spojena s nedostatkem hypokretinu (MIYAGAWA et al. 2009). Přímý dopad tohoto polymorfismu na REM by naznačoval, ţe sníţení mitochondriální beta-oxidace je spojeno s rostoucím REM, coţ spojuje REM spánek s energetickou homeostázou. Role purinoreceptorů v narkolepsii byly identifikovány pomocí GWAS u bělochů a následně mapovány i v jiných etnických skupinách. Purinoreceptory hrají klíčovou roli v regulaci imunity. SNP rs2305795, lokalizované na purinoreceptorovém genu P2Y11, je významně spojeno s náchylností k narkolepsii, protoţe sniţuje expresi těchto receptorů v periferních buňkách. P2Y11 také ovlivňuje chemotaxi buněk imunitního systému a buněčnou smrt vyvolanou ATP, coţ nasvědčuje, ţe destrukce hypokretinových buněk je autoimunitní (KORNUM et al. 2011). 28

Tabulka 1. Přehled vybraných genů, které ovlivňují narkolepsii u lidí Gen Patologie SNP/alely/mutace Komentář DQB1 a DQA1 (formovány do DQ heterodimeru) CPT1B/CHKB TCRA P2RY11 Narkolepsie/ deficit hypokretinu Narkolepsie/ deficit hypokretinu Esenciální narkolepsie Narkolepsie/ deficit hypokretinu Narkolepsie/ deficit hypokretinu Hlavní predispoziční efekt má DQB1*06:02 DQA1*01:02; Sekundární predispoziční efekt: DQB1*03:01; rs5770917c (ovlivňující expresi) rs1154155c (můţe modifikovat TCRJ) rs2305795a (ovlivňující expresi) Účinky zachovány u Afričanů, Američanů, asiatů a bělochů. Dominantní mediátor je DQ01*06:02; Velmi málo případů je DQB1*06:02 negativní. Téměř všechny případy mají alelu DQ1*0:102, s úzkou vazbou na DQB1*06:02. Asociace je stále provizorní. Identifikováno u Japonců, opakováno u Korejců. Asociace je zanedbatelná u Evropanů a Afričanů, u Číňanů nebylo opakováno. Spojené i s hypersomnií u Japonců. Lokusy mají roli v beta-oxidaci a syntéze acetylcholinu, potenciálně ovlivňují REM spánek. Identifikováno u bělochů a opakováno napříč etnickými skupinami (Asie, Afrika Amerika). Nezávisle opakováno u Evropanů a číňanů a Japonců s pozitivní HLA-esenciální hypersomnií To nasvědčuje zapojení specifického T receptoru do etiopatogeneze narkolepsie, je moţná interakce s DQ lokusem. Identifikováno u bělochů, s opakováním napříč etnickými skupinami. Imunomodulační funkce nebo redukce ATP indukuje apoptózu imunitních buněk. 29

3 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo shromáţdit dostupné informace o narkolepsii, popsat výskyt a průběh tohoto onemocnění u lidí, psů a zejména u koní, a analyzovat genetické zaloţení narkolepsie, především u koní. 30

4 DISKUZE Výzkum narkolepsie u koní je problematický, jedním z důvodů je úzký vzorek postiţených jedinců. Prevelance narkolepsie u koní je nízká, ale moţná ne tak nízká jak se domníváme. Případy narkolepsie u koní byly popsány jiţ v roce 1924 v chovu Suffolk. Bylo zaznamenáno, ţe se kaţdý rok v hříběcí sezóně narodilo několik hříbat vykazujících jasné příznaky narkolepsie. Tato hříbata byla později bez diagnózy utracena (HINES 2005). Hříbata s narkolepsií bývají utrácena i v dnešní době, stále se častokrát nepodaří stanovit diagnózu. Je tedy dost moţné, ţe koní s narkolepsií by bylo mnohem více, kdyby se u nich podařilo určit, o jaké onemocnění se jedná. Jak jiţ bylo řečeno v úvodu, narkolepsie není bolestivá ani neohroţuje koně na ţivotě (NISHINO, RIPLEY 2002). Výcvik je sice problematický, ale zvládnutelný a byly pozorovány případy narkoleptických koní, u kterých se nemoc s věkem zlepšovala. Příčina i mechanismus narkolepsie u koní jsou nejasné. Předpokládalo se, ţe to bude podobné jako u lidí a psů, kde je typický nedostatek hypokretinu (ALDRICH 1996; BILLIARD 2007; NEVŠÍMALOVÁ 2006; RIPLEY et al. 2001). V několika případech bylo tedy provedeno vyšetření mozkomíšního moku a stanovena koncentrace hypokretinu u koní trpících narkolepsií sporadické i familiární formy. BATHEN- NÖTHEN et al. (2009) popisuje měření hladiny hypokretinu u hříběte islandského poníka se sporadickou formou narkolepsie, LUNN et al. (1993) zaznamenal případ familiární narkolepsie u miniaturních koní a v České Republice bylo provedeno měření hladiny hypokretinu dvěma příbuzným klisnám lipického koně, jak mi sdělila MVDr. LUDVÍKOVÁ (pers. comm. 2010). V ţádném z těchto případů vyšetření neprokázalo deficit hypokretinu u postiţených koní. V případě lipicánů a miniaturních koní, kdy jde o familiární formu narkolepsie, by mechanismus mohl být stejný jako u rodinné narkolepsie u psů a lidí, kdy koncentrace hypokretinových neuronů v mozkomíšním moku je normální, chybí však hypokretinové receptory v mozku (NISHINO, RIPLEY 2002). U islandského poníka byly zaznamenány příznaky narkolepsie bez kataplexie, to můţe vysvětlovat, proč byla hladina hypokretinu v normálu. Jak bylo uvedeno výše, deficit hypokretinu se u narkolepsie bez kataplexie vyskytuje spíše výjimečně. Proč k nedostatku hypokretinu dochází, není přesně jasné, ani u lidí a u sporadické narkolepsie psů. Jen u familiární psí narkolepsie u dobrmanů a labradorů 31

prokázal LIN et al. (1999), ţe příčinou je autozomálně recesivně dědičná mutace hypokretinového receptoru Hcrtr 2. U koní je moţnost takovéto mutace nepravděpodobná. Aby se alespoň 25% hříbat narodilo s narkolepsií, nositeli mutace by museli být oba rodiče, coţ je nepravděpodobné, vzhledem k velmi nízkému výskytu narkolepsie u koní a také k tomu, ţe v případě familiární narkolepsie u lipicánů nejde o pravé sourozence. Klisny Rozita a Gastieza mají stejného otce, kterým je Neapolitano IV, ale ze strany matek Romanzy - 84 a Galanty - 10, nebyla prokázána příbuznost (viz rodokmeny klisen v příloze). To by znamenalo, ţe narkoleptických lipicánů by muselo být mnohem více, neţ se v současné době předpokládá. Je to nepravděpodobné, ale ne nemoţné. Lipicáni se chovají v rodinách a tak vzdálená příbuznost matek není vyloučena, navíc se ukázalo, ţe Romanza a Galanta, byly přivezeny současně z hřebčínu Piber, potom, co je odtamtud odkoupil JK Dukovany. Naproti tomu ale průzkum chovu miniaturních koní nepoukázal na ţádné podobné skutečnosti a v případě islandských koní bylo provedeno opakované připouštění stejných rodičů a hříbě se narodilo zdravé. To se ovšem dalo předpokládat, vzhledem k tomu, ţe zmiňovaná mutace u psí narkolepsie je recesivní, takţe i kdyby se narkolepsie u koní dědila stejně, museli by příznaky mít také oba rodiče, aby bylo 100% hříbat postiţených. Rodiče ale byli bez příznaků, takţe i kdyby byli nositeli mutace, 75% hříbat by se narodilo bez klinických příznaků narkolepsie, kromě toho šlo o sporadickou formu narkolepsie (BATHEN-NÖTHEN et al. 2009; LIN et al. 1999; LUDVÍKOVÁ pers. comm. 2010; LUNN et al. 1993; NISHINO, RIPLEY 2002). Deficit hypokretinu narkolepsie u lidí je pravděpodobně autoimunitní. Poukazuje na to fakt, ţe téměř ve všech případech narkolepsie s nedostatkem hypokretinu má jedinec dvě specifické alely: HLA DQA1*01:02 a HLA DQB1*06:02. (AKINTOMIDE, RICKARDS 2011; MIGNOT et al. 2001). Imunitní systém koní je dosud prozkoumán jen v omezené míře, není mnoho imunologů, kteří by se věnovali této problematice. Je však známo, ţe geny pro hlavní histokompatibilní komplex ELA (equine leukocyte antigen) se nachází na 20. chromozomu a byly nalezeny geny I., II. a III. třídy. Také u koní jsou tyto geny polymorfní, i kdyţ ne v tak velké míře jako u HLA. Byl popsán polymorfizmus loku DRA, a také ELA-DRB, DQA a DQB (HOŘÍN 2009). U lidí jsou však alely HLA DQA1*01:02 a HLA DQB1*06:02 spojeny s nedostatkem hypokretinu, typickým u narkolepsie-kataplexie, který nebyl u postiţených koní prokázán, nezávisle na tom, jestli trpěli i kataplexií nebo ne 32