CMVIgMELA Test PKS medac Český 0123 110PKSVPCZ/010414
VÝROBCE: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg MARKETING: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Bereich Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103/ 8006351 Fax: ++49/ 4103/ 8006359 ADRESA PRO PŘÍJEM OBJEDNÁVEK: Tel.: ++49/ 4103/ 8006111 Fax: ++49/ 4103/ 8006113 110PKSVPCZ/010414
CMVIgMELA Test PKS medac Enzymoimunologický test se systémem kontroly pipetování na průkaz protilátek IgM proti cytomegaloviru (CMV) v lidském séru a v plazmě Katalogové číslo: 110PKS POUZE PRO DIAGNOSTICKÉ POUŽITÍ IN VITRO ÚVOD Cytomegalovirus (CMV) patří do skupiny lidských patogenních herpetických virů, které obsahují dvouprovazcový genom DNA. Pro tyto viry je typické, že po proběhnutí primární infekce mohou zůstat latentně v organizmu. V důsledku toho může za určitých podmínek dojít k reaktivaci viru. Infekce zapříčiněné cytomegalovirem probíhají u imunokompetentních osob obyčejně nenápadně. U imumosupresivních osob (např. pacienti po transplantaci, lidé infikování virem HIV, tumoroví pacienti nebo novorozenci) se však pozorují závažné symptomy nejrůznějšího druhu. Obzvlášť důležitý je CMV jako častý agens prenatálních infekcí. Tyto infekce mohou způsobit vážné poškození dítěte, přičemž nelze vyloučit pozdější poruchy také u dětí narozených bez symptomů. Test CMVIgMELA Test PKS medac je vhodný na průkaz specifických protilátek IgM proti CMV v séru. Průkazem protilátek IgM lze diagnostikovat akutní infekci CMV. Přitom musíme brát do úvahy, že protilátky proti IgM se nevytvářejí vždycky. Při reaktivacích a reinfekcích u imunosupresivních pacientů jsou protilátky IgM dokazatelné pouze zřídka. 110PKSVPCZ/010414 1
PRINCIP TESTU Mikrotitrační deštička je pokryta protihumánním IgM. Frakce IgM ze vzorku pacienta se váže na mikrotitrační deštičku. Protilátky proti protilátkám CMV IgM se vážou na peroxidázou značený CMV IgMELA (AG = antigen, P = peroxidáza). Inkubace se substrátem TMB (*). Reakce se zastaví přidáním kyseliny sírové. Absorpce se odečte fotometricky. Výhody testu Žádné nespecifické reakce a žádné falešně pozitivní výsledky způsobené revmatoidními faktory. Nedochází k blokování protilátek IgM vysokým titrem IgG. Systém kontroly pipetování umožňuje vizuálně sledovat každý krok pipetování, při kterém dochází ke změnám barev. Lámací proužky s mikrojamkami umožňují efektivní využití testu. Testy lze automatizovat na otevřených zařízeních ELISA. 110PKSVPCZ/010414 2
OBSAH SOUPRAVY Katalogové číslo: 110PKS 1. MTP Mikrotitrační deštička: 12 testovacích proužků po 8 jamkách (označená jako CMM, s rámikem a desikantem v hliníkovém vakuovém balení), lámací proužky, dno tvaru písmena U, pokryta kozími protihumánními protilátkami IgM, BSA a indikátorem ph, připravená k použití. 2. CONTROL Negativní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum, připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClin TM 300 a gentamycin sulfát. 3. CONTROL + Pozitivní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum, připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClin TM 300 a gentamycin sulfát. 4. WB Promývací roztok: 1 láhev s obsahem 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, obsahuje ProClin TM 300. 5. VIRDIL Roztok na ředění vzorků: 1 láhev s obsahem 110 ml, PBS/Tween/ BSA, ph 7,2 7,4, připravený k použití, obsahuje ProClin TM 300. 6. ANTIGEN CMVIgMELA (enzymem označený antigen): 2 lahvičky každá s obsahem 5,0 ml, lyofilizovaný, obsahuje FKS, zbarvený červeně, konjugovaný HRP. 7. TMB Substrát TMB: 1 lahvička s obsahem 10 ml, připravený k použití. 8. STOP Roztok na zastavení reakce: 2 lahvičky s obsahem každá po 11 ml, 0,5 M kyselina sírová (H 2 SO 4 ), připravený k použití. 110PKSVPCZ/010414 3
1. SKLADOVÁNÍ A STABILITA Materiál/Reagencie Stav Skladování Stabilita Zkušební souprava neotevřená 2...8 C do uplynutí použitelnosti Mikrotitrační deštička otevřená 2...8 C v sáčku 6 týdnů s desikantem Kontroly otevřené 2...8 C 6 týdnů Promývací roztok zředěný 2...8 C 6 týdnů Roztok na ředění vzorků otevřený 2...8 C 6 týdnů CMVIgMELA rozpuštěný 2...8 C 5 dní 18 C* 6 týdnů Substrát TMB otevřený 2...8 C 6 týdnů Roztok na zastavení reakce otevřený 2...8 C do uplynutí použitelnosti * Alikvotní části po rozmražení už znovu nezmrazujte! Reagencie nepoužívejte po uplynutí jejich expirace. 2. DALŠÍ POŽADOVANÉ REAGENCIE A MATERIÁLY 2.1. Destilovaná nebo deionizovaná voda. 2.2. Mikropipety pro potřebné objemy. 2.3. Čisté skleněné nádoby nebo nádoby z umělé hmoty na ředění promývacího roztoku. 2.4. Vhodné zařízení na promývání mikrotitračních deštiček (např. multikanálová pipeta nebo promývačka na testy ELISY). 2.5. Inkubátor pro 37 o C. 2.6. Fotometr na mikrotitrační deštičky s filtry na 450 nm a 620 650 nm. 3. PŘÍPRAVA REGENCIÍ Před zahájením testu vytemperujte všechny komponenty na pokojovou teplotu, aby nedocházelo ke kondenzaci. Stanovte požadovaný počet mikrotitračních jamek. 3.1. Mikrotitrační deštička Hliníkový sáček se musí spolu s desikantem po každém otevření opět pevně uzavřít. Skladování a životnost nepoužitých mikrotitračních jamek jsou uvedeny v tabulce číslo 1. 110PKSVPCZ/010414 4
Pokyn: Jamky mikrotitrační deštičky mají slabě zelený odstín. Rovněž se objevující zelenohnědé skvrny v jamkách jsou způsobeny zpracováním deštičky a nemají negativní vliv na provedení a výsledek testu. 3.2. Promývací roztok Smíchejte jednu objemovou část promývacího roztoku (10x) s 9 částmi destilované nebo deionizované vody (např. 50 ml promývacího roztoku (10x) se 450 ml vody). Na 8 jamek budete potřebovat 10 ml promývacího roztoku. Krystaly v promývacím roztoku (10x) se musí rozpustit ohřáním (max. na 37 C) nebo promícháním při pokojové teplotě. 3.3. CMVIgMELA Lyofilizát rozpusťte v 5,0 ml roztoku na ředění vzorků. Lahvičky před otevřením lehce potřeste, aby se částice z uzávěru dostali do roztoku. Po rozpuštění se CMVIgMELA zbarví červeně a je připraveno k použití. Reagencie jednoho testu (mikrotitrační destička, kontroly, CMV IgMELA) se nesmí zaměňovat s reagenciemi jiných šarží. Oproti tomu se roztok na ředění vzorků, promývací roztok, substrát TMB a roztok na zastavení reakce u všech virologických testů firmy medac mohou principiálně zaměňovat. Reagencie jiných výrobců se obecně v tomto testu nesmí používat. Pouze při přesném dodržení pracovních předpisů obdržíte validní a reprodukovatelné výsledky. 4. VZORKY 4.1. Test je vhodný pro vzorky séra a EDTA plazmy. Vzorky pacientů uchovávejte maximálně 7 dní při teplotě 2 8 C. Delší uchovávaní se musí provádět při teplotě 20 C. Vzorky se nesmí opakovaně zamrazovat a odmrazovat. 4.2. Před testem není potřebné provádět žádnou úpravu vzorků např. deaktivaci. Testované vzorky však nesmí být kontaminovány mikroorganizmami ani nesmí obsahovat lidské erytrocyty. 4.3. Vzorky se musí zředit roztokem na ředění vzorků v poměru 1:100. Pro stanovení titru lze vzorků dále libovolně zředit. 110PKSVPCZ/010414 5
5.A. PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU 5.1. Otevřete hliníkový sáček a vyberte požadovaný počet mikrotitračních proužků (viz 3.1.). Mikrotitrační deštičky jsou připraveny k použití a nemusí se promývat. 5.2. Jamku A1 nechejte prázdnou (viz 6.A.). Do jamek na deštičce napipetujte po 50 μl zředěných vzorků, negativní kontrolu a pozitivní kontrolu pipetujte dvakrát. Po napipetování se vzorky (neutrální nebo bazické kapaliny) v jamkách zbarví modře. Pokud se roztok v některé jamce nezbarví, znamená to, že nebyly napipetovány sérum nebo kontroly. V případě potřeby se mikrotitrační deštičky mohou před dalším zpracováním ponechat ve vlhké komoře maximálně po dobu 30 minut při pokojové teplotě nebo při teplotě 2 8 C maximálně po dobu 60 minut. 5.3. Mikrotitrační deštičku inkubujte 60 minut ( 5 minuty) při teplotě 37 C ( 1 C) (vlhká komora nebo inkubační fólie). 5.4. Rozpusťte lyofilizované CMVIgMELA (viz 3.3). 5.5. Po inkubaci promyjte každou mikrotitrační jamku třikrát 200 μl promývacího roztoku. Při promývaní dbejte na to, aby se jamky pořádně naplnily. Po promytí vyklepejte mikrotitrační deštičku na filtračním papíru. Jamky nenechte vyschnout! Pokračujte v práci okamžitě! 5.6. Do každé jamky (kromě A1) přidejte rozpuštěné CMVIgMELA (zbarvené červeně). Při manuálním zpracování testu napipetujte do každé jamky 50 μl ELA. Upozornění: Při práci na automatizovaných přístrojích musíte naprogramovat pro každou jamku 60 μl ELA, protože v inkubačních komorách automatů dochází k intenzivnímu vypařování. V rámci validace se ukázalo, že tento test je v podstatě vhodný také na automatické zpracování. Nicméně doporučujeme verifikovat jeho kompatibilitu s přístrojem, na kterém se bude pracovat. 5.7. Inkubujte znovu 60 minut ( 5 minuty) při teplotě 37 C ( 1 C) (vlhká komora nebo inkubační fólie). 5.8. Po inkubaci znovu promyjte mikrotitrační jamky znovu (viz 5.5.). 110PKSVPCZ/010414 6
5.9. Do všech jamek (včetně A1) přidejte 50 μl substrátu TMB a inkubujte 30 minut ( 2 minuty) při teplotě 37 C ( 1 C) ve tmě (vlhká komora nebo inkubační fólie). Pozitivní vzorky se zbarví modře. 5.10.Enzymatickou reakci zastavte přidáním 100 μl roztoku na zastavení reakce do každé jamky (včetně A1). Modré zbarvení se změní na žluté. Před fotometrickým měřením vyčistěte ze spodu mikrotitrační deštičku a zkontrolujte, zdali v jamkách nejsou žádné bublinky vzduchu. Odečtení je nutno provést během 15 minut po přidání roztoku na zastavení reakce. 5.B. TABULKA ZNÁZORŇUJÍCÍ PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU Prázdná jamka (A1) Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky 50 μl 50 μl 50 μl Inkubujte 60 minut při teplotě 37 C, 3 x promyjte 200 μl promývacího roztoku CMVIgMELA 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) Inkubujte 60 minut při teplotě 37 C, 3 x promyjte 200 μl promývacího roztoku Substrát TMB 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl Roztok na zastavení reakce Inkubujte ve tmě 30 minut při teplotě 37 C 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Fotometrické odečtení optické density při 450 nm (ref. vln. Délka 620 650 nm) *) manuální/automatický postup (viz 5.6.) 110PKSVPCZ/010414 7
6.A. HODNOCENÍ TESTU (VALIDITA) Odečtěte hodnotu optické density (OD) při vlnové délce 450 nm (referenční vlnová délka 620 650 nm). Od všech hodnot OD odečtěte OD pozadí (A1 jamka). Střední hodnota OD negativní kontroly musí být < 0,100. Střední hodnota OD pozitivní kontroly musí být > 0,800. Cutoff = Střední hodnota OD negativní kontroly + 0,140 Šedá zóna = cutoff 10 % Pokud tyto kritériá validity nejsou splněna, musí se test opakovat. 6.B. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Vzorky s hodnotami OD pod dolní hranicí šedé zóny se hodnotí jako NEGATIVNÍ. Vzorky s hodnotami OD v oblasti šedé zóny se hodnotí jako HRANIČNÍ. Hodnoty v hraniční oblasti se musí opět zkontrolovat po 14 dnech společně s novými vzorkami, aby se zjistil pohyb titru IgM. Vzorky s hodnotami OD nad horní hranicí šedé zóny se hodnotí jako POZITIVNÍ. Výsledky testu se musí interpretovat vždycky společně s klinickým obrazem pacienta a dalšími diagnostickými parametry. Křížové reakce vyvolané protilátkami proti jiným herpetickým virům nelze v jednotlivých případech vyloučit. Velmi vysoké hodnoty lipidů mohou vést při negativních vzorkách ke falešně pozitivním výsledkům. Vysoké hodnoty hemoglobinu a bilirubinu neovlivňují výsledky testu. 110PKSVPCZ/010414 8
7. CHARAKTERISTICKÉ VLASTNOSTI TESTU V rámkách diagnostické evaluace jsme obdrželi následující charakteristické vlastnosti testu. 7.A. CITLIVOST A SPECIFITA 482 sér od dárců krve a od pacientů bylo testováno testem CMVIgMELA Test PKS medac. Paralelně byly tyto vzorky testovány vysoko specifickým referenčním testem ELISA, který se rutinně používá v laboratořích. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. CMVIgMELA Test PKS Referenční test negativní pozitivní negativní 314 1 pozitivní 1 166 Citlivost = 99,40 % Specifita = 99,68 % Pozitivní prediktivní hodnota: 99,40 % Negativní prediktivní hodnota: 99,68 % 7.B. PŘESNOST Vzorky Variace intraassay Vzorky Variace interassay (n = 11) Střední OD S VK (%) n Střední OD S VK (%) NK 0,034 0,005 15 24 NK 0,050 0,010 20 SP 0,314 0,013 4 24 SP 0,230 0,021 9 PK 2,269 0,048 2 24 PK 1,456 0,064 4 Č. 1 0,049 0,008 16 27 Č. 4 0,058 0,007 12 Č. 2 0,317 0,023 7 27 Č. 5 0,264 0,037 14 Č. 3 2,673 0,086 3 27 Č. 6 0,271 0,039 14 Č. 7 1,788 0,073 4 NK = negativní kontrola; SP = slabě pozitivní kontrola (není obsáhnuta v soupravě); PK = pozitivní kontrola 110PKSVPCZ/010414 9
ŠEOBECNÉ RADY TÝKAJÍCÍ SE MANIPULACE Aby se předešlo vzájemné kontaminaci jednotlivých reagencií, nezaměňujte lahvičky ani jejich šroubové uzávěry. Reagencie se musí ihned po použití uzavřít, aby nedošlo k jejich vypařování a mikrobiální kontaminaci. Po skončení testu se reagencie musí uložit tak, jak je uvedeno v pokynech, aby se zachovala jejich garantovaná životnost. Aby se předešlo záměně reagencií různých testovacích systémů nebo šarží, musí se všechny komponenty jednoho setu po použití skladovat spolu v původním balení (viz také 3.). INFORMACE TÝKAJÍCÍ SE BEZPEČNOSTI A OCHRANY ZDRAVÍ Je nevyhnutné dodržovat místní předpisy týkající se bezpečnosti práce. Reagencie lidského původu byli testovány na HBsAg, na protilátky proti HIV 1/2 a protilátky proti HCV a bylo zjištěno, že nejsou reaktivní. Přesto se musí s těmito reagenciemi a také s těmi, které obsahují součásti zvířecího původu, (viz obsah soupravy), pracovat jako s potencielně nákažlivými, aby se předešlo riziku nákazy. RADY TÝKAJÍCÍ SE LIKVIDACE Chemikálie a přípravky patřící k tomuto produktu a také jejich zbytky, vznikající při použití tohoto produktu, se považují zpravidla za odpady, které se musí odstraňovat dle předpisů. Odstraňování těchto odpadů se řídí národními zákony týkajících se odpadů. Informace o možnostech odstraňování odpadů Vám podají zodpovědný úřad nebo společnosti zabývající se odstraňováním odpadů. Datum vydání: 01.04.2014 110PKSVPCZ/010414 10
LITERATURA Enders, G.: Infektionen und Impfungen in der Schwangerschaft. Urban und Schwarzenberg, München, 930 (1990). Flik, J.: A comparison of 2 quantitative ELISAs used to detect IgG antibodies against HCMV in transplant recipients. Poster presented at the 5th Int. Cytomegalovirus Conference (1995). Jethon, C., Doerr, H. W., Weber, B.: Serologische Diagnose der CytomegalievirusInfektion: Evaluierung von drei Enzymimmunoassays zum Nachweis von spezifischen IgMAntikörpern in Serumproben von immunkompetenten und immunsupprimierten Patienten. Lab. Med. 20 (9), 480484 (1996). Reimer, K. und Meisel, H.: Humanes Zytomegalievirus, in: Diagnostische Bibliothek Bd.1, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell Wissenschaftsverlag, 279290 (1996). Schmitz, H., Doerr, H. W., Kampa, D. and Vogt, A.: Solidphase enzyme immunoassay for IgM antibodies to Cytomegalovirus. J. Clin. Microbiol. 5, 629634 (1977). Schmitz, H., Kampa, D., Doerr, H. W., Luthardt, T., Hillemanns, H. G. and Würtele, A.: IgM antibodies to Cytomegalovirus during pregnancy. Arch. Virol. 53, 177184 (1977). Schmitz, H., von Deimling, U. and Flehmig, B.: Detection of IgM antibodies to Cytomegalovirus (CMV) using an EnzymeLabelled Antigen (ELA). J. Gen. Virol. 50, 5968 (1980). Steinmann, J. and Bischoff, J.: Comparison of serological methods for the detection of Cytomegalovirus infection. Lab. Med. 15, 585589 (1991). Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder, U. and Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate between primary and recurrent or longterm human Cytomegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA (1997). Weber, B., Prosser, F., Munkwitz, A. and Doerr, H. W.: Serological diagnosis of Cytomegalovirus infection: comparison of 8 enzyme immunoassays for the detection of HCMVspecific IgM antibody. Clin. Diagn. Virol. 2, 245259 (1994). 110PKSVPCZ/010414 11