Vliv zvýšené hladiny dopaminu na chování potkana v časné dospělosti po neonatální aplikaci N-acetylaspartylglutamátu The Effect of Elevated Levels of Dopamine on Behaviour in Young Adult Rats After Neonatal Administration of N-Acetylaspartylglutamate Věra Bubeníková 1, Hana Tejkalová 1, Jan Klaschka 2, František Šťastný 1 1 Psychiatrické centrum Praha, 3. LF UK, Centrum neuropsychiatrických studií 2 Ústav informatiky Akademie věd ČR, Praha SOUHRN Neurovývojové modely schizofrenie vycházejí z předpokladu, že schizofrenie vzniká v důsledku chybného vývoje mozku. K příčinám vedoucím k abnormálnímu vývoji mozku patří i excitotoxické poškození. V našem experimentálním modelu jsme testovali úlohu N-acetylaspartylglutamátu (NAAG) v etiologii schizofrenie, na základě nálezu prokazujícího zvýšené hladiny NAAG v hipokampu a prefrontální kůře u pacientů se schizofrenií. Použili jsme intracerebroventrikulární aplikaci (ICV) NAAG u potkana 12. postnatální den (12. PD). Po aplikaci NAAG byl sledován rozsah navozené léze a její lokalizace, deficit v sociálním chování v prepubertálním období a změna exploračního chování po podání inhibitoru pro transport dopaminu (GBR 12909) postpubertálně. Neonatální aplikace NAAG vedla k časnému poškození především dorzálního hipokampu, dorzální části rostrálního talamu, retrospleniální a cingulární kůry. Přes rozsáhlé poškození, nebyl pozorován deficit v sociálním chování 10. den po aplikaci NAAG. Podání GBR 12909 vedlo ke zvýšení explorační aktivity potkana. Tyto výsledky ukazují spíše na vedlejší úlohu NAAG v patofyziologii schizofrenie. Klíčová slova: N-acetylaspartylglutamát, schizofrenie, animální model, chování, GBR 12909 SUMMARY Neurodevelopmental models of schizophrenia are based on assumption that schizophrenia arises from abnormal brain development. Primary factors which can produce abnormal brain development are excitotoxic lesions. In our experimental model we tested a role of N-acetylaspartylglutamate (NAAG) in etiology of schizophrenia. We chose the dipeptide because of the evidence of increased NAAG levels in hippocampus and prefrontal cortex of patients with schizophrenia. We applied NAAG intracerebroventricularly (ICV) on postnatal day (PD) 12. Following the NAAG infusion, the extent and localization of lesions was observed. Furthermore, a deficit in social behavior and changes in exploratory behavior were observed after the application of dopamine uptake inhibitor (GBR 12909) postpubertally. Neonatal infusion of NAAG produced acute neurodegeneration in dorsal hippocampus, dorsal parts of rostral thalamus and in retrosplenial and cingular cortex. Despite of large neurodegeneration, deficit in social behavior were not observed (10 days after NAAG infusion). Administration of GBR 12909 resulted
in increased exploratory behavior of rats in open field test. Our results indicate that NAAG may have a secondary role in the patophysiology of schizophrenia. Key words: N-acetylaspartylglutamate, schizophrenia, animal model, behavior, GBR 12909 Bubeníková V, Tejkalová H, Klaschka J, Šťastný F. Vliv zvýšené hladiny dopaminu na chování potkana v časné dospělosti po neonatální aplikaci N-acetylaspartylglutamátu. Psychiatrie 2003;7(Suppl.3):46 49. Úvod Schizofrenie (schizo: fragment, phren: mysl) byla popsána na počátku 20. století Emilem Kraepelinem a Eugenem Bleulerem, který tuto nemoc pojmenoval. V současné době se na schizofrenii nahlíží jako na komplexní onemocnění mozku, postihující kognitivní a emoční funkce (Andreasen, 2000). Definice fenotypu tohoto onemocnění je obtížná, protože pacienti trpící schizofrenií vykazují rozdílné symptomy. Prozatím neexistuje žádný patofyziologický ukazatel specifický pro schizofrenii a současně nejsou známy všechny možné příčiny vzniku tohoto onemocnění. Proto bylo navrženo několik etiologických hypotéz (Lipska a Weinberger, 2002; Andreasen, 2000), které shrnují jednotlivé patofyziologické nálezy u pacientů se schizofrenií a pokoušejí se objasnit vznik tak komplexního onemocnění, jakým je schizofrenie. Jedna z etiologických hypotéz schizofrenie je neurovývojová hypotéza, která vysvětluje vznik tohoto onemocnění na základě abnormálního vývoje mozku. Tuto hypotézu potvrzuje nález, že neexistuje glióza jako ukazatel neurodegenerace a některé další důkazy svědčí o poškození synaptogeneze a dalších faktorů zodpovědných za vývojové procesy v mozku (Weinberger a Lipska, 1995). Pokud neurovývojová hypotéza bude potvrzena, původ tohoto onemocnění může být umístěn na rozhraní druhého a třetího trimestru, kdy proliferují a migrují neurony, a do období, kdy dochází k prořezávání neuronálních spojení a ke změnám závislým na aktivitě mozku (Andreasen, 2000). Na základě neurovývové hypotézy schizofrenie bylo navrženo několik neurovývojových modelů schizofrenii podobného chování u zvířat (Bechevalier et al., 1999; Csernansky et al., 1998; Lipska a Weinberger, 1994). Mezi schizofrenii podobné chování patří např. sociální deficit, deficit ve zpracování informací, deficit v pracovní paměti, změny chování po zvýšení extracelulárních hladin dopaminu a zvýšená vulnerabilita na stres (Bubeníková et al., 2003a). V našem experimentálním modelu na potkanech jsme použili dipeptid N-acetylaspartylglutamát (NAAG), který je agonistou metabotropních glutamátových receptorů skupiny II (mglur II) již v nízkých koncentracích (nmol/l) a ve vyšších koncentracích (mmol/l) je smíšeným agonistou/antagonistou ionotropních glutamátových receptorů NMDA typu (Coyle, 1997; Neale et al., 2000), a to především těch NMDA receptorů, které exprimují podjednotku NR2D (Hess et al., 1999). Tento dipeptid jsme vybrali ve vztahu k modelu schizofrenie vzhledem k nálezu, že zvýšené hladiny tohoto dipeptidu byly prokázány v hipokampu a v prefrontální kůře (PFC) u pacientů se schizofrenií. Zároveň aktivita enzymu NAALADázy, který štěpí NAAG na glutamát a N-acetylaspartát, negativně korelovala s hladinami NAAG v PFC a hipokampu. Snížení aktivity NAALADázy vedlo ke snížení hladin glutamátu a N-acetylaspartátu v PFC a hipokampu a tím k dalšímu prohloubení hypoglutamátergního stavu, který byl nalezen u pacientů se schizofrenií (Tsai et al., 1995; Goff a Coyle, 2001). Cílem našeho pozorování bylo ukázat, že neonatální zvýšení hladiny NAAG způsobí narušení vývoje některých mozkových struktur a následný abnormální vývoj mozku potkana povede k manifestaci schizofrenii podobného chování.
Metodika Samcům potkana (Wistar Hann, Konárovice BioTest s.r.o, Česká republika) byl aplikován NAAG 12. PD intracerebroventrikulárně (ICV) pomocí stereotaktického přístroje s koordinátami (AP 1 mm od bregmy; L ±1,5 mm; V 3,5 mm od povrchu lebeční kosti) v množství 0,25 mmol v 0,25 ml sterilního fyziologického roztoku do komory. Kontrolním zvířatům (SHAM) byl podán sterilní fyziologický roztok ve stejném objemu. Všechna zvířata byla ve světelném režimu 12 h světlo/12 h tma s volným přístupem k vodě a potravě. Před odstavem 28. PD byla zvířata umístěna v počtu 10 mláďat v hnízdě s matkou. Všechny experimenty byly schváleny odbornou komisí pro laboratorní zvířata při 3. LF UK a PCP a byly provedeny v souladu se zákonem 246/1992 Sb. na ochranu zvířat proti týrání a ve smyslu znění vyhlášky 311/1997 Sb. Histologie U třech potkanů z každé skupiny byla za 24 h nebo 96 h po ICV aplikaci NAAG nebo fyziologického roztoku provedena transkardiální perfuze Ringerovým roztokem (ph 7,4) a následně 4% paraformaldehydem v Ringerově roztoku (ph 7,4). Mozky byly vyjmuty, histologicky zpracovány a sériově krájeny na mikrotomu. Na každém 15. řezu (vzdálenost řezů 105 mm) o síle 7 mm bylo použito Nisslovo barvení pomocí toluidinové modři (0,1 % v destilované vodě, Sigma). Testování chování Chování zvířat kontrolních a ovlivněných NAAG bylo sledováno 10. den (22. PD) a 38. den (50. PD) po aplikaci. Sociální chování spolu s hravým chováním bylo testováno mezi potkany z různých vrhů, ale se stejnou aplikací 22. PD v chovném boxu po dobu 15 minut (Vanderschuren et al., 1995). Zvířata byla před pokusem 3,5 h izolována od matky. Bylo sledováno trvání těchto aktivit: hraní, přelézání a podlézání, čištění partnera, vzdalování a přibližování se k partnerovi. Vliv GBR 12909 (Tocris, UK; 10 mg/kg, i.p. 30 min před začátkem experimentu) byl studován 50. PD v aréně o rozměrech 68 45 35 cm po dobu 5 minut. Byla sledována frekvence těchto aktivit: lokomoce (crossing), vztyčování (rearing) a trvání těchto aktivit: immobilita (immobility), čištění (grooming), čichání (sniffing). Výsledky Histologie Morfologickou analýzou byl prokázán výskyt poškozených (pyknotických) neuronů 24 h po aplikaci NAAG, n = 3: cingulární kůra, gyrus dentatus, mediální část substantia nigra, dorzální část rostrálního talamu; 96 h po aplikaci NAAG, n = 3: cingulární, retrospleniální a insulární kůra, gyrus dentatus, mediální část substantia nigra (obr. 1). Poškození bylo nejvíce patrné v dorzální části hipokampu.
Sociální chování Nebyla pozorována žádná statisticky významná změna v sociálním a hravém chování jak u 10 párů zvířat pokusných, tak kontrolních 22. PD (tab. 1). Vliv GBR 12909 na chování Aplikace GBR 12909 vedla ke statisticky významnému zvýšení exploračních aktivit u potkanů, kterým byl aplikován NAAG 12. PD (obr. 2a, b).
Diskuze U pacientů se schizofrenií byly nalezeny zvýšené hladiny NAAG a zároveň snížení aktivity enzymu NAALADázy v hipokampu a prefrontální kůře (Tsai et al., 1995). Takto zvýšená hladina NAAG může snížením hladin glutamátu prohlubovat hypoglutamátergní stav, který byl prokázán u pacientů se schizofrenií (Goff a Coyle, 2001). Tyto nálezy nás vedly k použití NAAG v neurovývojovém modelu schizofrenii podobného chování (sociální deficit, hyperlokomoce a změna v exploračním chování po zvýšení extracelulární hladiny dopaminu). Neonatální zvýšení hladiny NAAG způsobilo významné poškození neuronů v některých oblastech mozku.
V hipokampu, mozkové oblasti důležité v patofyziologii schizofrenie (Heckers a Konradi, 2002; Weinberger, 1999; Benes, 1999), byla zjištěna rozsáhlá neurodegenerace především v dorzálním hipokampu (Bubeníková et al., 2003b). Tento nález ukazuje na výrazný excitotoxický účinek NAAG u mladých potkanů pravděpodobně spojený s NMDA receptory (NR1/NR2D podtypu). Tento předpoklad potvrzuje údaj o změně v expresi NR2D podjednotky v hipokampu během ontogeneze potkana, kdy nejvyšší exprese mrna NR2D podjednotky NMDA receptoru byla pozorována 7. 18. PD (Ritter et al., 2001). Druhým vysvětlením toxicity NAAG, může být toxický účinek L-glutamátu, látky vzniklé hydrolýzou NAAG pomocí enzymu NAALADázy. Přes takto rozsáhlou akutní neurodegeneraci v hipokampu a v některých jiných oblastech mozku potkana jsme nepozorovali výrazné změny v aktivitách sociálního chování 10 dní po aplikaci NAAG. V časné dospělosti (50. PD) jsme však prokázali zvýšenou citlivost na reakci v novém prostředí (Šťastný et al., 2002; Bubeníková et al., 2003c). Mezi další typ schizofrenii podobného chování, které je korelováno s pozitivními příznaky, patří hyperlokomoce po zvýšení hladiny extrasynaptického dopaminu (Bubeníková et al., 2003c). V našem experimentu jsme použili látku GBR 12909, která inhibuje transport dopaminu a zvyšuje jak synaptickou, tak extrasynaptickou hladinu tohoto mediátoru. Aplikace GBR 12909 vedla k výraznému zvýšení lokomoce, vztyčování a současně ke snížení imobility u pokusných zvířat v porovnání s kontrolní skupinou (SHAM). Tyto nálezy mohou svědčit o změně citlivosti na zvýšené hladiny dopaminu při explorační aktivitě potkana s NAAG lézí. Závěrem lze říci, že neonatální ICV aplikace NAAG vede k akutní neurodegeneraci především v dorzálním hipokampu a následně ke zvýšené citlivosti exploračního chování potkana v postpubertě na zvýšené hladiny mozkového dopaminu. Nemění se však sociální chování u těchto zvířat v prepubertě. Můžeme proto konstatovat, že neonatální zvýšení hladin NAAG nevede k plné manifestaci schizofrenii podobného chování u potkana, a proto pravděpodobně není primárním faktorem vedoucím k dezinhibici glutamátergního systému u tohoto onemocnění. Pro tuto hypotézu svědčí i nezměněná celková vazba [ 3 H]glutamátu do striata, hipokampu a frontální kůry potkana 38. den po aplikaci NAAG (Šťastný et al., 2002). Domníváme se, že zvýšené hladiny NAAG zjištěné u pacientů se schizofrenií pouze přispívají k patofyziologii schizofrenie. Tato práce byla podpořena projektem LN00B122 MŠMT ČR. LITERATURA RNDr. Věra Bubeníková Psychiatrické centrum Praha Ústavní 91 181 03 Praha 8-Bohnice tel: 266 003 173 e-mail: bubenikova@pcp.lf3.cuni.cz Andreasen N. Schizophrenia: the fundamental questions. Brain Res Rev 2000;31:106 112. Bachevalier J, Alvarado MC, Malkova L. Memory and socioemotional behavior in monkeys after hippocampal damage incurred in infancy or in adulthood. Biol Psychiatry 1999;43:436-445. Benes F. Evidence for altered trisynaptic circuitry in schizophrenic hippocampus. Biol Psychiatry 1999;46:589 599.
Bubeníková V, Horáček J, Benešová O, Šťastný F. Animální modely schizofrenie. Psychiatrie 2003a;7:26 30. Bubeníková V, Balcar VJ, Druga R, Pliss L, Šťastný F. Neonatal neurodegneration after N-acetylaspartylglutamate (NAAG) admi-nistration in rat hippocampus. J Neurochem 2003b;85:25. Bubeníková V, Balcar VJ, Tejkalová H, Horáček J, Šťastný F. Význam neonatálního excitotoxického poškození mozku v neurovývojovém modelu schizofrenie. Psychiatrie 2003c;7:19 20. Csernansky JG, Csernansky CA, Kogelman L, Montgomery EM, Bardgett ME. Progressive neurodegeneration after intracere/broventricular kainic acid administration in rats: implications for schizophrenia? Biol Psychiatry 1998;44:1143 1150. Coyle JT. The nagging question of the function of N-acetylaspartylglutamate. Neurobiology of Disease 1997;4:231 238. Goff DC, Coyle JT. The emerging role of glutamate in the pathophy-siology and treatment of schizophrenia. Am J Psychiatry 2001;158:1367 1377. Heckers S, Konradi C. Hippocampal neurons in schizophrenia. J Neuronal Transm 2002;109:891 905. Hess SD, Pasiecyny R, Rao SP, Jachec C, Varney MV, Johnson EC. Activity of N-acetylaspatylglutamate at human glutamate receptors. Soc. Neurosci Abstr 1999;25:975. Lipska BK, Weinberger DR. Subchronic treatment with haloperidol or clozapine in rats with neonatal excitotoxic hippocampal damage. Neuropsychopharmacology 1994;10:199 205. Lipska BK, Weinberger DR. A neurodevelopmental model of schizophrenia: neonatal disconnection of the hippocampus. Neurotox Res. 2002;4:469 475. Neale JH, Bzdega T, Wroblewska B. N-Acetylaspartylglutamate: the most abundant peptide neurotransmitter in the mammalian central nervous system. J Neurochem 2000;75:443 452. Ritter LM, Vazquez DM, Meador-Woodruff JH. Ontogeny of ionotropic glutamate receptor subunit expression in the rat hippocampus. Dev Brain Res 2001;139:227 236. Šťastný F, Bubeníková V, Tejkalová H. N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamát, G-proteinová signalizace a psychotické chování potkana v animálním modelu. Psychiatrie 2002;6(Suppl 4):20 24. Tsai G, Passani LA, Slusher BS, Carter R, Baer L, Kleinman JE, Coyle JT. Abnormal excitatory neurotransmitter metabolism in schizophrenic brains. Arch Gen Psychiatry 1995;52:829 836. Vanderschuren LJ, Niesink RJ, Spruijt BM, Van Ree JM. Influence of environmental factors on social play behavior of juvenile rats. Physiol Behav 1995;58:119 123. Weinberger DR. Cell biology of the hippocampal formation in schizophrenia. Biol Psychiatry 1999;45:395 402. Weinberger DR, Lipska BK. Cortical maldevelopment, anti-psychotic drugs, and schizophrenia: a search for common ground. Schizophr Res 1995;16:87 110.