VĚDECKÁ ČÁST. Z á vě r ečná zpráva o řešení vý z k u m n é h o z á měru

Z á vě r ečná zpráva o řešení vý z k u m n é h o z á měru F u n kční diagnostika zhoubných nádorů Výzkumný záměr byl udělen Ministerstvem zdravotnictví ČR pod označením FUNDIN MZ0MOU2005. VĚDECKÁ ČÁST (Samostatná příloha závěrečné zprávy č. I) Za Masarykův onkologický ústav předkládají: MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. náměstek pro rozvoj, vědu a výuku hlavní řešitel MZ0MOU2005 prof. MUDr. Jiří Vorlíček, CSc., dr.h.c. ředitel MOÚ V Brně, dne 29.1.2012 1

PŘEHLED AKTIVIT V JEDNOTLIVÝCH PROGRAMECH PODPOROVANÝCH PROSTŘEDKY VÝZKUMNÉHO ZÁMĚRU A PROSTŘEDKY PRO ROZVOJ VÝZKUMNÉ ORGANIZACE V LETECH 2005 AŽ 2011. 1. PROGRAM TECHNOLOGICKÉ PODPORY /PTP/ PROJEKT HEREDITY A SOCIOANALÝZY Řešitelka: doc. MUDr. Lenka Foretová, Ph.D. a řešitelský tým Oddělení epidemmiologie a genetiky nádorů (OEGN) MOÚ Laboratoř OEGN byla z prostředků pro Rozvoj výzkumné organizace v roce 2011 vybavena novým DHPLC systémem v ceně 2 800 000 Kč. Jedná se o denaturační vysokorozlišovací kapalinovou chromatografii s DNASep kolonou (patentovaná separační kolona). Přístroj byl zakoupen prostřednictvím veřejné zakázky, která se vztahovala na dodání DHPLC systému s DNASep kolnonou, jeho montáž, instalaci a uvedení do provozu. Systémý umožňuje vysoce senzitivní a automatickou analýzu mutací ve fragmentech nukleové kyseliny (DNA) založenou na principu heteroduplexní analýzy. Jeho pořízení bylo nezbytným předpokladem k zefektivnění genomových mutačních analýz, které laboratoř OEGN postupně zavedla v průběhu řešení VZ FUNDIN. I) Genetická vyšetření v laboratoři OEGN zavedená s podporou VZ FUNDIN a prostředků pro Rozvoj výzkumné organizace. a) Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC, Lynchův syndrom) HNPCC je nejčastější formou dědičného kolorektálního karcinomu. HNPCC je syndrom s autozomálně dominantní dědičností, jehož příčinou jsou mutace v některém z mismatch reparačních (MMR) genů, neboli genů kódujících proteiny opravující chybné párování bazí. Odhad incidence v západní populaci je 1:1000 1:2000 a penetrance dosahuje 75%. Nejčastější příčinou HNPCC syndromu jsou mutace v genu MLH1 (lokus 3p22) nebo MSH2 (lokus 2p21), méně často v genu MSH6 (lokus 2p16). 2

V letech 2006-2007 byly optimalizovány a validovány podmínky pro vyšetření genů MLH1, MSH2 a MSH6 a vyšetření bylo v roce 2007 nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP- 2: Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC, Lynchův syndrom): mutační analýza genů MLH1, MSH2, MSH6 metodou HRM, sekvenováním a MLPA b) Li-Fraumeni syndrom Li-Fraumeni je jedním z nejzávažnějších nádorových syndromů s autozomálně dominantní dědičností. Jedná se o vzácné onemocnění, ale s velmi agresivním projevem. Příčinou je u většiny případů mutace v genu TP53 (lokus 17p13.1), které relativně často vznikají de novo. Typickým fenotypovým projevem syndromu jsou tyto malignity: sarkomy měkkých tkání, osteosarkom, karcinomy prsu, mozkové nádory, adrenokortikální karcinomy v dětském věku, rhabdomyosarkomy a leukémie. V roce 2007 byly optimalizovány a validovány podmínky pro vyšetření genu TP53 a vyšetření bylo v roce 2008 nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP- 3: Hereditární syndrom Li-Fraumeni: mutační analýza genu TP53 metodou přímého sekvenování a MLPA. c) Hereditární syndrom maligního melanomu Populační celoživotní riziko pro onemocnění zhoubným melanomem se v ČR pohybuje kolem 1-1,5% a z toho jen asi 10% případů vykazuje familiární zátěž. V souvislosti s autozomálně dominantní dědičností maligního melanomu byly popsány zárodečné mutace v genu CDKN2A (cyklin-dependent kinase inhibitor 2A). Gen CDKN2A (lokus 9p21) je exprimován ve formě několika alternativních transkripčních variant. Z hlediska nádorové predispozice jsou nejvýznamnější produkty genu CDKN2A exprimované ve všech tkáních, které se účastní kontroly průběhu buněčného cyklu ve fázi G1: 3

protein p16/ink4a - inhibitor cyklin dependentní kinázy CDK4 a CDK6 protein p14/arf který interakcí s MDM1 brání degradaci p53 proteinu. V roce 2006 byla provedena optimalizace a validace vyšetření kompletní kódující sekvence CDKN2A genu pro obě varianty p16/ink4a a p14/arf a vyšetření bylo nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP- 4: Hereditární syndrom familiárního melanomu: mutační analýza genu CDKN2A metodou přímého sekvenování a MLPA d) Hereditární syndrom difúzního karcinomu žaludku Vzácný autozomálně dominantní nádorový syndrom s časným výskytem difúzního nádoru žaludku s kumulativním rizikem až 83% do věku 80 let. Dochází k infiltraci stěny žaludku nádorovými buňkami a typická je přítomnost tzv. buněk pečetního prstenu. Zvýšené riziko je zároveň pro vznik kolorektálního karcinomu a lobulárního karcinomu prsu. Příčinou dědičné formy hereditárního karcinomu žaludku jsou zárodečné mutace v genu CDH1 (lokus 16q22), který kóduje protein E-cadherin. E- cadherin je transmembránový glykoprotein (adhezivní protein), který je součástí cytoskeletonu a má významnou úlohu v kontaktní inhibici proliferace, zároveň se podílí na řízení diferenciace epiteliálních tkání. V roce 2008 byla provedena optimalizace a validace vyšetření genu CDH-1 a vyšetření bylo nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP- 5: Hereditární syndrom difúzního karcinomu žaludku: mutační analýza genu CDH1 (E-cadherin) metodou přímého sekvenování a MLPA. e) Vyšetření genu CHEK2 Produkt genu CHEK2 (alternativně CHK2, homolog Cds1 a RAD53) je významnou protein kinázou, která se podílí na regulaci buněčného cyklu. Při poškození DNA je CHEK2 protein kináza významná pro aktivaci celé řady proteinů (mimo jiné také p53, BRCA1), které se podílejí na řízení DNA reparace a apoptózy. V současné době jsou 4

některé mutace v CHEK2 genu popisovány jako nízko-středně penetrantní alely způsobující genetickou predispozici ke vzniku nádoru prsu. Některé studie popisují zvýšenou predispozici ke vzniku nádoru prostaty, plic, ovaria, mozkových nádorů a osteosarkomů. V roce 2005 byla provedena optimalizace a validace vyšetření 2 rizikových mutací v genu CHEK (delece 2 exonů v centrální části genu a mutace c.1100delc); v roce 2008 byly zařazeny další 2 mutace jejichž výskyt byl zachycen v české populaci (sestřihová mutace c.444+1g>a a missense mutace p.ile157thr). Vyšetření bylo nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP- 6: Multiorgánová nádorová predispozice: vyšetření populačně nejčastějších mutací v genu CHEK2 metodou HRM, PCR a sekvenováním. f) Molekulárně genetické potvrzení Gilbertova syndromu Jako Gilbertův syndrom je označována benigní forma nekonjugované hyperbilirubinemie. Homozygotní genotyp: (TA)7/(TA)7 v TATA boxu UGT1A1 genu (označován také jako polymorfismus UGT1A1*28) je nejčastější příčinou Gilbertova syndromu v bělošské populaci - až u 90% jedinců s klinickými příznaky Gilbertova syndromu. U jedinců s homozygotním genotypem (TA)7/(TA) 7 dosahuje hladina jaterní UDP-glucorunosyltransferázové aktivity pouze cca 30% normálních hodnot. Snížená exprese UGT1A1 genu může způsobit komplikace u metabolizace některých léčiv (především irinotecanu) podávaných onkologickým pacientům. Chemoterapie irinotecanem bývá u jedinců s Gilbertovým syndromem doprovázena gastrointestinální toxicitou a toxicitou na kostní dřeň, způsobenou aktivním metabolitem irinotecanu: SN-38 (7-ethyl-10-hydroxycamptothecin). V roce 2011 bylo vyšetření inzerce di-nukleotidu TA v oblasti TATA boxu genu UGT1A1 nabízeno klinickým lékařům k diagnostickým účelům. 5

g) Analýza aktivačních mutací v hot spot oblastech genů KIT a PDGFRA v nádorové tkáni u gastrointestinálních stromálních nádorů (GIST) Geny c-kit a PDGFRA kódují příbuzné proteiny z rodiny tyrozin kinázových receptorů, které v mutované formě mají výrazně onkogenní efekt. Aktivační mutace se nejčastěji se vyskytují v juxtamembránové doméně (exon 11 genu KIT; exon 12 genu PDGFRA) a vedou k ligand-independetní aktivaci tyrozinkinázy. Mutace v genech KIT a PDGFRA výrazně ovlivňují odpověď GIST pacientů na léčiva typu tyrozin kinázových inhibitorů (např.gleevec). Mutační analýza KIT a PDGFRA má význam pro aplikaci cílené terapie a predikci odpovědi GIST na léčbu imatinibem. V roce 2010 byla v OEGN-laboratoři provedena optimalizace a validace vyšetřovacích postupů pro analýzu hot spot oblastí genů KIT (exony 9, 11, 13, 17) a v genu PDGFRA (exony 10, 12, 14, 18) a vyšetření bylo nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP- 7: Gastrointestinální stromální nádory: vyšetření somatických mutací v genech KIT a PDGFRA metodou přímého sekvenování. II) Aplikace senzitivnějších metod v OEGN laboratoři v letech 2005-2011 s podporou VZ FUNDIN a) MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification V průběhu roku 2005 byla optimalizována metoda MLPA (s využitím SALSA kitů firmy MRC Holland), která umožňuje detekci velkých intragenových delecí/duplikací, zahrnujících celé exony genů. V roce 2011 byla metoda MLPA akreditována dle ČSN EN ISO 15189:2007 (SOP-1: Hereditární syndrom nádoru prsu a/nebo ovaria: mutační analýza genů BRCA1 a BRCA2 metodou HRM, sekvenováním, MLPA a LR PCR analýza genu BRCA1) i jako součást vyšetření dalších genů u jiných hereditárních nádorových syndromů. b) HRM High Resolution Melting - Vysokorozlišovací analýza křivek tání 6

V průběhu let 2007-2008 byla optimalizována a validována metoda HRM s využitím přístroje LightScanner (Idaho Technologies) pro vyšetření bodových mutací v genech BRCA1 a BRCA2. Metoda MRM je založená na principu heteroduplexní analýzy, která využívá vlastností fluorescenční barvy (LCGreen plus), která se během PCR reakce inkorporuje do dsdna. Během postupného zahřívání dochází k meltingu DNA a barva se z jednořetězců uvolňuje, což se projevuje poklesem fluorescence. Přítomnost heteroduplexu v analyzovaném fragmentu DNA výrazně mění profil křivky meetingu (tání, postupu denaturace DNA). Senzitivita metody pro záchyt mutací v heterozygotní stavu je téměř 100%. HRM je v laboratoři používána jako presekvenační skreeningová metoda. V roce 2011 byla metoda HRM akreditována dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako součást vyšetření u hereditárních nádorových syndromů (Dědičný syndrom nádoru prsu a Lynchův syndrom). c) Sekvenování na Genetic Analyser 3130 Sekvenování a fragmentační analýza na 4-kapilárním sekvenátoru Genetic Analyser 3130 (Applied Biosystems) byla v roce 2011 akreditována dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako součást vyšetření různých genů u hereditárních nádorových syndromů. III) Klinické studie v oblasti hereditárních maligních onemocnění a mezinárodní spolupráce v této oblasti 1) Studovaná problematika: Psychosociální aspekty genetického testování. Studie se zaměřila na výzkum žen testovaných pro dědičnou etiologii nádorů prsu nebo ovaria. V roce 2005 bylo osloveno 130 žen (pacientek i zdravých) formou dotazníků (Deprese, Obava z rakoviny, Sociální podpora, Motivace a postoj k testování, Životní styl, Preventivní péče, Preventivní operace). Dotazníky byly zpracovávány ve spolupráci se statistikem. Byl hodnocen pohled pacientek na význam testování, jejich nejčastější motivace k vyšetření a dále především vliv testování na psychický stav. Velmi důležitou součástí je i hodnocení úrovně preventivní péče. 7

2) Od roku 2006 (- doposud) probíhá longitudinální studie IBCCS ( International Breast Cancer Carrier Study), která má za úkol v mezinárodním měřítku sledovat klinické charakteristiky nosiček BRCA1/2 mutace. Pomocí standardizovaného dotazníku jsou genetickou sestrou zjišťovány rizikové faktory a údaje o preventivní péči a výsledcích sledování včetně výskytu maligních onemocnění. Tato studie probíhá ve spolupráci s IARC. V průběhu 6 let bylo zařazeno do studie 274 nosiček mutace ( 5 jich zemřelo,2 se odstěhovaly). Pouze vstupní dotazník byl odebrán od 92 osob, vstupní a follow-up od 103 osob, další sledování je po dvou letech, tři dotazníky jsou u 72 osob. Původně bylo zařazeno do studie i 31 mužů, ale vzhledem k tomu, že nám nebyl dodán dotazník follow-up pro muže, od dalšího sledování jsme upustily.všechna data jsou vkládána do databáze a jsou součástí mezinárodního hodnocení. 3) V letech 2005-2006 proběhla výzkumná studie ve spolupráci s Department of Genom Science and Medicine, University of Washington: Analýza přítomnosti delece 2 exonů v centrální doméně genu CHEK2 genu u cca 500 nepříbuzných pacientek diagnostikovaných s nádorem prsu nebo ovaria z rizikových rodin s pozitivní rodinnou anamnézou nebo diagnostikovaných v mladém věku (pod 40 let) nebo s duplexním nádorem bez pozitivní rodinné anamnézy. Výsledky byly publikovány s dedikací MZO MOU 2005 (MZO00209805) viz. Walsch et al., 2006. 4) Dlouhodobá spolupráce s Centrem pro lékařskou genetiku v Gentu (Univerzitní nemocnice v Gentu, Belgie) při charakterizaci důsledku nově detekovaných sestřihových mutací v genech BRCA1 a BRCA2 v české populaci. Výsledky byly publikovány s dedikací MZO MOU 2005 viz. Machackova et al., 2008. 5) Rozsáhlá mezinárodní spolupráce při vyhledávání modifikačních a rizikových oblastí genomu významných pro predispozici ke vzniku nádorových onemocnění (CIMBA Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2) viz publikace 6) Rozsáhlá mezinárodní spolupráce v oblasti epidemiologie nádorových onemocnění ( case-control studie nádorů plic, ledvin, pankreatu, lymfomů viz publikace) 8

7) Od roku 2009 je OEGN zapojeno do mezinárodního programu ENIGMA (Evidence-based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles: Unclasified Variant in Cancer Susceptibility Genes Consortium) vedeného Davidem Goldgarem. Pracovní skupiny ENIGMA se zabývají problematikou klasifikace vzácných sekvenčních variant nejasného významu (UV) detekovaných v rizikových genech u pacientů s podezřením na hereditární formu onkologického onemocnění. Studovaná problematika zahrnuje: a. Informace o výskytu UV spolu s patogenní mutací (co-occurence) b. Segregaci variant s onemocněním v postižených rodinách c. Analýzu ztráty heterozygozity v nádorové tkáni (LOH) d. Imunohistopatologie ztrátových mutací versus missense substitucí e. Penetrance missense substitucí, vyhledávání středně rizikových (moderate-risk) alel f. Analýzy sestřihu sekvenčních alterací v exonech i intronech g. in-siliko predikční modely h. Funkční analýzy i. Sběr klinických informací IV) Spolupráce při výzkumu hereditárních nádorových onemocnění v rámci ČR výstupy pro klinickou praxi / doporučené postupy na celostátní úrovni V roce 2006 bylo vydáno první informativní supplementum Klinické onkologie s názvem: Hereditární nádorová onemocnění, suppl. 2006, ročník 19. V rámci standardizace péče o rizikové osoby byl vytvořen soubor standardních doporučení kolektivem autorů (onkologů, genetiků) s názvem Dispenzarizace nádorových syndromů. Tento soubor byl po schválení SLG a ČOS ČLS JEP publikován jako supplementum Klinické onkologie, suppl. 2009, ročník 22. Publikační aktivita řešitelského týmu s dedikací VZ FUNDIN: rok 2005: dedikace MZ00020980501 Kleibl Z, Novotný J, Malík R, Bezdíčková D, Kleiblová P, Foretová L, Krutílková V, Cínek M, Ilenčíková D, Petruželka L, Matouš B, Pohlreich P. Výskyt a význam 9

mutace CHEK2 1100delC u pacientek s karcinomem prsu a v kontrolní skupině zdravých žen v České republice. Klinická onkologie 18, 3, 2005, s. 98-101. rok 2006: dedikace MZ000209805 Walsh T, Casadei S, Coats KH, Swisher E, Stray SM, Higgins J, Roach KC, Mandell J, Lee MK, Ciernikova S, Foretova L, Soucek P, King MC. Spectrum of mutations in BRCA1, BRCA2, CHEK2, and TP53 in families at high risk of breast cancer. JAMA. 2006; 295(12): p.1379-88. IF=28,9 Foretova L, Petrakova K, Palacová M, Kalabova R, Navratilova M, Lukesova M, Vasickova P, Machackova E, Kleibl Z, Pohlreich P. Genetics and preventive services for hereditary breast and ovarian cancer in the Czech Republic. Hereditary Cancer in Clinical Practice 2006 4(1), p.3-6. IF=0,28 Supplementum KO, suppl. 2006, ročník 19. Foretová L, Navrátilová M., Petráková K., Palácová M., Kalábová R, Puchmajerová A, Novotná K, Sedláček Z. Kasuistiky Li-Fraumeni syndromu: diagnostické a preventivní možnosti. Klinická onkologie 2006, Supplement 2006, p.85-87. Goetz P, Foretová L, Puchmajerová A. Hereditární etiologie nádorových onemocnění a význam genetického poradenství a testování v onkologii. Klinická onkologie 19, Supplement 2006. s. 44-47. Lukešová M, Macháčková E, Vašíčková P, Navrátilová M, Pavlů H, Urbánková V, Kuklová J, Foretová L. Výsledky testování BRCA1 a BRCA2 genů v molekulárně genetické laboratoři Masarykova onkologického ústavu. Klinická onkologie 2006, Supplement 2006, p.55-57. Macháčková E, Plevová P, Lukešová M, Vašíčková P, Šilhánová E, Foretová L. Genetická predispozice ke vzniku maligního nádoru prsu. Klinická onkologie 2006, Supplement 2006, p.48-54. Petráková K, Palácová M, Foretová, Kalábová R. Algoritmus preventivních vyšetření u geneticky podmíněných malignit. Klinická onkologie 2006, Supplement 2006, p.88-90. Plevová P, Šilhánová E, Foretová L. Vzácné hereditární syndromy s vyšším rizikem vzniku nádorů. Klinická onkologie 2006, Supplement 2006, p.68-75. Vašíčková P, Macháčková E, Lukešová M, Horký O, Pavlů H, Urbánková V, Kuklová J, Foltánková V, Navrátilová M, Foretová L. Varianty neznámého významu a intragenová přeskupení v genech BRCA1 a BRCA2. Klinická onkologie 2006, Supplement 2006, p.58-62. rok 2008: dedikace MZ0MOU2005 Foretova L. Genetika nádorů prsu. Onkologie 2008; 1:39-43. 10

Machackova E, Foretova L, Lukesova M, Vasickova P, Navratilova M, Coene I, Pavlu H, Kosinova V, Kuklova J, Claes K. Spectrum and characterisation of BRCA1 and BRCA2 deleterious mutations in high-risk Czech patients with breast and/or ovarian cancer. BMC Cancer. 2008, 8:140. IF 3,15 rok 2009: dedikace MZ0 MOU 2005 Antoniou AC, Sinilnikova OM, McGuffog L, Foretova L, et al. CIMBA. Common variants in LSP1, 2q35 and 8q24 and breast cancer risk for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Hum Mol Genet. 2009 Nov 15;18(22):4442-56. IF=8,14 Osorio A, Milne RL, Pita G.Foretova L, et al. CIMBA. Evaluation of a candidate breast cancer associated SNP in ERCC4 as a risk modifier in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Results from the Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/BRCA2 (CIMBA). Br J Cancer. 2009 Dec 15;101(12):2048-54. IF=4,83 Supplementum KO, suppl. 2009, ročník 22. Plevová P, Novotný J, Petráková K, Palácová M, Kalábová R, Schneiderová M, Foretová L. Syndrom hereditárního karcinomu prsu a ovarií. Klin Onkol 2009 ( Suppl S1): S6-S11. Plevová P, Novotný J, Šachlová M, Křepelová A, Foretová L. Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC, Lynchův syndrom). Klin Onkol 2009 ( Suppl S1): S12-S15 Plevová P, Štekrová J, Kohoutová M, Novotný J, Šachlová M, Petráková K, Foretová L. Familiární adenomatózní polypóza. Klin Onkol 2009 ( Suppl S1): S16-S19 Plevová P, Krutílková V, Petráková K, Palácová M, Foretová L, Novotný J. Syndrom Li-Fraumeni. Klin Onkol 2009 ( Suppl S1): S20-S22 Foretová L, Macháčková E, Šachlová M, Petráková K, Palácová M. Syndrom familiárního melanomu (s dysplastickými naevy či bez nich). Klin Onkol 2009 ( Suppl S1): S32-S33 Plevová P, Krutílková V, Puchmajerová A, Foretová L. Gorlinův syndrom. Klin Onkol 2009 ( Suppl S1): S34-35 Petrák B, Plevová P, Novotný J, Foretová L. Neurofibromatosis von Recklinghausen. Klin Onkol 2009 ( Suppl S1): S38-44 Vrtěl R, Filipová H, Vodička R, Šantavá A, Curtisová V, Foretová L. Tuberosní skleróza. Klin Onkol 2009 ( Suppl S1): SS50-S53 Foretová L, Navrátilová M, Macháčková E. Limitace genetického testování v onkologii. Klin Onkol 2009 ( Suppl S1): S65-S68 11

Hüttelová R, Kleibl Z, Řezáčová J, Krutílková V, Foretová L, Novotný J, Kotlas J, Zikán M, Pohlreich P. Předpoklady pro preimplantační genetickou diagnostiku (PGD) u nosičů mutací v nádorových predispozičních genech. Klin Onkol 2009 ( Suppl S1): S69-S74 rok 2010: dedikace MZ0 MOU 2005 Antonis CA, Wang X, Fredericksen ZS, at al. A locus on 19p13 modifies risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers and is associated with hormone receptor-negative breast cancer in the general population. Nature Genet. 2010, Vol.42(10):885-892. IF=36,37 Antoniou AC, Beesley J, McGuffog L. Foretova L.et al. CIMBA. Common breast cancer susceptibility alleles and the risk of breast cancer for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers: implications for risk prediction. Cancer Res. 2010 Dec 1;70(23):9742-54.. IF=8,43 Wang X, Pankratz VS, Fredericksen Z,. Foretova L.et al. Common variants associated with breast cancer in genome-wide association studies are modifiers of breast cancer risk in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Hum Mol Genet. 2010 Jul 15;19(14):2886-97. IF=8,14 Conde L, Halperin E, Akers NK,. Foretova L.et al. Genome-wide association study of follicular lymphoma identifies a risk locus at 6p21.32. Nat Genet. 2010 Aug;42(8):661-4. IF=36,37 Mohelnikova-Duchonova B, Havranek O, Hlavata I, Foretova L, Kleibl Z, Pohlreich P, Soucek P. CHEK2 gene alterations in the forkhead-associated domain, 1100delC and del5395 do not modify risk of sporadic pancreatic cancer.cancer Epidemiol. 2010 Oct;34(5):656-8. IF=2,056 The A1B1 gene polyglutamine repeat length polymorphism and the risk of breast cancer development. Kleibl Z et al., J Cancer Res Clin Oncol. 2010 Apr 27. IF= 2,26 Hosgood HD et al. In-home coal and wood use and lung cancer risk: A pooledanalysis of the International Lung Cancer Consortium. Environ Health Perspect 2010, Sept. 15. IF=6,19 Foretova L., Petrakova K., Palacova M., Kalabova R., Svoboda M., Navratilova M., Schneiderova M., Bolcak K., Krejci E., Drazan L., Mikova M., Hazova J., Vasickova P., Machackova E. 1 Genetic Testing and Prevention of Hereditary Cancer at the MMCI over 10 years of experience. Klinická onkologie 2010. 23 (6):388-400. Rok 2011 - dedikace MZO MOU 2005: Hamel N, Feng BJ, Foretova L, et al. On the origin and diffusion of BRCA1 c.5266dupc (5382insC) in European populations. Eur J Hum Genet 2011 Mar;19(3):300-6. IF= 4,38 12

Masciari S, Dewanwala A, Stoffel EM, Lauwers GY, Zheng H, Achatz MI, Riegert- Johnson D, Foretova L, Silva EM, Digianni L, Verselis SJ, Schneider K, Li FP, Fraumeni J, Garber JE, Syngal S. Gastric cancer in individuals with Li-Fraumeni syndrome.genet Med. 2011 Jul;13(7):651-7. IF=5,28 Urayama KY, Holcatova I, Janout V, Foretova L, Fabianova E, Adamcakova Z, Ryska M, Martinek A, Shonova O, Brennan P, Scélo G. Body mass index and body size in early adulthood and risk of pancreatic cancer in a central European multicenter casecontrol study.int J Cancer. 2011 Dec 15;129(12):2875-84 IF=4,93 Melichar B, Laco J, Fridrichová P, Simkovič M, Papajík T, Foretová L. Therapyrelated myeloid neoplasms in epithelial ovarian cancer patients carrying BRCA1 mutation: Report of two cases. Acta Oncol. 2011 Aug 22. [Epub ahead of print] IF= 2,27 Foretová L.: Prevence dědičného rizika nádorů prsu a ovaria. Prakt Gyn 2011; 15(3): 155 161 13

FARMAKOGENETIKA Řešitel: doc. MUDr. Dalibor Valík, Ph.D. I) Farmakogenetické a metabolické biomarkery terapie antifoláty Řešitelé: doc. MUDr. D. Valík, Ph.D., prof. MUDr. J. Štěrba, CSc., MUDr. R. Demlová Od roku 2005 probíhají farmakodynamické studie s methotrexátem u dětí léčených pro akutní lymfoblastickou leukémii (ALL). Iniciálně se jednalo o studie s protokolem obsahujícím 2 g/m2 i.v. methotrexátu až do jeho ukončení v klinické praxi v listopadu 2007. Následně se pokračovalo ve farmakodynamických studiích u pacientů léčených tzv. Capizziho methotrexatem. Jelikož jde o prospektivní studii, je nábor pacientů postupný, v současnosti je analyzováno 35 pacientů. Průběžné výsledky byly prezentovány, včetně mezinárodních konferencí, kde byly i oceněny, viz průběžné zprávy. Studie bude dále pokračovat i po ukončení VZ FUNDIN. Nejvýznamnějšími výstupy bylo udělení I. ceny řešitelskému kolektivu na světovém kongresu dětské hematoonkologie v Turecku (přiloženo ke zprávě 2010) a řada předchozích impaktovaných publikací (viz předchozí zprávy: Sterba J, Dusek L, Demlova R, Valik D. Pretreatment plasma folate modulates the pharmacodynamic effect of high-dose methotrexate in children with acute lymphoblastic leukemia and non-hodgkin lymphoma: "folate overrescue" concept revisited. Clin Chem. 2006 Apr;52(4):692-700. Sterba J, Valík D, Bajciová V, Kadlecová V, Gregorová V, Mendelová D. High-dose methotrexate and/or leucovorin rescue for the treatment of children with lymphoblastic malignancies: do we really know why, when and how? Neoplasma. 2005;52(6):456-63. II) Farmakogenetické aspekty terapie fluoropyrimidiny Řešitelé: doc. MUDr. D. Valík, Ph.D., MUDr. R. Demlová, PhD, MUDr. Radka Obermannová, Mgr. Martina Mrkvicová, Ph.D. Řešení projektu paralelně probíhalo ve třech okruzích: i) stanovení eliminačního fenotypu fluoropyrimidinů u pacientů léčených 5-FU dle protokolů de Gramont a FUFA Mayo. Kolektiv řešitelů dále zavedl monitoring 14

hladin aktivního fluoropyrimidinu u dnes stále běžněji podávaného preparátu kapecitabin, který má charakter prodrug a jehož metabolická aktivace může vykazovat interindividuální variabilitu. ii) stanovení preterapeutické exkrece přirozených pyrimidinů, kde byla optimalizována metoda stanovení thyminu pomocí plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií metodou stabilní izotopové diluce. Do doby ukončení projektu jsme pomocí tohoto metodického postupu nezískali klinicky relevantní výsledky vzhledem k řadě metodických problémů s hmotnostní spektrometrií biologického materiálu (iontová suprese, apod.) iii) genotypizace genu pro DPYD. Kritickým místem katabolické cesty fluoropyrimidinu je iniciální hydrogenace enzymem DPD, který je limitující pro rychlost degradace 5-FU. U jedinců se sníženou aktivitou DPD, způsobenou např. vrozenou mutací, dochází k neefektivní inaktivaci 5-FU a může u nich dojít k rozvoji nežádoucích účinků. V roce 2011 bylo v naší laboratoři zavedeno komplexní vyšetření genotypu a farmakofenotypu, spočívající ve stanovení rychlosti in vivo syntézy 5,6-dihydrofluorouracilu. Genotypizace genu DPYD byla zavedena do klinické laboratorní praxe (http://www.mou.cz/file.html?id=1223) a vyšetření bylo akreditováno dle kritérií ČSN EN ISO15189. Tímto vyšetřením je detekována nejčastější patogenní alela v západoevropské populaci, označovaná DPYD*2A, která nese mutaci v rozpoznávací sekvenci pro splicing intronu 14 (IVS14+1 G>A) vedoucí k výpadku exonu 14. Výstupy výzkumné aktivity Farmakogenetika a farmakofenotypizace v terapii 5-FU jsou v současnosti zavedeny jako klinický test v praxi Masarykova onkologického ústavu v podobě farmakofenotypizace 5FU, spojené se stanovením in vivo aktivity DPD (originální výsledek), a genetické mutační analýza DPYD. Genotypizace je akreditována dle ISO15189, viz http://www.mou.cz/cz/oddeleni-laboratorni-medicinyolm/department.html?id=115&chapter=161. III) Farmakogenetické aspekty terapie inhibitory topoisomerázy Řešitelé: doc. MUDr. D. Valík, Ph.D., Mgr. Pavel Odráška, MUDr. R. Demlová, RNDr. E. Macháčková, doc. RNDr. L. Dušek, Ph.D. 15

Projekt byl zaměřen na identifikaci jedinců v riziku toxické reakce po podání irinotecanu. Tato reakce bývá podmíněna zpomalenou eliminací aktivního metabolitu irinotecanu nazývaného SN-38. Tato látka je eliminována z organismu po konjugaci s glukuronovou kyselinou. U lidí s porušenou glukuronidací dochází ke zvyšování plasmatické koncentrace SN-38 s doprovodnými projevy toxicity typicky jde o jedince, u nichž se vyskytuje jinak benigní hyperbilirubinemie. Provádíme vyšetření inzerce TA sekvence v TATA boxu v promotorové oblasti UGT1A1 genu (UDP-glukuronosyltransferáza 1), která je nejčastější příčinou Gilbertova syndromu v Evropské populaci (90%). U normální wild type alely se vyskytuje repetice 6TA, mutovaná alela s inzercí je tvořena repeticí 7TA. Klinické příznaky Gilbertova syndromu se projeví u homozygotů 7TA/7TA, kdy dochází ke snížení exprese UGT1A1 genu na 20-30%. Snížená exprese UGT1A1 genu může způsobit komplikace u metabolizace některých léčiv podávaných onkologickým pacientům. IV) Farmakogenetické aspekty terapie thiopuriny u dětské ALL Řešitelé: doc. MUDr. D. Valík, Ph.D., MUDr. R. Demlová, Ph.D, Mgr. M. Mrkvicová, Ph.D., prof. MUDr. J. Štěrba, Ph.D. Postupně jsme zavedli komplexní testování thiopurin S-methyltransferázy (TPMT). TPMT je cytoplasmatický enzym katalyzující S-methylaci aromatických a heterocyklických sulfhydrylových komponent thiopurinových léčiv včetně 6- thioguaninu, 6-merkaptopurinu a azathioprinu. Tato léčiva se používají v medicíně jako protinádorová léčiva a imunosupresiva při terapii autoimunitních onemocnění, hematoonkologických onemocnění u dětí, idiopatických střevních zánětů a při transplantacích. Z thiopurinových léčiv vznikají vlastní účinné thioguaninové metabolity, které se jako falešné báze inkorporují do nukleových kyselin a inhibují tak jejich transkripci. Dalším mechanismem cytotoxického a imunosupresivního účinku je inhibice de novo syntézy purinových nukleotidů zprostředkovaná dalším účinným metabolitem methylthioinosinmonofosfátem, vytvářeným alternativní metabolickou cestou. TPMT je tedy zásadní enzym pro biodegradaci thiopurinů na neaktivní a netoxické metabolity, jež jsou posléze vyloučeny z organismu. Dostatečná aktivita 16

TPMT tak zabraňuje hromadění thioguaninových nukleotidů a vzniku vedlejších nežádoucích účinků při odbourávání thiopurinových léčiv jako jsou neurotoxicita, hepatotoxicita, myelosuprese, záněty sliznic atd. Snížená metabolická aktivita enzymu TPMT je důsledkem funkčních polymorfizmů v kódující oblasti genu TPMT, z nichž mezi nejčastější deficitní alely v indoevropské populaci patří TPMT*2 (g.238g>c; p.ala80pro), TPMT*3B (g.460g>a; p. Ala154Thr), TPMT*3C (g.719a>g; p.tyr240cys) a TPMT*3A (g.460g>a + g.719a>g; p. Ala154Thr + p.tyr240cys). U běžné populace neléčené thiopuriny se polymorfizmus TPMT neprojevuje, protože není doposud znám fyziologický substrát tohoto enzymu. Klinické projevy deficitu TPMT mohou být závažné pro léčené heterozygoty a homozygoty pro funkčně variantní alely a genetické polymorfizmy tak značnou měrou predisponují pacienta pro účinnost a úspěšnost léčby. O farmakologickém resp. patofyziologickém významu superaktivitních variant není v současnosti známo mnoho. Skutečná aktivita enzymu TPMT odpovídá genotypu a zejména u pacientů heterozygotních a homozygotních pro sledované polymorfizmy je riziko toxických reakcí významné. Aktivita enzymu TPMT je u pacientů sledována na základě měření aktivity v erytrocytech pomocí kinetické HPLC. U 143 vyšetřených pacientů (tab. 1) byly zjištěny jak individuální rozdíly v aktivitě TPMT (graf č. 1), tak významné rozdíly v závislosti na genotypu TPMT, kdy jedinci nesoucí mutantní alelu vykazovali sníženou aktivitu enzymu (graf č. 2). V našem souboru jsme zachytili pacienta z KDHO Praha, který měl závažnou klinickou toxicitu po terapii 6-merkaptopurinem, měl výrazně sníženou aktivitu TPMT a byl složeným triple heterozygotem pro sledované mutace (obr. č. 1). Genotyp TPMT Počet pacientů *1/*1 (wt) 126 (88%) *2/*1 3 (2%) *3A/*1 (*3B/*3C) 13 (9%) *2/*3A 1 (1%) 17

*3B/1 0 (0%) *3C/1 0 (0%) Celkem 143 Tabulka č. 1: Zastoupení genotypů TPMT ve vyšetřovaném souboru 143 pacientů. 30 25 Počet jedinců 20 15 10 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Aktivita TPMT (nmol/hod/mlrbc) Graf č. 1: Distribuce aktivity enzymu TPMT v souboru 143 pacientů Aktivita TPMT (nmol/hod/mlrbc) *2/*3A *2/*1 *3A/*1 *1/*1 (wt) Genotypy TPMT Graf č. 2: Distribuce aktivity enzymu TPMT dle zjištěných genotypů v souboru 143 pacientů. 18

Otec pacienta genotyp TPMT*1/*2 TPMT*1(wt) TPMT* g.238g>c (Ala Pro) Pacient genotyp TPMT*2/*3A TPMT* TPMT*3A g.2460g>a (Ala Thr) g.719a>g (Tyr Cys) Obr. č. 1: Šedé úseky znázorňují exony s otevřeným čtecím rámcem, bílé úseky pak nepřekládající se části genu, zelené boxy jsou vyšetřované lokusy v exonu 5, 7, a 10, oranžové boxy představují lokusy, kde byla detekována mutace. Otec pacienta je nositelem mutace TPMT*2 (asociována se sníženou aktivitou enzymu) - heterozygotní genotyp TPMT*2/*1 s aktivitou enzymu 13,4 nm/hod/mlrbc. Pacient je složený heterozygot pro všechny tři sledované mutace v genu TPMT. Výrazně snížená aktivita TPMT (2,4 nmol/hod/mlrbc) koresponduje se zjištěným genotypem. V současnosti stanovujeme aktivitu TPMT v korelaci s genotypizací sledovaných mutací pomocí real time PCR, která je v současné době k dispozici v naší laboratoři jako klinický test. Vyšetření provádíme pro Kliniku dětské onkologie FN Brno. V návaznosti na loňské jednání s pracovní skupinou pro dětskou hematologii ČHS a ČPS jsme provedli i řadu stanovení pro Kliniku dětské hematologie a onkologie FN Motol a další pracoviště. Zjištěná patologie bude předmětem další publikací. 19

V námi vyšetřeném souboru 99 dětských pacientů s ALL byly zastoupeny následující genotypy TPMT*1/*1 (87%), TPMT*2/*1 (3 %) a TPMT*3A/*1, resp. TPMT*3B/*3C, (9%) a složený heterozygot TPMT*3A/*2 (1 %). Genotypy TPMT*3B/*1 a TPMT*3C/*1 nebyly v našem souboru zachyceny (tab. 1). Zjištěné genotypové frekvence se shodují s údaji publikovanými pro indoevropskou populaci, kdy nejčastěji vyskytující mutací je TPMT*3A. Vzhledem ke skutečnosti, že nerovnoměrné rozložení aktivity TPMT v populaci způsobuje rozdíly v účinnosti léčby, je stanovení aktivity TPMT a příslušného genotypu před začátkem léčby dobrým nástrojem pro určení vhodného dávkování léčiva. Postup stanovení genotypu a farmakofenotypu byl úspěšně zaveden na OLM jako diagnostický test (http://www.mou.cz/cz/oddeleni-laboratorni-medicinyolm/department.html?id=115&chapter=161 a http://www.mou.cz/file.html?id=979). Genotypizace je akreditována dle ISO15189. Nespornou výhodou námi zoptimalizovaného a zavedeného testu je nestandardně malý objem vstupního biologického materiálu (2,6 ml periferní krve) představující sníženou zátěž pro pediatrického pacienta. Závěr: Program farmakogenetika, který jsme měli možnost relizovat z prostředků VZ FUNDIN MZOMOU2005, umožnil studium biochemických a farmakologických aspektů protinádorové terapie v neobyčejné šíři. V jeho hlavních třech aktivitách, tj terapie ALL antifoláty, terapie fluoropyrimidiny a terapie thiopuriny se řešitelskému týmu podařilo získat významné a zejména klinicky relevantní výsledky, které byly jednak předmětem publikací v impaktované literatuře a jednak přímo aplikovatelné v praxi klinických laboratoří. Neméně významnou skutečností je i to, že dva takto realizované, a optimalizované laboratorní postupy se řešitelskému týmu podařilo akreditovat dle kritérií ČSN EN ISO15189. Tato skutečnost je kromě vlastních kvalitativních aspektů činnosti důležitá i pro smluvní výzkum, tj potenciální zadavatele klinických hodnocení jak komerčních, tak plánovaných, akademických realizovaných cestou infrastruktury CZECRIN, jíž je jeden ze spoluřešitelů tohoto projektu koordinátorem (Dr. Demlová). Publikační aktivita řešitelského týmu s dedikací VZ FUNDIN: 20

Sterba J, Pavelka Z, Andre N, Ventruba J, Skotakova J, Bajciova V, Bronisova D, Dubska L, Valik D. Second complete remission of relapsed medulloblastoma induced by metronomic chemotherapy. Pediatr Blood Cancer. 2010 Apr;54(4):616-7. PubMed PMID: 19967772. Lakomý R, Greplová K, Pilný R, Budinská E, Valík D, Poprach A, Nemecek R, Vyzula R. Profiles of low-molecular proteome spectrum obtained through SELDI-TOF mass spectrometry in the sera of patients with metastatic malignant melanoma: pilot study]. Klin Onkol. 2009;22(5):228-32. Czech. PubMed PMID: 19886361. Adam J, Andres P, Bolcák K, Cermáková M, Demlová R, Dubská L, Sedlácková S, Valík D. New radiopharmaceuticals and positron-emission tomography applications at the Masaryk Memorial Cancer Institute in Brno]. Klin Onkol. 2009;22(3):94-7. Czech. PubMed PMID: 19708542. Sterba J, Valík D, Bajciova V. High-dose methotrexate in pediatric oncology-back to bench from bedside for a while? J Pediatr Hematol Oncol. 2009 Feb;31(2):151-2. PubMed PMID: 19194206. Oslejskova H, Horinova V, Sterba J, Pavelka Z, Babovic-Vuksanovic D, Dubska L, Valik D. Malignant intracranial germinoma in Smith-Lemli-Opitz syndrome: cholesterol homeostasis possibly connecting morphogenesis and cancer evelopment. J Pediatr Hematol Oncol. 2008 Sep;30(9):689-91. PubMed PMID: 18776762. Oikonomopoulou K, Li L, Zheng Y, Simon I, Wolfert RL, Valik D, Nekulova M, Simickova M, Frgala T, Diamandis EP. Prediction of ovarian cancer prognosis and response to chemotherapy by a serum-based multiparametric biomarker panel. Br J Cancer. 2008 Oct 7;99(7):1103-13. Epub 2008 Sep 2. PubMed PMID: 18766180; PubMed Central PMCID: PMC2567083. Sterba J, Valik D, Mudry P, Kepak T, Pavelka Z, Bajciova V, Zitterbart K, Kadlecova V, Mazanek P. Combined biodifferentiating and antiangiogenic oral metronomic therapy is feasible and effective in relapsed solid tumors inchildren: single-center pilot study. Onkologie. 2006 Jul;29(7):308-13. Epub 2006 Jul 3. PubMed PMID: 16874014. Sterba J, Dusek L, Demlova R, Valik D. Pretreatment plasma folate modulates the pharmacodynamic effect of high-dose methotrexate in children with acute lymphoblastic leukemia and non-hodgkin lymphoma: "folate overrescue" koncept 21

revisited. Clin Chem. 2006 Apr;52(4):692-700. Epub 2006 Feb 2. PubMed PMID: 16455868. Sterba J, Valík D, Bajciová V, Kadlecová V, Gregorová V, Mendelová D. High-dose methotrexate and/or leucovorin rescue for the treatment of children with lymphoblastic malignancies: do we really know why, when and how? Neoplasma. 2005;52(6):456-63. Review. PubMed PMID: 16284689. Valik D, Sterba J, Bajciova V, Demlova R. Severe encephalopathy induced by the first but not the second course of high-dose methotrexate mirrored by plasma homocysteine elevations and preceded by extreme differences in pretreatment plasma folate. Oncology. 2005;69(3):269-72. Epub 2005 Sep 15. PubMed PMID: 16166815. TESTOVÁNÍ CHEMOREZISTENCE / CHEMOSENZITIVITY PRIMÁRNÍCH NÁDORŮ V EX VIVO PODMÍNKÁCH Řešitel: Mgr. Eva Michalová, RNDr. Libor Hanák Chemoterapie je stále nenahraditelnou modalitou protinádorové léčby. Volba chemoterapeutik, jejich kombinace a dávkovací schémata v případě jednotlivých diagnóz jsou založena na empirických zkušenostech a výsledcích multicentrických studií. V systémové chemoterapii nádorových onemocnění se standardně využívají v klinických studiích ověřené režimy a statisticky nejúspěšnější terapie je vnímána jako nejlepší léčebný postup. Teprve při selhání léčby první, druhé, nebo vyšší řady je výběr chemoterapie omezen a volba léčby není standardně určena. Nicméně ani statisticky nejefektivnější způsob terapie není zárukou úspěšné léčby a vždy existuje podíl případů dané diagnózy, u nichž není dosaženo očekávaného výsledku chemoterapie. Účinek chemoterapeutik není přísně specifický a cytostatika nepůsobí selektivně na nádorové buňky, nýbrž svými toxickými účinky postihuje více či méně i buňky normální. Respektování faktorů individuality a zavádění personalizované medicíny je směr, jehož cílem je co nejvíce zvýšit účinnost terapie s minimálním 22

vedlejším zatížením pacienta. Jedním z přístupů individualizované chemoterapie je snaha o výběr cytostatik s maximální účinností pro daný nádor za současné eliminace těch, k nimž je nádor vysoce rezistentní, a to na základě hodnocení citlivosti nádorové populace k chemoterapeutikům v ex vivo podmínkách. Ex vivo testy představují naději, s níž by predikce citlivosti nádoru k vybraným chemoterapeutikům umožnila výběr co nejefektivnější léčby nádorových onemocnění za současné minimální zátěže pacienta. Možnost vytipování účinné látky na základě jednoduchého ex vivo testu by navíc jednoznačně zvýšila úspěšnost léčby při selhání standardní chemoterapie či v případě léčby primárně chemorezistentních nádorů. Nejrozšířenější metodou ex vivo stanovení citlivosti k chemoterapeutikům je tetrazoliový test (MTT test) (Black a kol., 1954, Mosmann, 1983, Carmichael a kol., 1987). Metoda MTT testu je založena na izolaci buněk vzorku nádorové tkáně a jejich následné kultivaci ex vivo s vybranými cytostatiky o různých koncentracích. Metodika testu byla na pracovišti Masarykova onkologického ústavu (MOÚ) zavedena v průběhu roku 2003 za účelem využití jejích výsledků v klinické praxi. Plně rutinní podoby pak test nabyl od počátku roku 2004. Zpočátku byla testována citlivost všech dostupných vzorků bez omezení diagnózy. V průběhu roku 2006 a 2007 byly vyhodnoceny dosažené výsledky a metoda testu byla obměněna v některých krocích. Tato optimalizace byla zásadní ke správnému provádění testu a měla napomoci ke zvýšení úspěšnosti vlastní metody. Ná základě těchto analýz a změn bylo spektrum diagnóz vhodných k testování citlivosti k cytostatikům zúženo na sarkomy měkkých tkání, karcinom ledvin, metastazující maligní melanom a karcinomu vaječníku. Ve spolupráci s klinickými onkology bylo rovněž stanoveno spektrum cytostatik vhodných k testování u jednotlivých diagnóz. Vzorky jiných diagnóz jsou testovány na vyžádání. Od uvedených změn bylo v Laboratoři chemorezistence MOÚ zpracováno více než 200 vzorků nádorové tkáně získané v MOÚ s cílem určit citlivost jejich buněk ke spektru cytostatik dle diagnózy. Vzorky byly zpracovány dle standardního operačního protokolu optimalizovaného v předchozích letech řešení projektu (viz zpráva FUNDIN 2007). Nejčastěji se jednalo o sakormy měkkých tkání (42 vzorků), karcinom ledviny (69), karcinom vaječníku (41), vzorky metastazujícího melanomu (33) a vzorky dalších malignit. 23

Avšak pouze u 46 % byl získán dostatek živých buněk pro následnou kultivaci alespoň s jedním požadovaným cytostatikem. Převaha mrtvých buněk ve vzorku nemusí být nutně dána malým objemem zpracovaného materiálu, ale spíše individuálními charakteristikami nádorové tkáně a citlivostí jejich buněk ke stresovým podmínkám izolačního kroku. U zbývajících vzorků bylo provedeno více než 400 kultivací s cytostatiky, pouze však 56 % z nich vedlo k úspěšnému hodnocení citlivosti vzorku. V některých případech došlo k úhynu buněk v podmínkách ex vivo, jindy nebyla získána dostatečně kvalitní data. Převážná většina hodnotitelných kultivací poukazovala na rezistenci vzorku (221 kultivací), pouze 39 kultivací poukazovalo na potenciální citlivost vzorku k testovaným cytostatikům. Lze tedy shrnout, že v rámci souboru 223 zpracovaných vzorků byl kompletní výsledek (tj. citlivost stanovená u všech požadovaných cytostatik dle diagnózy) získán pouze u 23 vzorků (10 %), částečný výsledek (tj. citlivost stanovené u omezeného počtu požadovaných cytostatik dle diagnózy) získán u 57 vzorků (26 %), u 143 vzorků (64 %) nebyl získán žádný výsledek informující citlivosti či rezistenci vzorku. Závěr Nádorová tkáň představuje velmi heterogenní materiál, pro něhož je typické zastoupení normálních a nádorových buněk v různém poměru. V porovnání s provedením testu u homogenní kultury buněčné linie je právě kvůli tomuto faktu provádění testu u vzorků nádorové tkáně značně kontroverzní. V opačném případě lze na nádor pohlížet jako na heterogenní tkáň tvořenou maligními buňkami a řadou podpůrných buněk, bez nichž by samotné nádorové buňky nemohly existovat. Pak je možno oprostit se od faktu, že je citlivost stanovována v blíže neurčené heterogenní populaci a výsledek jednoznačně neodráží vlastnosti nádorových buněk. Každý vzorek byť se stejnou diagnózou představuje jedinečnou tkáň odrážející individuální spektrum poškození normálních buněk vedoucích k maligní transformaci a individuální vývoj nádoru. Nízká úspěšnost testu je předurčena zejména vzorkem samotným, tedy množstvím živých buněk a jejich schopností odolat stresovým podmínkám při zpracování vzorku a chováním v podmínkách ex vivo. Metodika stanovení citlivost nádorových buněk ex vivo byla maximálně optimalizována, nicméně ani zásadní změny v jejím provedení nepomohly zvýšit celkovou úspěšnost 24

testu a získání kvalitnějšíchvýsledků. Závěrem je nutno poznamenat, že ex vivo testy nemohou dostatečně napodobit podmínky lidského těla. Konečné vyhodnocení vzorku jako citlivého k určitému cytostatiku na základě ex vivo testu proto ještě nemusí nutně znamenat citlivost buněk in vivo a pozitivní léčebný efekt nasazené léčby. I přes všechny tyto limitace, o kterých jsou plně informováni lékaři vedoucí onkologickou léčbu, je v MOÚ ex vivo testování chemosenzitivity nádorových buněk ze vzorků nádorů laboratorně dostupné (testuje se citlivost k cytostatikům: dakarbazin, vinkristin, docetaxel, etoposid, cisplatina, doxorubicin, karboplatina, melfalan, vinblastine, bleomycin, karmustin, gemcitabin, 5-fluorouracil, topotekan, paklitaxel). Publikační aktivita řešitelského týmu s dedikací VZ FUNDIN: MICHALOVÁ, E., POPRACH, A., NĚMEČKOVÁ, I., NENUTIL, R., VALÍK, D., ŽALOUDÍK, J., VYZULA, R., VOJTĚŠEK, B. Predikce citlivosti nádorových buněk k chemoterapeutikům ex vivo úskalí a limitace vlastní metody. Klinická onkologie, 2008, vol. 21, no. 3, 93-97. ISSN: 0862-495 X. POPRACH, A., MICHALOVÁ, E., PAVLÍK, T., LAKOMÝ, R., VYSKOČIL, J., NĚMEČEK, R., ŽALOUDÍK, J., VYZULA, R., KOCÁK, I., KOCÁKOVÁ, I. Současný stav testování chemorezistence nádorů ex vivo v Masarykově onkologickém ústavu v Brně. Klinická onkologie, 2008, vol. 21, no. 3, p. 116-121. ISSN: 0862-495X. VÝZKUM PROTEOMU NÁDOROVÉ BUŇKY Řešitel: výzkumná skupina RNDr. Bořivoje Vojtěška, DrSc. STRESOVÉ PROTEINY Analýza chaperonového systému u nádorových buněk Řešitel: MUDr. Petr Müller, Ph.D. a Mgr. Eva Růčková Aktivace chaperonového systému je jednou ze základních vlastností nádorové buňky, která umožňuje vyrovnávat stres způsobený genetickou nestabilitou. Zejména stresový protein Hsp90 a s ním spojené chaperony jsou klíčové pro stabilitu řady 25

onkogenních proteinů, jako jsou například receptory pro růstové faktory (EGFR, Her2, VEGFR), steroidní receptory a onkogeny (BRAF, AKT, BCR-Abl, CDK4). Hsp90 se proto ukazuje jako výjimečný cíl protinádorové terapie ze dvou důvodů 1) Hsp90 v nádorových buňkách vykazuje nesrovnatelně vyšší sensitivitu na specifické inhibitory 2) inhibice Hsp90 v nádorech vede k inhibici onkogenní signalizace v mnoha různých drahách a úrovních. Přestože je v současné době řada specifických inhibitorů již testováno klinických zkouškách, není dostatečně vysvětlen mechanismus hyperaktivace Hsp90 v nádorech. Cílem tohoto projektu je analyzovat chaperonový systém Hsp90 na úrovni exprese mrna i proteinů jeho jednotlivých genů a najít potenciální markery, které by určovali aktivitu Hsp90 a jeho případnou sensitivitu vůči inhibitorům. Nově syntetizované nebo denaturované proteiny mohou být prostřednictvím chaperonů Hsp70 a Hsp90 buď stabilizovány a konfirmačně poskládány, nebo mohou být naopak prostřednictvím těchto chaperonů ubiquitinovány a degradovány v proteazomu. Tato rozdílná aktivita chaperonů je určena jejich interakcí s různými kochaperony. Kochaperon HOP se váže současně na Hsp70 a Hsp90 a zvyšuje tak schopnost Hsp90 stabilizovat řadu onkogenních proteinů. Naproti tomu kochaperon CHIP funguje jako ubiquitin ligáza, která vede k ubiquitinaci a degradaci denaturovaných onkogenních proteinů. Vzhledem k tomu, že se oba proteiny se váží na C-konec Hsp70 a Hsp90 a vzájemně tak soutěží o vazbu, je regulace této interakce důležitým mechanismem regulující konformaci nebo degradaci řady důležitých proteinů. V naší práci jsme objevili, že interakce kochaperonů CHIP a HOP je regulována prostřednictvím fosforylace C-konce Hsp70 a Hsp90, která vede k zesílení interakce s proonkogenním proteinem HOP a zeslabení interakce s proteinem CHIP. Zároveň jsme ukázali, že C-koncové fosforylace Hsp70 a Hsp90 jsou regulovány v závislosti na proliferaci buňky, což podtrhuje jejich význam pro nádorovou buňku. Monoklonální protilátky rozeznávající tyto fosforylace byly dále použity pro analýzu vzorků nádoru prsu a kolorekt. Předběžná studie ukazuje, že tyto posttranslační modifikace jsou specifické pro nádorovou buňku a jsou tak zodpovědné za změny aktivity Hsp90 v nádorové buňce. Hodnocení hladiny fosforylace Hsp70 a Hsp90 se tak může stát cenným nástrojem pro stanovení sensitivity nebo rezistence nádoru na vůči inhibitorům Hsp90. 26

V projektu zabývajícím se hodnocení exprese genů chaperonového systému Hsp90 u nádorů jsme analyzovali regulaci genů Hsp70, Hsp90α, Hsp90 β, HOP a CHIP po působení nízkomolekulárního inhibitoru Hsp90 17AAG. Ukázali jsme, že inhibice Hsp90 vede k aktivaci transkripčního faktoru HSF1, který zvyšuje expresi Hsp70, Hsp90α, Hsp90β a HOP. Regulace potenciálního nádorového supresoru CHIP byla na HSF1 nezávislá a byla naopak zvýšena u buněk se zástavou buněčného cyklu v G1 fázi. Tyto výsledky naznačují, že rozdílná exprese genu CHIP a HOP má souvislost s proliferačním potenciálem nádorových buněk a odráží i aktivitu Hsp90 ve smyslu jeho kapacity stabilizovat onkogenní proteiny. Pro potvrzení těchto hypotéz jsme analyzovali hladinu mrna genů Hsp70, Hsp90α, Hsp90β, HOP a CHIP na panelu 50 kolorektálních karcinomů, abychom zhodnotili jejich význam pro prognózu onemocnění. Absolutní množství počtu kopií dané mrna bylo získáno prostřednictvím standardní křivky. Normalizace exprese daného genu byla provedena srovnáním s expresí genu pro β-aktin. Pacienti byli rozděleni do dvou skupin podle relativní hladiny exprese daného genu, aby bylo možné zhodnotit přežití v závislosti na hladině exprese daného genu. Medián přežití byl nejvíce ovlivněn hladinou exprese genu Hsp70. Medián přežití u pacientů s nízkou hladinou Hsp70 byl 1281 dní, zatímco u pacientů s vysokou expresí Hsp70 byl 542 dní. I přes patrný rozdíl v mediánu přežití, nedosahuval tento rozdíl statistické významnosti. Hladiny exprese Hsp90α a Hsp90β ovlivnily přežití jen mírně, medián přežití ve skupině s nízkou expresí Hsp90 byl 1257 dní zatímco medián u skupiny s vysokou expresí byl 800 dní. Relativní exprese samotných kochaperonů HOP a CHIP neměla významný vliv na přežití. Nicméně jejich vzájemný poměr ukázal významný vliv na přežití pacientů. Medián přežití u pacientů s vysokým poměrem HOP/CHIP byl 580 dní, zatímco u skupiny pacientů s nízkým poměrem byl 1257. Tento výsledek ukazuje, že pro aktivitu chaperonového systému je důležitý poměr kochaperonů HOP a CHIP, které vzájemně soutěží o vazbu na Hsp70 a Hsp90. Protein HOP působí jako pro-onkogenní faktor zvyšující kapacitu Hsp70 a Hsp90. Naopak protein CHIP je potenciální tumor-supresorický gen, jehož interakce s chaperony má za následek degradaci klientských proteinů i samotných chaperonů. V další fázi jsme analyzovali vzájemný vztah exprese genů Hsp70, Hsp90 a jejich kochaperonů HOP a CHIP. Ve sledovaném souboru jsme nalezli statisticky významnou korelaci mezi expresí Hsp70 a poměrem exprese HOP/CHIP. Vzhledem k tomu, že exprese Hsp70 je nejvíce ovlivněna aktivitou HSF1, předpokládali jsme, že kochaperony HOP a CHIP mají 27