8. Mikroskopické metody 1/9 8 Mikroskopické metody studia struktury a ultrastruktury buněk struktura buňky struktura cytoplazmy cytoskelet imunofluorescenční mikroskopie, fázový kontrast, interferenční mikroskopy, konfokální laserový skanovací mikroskop, NFOS, STM, AFM, SEM, TEM 8.1 Struktura buňky Podle buněčné teorie(schleiden a Schwann, 1839) jsou všechny živé organismy složeny z buněk. Podle vnitřní struktury rozlišujeme dva hlavní typy buněk: prokaryontní a eukaryontní. Struktura buněk prokaryontů je jednodušší a je tvořena jediným kompartmentem, tzv. nukleocytoplazmatickou matrix. Oblast obsahující DNA(nukleotid) není zřetelně oddělena od ostatní základní cytoplazmy. Eukaryonty, k nimž patří všechny vyšší druhy rostlinných a živočišných buněk, vykazují mnohem složitější strukturu charakterizovanou komplexní kompartmentací(buněčnými organelami). Hlavní příčina spočívá ve vyšší diferenciaci endoplazmatických membrán. Je zajímavé, že všechny buňky eukaryontů mají přibližně stejné organely a rostlinné buňky se od živočišných liší v jejich zastoupení spíše kvantitativně, než kvalitativně. Základní buněčné organely: Membránové organely s DNA Jádro kryté dvouvrstvou jadernou membránou s póry tvořenými speciálními bílkovinami(umožňují transport makromolekul). V jádře chromatin(dna, RNA, histonyproteiny o nízké molekulové hmotnosti)- euchromatin(rozmotaná DNA), heterochromatin(smotaná). Je navázáno na endoplazmatické retikulum. Caryotéka, caryoskelet, laminy - na ně navázány makromolekuly DNA s bílkovinami. Jedno i více(až několik set) jadérek - místo, kde se syntetizuje RNA. Mitochondrie tvořeny dvojitou membránou, jejíž vnitřní část zprohýbaná do tzv. kryst(zvětšení reakční plochy a vytváří oddělené prostory pro různé chemické reakce). Vnitřní prostor vyplňuje matrix. Vlastní DNA- semiautonomní organely. Probíhá zde citrátový cyklus, respirační řetězec, oxidativní fosforylace a degradace mastných kyselin. Plastidy dvojitá membrána a vlastní DNA. Dělíme je na protoplasty(dosud nedozrále plastidy, z nich se tvoří další), leukoplasty(zásobní funkce- amylo-, proteo-, oleoplasty), chromoplasty(barevné, chloroplasty, fenoplasty, atd.). Další membránovité útvary Cytoplazmatická membrána spíše částí otázky 6. Endoplazmatické retikulum(er) přímo navazující na nukleární obal jádra. Jedná se o jednotlivou membránu, tvořící cisterny a váčky. Hladké retikulum- bez ribozómů, funkce syntézy lipidů a sacharidů. Hrubé ER s ribozómy, jehož funkcí je syntéza bílkovin. Golghiho aparát(ga) membránovitá struktura, koláčky, placky na sobě. NavazujenaER,zněhožjdounaGAproteiny.ProduktyzískanézERjsouzdedálezpracovány. Obsahují také lysosomy. Vakuola u rostlin, plní zásobní funkci.
8. Mikroskopické metody 2/9 Lysosomy degradace látek, odstraňování cizích těles a buněčných struktur. Nemembránové části buňky Cytoplazma vnitřní prostředí buňky Cytoskelet viz. dále. Ribozomy organely složené s RNA a bílkovin, v buňce jsou volně i přisedlé k hrubému ER. Zodpovědné za syntézu bílkovin. Buněčnástěna urostlinahub. Dělící vřeténko mikrotubulární útvar vznikající v době dělení buňky. Mikrotělíska(peroxizómy) mají na starosti přeměnu aminokyselin a tuků na cukry. Inkluze kapénkové nebo krystalické struktury, tvořené rezervními(glykogen, tuk, bílkoviny) či odpadními látkami. 8.2 Struktura cytoplazmy Základní cytoplazma představuje nitrobuněčné prostředí nezbytné jak pro existenci buňky jako celku, tak pro činnost buněčných organel. Z hlediska molekulové struktury představuje složitý disperzní systém obsahující jak analytické, tak koloidní složky. Součástí základní cytoplazmy jsou i jemné tabulární a vláknité útvary- mikrotubuly a mikrofilamenta, tvořící tzv. cytoskeletální systém. Základní cytoplazma přechází z tekutého stavu sol(cytosol) do stavu gelu- hlavně v průběhu buněčných funkcí. Složení: voda, anorganické látky, organické sloučeniny a biopolymery. Voda hlavní složka cytoplazmy, tvoří 70-85%. Základní funkce vody v cytoplazmě: je rozpouštědlem anorganických i organických látek tvoří disperzní prostředí pro koloidní součásti cytoplazmy podílísenatransportulátekvbuňce podílí se na vytváření osmotické rovnováhy uvnitř buňky Anorganické složky a elektrolyty nejvíce zastoupeny uhlík, vodík, kyslík, dusík, síra a fosfor. Dále prvky nutné pro látkovou přeměnu a některé buněčné fyzikální procesy: sodík, draslík, hořčík, vápník a chlór. Třetí skupinu tvoří stopové prvky, které často plní úlohu koenzymů či jejich složek při biochemických pochodech: bór, fluór, jód, kobalt, křemík, mangan, molybden, zinek a železo. Elektrolyty jsou sloučeniny, které ve vodě disociují na ionty. Jsou nezbytné jednak pro metabolismus buňky, jednak pro vznik elektrických jevů v buňce. Největší důležitost mají ionty draselné, hořečnaté, fosforečnanové, síranové, hydrogenuhličitanové a chloridové. Méně jsou zastoupeny sodné a vápenaté ionty. Biopolymery jsou představovány hlavně bílkovinami(10-20%). Rozlišujeme dva typy cytoplazmatických bílkovin: strukturní a globulární. Strukturní bílkoviny jsou přítomny v buňce především ve formě tenkých filament. Podílejí se na struktuře kontraktilního aparátu buňky. Globulární bílkoviny jsou rozpustné v cytoplazmě, jako enzymy se účastní chemických reakcí. Lipdy(2%) představují v cytoplazmě především zásobník energie pro buňku. Sacharidy(asi 1%) jsou taktéž zdrojem energie pro buňku. V menší míře jsou v cytoplazmě obsaženy i nukleové kyseliny, zvláště RNA. Jsou však především vázány na specifické cytoplazmatické struktury(jádro, ribozomy).
8. Mikroskopické metody 3/9 Optické vlastnosti: Základní cytoplazma dobře propouští viditelné světlo, nevykazuje žádnou specifickou absorpci, jeví se jako bezbarvá. Obsahuje-li pigmenty či chromofory, může vykazovat specifickou absorpci. V polarizovaném světle je izotropní(neobsahujeli vláknité struktury vykazující dvojlom). Průměrná hodnota indexu lomu kolísá mezi 1,38 a 1,44. Na rozdílech indexu lomu mezi základní cytoplazmou a cytoplazmatickými strukturami je založena mikroskopická metoda fázového kontrastu. Mechanické vlastnosti: Pevnost, či pružnost závisí na jejím koloidním stavu(gel pevnější, pružnější než sol). Viskozita cytoplazmy: Je určována druhem a počtem vazeb mezi jejími stavebními jednotkami, teplotou a složením vnějšího prostředí buňky. V průběhu některých buněčných funkcí se viskozita mění. Povrchové napětí Aktuální reakce: je obecně slabě kyselá(ph asi 6,8). Hodnota ph je poměrně stálá. Cytoplazma se chová jako pufr, její ph se relativně rychle ustálí i při vnějším zásahu (injekce kyselého či zásaditého roztoku). V cytoplazmě lze pozorovat světelným mikroskopem oblasti homogenně opalescenční hmoty hyaloplazma, vyplňující prostor buňky v blízkosti cytoplazmatické membrány a granuloplazmu, nacházející se v sousedství buněčného jádra a mající zrnitý charakter. 8.3 Cytoskelet Speciálními imunofluorescenčními metodami lze v cytoplazmě prokázat složitý vláknitý systém. Slouží k zajištění pohybu cytoplazmy a vnitrobuněčnému přenosu informace. Tento systém se označuje jako cytoskelet. Nejjemnější vlákna nesou název mikrofilamenta a jsou tvořena bílkovinnou aktinem. Průměr vláken 6 nm. Mají kontraktilní vlastnosti a polární strukturu. Hlavní funkce mikrofilament je udržování tvaru buňky a zajištění jejího pohybu. Mikrotubuly mají průměr vláken asi 22 nm a jsou tvořeny tubulinem. Tubulin má dvě modifikace alfa a beta, které tvoří dimery spojené vodíkovými můstky. Dimery jsou seřazeny do protofilament, přičemž 13 paralelně uložených protofilament tvoří vlastní mikrotubulus. Mikrotubuly se snadno rozpadají na své podjednotky a zase se spojují. Hrají důležitou roli při buněčném dělení, tubulin se stává součásti vřeténka. S velkou pravděpodobností pak obnovují geometrii dceřinných buněk. Intermediární filamenta mají průměr 8-11 nm. U epiteliálních buněk jsou tvořena bílkovinou prokeratinem, u mezenchymálních buněk vimentinem a u svalových buněk cesmínem. Funkce není dosud zcela jasná, soudí se, že přispívají k celkové mechanické stabilitě buňky. Ze všech cytoskeletálních struktur jsou nejméně citlivé k působění fyzikálních faktorů. 8.4 Metody mikroskopie Rozlišovací schopnost lidského oka je jedna oblouková minuta, což odpovídá při pozorování z konvenční zrakové vzdálenosti bodům vzdáleným od sebe zhruba sedm setin milimetrů. Použitím lupy lze tuto vzdálenost zmenšit řádově desetkrát. První mikroskop byl zkonstruován v 16. století v Holandsku, dále zdokonalený v roce 1650 Anthony van Leeuwenhoekem. Elektronový mikroskop byl zkonstruován ve třicátých letech 20. století. Rozlišovací schopnost se tak posunula až na úroveň molekul a dnes jsme schopni pozorovat s užitím tzv. tunelového mikroskopu i struktury atomární. Pro mikroskopii lze v zásadě použít jakékoli vlnění, jehož vlnová délka je výrazně kratší než rozměry objektu, který chceme pozorovat. Proto jsou pro mikroskopii vhodné
8. Mikroskopické metody 4/9 Obrázek 1: Schéma optické soustavy mikroskopu F i extrémně vysoké ultrazvukové frekvence(ghz). V případě použití elektronového mikroskopu uvažujeme vlnovou délku tzv. de Broglieových vln. 8.4.1 Optická mikroskopie Základem optického mikroskopu jsou dvě soustavy čoček objektiv a okulár. Obě soustavy mají kladnou optickou mohutnost(v prvním přiblížení nahraditelné spojkami). Objektiv vytváří skutečný, zvětšený a převrácený obraz. Pozorovaný předmět musí být umístěn mezi předmětovým ohniskem objektivu a jeho dvojnásobnou vzdáleností. Mechanická část spojující objektiv s okulárem se nazývá tubus. Obraz vytvořený objektivem je pozorován okulárem, přičemž se musí nacházet těsně za předmětovým ohniskem okuláru. Výsledkem je zvětšený, převrácený a neskutečný obraz(obr.??). Kondenzor je optická soustava, zajišťující dokonalé osvětlení zorného pole mikroskopu. Soustřeďuje světelné paprsky do místa, kde se nachází pozorovaný objekt. Některé moderní, zejména fluorescenční mikroskopy mají v tubusu také čočku(mikroskopy s nekonečným optickým intervalem Infinity Corrected Optics). Celkovézvětšení Zmikroskopujedánosoučinemzvětšeníobjektivu Z obj aokuláru Z ok : Z = Z obj Z ok = d f obj f ok, (1) kde d je konvenční zraková vzdálenost(0, 25 m), optický interval mikrokopu čili vzdálenostmeziobrazovýmohniskemobjektivuapředmětovýmohniskemokuláru, f obj a f ok jsou příslušné ohniskové vzdálenosti. Vhodnou kombinací čoček či použitím velmi silných okulárů by bylo možno vytvořit mikroskop s prakticky neomezeným zvětšením. Toto zvětšení by však neumožňovalo rozlišit detaily(bylo by plané). Místo skutečných struktur by byly pozorovány ohybové jevy a artefakty způsobené optickými vadami. Zvětšení je prakticky omezeno rozlišovací
8. Mikroskopické metody 5/9 schopností mikroskopu. Z výpočtů vycházejících z interference světelných paprsků po průchodu strukturami zobrazovaného přemětu byla v 19. století Ernstem Karl Abbem odvozena rozlišovací mez mikroskopu: δ= λ nsin α, kde δ je mřížková konstanta(čili vzdálenost dvou vrypů mřížky, prakticky vzdálenost dvou ještě rozlišitelných bodů), λ je vlnová délka použitého světla, n je index lomu prostředí mezi čelem objektivu a krycím sklíčkem preparátu, α je úhel svíraný optickou osou mikroskopu a pláštěm kužele, v němž se nacházejí paprsky, které z daného místa preparátumohouvstoupitdoobjektivuapodíletsenazobrazení.výraz nsin αsenazývá numerická apertura objektivu(na). Paprsek, který vystupuje z preparátu pod úhlem α se na rozhraní mezi krycím sklíčkem a vzduchem láme od kolmice a nemůže se podílet na tvorbě obrazu. Při použití imerzního prostředí(immergere ponořit) v prostoru mezi čelem objektivu a krycím sklíčkem, které představuje kapalina o stejném indexu lomu, jako má krycí sklíčko, se zvětší úhel α a omezuje se možnost vzniku úplného odrazu světla na horní straně krycího sklíčka(přechod paprsků z prostředí opticky hustšího do opticky řidšího). Často se používá cedrový olej(n = 1, 52). Při vyšším zvětšení je potřeba vyvarovat se otvorých vad objektivu, také se objevují artefakty, které můžeme považovat za objekty. Otvorová vada(též kulová či sférická) je způsobena tím, že objektiv není tvořen dokonale tenkými čočkami. Navíc dochází ke značnému odchylování paprsku od optické osy.paprskyvíceodchýlenéodoptickéosyjsouivícelámány.bodovýpředmětjepak zobrazen jako úsečka. Barevná vada(též chromatická) je způsobena optickou disperzí, tj. závislost indexu lomu na vlnové délce světla. Bodový předmět je zobrazován na různá místa optické osy v závislosti na vlnové délce světla. Vady lze korigovat kombinacemi vhodných spojných či rozptylných čoček z různých materiálů o různém indexu lomu. Podle stupně korekce otvorové a barevné vady rozlišujeme zejména tyto objektivy: Achromáty korekce barevné vady(tj. objektiv má stejnou ohniskovou vzdálenost) pro dvě barvy spektra, obvykle červené a modrozelené. Otvorová vada je korigována pro světlo žluté. Semiapochromáty korekce barevné vady pro dvě barvy blíže k oběma koncům viditelného spektra. Apochromáty korekce barevné vady minimálně pro tři barvy spektra. Otvorová vada korigována pro dvě barvy. Nejdokonalejší objektivy pro pozorování v bílém světle. Planachromáty a planapochromáty korekce zklenutí zorného pole, které se jinak projevuje nemožností zaostřit rovinný objekt současně v zorném poli mikroskopu. Zvláštní význam pro mikrofotografii. Podle účelu jsou vyráběny také různé okuláry: Ortoskopické okuláry přesně stejné zvětšení v celém zorném poli, vhodné k měřícím účelům. Periplanatickéokuláry odstraňujíastigmatickouvadu 1 silnějizvětšujícíchobjektivů. 1 Astigmatismusjezpůsobennesouměrnostílámavýchploch.Řezsystémem,vníchžjeoptickámohutnostnejvětšíanejmenší,jsouvzájemněkolmé 2 anazývajísemeridiány.rozdíllomivostivobou hlavních řezech představuje tzv. astigmatický rozdíl. V jeho důsledku není ohnisko systému bodové, nýbrž má tvar dvou úseček(tzv. fokály) vzájemně kolmých a posunutých vůči sobě. Viz.[1, str. 184] (2)
8. Mikroskopické metody 6/9 Kompenzační okuláry odstraňují zbytkovou vadu chromatickou. Projektivy používány při mikrofotografii. Mikroskopy monokulární jsou tvořeny jediným okulárem. Binokulární mikroskopy majíokulárydva propravéalevéoko,omezujítakzrakovouúnavu.světelnýsvazek je v těchto mikroskopech rozdělen na dva pomocí hranolu zabudovaného v horní části tubusu. Při mikroskopii lze využít odraženého světla ze vzorku, kdy osvětlujeme vzorek ze shora. Při promítnutí paprsků zespoda pod určitým úhlem a odclonění paprků jdoucích podél osy mikroskopu lze pozorovat preparátem rozptýlené paprsky. Rozptýlené světlo se jeví jako světlé na temném pozadí pozorování v temném poli. Stereomikroskop využívá dva využívá dva samostatné objektivy a okuláry, tedy v podstatě dva mikroskopy, jejichž optické osy spolu svírají určitý úhel, např. 15. Stereoskopické vidění je důležité u operačního mikroskopu, který nesmí navíc snímat stranově převrácený obraz. Intenzivní světlo je přiváděno světlovody. Často je tento mikroskop vybaven možností plynulé změny ohniskové vzdálenosti objektivu čili zvětšení tzv. zoomem,takžepřizměnězvětšenínenítřebaznovazaostřovat. Mikrofotografie na klasický fotografický materiál je dnes nahrazena digitálním přenosem obrazu na monitor. Vedle klasických úprav digitalizovaného obrazu(změna kontrastu, jasu) rozšiřují možnosti mikroskopie numerické analýzy obrazu pomocí počítačů. 8.4.2 Speciální optické mikroskopy Fluorescenční mikroskop využívá schopnost některých látek emitovat viditelné světlo po ozáření světlem o kratší vlnové délce. Většinou se využívá dlouhovlnné UV záření a přilehlé oblasti viditelného spektra emitovaného halogenovými lampami. Optika kondenzoru musí být přizpůsobena požadavkům UV světla(křemenné sklo), přidány jsou také filtry chránící lidský zrak před zbytkovým UV zářením. Fluorescenci vykazují např. aminokyselina tryptofan i jiné látky s aromatickým jádrem či heterocyklem. Výhodné je přidat k preparátům speciální fluorescenční barviva(např. fluorochrom, fluorescenční sonda) schopná specifické interakce s různými buněčnými strukturami. Při navázání fluorescenčního barviva na protilátku specifickou pro některou z bílkovin přítomných v cytoplazmě lze selektivně zviditelnit např. složky cytoskeletu, chromatin, membránové bílkoviny, apod. Fázově kontrastní mikroskop Při průchodu světelné vlny fázovým objektem nesledujeme změnu intenzity, nýbrž posun její fáze, a to v závislosti na rozdílu indexu lomu danéstrukturyajejíhookolí,nadélceoptickédráhyinavlnovédélcesvětla.měnísetaké směr dalšího šíření vlny vlivem lomu, odrazu a rozptylu. Do přední ohniskové roviny kondenzoru je umístěna kruhová clona se zatemněným středem světlo prochází jen úzkým mezikružím. Paprsek projde vzorkem, dojde k odchýlení některých paprsků z původního směru(ohyb, rozptyl, lom). V zadní ohniskové rovině objektivu se nachází tzv. čtvrtvlnová destička(posunuje fázi o +π/2 nebo π/2). Tato destička má opět tvar mezikruží, na které dopadnou především ty paprsky, které nezměnily svůj směr při interakci s fázovými objekty. Ostatní paprsky čtvrtvlnovou destičku minou, nejsou tedy fázově posunuty. Interferencí paprsků fázově posunutých i neposunutých je vytvářen obraz. Pozitivní fázový kontrast fázově posunuty jsou paprsky se změněným směrem šíření, fázové objekty se jeví jako tmavší vůči svému pozadí. Negativně pozitivní kontrast nevychýlené paprsky jsou fázově posunuty, fázové objekty se jeví jako světlejší vůči svému pozadí.
8. Mikroskopické metody 7/9 Pomocí fázově kontrastnímu mikroskopu se lze vyhnout barvení pozorovaných objektů, což je často u běžného optického mikroskopu nutné. Přítomnost barviva by mohla pro živý systém znamenat zásadní změnu. Interferenčnímikroskop pracujesedvěmakoherentnímisvětelnýmisvazky 3,znichž jeden prochází pozorovaným objektem a druhý vedle něj. Interferencí těchto dvou oddělených paprsků vzniká obraz. Výhodou je možnost přímého měření indexu lomu. U mikroskopu s diferenčním interferenčním kontrastem podle Nomarského(zkratka DIC) preparátem prochází svazek polarizovaného světla, který je po průchodu objektivem rozštěpen na dva nepatrně vzájemně posunuté svazky pomocí dalšího polarizačního filtru(nastává dvojlom). Takto jsou vytvořeny i dva vzájemně nepatrně posunuté obrazy, navzájem kolmopolarizované.místa,kdeseplochyobrazůpřekrývají(srůznýmfázovým posunem), jsou vlivem interference zviditelněna změnou jasu(monochromatické) nebo barevným obrysem(polychromatické světlo). Velmi citlivé i na velmi malou změnu optické dráhy paprsků(optická dráha je součin indexu lomu a geometrické dráhy paprsku v daném prostředí). Polarizační mikroskop slouží ke zviditelnění opticky aktivní nebo dvojlom vykazující struktury.vznikajíspojenímkonvenčníhomikroskopuapolarimetru 4,např.některésložkyvcytoplazmě, nebo proudění cytoplazmy. Mikroskop ultrafialového světla musí mít optiku z křemenného skla(proputnost pro UV záření). Obraz nelze pozorovat okem, zviditelní se na luminiscenční stínítko. S ohledem na kratší vlnovou délku bychom očekávali vyšší rozlišovací schopnost, která se v praxi nedostavuje. Umožňuje přímo pozorovat struktury, které propouští viditelné světlo, ale UV pohlcují(dna, bílkoviny). Laserový řádkovací konfokální mikroskop (též laserový řádkovací či skenovací konfokální mikroskop) je většinou osvětlován shora, pracuje s odraženým světlem a fluorescenčním zářením. Světlo vychází z bodového zdroje(malý kruhový otvor ve cloně osvětlované laserovým světlem). Dále prochází polopropustným zrcadlem na čočku, která soustřeďuje paprsky do ohniska v preparátu. Paprsky odražené z tohoto ohniska procházejí stejnou čočkou zpět na polopropustné zrcadlo. Stejná čočka slouží jako objektiv i projektiv. Od polopropustného zrcadla se světlo nesoucí o preparátu odráží na bodový otvor v další cloně předsazené citlivému detektoru světla, obvykle fotonásobič. Optický systém je seřízen tak, že otvorem v této cloně 3 vlněníostejnéfrekvenci,stejnémsměrukmitání,astejnoufází. 4 Polarimetryměřístáčenírovinypolarizovanéhosvětlaoptickýmilátkamičijejichroztoky.Optickou aktivitu vykazují opticky anizotropní krystaly, mající v různých směrech definovaných vůči krystalografickým osám různý index lomu, či roztoky organických látek s chirální strukturou(např. obsahující asymetrický uhlík). Velikost úhlu stočení závisí na koncentraci a vlnové délce světla(optická rotační disperze). Vhodné je použít zdroje monochromatického světla, nebo monochromatických filtrů. Světlo ze zdroje dopadá na polarizátor(propouští jen lineárně polarizovanou složku), vyrobený např. z krystalu islandského vápence vybroušeného do podoby Nicolova, nebo Glanova Thompsonova hranolu. Levnější jsou polarizační filtry(polaroidy) z organických polymerů. Světlo postupuje přes kyvetu s opticky aktivní látkou do analyzátoru, který je obdobou polarizátoru. Analyzátorem lze otáčet a jeho poloha je indikována na stupnici polarimetru. Paprsky z analyzátoru jsou sledovány pomocí dalekohledu. U opticky neaktivní látky všechny paprsky procházejí a vstupují do dalekohledu(světlé zorné pole), pravě když jsou polarizační roviny polarizátoru a analyzátoru rovnoběžné. Jsou-li tyto dvě roviny na sebe kolmé, všechny paprsky jsou v analyzátoru absorbovány(zorné pole je tmavé). U opticky aktivní látky hledáme takovou polohu analyzátoru vůči polarizátoru, při níž je zorné pole dalekohledu osvíceno maximálně(nebo minimálně). v tomto stavu se odečítá úhel stočení. Polostínová metoda umožňuje sledovat rozhraní světlé a tmavé plochy namísto jedné plochy odpovídající maximu(minimu). Viz.[1, str. 246]
8. Mikroskopické metody 8/9 projdou pouze paprsky, které se odrazily od bodových struktur v zaostřené rovině. Všechny ostatní paprsky(rozptýlené preparátem nebo optickým systémem mikroskopu) jsou clony zachyceny. Právě tyto paprsky zhoršují kvalitu zobrazení v běžném mikrokopu, protože zvyšují jas a snižují kontrast v celém zorném poli. Konfokálním mikroskopem lze pozorovat i poměrně silné preparáty, včetně nativních. Řádkovací zařízení je systém otočných zrcadel, která mohou posunovat ohnisko po těsně vedle sebe umístěných řádcích. Konfokální mikroskop lze s výhodou upravit i pro fluorescenční mikroskopii. Preparát je osvětlen laserovým světlem o kratší vlnové délce a snímáno je fluorescenční zařazení o vlnové délce delší. Detektor je před budícím krátkovlnným světlem odstíněn vhodným barevným filtrem. Podobně je chráněn i zdroj před dopadem fluorescenčního záření. Tento mikroskop má oproti běžnému fluorescenčnímu mikroskopu lepší rozlišení, větší hloubku ostrosti a lze použít silnějších preparátů. COSMICFlyingSpot (COlourScanningMICroscope)jebarevnýřádkovacímikroskop sletícístopou.místomechanickéhořádkovacíhosystémujezdepoužitojasnébílésvětelné stopy přebíhající po řádcích na obrazovce osciloskopu. Obraz phybující se stopy je promítán na preparát, kterým světlo prochází na kolektorovou čočku. Poté je světelný svazek rozložen na třech odrazových barevných filtrech do tří barev(červená, zelená, modrá), které jsou samostatně digitalizovány a použity pro konstrukci obrazu na obrazovce počítače. Hlavní výhodou je jednak výborná rozlišovací schopnost, jednak pozoruhodný kontrast, kterého lze dosáhnout úpravou jasu zdrojové světelné stopy v závislosti na absorbanci preparátu. Optická skenovací mikroskopie v blízkém poli (near field optical scanning microscopy, NFOS). Velmi úzký světelný paprsek prochází po řádcích velmi tenkým preparátemajsouměřenyjehointenzity 5.Rozlišeníjedesetkrátažstokrátvětšínežuklasického světelného mikroskopu. Vzorky nemusí být ve vakuu(narozdíl od klasické elektronové mikroskopie), mohou být např. ve vodném roztoku, což je výhodné pro studium biologických objektů. Optická koherenční tomografie využívá ingračerveného světla o vlnové délce 1300 nm. Původoní svazek je rozdělen do dvou svazků. Jeden z nich se odráží od zrcadla umístěného v konstatní vzdálenosti od zdroje světla(svazek referenční). Druhý svazek je přiváděn optickým vláknem endoskopické sondy se zrcadlem do vyšetřované tkáně. Různá hloubka odrazu tohoto svazku vede k jeho různému fázovému posunu vůči svazku referenčnímu. Vyšší rozlišovací schopnost(10 µm) než vysokofrekvenční UV mikroskopické sondy, navíc nevyžaduje vazebné médium, takže může být oddělena od vyšetřovaného povrchu tkáně vzduchem. 8.4.3 Elektronová mikroskopie Elektronům lze přisoudit vlnovou délku, tzv. de Broglieovy hmotnostní vlny: λ= h mv (3) eu= 1 2 mv2, (4) kde λ je de Broglieova vlnová délka, h Planckova konstanta, m relativistická hmotnost elektronu, v jeho rychlost, e náboj elektronu, U urychlovací napětí mezi anodou a katodou zdroje elektronů. 5 Otvoremvkovovémobaluskleněnéhohrotu,kterýmáprůměr 5 10nm,procházíúzkýsvazekargonového laseru. Tenký řez preparátu se pohybuje nad otvorem, kontrola vzdálenosti preparátu se děje pomocí tunelového efektu. Detektor je umístěn nad preparátem.
8. Mikroskopické metody 9/9 Např.elektronoenergii1,5eVmávlnovoudélku1nm. Podobně jako u světelného mikroskopu, mají-li zobrazované předměty velikost srovnatelnou s vlnovou délkou, začne místo odrazu a lomu docházet k ohybovým jevům, které zobrazení znemožní. Vysokýmurychlenímelektronůlzedosáhnoutještěřádově 10 5 krátkratšíchvlnových délek. Rozlišovací schopnost mikroskopu vypočtená z rovnice(2) na straně 4 bude tedy malá. Současně však vlivem velkých optických vad použitých čoček je poměrně malá i numerickáapertura(na) řádově 10 2.Chodelektronovýchpaprskůlzeovlivňovatpouze čočkami elektrostatickými nebo magnetickými. V elektronových mikroskopech jsou použity téměř výhradně čočky magnetické. V praxi mají elektronové mikroskopy rozlišovací mez několik desetin nanometru, což odpovídá větším molekulám. Nelze používat čočky ze skla ani jiného materiálu(využívá se magnetické čočky). Skenovací tunelová elektronová mikroskopie ( scanning tunelling electron microscopy, STM), nad povrchem preparátu se pohybuje velmi ostrý kovový hrot, ke kterému jdou tunelovými jevy elektrony z povrchu preparátu. STM zobrazí elektronovou hustotu na povrchu s rozlišením na úrovni atomů. Není nutné vakuum, lze použít preparáty ve vodném prostředí. ATM atomic force microscopy, informace je získávána pomocí jehly, která kopíruje povrch vzorku. Rozlišení na úrovni molekul či atomů. Rastrovací elektronová mikroskopie SEM (též skenovací nebo řádkovací, Scanning Electron Microscope, SEM). Velmi úzký elektronový paprsek, vychylovacím systémem je nucen přejíždět povrch preparátu po řádcích. Dopadající elektrony se rozptylují do okolí, případně vyrážejí jiné elektrony z povrchu preparátu. V blízkosti preparátu detektor. Množstvíuvolněnýchelektronůzávisíinaúhludopadu.Lzetakzískat3D stínovaný obraz s velkou hloubkou ostrosti. RozlišenímenšínežuTEMojedenaždvařády,alemožnostsledovat3Dstrukturu. Stejně jako u TEM lze využít pokovování vzorku, fixační metody jsou poměrně náročné. TEM i SEM trpí artefakty vzniklými fixací a jinými úpravami vzorků. Při ozáření vzorků elektronovými svazky vzniká charakteristické rtg. záření, kterého lze využít pro chemickou analýzu vzorku. Výbava rentgenovými spektrometry u některých SEM. Transmisní elektronová mikroskopie TEM je založena na průchodu(transmisí) fokusovaného elektronového svazku zkoumaným objektem. Rozbíhavý svazek z elektronového děla, kondenzorovou čočkou je soustřeďován na ultratenký preparát. Dojde k absorpci a rozptylu části svazku, což se projeví útlumem. Výsledný skutečný obraz na luminiscenčním stínítku tvořen magnetickými čočkami objektivu a projektivu. Nutnost ultratenkých řezů preparátu, nutnost přípravy ve vakuu, často využito pokovování. Pozorování nativních preparátů je tak vyloučené, pokud se nevyužije tzv. enviromentální elektronový mikroskop, v nichž je preparát v prostředí o vysokém tlaku. Akustická mikroskopie Vlnová délka hyperzvuk o frekvenci např. 1,55 GHz při rychlosti šíření 1550 ms 1 činí 1 µm.jednásevětšinouořádkovacímikroskopy.metodaprůchodováa odrazová jsou krátce popsány v[1, str. 259].
8. Mikroskopické metody 10/9 Reference [1] I. Hrazdira, V. Mornstein. Lékařská biofyzika a přístrojová technika, první vydání, Neptun, Brno, 2001 [2] V. Ptáček. Přednášky PřF:Bi5800 Buněčná biologie, Masarykova univerzita, jarní semestr 2003 Poznámky Strukturu buňky, složení cytoplazmy a cytoskelet lze nalézt v[1, str. 115-122], zde napsaný text v podstatě kopíruje informace obsažené v knize, základní znalosti jsou doplněnyzpřednášek[2] 6. Mikroskopické metody byly zpracovány z knihy[1, str. 249-259], opět zde podaný text v podstatě kopíruje informace obsažené v knize, knížka prof. Hrazdiry a prof. Mornsteina bude pro naučení otázky pravděpodobně stačit. 6 Vzhledemktomu,ževknize[1]jedleméhonázorudostatekpodkladůatextzpřednášekprof.Ptáčka doplňuje spíše středoškolské znalosti problematiky, k otázce bude bohatě stačit knížka prof. Hrazdiry a prof. Mornsteina.