Masarykova univerzita IMUNOHEMATOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ PROTILÁTEK PROTI ERYTROCYTŮM

Masarykova univerzita Lékařská fakulta IMUNOHEMATOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ PROTILÁTEK PROTI ERYTROCYTŮM Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: Autor: MUDr. Alena Vlachová Jana Fabešová Brno, duben 2012

Jméno a příjmení autora: Jana Fabešová Název bakalářské práce: Imunohematologické vyšetření protilátek proti erytrocytům Pracoviště: Transfuzní oddělení Fakultní nemocnice Královské Vinohrady, Praha Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Alena Vlachová Rok obhajoby bakalářské práce: 2012 Souhrn: Vyšetření protilátek proti erytrocytům tvoří základ práce v imunohematologických laboratořích. Protilátky jsou vyšetřovány při předtransfuzním vyšetření, u gravidních žen, u osob s hematologickými chorobami, u potransfuzních reakcí a u dárců krve. V první části mé práce se zaměřuji na teoretické poznatky, na základní imunohematologické pojmy, na vztahy mezi antigenem a protilátkou. V další části podávám přehled hlavních skupinových systémů na erytrocytech člověka a možných protilátek. V praktické části se zabývám jednotlivými laboratorními postupy vyšetření protilátek na svém pracovišti Transfuzním oddělení Fakultní nemocnice Královské Vinohrady v Praze, s přihlédnutím k nejnovějším poznatkům a doporučením Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP. V experimentální části své práce uvádím statistický přehled vyšetření protilátek proti erytrocytům v imunohematologické laboratoři TO FNKV za celý rok 2011 a vyhodnocuji výsledky vyšetření protilátek vzhledem k teoretickým poznatkům. Na konci práce popisuji tři zajímavé kazuistiky vyšetření protilátek. Klíčová slova: protilátka, antigen, screening, NAT, enzym, erytrocyty Souhlasím, aby má práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Vlachové Aleny a v seznamu literatury uvedla všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne: 20.4.2012

Touto cestou bych velmi ráda poděkovala vedoucí mé práce MUDr. Aleně Vlachové za její velkou pomoc, cenné rady, ochotu a čas při zpracování dané problematiky. Rovněž děkuji MUDr. Renatě Brudňákové za ochotu při vyhledávání zajímavých kazuistik. Taktéž děkuji svému příteli za velkou trpělivost.

Seznam symbolů a zkratek: AIHA autoimunní hemolytická anémie AK autokontrola APC buňka předkládající antigen (antigen presenting cell) BCR receptor lymfocytů B pro antigen (B cell receptor) ČLS JEP Česká lékařská společnost Jana Evangelisty Purkyně Fab variabilní oblast lehkých a těžkých řetězců Ig Fc konstantní oblast těžkého řetězce Ig HLA hlavní lidský (histokompatibilní) antigen (human leukocyte antigen) HON hemolytické onemocnění novorozence Ig imunoglobulin kda kilodalton jednotka molekulové hmotnosti KS krevní skupina LIS laboratorní informační systém LISS roztok o nízké iontové síle (Low Ionic Salt Solution) min minuta NAT nepřímý antiglobulinový test NK lymfocyty přirozený zabíječ (natural killers) NRL Národní referenční laboratoř ot/min počet otáček za minutu při centrifugaci PAT přímý antiglobulinový test PEG polyethylenglykol PN pracovní návod SA sloupcová aglutinace SOP standardní operační postup TCR receptor lymfocytů T pro antigen (T cell receptor) Th pomocný T lymfocyt (helper T cell) TO FNKV Transfuzní oddělení Fakultní nemocnice Královské Vinohrady ÚPMD Ústav pro péči o matku a dítě

Obsah 1 Úvod...8 2 Teoretická část...9 2.1 Základní imunohematologické pojmy...9 2.1.1 Antigen...9 2.1.2 Hapten...9 2.1.3 Protilátky...10 2.1.3.1 Chemická struktura...10 2.1.3.2 Tvorba protilátek...11 2.1.3.3 Rozdělení protilátek...12 2.1.3.4 Třídy imunoglobulinů...13 2.1.3.5 Kinetika protilátky...15 2.1.4 Komplement...15 2.2 Reakce antigen protilátka...16 2.2.1 Aglutinace...16 2.2.1.1 První fáze...17 2.2.1.2 Druhá fáze...17 2.2.2 Precipitace...19 2.2.2.1 Imunodifuze...19 2.2.2.2 Imunoelektroforéza...19 2.2.3 Hemolýza...20 2.2.4 Inhibice hemaglutinace...20 2.2.5 ELISA...20 2.3 Skupinové systémy erytrocytů...20 2.3.1 AB0 systém...20 2.3.1.1 Geny systému AB0...21 2.3.1.2 Antigeny systému AB0...22 2.3.1.3 Protilátky systému AB0...23 2.3.1.4 Vylučovatelství...24 2.3.1.5 Význam AB0 systému pro transfuzi...24 2.3.2 Rh systém...25 2.3.2.1 Geny Rh systému...26 2.3.2.2 Antigeny Rh systému...26 2.3.2.3 Protilátky Rh systému...29 2.3.2.4 Význam Rh systému pro transfuzi...30 2.3.3 Kell systém...31 2.3.3.1 Geny Kell systému...31 2.3.3.2 Antigeny Kell systému...32 2.3.3.3 Protilátky Kell systému...32 2.3.3.4 Význam antigenů Kell systému pro transfuzi...32 2.3.4 Lewis systém...33 2.3.4.1 Geny Lewis systému...33 2.3.4.2 Antigeny Lewis systému...33 2.3.4.3 Protilátky Lewis systému...33 2.3.4.4 Význam antigenů Lewis systému pro transfuzi...34 2.3.5 Kidd systém...34 2.3.6 Duffy systém...35 2.3.7 Lutheran systém...35

2.3.8 MNSs systém...36 2.3.9 P systém...36 2.3.10 Ii systém...37 2.3.11 Ostatní skupinové systémy...38 2.3.11.1 Xg systém...38 2.3.11.2 Sid systém...38 2.3.11.3 Cartwrith systém...39 2.3.11.4 Colton systém...39 2.3.11.5 Dombrock systém...39 2.3.11.6 Diego systém...39 2.3.11.7 Scianna systém...40 2.3.11.8 Antigeny Chido a Rodgers...40 2.3.12 Antigeny s vysokou frekvencí výskytu...40 2.3.13 Antigeny s nízkou frekvencí výskytu...40 3 Praktická část...41 3.1 Vyšetření aglutininů anti A, anti B...43 3.1.1 Vyšetření aglutininů metodou SA v systému DG Gel Grifols...43 3.1.2 Vyšetření aglutininů zkumavkovou metodou...44 3.1.3 Vyšetření aglutininů na mikrodeskách...44 3.2 Vyšetření volných imunních protilátek u novorozence metodou SA...44 3.3 Screening nepravidelných protilátek...45 3.3.1 Vzorky, reagencie, techniky...45 3.3.2 Techniky testů...46 3.3.3 Aplikace testů na TO FNKV...47 3.3.3.1 NAT a enzymatický test v systému Biorad...47 3.3.3.2 NAT a enzymatický test v systému DG Gel Grifols...48 3.3.3.3 Solný a enzymatický test ve zkumavce s krvinkami Biorad...48 3.3.3.4 NAT ve zkumavce...48 3.3.3.5 Chladové protilátky v systému DG Gel Grifols a Biorad...49 3.4 Identifikace specifických protilátek...49 3.4.1 Identifikace v systému DG Gel Grifols...51 3.4.2 Identifikace v systému Biorad...52 3.4.3 Vyšetření antigenů na erytrocytech...53 3.5 Titrace specifických protilátek...53 3.5.1 Titrace v systému DG Gel Grifols a Biorad...54 3.5.2 Titrace chladových protilátek...55 3.6 Vysycování séra...55 3.7 Absorpce a eluce protilátek...57 3.7.1 Absorpce...58 3.7.2 Eluce klasicky...58 3.7.3 Eluce pomocí diagnostické soupravy Gamma ELU KIT II...59 4 Experimentální data...60 4.1 Statistické údaje...60 4.2 Kazuistiky...65 4.2.1 Kazuistika 1...65 4.2.2 Kazuistika 2...65 4.2.3 Kazuistika 3...66 5 Závěr...67 6 Použitá literatura a odborné zdroje...69

1 Úvod Cílem mé práce je snaha podat ucelený přehled imunohematologické problematiky jak z teoretického tak z praktického hlediska. Dané téma popisuji vzhledem k nejnovějším poznatkům a doporučením Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP. Jedním z cílů mé práce je dokázat, že výsledky vyšetření identifikace nepravidelných protilátek v praxi, tedy na mém pracovišti, odpovídají současným poznatkům, které budu popisovat v teoretické části. Vyšetření protilátek proti erytrocytům patří mezi základní vyšetření v imunohematologických laboratořích. Výsledky vyšetření protilátek jsou důležité napříč medicínskými obory, např. všude tam, kde je potřeba transfuze krve, v prenatálních poradnách gravidních žen, u dárců krve a u hematologických pacientů, např. s diagnózou AIHA. Protilátky se vyšetřují u pacientů před transfuzí erytrocytárních přípravků se záměrem odhalit, zda pacient nemá protilátku, která by mohla vyvolat potransfuzní reakci, pokud by pacient dostal krev s antigenem, proti kterému je tato protilátka namířena. Pokud je základní vyšetření, tzv. screening protilátek pozitivní, je třeba zjistit, o jaký typ protilátky se jedná. U těhotných žen je velmi důležité vyšetřit, zda nemají specifickou protilátku, a tak minimalizovat možnost poškození plodu. Pokud je zjištěn typ protilátky, provede se titrace a zhodnocuje se riziko hemolytického onemocnění novorozence. Gravidní žena se dle významnosti zjištěné protilátky, ve spolupráci s gynekologem, předává na specializované pracoviště. U hematologických pacientů s diagnozou AIHA se protilátky vyšetřují s cílem odhalit, o jakou autoprotilátku se jedná, zda o tepelnou čí chladovou. V případě potřeby transfuze krve je nutné autoprotilátku tzv. vysytit, tzn. navázat ji na vhodné (buď vlastní, nebo dárcovské) enzymem opracované erytrocyty, a poté vyšetřit, zda pacient nemá aloprotilátku. U dárců krve je nutné protilátky vyšetřit, aby nedošlo k eventuálním potransfuzním reakcím u příjemců transfuzních přípravků obsahujících plazmu. V první části mé práce se zabývám teoretickými poznatky z oboru imunohematologie. Popisuji základní pojmy a vztahy mezi nimi. V další části poskytuji přehled nejdůležitějších skupinových systémů na erytrocytech a možných protilátek. V praktické části se zabývám jednotlivými metodami vyšetření protilátek. Ve statistickém souboru na konci práce sumarizuji rok 2011 z pohledu vyšetření protilátek v imunohematologické laboratoři TO FNKV. Ke konci praktické části popisuji tři zajímavé případy z hlediska vyšetření protilátek. V závěru hodnotím statistické výsledky vzhledem k popisovaným teoretickým poznatkům. 8

2 Teoretická část 2.1 Základní imunohematologické pojmy 2.1.1 Antigen V imunohematologii jsou hlavní krevně skupinové antigeny nazývány aglutinogeny. Z chemického hlediska je to složitá organická makromolekula, která je schopna vyvolat imunitní odpověď. Mezi antigeny patří různé chemické struktury, nejčastěji proteiny (glykoproteiny), lipidy (fosfolipidy, glykolipidy) a ze sacharidů polysacharidy. Aby byla vyvolána imunitní odpověď, musí být antigen buď rozpustný v tělních tekutinách, nebo se nacházet na povrchu buněk. Rovněž musí být pro organismus cizí a mít určitou velikost. Určité části molekuly antigenu jsou antigennější než jiné části téže molekuly. Tyto oblasti vyvolávají tvorbu specifických protilátek a nazývají se antigenními determinantami (Smetana a kol.,1992). Antigeny krevních skupin se nachází na povrchu buněčné membrány a mají zde různé funkce: transportní kanály pro vodu, močovinu, ionty, regulace systému komplementu, enzymatická aktivita, receptory pro bakterie a viry, jsou nutné pro udržení morfologických vlastností erytrocytů. Na erytrocytech vznikají antigeny krevních skupin během ontogeneze: přibližně po 5. týdnu antigeny AB0, po 8. týdnu antigeny Rh systému (Tesařová a kol., 2008). 2.1.2 Hapten Pokud antigen nemá dostatečnou velikost, sice se může s protilátkou vázat, ale nevyvolá její tvorbu. Takovýto antigen se nazývá hapten. Může se stát plnohodnotným antigenem pouze po vazbě na větší molekulu, tzv. nosič. 9

2.1.3 Protilátky V imunohematologii jsou přirozené protilátky (anti A, anti B) nazývány aglutininy. Protilátky jsou tvořeny organismem v imunitní reakci na antigen. Vlivem působení protilátek dochází k neutralizaci, opsonizaci a aktivaci komplementu. Neutralizace znamená blokování aktivity toxinů, virů a dalších mikroorganismů a to tak, že se protilátka váže na ty epitopy, které jsou odpovědné za toxické účinky, vniknutí mikroorganismů do buněk, či jejich přilnutí k buňkám. To, že se protilátky váží, tzv. opsonizují, na povrch mikroorganismů a antigenů, umožňuje a zkvalitňuje jejich pohlcení fagocyty a atakování NK lymfocyty. Aktivace komplementu klasickou cestou je způsobena vazbou protilátky na antigen. To přispívá k opsonizaci, chemotaxi fagocytů a rozvoji zánětlivé reakce a u citlivých mikroorganismů může docházet až k osmotické lýze membranolytickým komplexem komplementu (Hořejší, Bartůňková, 2005). 2.1.3.1 Chemická struktura Protilátky jsou glykoproteiny a nachází se volně v séru, lymfě nebo na povrchu B lymfocytů. S antigenem se váží pomocí slabých nekovalentních vazeb. Při elektroforéze se pohybují v gamaglobulinové frakci. Protože souvisí s imunitní reakcí, jsou nazývány imunoglobuliny. Termín imunoglobulin = širší pojem pro protilátku bez specifity. Termín protilátka = specifický imunoglobulin pro určitý antigen. Každá molekula protilátky se skládá ze čtyř bílkovinných řetězců vzájemně spojených disulfidickými vazbami. Dva a dva jsou stejné. Jeden pár má označení H, nazývají se těžké, mají delší řetězec a větší hmotnost. Další dva jsou lehké, označují se L, mají kratší řetězec a menší hmotnost. Jsou uspořádány do písmene Y (obr. 1). Těžké a lehké řetězce se člení na podjednotky domény. Lehké řetězce vytváří jednu variabilní a jednu konstantní doménu. Těžké řetězce vytváří jednu variabilní a tři nebo čtyři konstantní domény. Na rozvětvenou neboli variabilní část, zvané Fab, se váže antigen svou antigenní determinantou. Je tvořena fragmenty lehkých a těžkých řetězců. Sekvence aminokyselin určuje, který antigen se zde bude vázat. Koncová část se označuje jako konstantní oblast Fc. Je tvořena těžkými řetězci a váže se na buňky, mající pro ni receptor (buňky tkání, imunitního systému, komplementu). 10

Dle uspořádání aminokyselin se řetězce dělí na izotypy. Lehké řetězce jsou kappa a lambda, těžké řetězce alpha, delta, epsilon, gamma a mí. Řetězce se vzájemně kombinují. Oblast spojení těžkých řetězců disulfidickými můstky je nazývána pantová (otočná) a je citlivá k působení enzymů. V této části dochází ke štěpení protilátek (obr. 2). Papain ji štěpí na 3 fragmenty dva Fab fragmenty a jeden Fc fragment. Pepsin oproti tomu štěpí protilátku na 2 fragmenty dva spojené fragmenty Fab a torzo Fc části. Tato protilátka nemá biologické vlastnosti, protože jí chybí Fc část. Části imunoglobulinových molekul, lišící se strukturou vazebných míst ve variabilní části, se nazývají idiotopy. Identické imunoglobulinové molekuly se vyznačují určitým společným idiotypem (souhrn idiotopů) (Hořejší, Bartůňková, 2005). Typy protilátek s geneticky daným odlišným uspořádáním v Fc oblasti těžkého řetězce se nazývají allotypy. Obr. 1: Struktura imunoglobulinu Obr. 2: Štěpení protilátek 2.1.3.2 Tvorba protilátek Tvorba protilátek patří do specifické, humorální imunity. Protilátky jsou tvořeny organismem v imunitní reakci na antigen. Na povrchu B lymfocytů jsou antigenně specifické receptory pro antigen BCR. Komplex BCR se skládá z vlastního povrchového imunoglobulinu (rozeznává antigen) a asociovaných signalizačních molekul (Hořejší, Bartůňková, 2005). Po vazbě antigenu na BCR receptor dojde ke stimulaci B lymfocytu. Antigen je pohlcen APC buňkou, např. 11

dendritickou buňkou a dojde k vystavení jeho peptidových fragmentů na molekulách HLA II. třídy. Tímto je aktivován T lymfocyt, který má na svém povrchu TCR receptor. Úplná aktivace lymfocytu vyžaduje ještě další kostimulační a signalizační molekuly. Prezentace antigenu Th prekurzorům vede ke tvorbě klonů antigenně specifických Th 2 buněk. Tyto rozeznají B lymfocyty, které jsou antigenně stimulované a poskytují jim signály (cytokiny), které způsobí pomnožení a diferenciaci na plazmatické buňky, které jsou konečným stádiem B lymfocytů a produkují protilátky. 2.1.3.3 Rozdělení protilátek a) dle původu lidské zvířecí (xenoséra) rostlinné (lektiny) rostlinné protilátky, sérologickými vlastnostmi se podobají živočišným antisérům monoklonální tyto protilátky jsou produktem jednoho klonu plazmatických buněk, jsou jednoho izotopu a mají jednu specifitu. In vivo vznikají monoklonální protilátky při plazmocytomu (myelomu). In vitro je možno tyto protilátky získat izolací klonů B lymfocytů, které produkují požadovaný typ protilátky. B lymfocyty žijí krátkou dobu, proto fúzují s myelomovými buňkami, které žijí neomezeně v tkáňové kultuře. Toto spojení se nazývá hybridom. Hybridní buňka roste v tkáňové kultuře a produkuje stejné protilátky jako původní B lymfocyt. b) dle specifity specifické reagují obvykle s jedním antigenem nespecifické (polyspecifické) reagují se všemi či většinou antigenů c) dle způsobu vzniku přirozené pravidelné vznikají přirozeně, bez setkání organismu s antigeny erytrocytů, např. anti A, anti B přirozené nepravidelné vznikají u lidí, kterým chybí odpovídající antigen, např. anti H, anti P1, anti A1 imunní vznikají při těhotenství, transfuzi, transplantaci autoprotilátky proti vlastním antigenům; mnoho autoprotilátek nezpůsobuje žádné 12

klinické problémy, ale např. u autoimunní hemolytické anémie způsobují zkrácené přežívání erytrocytů; rozlišujeme AIHA s tepelnými protilátkami, AIHA s chladovými protilátkami a AIHA smíšeného typu, kdy se vyskytují současně chladové i tepelné autoprotilátky d) dle sérologické reakce kompletní takové protilátky, které krvinky aglutinují přímo, většinou třídy IgM inkompletní většinou třídy IgG nebo IgA, k aglutinaci je třeba jim pomoci. Jako pomocný prostředek se využívá snížení množství elektrolytů (např. NaCl) nebo zvýšení množství bílkovin (např. hovězí albumin), popř. umělých koloidů (např. dextran) v prostředí, ve kterém jsou krvinky resuspendovány. Jiným způsobem snižování negativního náboje krvinek, a tím přibližování krvinek je enzymové natrávení povrchu krvinek. Za přispění pomocné cesty se inkompletními protilátkami dá dosáhnout stejně silné aglutinace jako protilátkami kompletními (Hrubiško a kol., 1983). K průkazu inkompletních protilátek se také využívá protilátek proti lidským sérovým globulinům, tzv. AGH séra (serum antiglobulinum humanum), která reagují s protilátkami navázanými na krvinkách, a proto je shlukují. AGH sérum zavedl do praxe Coombs, je tedy nazýváno Coombsovo sérum a vyšetřovací testy Coombsovy antiglobulinové testy. Pro průkaz protilátek navázaných na krvinky in vivo slouží přímý antiglobulinový test (PAT) a pro průkaz protilátek navázaných na krvinky in vitro slouží nepřímý antiglobulinový test (NAT). lysiny po navázání na antigen váží na sebe komplement, aktivují ho a vyvolávají hemolýzu krvinek e) dle optimální teploty při reakci chladové teplota reakce 4 C tepelné teplota reakce 37 C pokojové teplota reakce 20 24 C 2.1.3.4 Třídy imunoglobulinů Podle typu těžkého řetězce rozlišujeme IgA (alpha), IgM (mí), IgG (gama), IgD (delta), IgE (epsilon). Z lehkých řetězců převažují řetězce kappa nad lambda, v poměru 3 : 2. 13

Základní jednotkou je monomer 2 těžké a 2 lehké řetězce. Molekuly některých tříd imunoglobulinů (IgM, IgA) se skládají z několika základních jednotek, které jsou spojeny strukturně zcela odlišným řetězcem zvaným J (Hořejší, Bartůňková, 2005). a) IgM První typ imunoglobulinu, který tvoří zralý imunitní systém a je vytvářen na začátku primární imunitní odpovědi. Celkové množství v intravaskulárním poolu je 10 %. Molekulová hmotnost je 900 kda, neproniká tedy placentou ani do tkání. Vyskytuje se jako pentamer spojený J řetězcem. Jako pentamer má 10 vazebných míst, ale pokud mají vazebná místa nízkou afinitu k antigenům, váže pouze 5 antigenů. IgM po navázání na antigen dobře váže komplement a aktivuje ho klasickou cestou. Je to kompletní protilátka, tzn., že krvinky aglutinuje přímo, protože maximální rozpětí jejich Fab zakončení je až 35 nm a krvinky resuspendovány ve fyziologickém roztoku jsou od sebe vzdáleny 20 30 nm, tudíž je tento imunoglobulin překlene. Mezi IgM patří přirozené protilátky anti A, anti B a chladové protilátky. b) IgG Tento imunoglobulin je typický při sekundární imunitní odpovědi. Tvoří 70 75 % celkových imunoglobulinů. Vyskytuje se intravaskulárně i extravaskulárně. Molekulová hmotnost je 155 kda, proniká tedy placentou. Vyskytuje se jako monomer a má 2 vazebná místa pro antigen. IgG molekuly je možné rozdělit na podtřídy IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Ty se liší pořadím aminokyselin H řetězce. Jejich rozdíly vedou k odlišným sérologickým vlastnostem protilátek: např. IgG1 a IgG3 dobře váže komplement, IgG2 nedostatečně, IgG4 vůbec ne (Tesařová a kol., 2005). Je to inkompletní protilátka, k viditelné aglutinaci potřebuje pomocné prostředky (viz kapitola 2.1.3.3., bod d), protože svými Fab zakončeními je schopna překlenout vzdálenost pouze 14 18 nm. c) IgA Je dalším typem imunoglobulinu vznikající v průběhu imunizace. Tvoří 15 20 % celkových imunoglobulinů. Molekulová hmotnost je 160 1000 kda a vyskytuje se ve dvou formách sérové a slizniční, kde tvoří ochranu před mikroorganismy. Slizniční IgA je ve formě dimeru spojené J řetězcem. Sérový může být jako monomer, dimer i trimer. Není to aglutinin, neváže komplement, ale působí jako opsonin. 14

d) IgD Koncentrace v séru je nízká, okolo 1 %, jeho molekulová hmotnost je 180 kda. Ve formě monomeru se vyskytuje jako povrchový imunoglobulin na B lymfocytech, kde má funkci receptoru pro antigen. Přesná biologická funkce stále není známa. e) IgE Koncentrace v séru je pod 1 % a molekulová hmotnost je 190 kda. Uplatňuje se především v obranných reakcích proti mnohobuněčným parazitům na sliznicích a je hlavní příčinou alergických (atopických) reakcí. Vysokoafinitní receptory pro IgE se nacházejí na povrchu žírných buněk a bazofilů (Hořejší, Bartůňková, 2005). 2.1.3.5 Kinetika protilátky Kolem 4. dne po expozici antigenem dochází k primární imunitní odpovědi. Z B lymfocytů se vytváří plazmatické buňky, které produkují protilátku IgM. Maximálního titru dosahuje 7. až 10. den, poté se snižuje. Kromě plazmatických buněk vznikají i paměťové buňky, které jsou zodpovědné za sekundární imunitní odpověď. Při ní se, po opakovaném styku s antigenem, zvyšuje produkce protilátky až tisíckrát. Jsou už specifické a typu IgG. 2.1.4 Komplement V imunohematologii je velmi důležitý, je vázán protilátkami IgG, IgM a jeho působením dochází k lýze buněk, tedy i erytrocytů. Protilátky IgA, IgD, IgE jej neváží. Je to komplex asi 30 sérových a membránových proteinů, hlavními složkami je 9 proteinů označovaných C1 C9, z toho nejdůležitější je C3 složka a enzym C3 konvertáza. Vyskytují se běžně v séru v inaktivní formě a za vhodných podmínek se aktivují a rozbíhá se enzymatická kaskádovitá reakce, kdy jednotlivé meziprodukty reakce aktivují další složky. Existují dvě cesty aktivace komplementu klasická a alternativní. Klasická cesta začíná vazbou C1 složky na komplex antigen protilátka. Tato cesta vyžaduje přítomnost složek C4 a C2, jejichž fragmenty vytvoří klasickou C3 konvertázu. Druhá cesta aktivace alternativní, tyto složky nevyžaduje, protože v séru je C3 proaktivátor (beta globulin), který reaguje s C3b, jenž je produkován neustále. Reakcí těchto a dalších pomocných složek vzniká C3 konvertáza, která štěpí další molekuly C3 na C3a C3b a spouští se kaskádovitá reakce, jejímž důsledkem je terminální produkt soubor proteinů C5b, C6, C7, 15

C8, C9 (membranolytický komplex). Tento komplex perforuje membrány a dochází k osmotické lýze buněk. Meziprodukty enzymatického štěpení se účastní celé řady pochodů opsonizace, chemotaxe a aktivace B lymfocytů. Štěpení C3 je spontánním dějem a mohlo by tedy docházet k poškozovaní nejen cizorodých částic, ale i vlastních buněk. V organismu proto existují regulační mechanismy, tzv. inhibitory, které brání rozvoji kaskády samovolných reakcí. In vitro je možné aktivitu komplementu, který je nežádoucí při imunohematologických vyšetřeních, inaktivovat. Inaktivace se provádí zahříváním séra na 56 C, stáním nebo přidáním citrátu sodného ke vzorku krve. 2.2 Reakce antigen protilátka Protilátka a antigen se spolu váží slabými a nekovalentními vazbami, mezi ně patří vazby vodíkové, van der Waalsovy, hydrofobní a iontové. Vytvořený imunokomplex je reverzibilní. Na povrchu červených krvinek je negativní náboj, tzv. zeta potenciál, ten způsobuje, že se erytrocyty vzájemně odpuzují Afinita vyjadřuje sílu interakce mezi jedním vazebným místem protilátky a jedním epitopem antigenu. Je přímo úměrná specifitě protilátky. Avidita vyjadřuje sílu interakce mezi polyvalentní protilátkou a polyvalentním antigenem. Čím větší afinita, tím větší avidita. Desetivalentní molekuly IgM se váží na antigen s velkou aviditou, ale afinita jednotlivých vazebných míst k epitopům je nízká. Imunohematologické sérologické testy používané na vyšetření komplexů antigen protilátka jsou aglutinace, testy na průkaz hemolyzinů, inhibice aglutinace, méně často precipitace a ELISA. 2.2.1 Aglutinace Tvoří základ imunohematologických vyšetření. Jsou používány při vyšetření krevních skupin, erytrocytárních antigenů, protilátek a předtransfuzních vyšetření. Aglutinace je shlukování krvinek v izotonickém roztoku NaCl, při reakci se vytváří prostorová mřížka, v níž jsou erytrocyty, nesoucí na svém povrchu příslušný antigen, spojovány se dvěma a více vazebnými místy protilátek. Erytrocyty nesou ve své membráně velký počet receptorů a aglutináty vznikají snadno. Aglutinační reakce má dvě fáze. 16

2.2.1.1 První fáze Dochází k navázání protilátky na erytrocyt = senzibilizace. Tato část reakce je rychlá, reverzibilní, neviditelná a je ovlivněna různými faktory. a) Poměr koncentrací antigenu a protilátky Při nadbytku protilátky dochází k falešně negativním reakcím, všechny antigenní determinanty jsou obsazené = fenomén prozóny. Tomuto je možné předejít ředěním séra a optimálním poměrem antigenu a protilátky. b) Teplota IgM protilátky optimálně reagují při teplotě od 4 27 C. IgG protilátky při teplotě od 30 37 C. Jako klinicky významné se berou protilátky reagující při 37 C. c) ph 6,5 7 d) Čas Doba inkubace je čas potřebný k dosažení rovnováhy pro různé protilátky, závisí na třídě imunoglobulinu a schopnosti jeho připojení ke specifickému antigenu (Tesařová, 2008). 25 % protilátky se naváže na antigen v prvních 15 minutách a zbytek se naváže do 1 hodiny. e) Koncentrace NaCl Snížením koncentrace NaCl dochází ke snížení odpudivých sil mezi antigenem a protilátkou a dochází ke zlepšení vazby protilátky. 2.2.1.2 Druhá fáze Je pomalejší než první fáze. Protilátky spojují antigenní receptory a dochází k vytvoření agregátu erytrocytů viditelná fáze. V suspenzi fyziologického roztoku se mezi krvinkami, díky elektrostaticky negativně nabitým antigenům, vytváří prostory cca 20 30 nm. Díky nim nedochází ke shlukování krvinek. Při reakci antigen protilátka in vitro je třeba tento prostor překlenout. Toto není problém, pokud se jedná o kompletní protilátku IgM, která 17

má rozpětí svých Fab 35 nm. Inkompletní protilátky IgG nebo IgA, mající rozpětí 14 18 nm, se sice naváží na antigen, ale nevzniká viditelná reakce. Reakci je třeba pomoci : a) Proteolytickými enzymy Papain, bromelin a ficin se přidávají do reakce za účelem odstranění kyseliny sialové z povrchu erytrocytů kvůli snížení zeta potenciálu, a tedy zrušení negativního náboje, čímž je umožněno jejich větší vzájemné přiblížení. Erytrocyty, ošetřené enzymem, jsou také více aglutinabilní pro IgG molekuly. Při použití enzymu spočívá zvýšené riziko v poškození některých antigenů M, N, S, s, Lua a Duffy. b) AGH sérem Antiglobulinum humanum = protilátka proti lidské protilátce. Detekují se inkompletní protilátky navázané na erytrocytech. Séra AGH jsou polyspecifická nebo monospecifická. Polyspecifická jsou směsí protilátek proti IgG a komplementu, monospecifická séra obsahují protilátky proti určitému imunoglobulinu nebo složce komplementu. c) Centrifugací Přispívá k vzájemnému přibližování krvinek a pevnější vazbě, zároveň urychluje reakci. d) Snížením negativního náboje krvinek Snížení se dosáhne pomocí zvýšeného množství bílkovin, umělých koloidů, např. dextranu. e) Roztokem LISS Roztok o nízké iontové síle, který zkracuje inkubační dobu, snižuje iontovou sílu prostředí a zvyšuje počet spojení protilátek. Protilátky o nízkém titru jsou v prostředí LISS lépe detekovány. f) Přidáním PEG polyethylenglykol Jeho působením jsou z okolí erytrocytu odstraňovány molekuly vody a tím se lépe váží protilátky. 18

g) Chemickou modifikací IgG molekuly Po úpravě disulfidických vazeb v pantové oblasti protilátky, reaguje IgG v solném prostředí přímo. h) Pozitivně nabitými molekulami Pozitivně nabité molekuly neutralizují negativní náboj na krvinkách a uvolňují molekuly vody a tím usnadňují aglutinaci. 2.2.2 Precipitace Na rozdíl od aglutinace je při precipitaci antigen rozpustný a protilátky jsou namířeny proti bílkovinám nebo jiným rozpustným antigenům. Dochází k vytvoření nerozpustného precipitátu. Ve zkumavce je vidět jako sediment a na agaru jako interakční linie. Při reakci je nutné dodržet podmínky jako při aglutinaci, tzn. teplotu, ph, iontovou sílu, poměr koncentrací. Je žádoucí dosáhnout bodu ekvivalence, stavu, kdy je optimální poměr antigenu a protilátky, precipitát se pak tvoří nejrychleji. Precipitace je základem metod imunodifuze a imunoelektroforézy. V imunohematologii nachází precipitace využití při zjišťování skupinových vlastností A a B v různých tělních tekutinách, např. ve slinách sekretorů. 2.2.2.1 Imunodifuze Je založena na difuzi látek v prostředí koncentračního gradientu. Antigeny a protilátky difundují agarovým nebo agarozovým gelem a v místě, kde dosáne koncentrace antigenu a protilátky optimálního poměru, dojde k vytvoření precipitační linie. 2.2.2.2 Imunoelektroforéza Jedná se o kombinaci dvou metod. Nejdříve se provede elektroforéza séra, poté se do agarozového gelu vyřízne žlábek, naplní se antisérem proti hledanému antigenu a nechá se proběhnout imunodifuze. Důsledkem je vytvoření precipitační linie. 19

2.2.3 Hemolýza Hemolýzu vyvolávají pouze protilátky IgM a IgG. Protilátky se naváží na antigen, dojde k aktivaci komplementu klasickou cestou a konečným vyústěním je kaskádovitá reakce, na jejímž konci je proděravění membrány erytrocytu. Intracelulární hemoglobin je uvolněn do okolí a krvinka se rozpadne. Hemolýza je pozitivním výsledkem testu, protože prokazuje přítomnost protilátek, které aktivují komplement. Při reakci je důležitá teplota. Při jejím poklesu se hemolýza zpomaluje až nakonec ustává. Při 0 C se komplement naváže, ale nedojde k aktivaci. Při teplotě nad 37 C se hemolýza urychluje, ale se stoupající teplotou klesá stupeň lýzy. Při 56 C je komplement inaktivován. Pro aktivaci komplementu jsou důležité Ca2+ ionty a ph okolo 7,0. Proto je komplement inaktivní v plazmě obsahující chelatační látky. 2.2.4 Inhibice hemaglutinace Inhibicí dříve zjištěné aglutinace se prokazuje přítomnost antigenu nebo protilátky. Na rozpustné antigeny ve slinách se naváží odpovídající protilátky a po přidání vhodných erytrocytů nedojde k aglutinaci, protože protilátka byla spotřebována vazbou na rozpustný antigen. 2.2.5 ELISA Rutinně se používá pouze omezeně. Lze jí prokázat jak antigeny tak protilátky. K detekci reakce se používá enzym, který je navázán na specifickou protilátku. Do reakce se přidá vhodný substrát, který je enzymem rozložen a vzniklá barevná reakce je detekována spektrofotometrem. 2.3 Skupinové systémy erytrocytů 2.3.1 AB0 systém AB0 systém a k němu patřící krevní skupiny jsou ze všech skupinových systémů nejstarší. Mají největší význam pro transfuziologii a proto se označují jako hlavní. AB0 20

systém je jediným systémem, ve kterém jsou přirozené pravidelné protilátky = aglutininy anti A, anti B. Protilátky se nachází v séru těch osob, které nemají příslušný antigen, neboli aglutinogen. Objev AB0 systému se datuje k roku 1901 a je spojen se jménem Karla Landsteinera. Ten předpokládal existenci tří krevních skupin A, B, C. Teprve český vědec Jan Jánský objevil, že existují čtyři krevní skupiny A, B, 0, AB. Zastoupení antigenů a protilátek v AB0 systému sumarizuje tabulka 1 a výskyt krevních skupin tabulka 2. Krevní skupina Antigeny na krvinkách Protilátky v séru / plazmě A A anti B B B anti A 0 žádné anti A, anti B AB A, B žádné Tab. 1: Krevní skupiny AB0, antigeny a protilátky Krevní skupina Výskyt A1 32 % A2 10 % B 18 % 0 32 % AB 8% Tab. 2: Výskyt krevních skupin AB0 2.3.1.1 Geny systému AB0 V systému AB0 jsou tři základní alely: A, B, 0. Geny jsou umístěny na 9. chromozómu. Se systémem AB0 jsou spjaté další geny, nacházející se na 19. chromozómu. Jde o geny H, h a geny Se, se, které jsou spojené se sekretorstvím. Nositel genové kombinace SeSe a Sese vylučuje AB0 substance do tělních tekutin. Označuje se jako sekretor 80 % populace. Homozygot sese je nonsekretor 20 % populace. Alely A a B jsou vůči sobě kodominantní a dominantní nad alelou 0. Alely se homozygotně nebo heterozygotně kombinují a tak vznikají fenotypy A, B, 0, AB. Fenotyp A má genotyp AA nebo A0. Fenotyp B má genotyp BB nebo B0. Fenotyp 0 má genotyp 00. 21

Fenotyp AB má genotyp AB. 2.3.1.2 Antigeny systému AB0 Na membráně erytrocytů se v systému AB0 nachází tři antigeny A, B, H. Z chemického hlediska jsou postranními řetězci polysacharidů. Antigeny nejsou přímým produktem genu, ale geny kódují vznik enzymu transferázy, který katalyzuje přenos specifického monosacharidu ke dvěma typům prekurzorové jednotky. Typ 1 se nachází v tělních tekutinách, tkáních a může být adsorbován na erytrocyty, typ 2 je převážně na erytrocytech. Alela A kóduje vznik enzymu, který přenáší N acetylgalaktosamin. Alela B kóduje vznik enzymu specifického pro D galaktozu. Gen H má vliv na enzym přenášejícím fukozu a funguje jako biosyntetický předstupeň. H transferáza katalyzuje připojení fukozy k jednomu ze dvou typů prekurzorového řetězce a vytvoří se H substance, čímž vzniká krevní skupina 0. A transferáza připojuje N acetyl galaktosamin k H substanci a vzniká sacharid typický pro skupinu A. B transferáza připojuje D galaktozu k H substanci a vzniká sacharid typický pro skupinu B. Gen 0 je němý a nemá transferázovou aktivitu. Nevzniká tedy žádný enzym a H substance je nemodifikována. Gen h je amorfní, v homozygotní formě se nevytváří žádná H substance, tudíž se nepřipojují žádné cukry, nevzniká žádný antigen H, A, B. Tento fenotyp se označuje jako bombayský. V séru těchto lidí mohou být protilátky anti A, anti B, anti H. Tito jedinci nesmí dostat transfuzi krevní skupiny 0, ale právě bombayský fenotyp. Prekurzorová substance H a antigeny A a B jsou prokazatelné již v 6. týdnu embryonálního života. Plné exprese dosahují mezi 1. až 2. rokem věku. a) Skupina A Skupina A se na základě kvalitativních a kvantitativních rozdílů mezi A antigeny a i vzhledem ke kvantitativnímu poměru k H antigenu, rozděluje na podskupiny. Nejčastější jsou A1 (78 %), A2 (21 %) a slabé podskupiny (A3, Ax, Aend, Am, Ay, Ael). Toto platí i pro skupinu 22

AB. V podskupině A1 je nejvíce antigenu A a skoro žádný antigen H. V dalších podskupinách je méně antigenu A, více antigenu H a může se vyskytovat protilátka anti A 1. Rozdíl mezi podskupinami je i v kvalitativním rozdílu ve struktuře polysacharidu. Vyšetření podskupin spočívá ve vyšetření krvinek s lektinem anti A1 nebo lektinem anti H. Rovněž také v nálezu přirozených nepravidelných protilátek anti A 1 a anti H v séru a v průkazu substance A a H v sekretech vylučovatelů. b) Skupina B I ve skupině B jsou podskupiny, např. B3, Bx, Bm, Bel. B podskupiny jsou vzácnější než u A antigenu. Ze sérologických reakcí je typické, že se zeslabuje reakce s anti B, přibývá reakce s anti H a v séru se mohou se vyskytovat protilátky anti B. 2.3.1.3 Protilátky systému AB0 a) Přirozené pravidelné V systému AB0 se vyskytují přirozené pravidelné protilátky anti A a anti B. Zastoupení u skupin ukazuje tabulka 1. Tyto protilátky nemá člověk vrozené, ale po narození se setkává s bakteriemi, které mají podobné imunoreaktivní části jako ABH molekuly. Imunitně dobře reagující jedinec si začne do 6. měsíce věku proti nim vytvářet protilátky, ne však proti vlastním antigenům. Vyšetření probíhá pomocí typových erytrocytů, nesoucích příslušné aglutinogeny. U dětí do 6 měsíců se vyšetření aglutininů neprovádí, mohou ještě interferovat AB0 protilátky získané od matky. Přirozené pravidelné protilátky jsou typu IgM a reagují při pokojové teplotě. Po imunizaci (u plodu, novorozence v průběhu těhotenství, po inkompatibilní transfuzi) se mohou vytvářet imunní protilátky IgG. b) Přirozené nepravidelné Někteří jedinci skupiny A1 nebo A1B mohou vytvářet přirozenou nepravidelnou protilátku anti H. Stejně tak jedinci skupiny A 2 nebo A2B mohou vytvářet přirozenou nepravidelnou protilátku anti A1 (tab. 3). Protilátky jsou většinou chladového typu. 23

Reakce s krvinkami Krevní skupina A1 nebo A1B s Krevní skupina A2 nebo A2B s přirozenou nepravidelnou anti H přirozenou nepravidelnou anti A1 0 pozitivní negativní A1 negativní pozitivní A2 pozitivní negativní B pozitivní pozitivní Tab. 3: Přirozené nepravidelné protilátky 2.3.1.4 Vylučovatelství Skupinové vlastnosti H, A, B se nenacházejí pouze na krvinkách, ale i v plazmě a v tělesných tekutinách (sliny, trávící šťávy). Izolované substance se nazývají Witebského skupinové substance. Vylučované vlastnosti jsou z chemického hlediska glykoproteiny a jsou rozpustné ve vodě. Lidé, kteří substance vylučují, jsou vylučovatelé = sekretoři a ti, co nevylučují jsou nevylučovatelé = nonsekretoři. Vylučovatelství je podmíněno geny Se a se. S vylučovatelstvím souvisí skupinový systém Lewis (Le). Vylučovatel má genotyp SeSe nebo Sese a jsou Le a negativní a Leb pozitivní i negativní. Nevylučovatel nese genotyp sese a je Le a negativní i pozitivní a Leb negativní. Vylučovatel vylučuje do svých tělních tekutin antigen H a pak antigen A nebo B dle své skupinové příslušnosti. Nevylučovatel nevylučuje žádný z A, B a H antigenů. Význam vylučovatelství pro imunohematologii je v možnosti vyšetření krevní skupiny ze slin (inhibice hemaglutinace) využití v soudním lékařství. Skupinové vlastnosti lze prokázat i při 1000 násobném zředění slin a jsou odolné vůči teplotě i tlaku. 2.3.1.5 Význam AB0 systému pro transfuzi AB0 systém je z hlediska transfuze nejdůležitějším systémem, protože má pravidelné protilátky. Dárci krevní skupiny 0 jsou univerzální dárci erytrocytů a dárci krevní skupiny AB jsou univerzální příjemci erytrocytů. Preferuje se stejnoskupinová transfuze, ale z důvodu nedostatku krve je možné podat nestejnoskupinovou transfuzi dle daných pravidel (tab. 4, ). Při transfuzi plazmy jsou pravidla opačná (tab. 5). Univerzálním dárcem je nositel krevní skupiny AB, univerzálním příjemcem nositel krevní skupiny 0. 24

Pacient Erytrocytární koncentrát krevní skupiny A krevní skupiny A, 0 krevní skupiny B krevní skupiny B, 0 krevní skupiny 0 krevní skupiny 0 krevní skupiny AB krevní skupiny AB, A, B, 0 Tab. 4: Varianty transfuze erytrocytů Pacient Plazma krevní skupiny A krevní skupiny A, AB krevní skupiny B krevní skupiny B, AB krevní skupiny 0 krevní skupiny 0, A, B, AB krevní skupiny AB krevní skupiny AB Tab. 5: Varianty transfuze plazmy Při transfuzi trombocytového koncentrátu platí pravidla jako při transfuzi plazmy. Při nedostatku trombocytárních přípravků dané krevní skupiny je možno podat trombocytový koncentrát krevní skupiny 0, jen pokud má dárce nízký titr aglutininů anti A a anti B. Další možností je transfuze trombocytů krevní skupiny 0 v náhradním roztoku. 2.3.2 Rh systém Druhým systémem, který je v imunohematologii velmi důležitý, je systém Rh. Jedná se o nejpolymorfnější a nejimunogenější krevní skupinový systém. Než byl objeven, byla většina potransfuzních reakcí a hemolytických onemocnění novorozenců způsobena právě Rh systémem. V roce 1939 byly objeveny neznámé protilátky u ženy, která porodila dítě, jenž zemřelo kvůli HON. V roce 1940 Landsteiner a Wiener imunizovali králíka červenými krvinkami opice Macacus Rhesus. Imunní protilátka aglutinovala erytrocyty 85 % lidí. Reagovala s antigeny na povrchu lidských erytrocytů i rhesus erytrocytů. Odtud označení Rh faktor. Byla zjištěna souvislost mezi tímto faktorem a protilátkami u lidí Rh negativních, kteří dostali Rh pozitivní krev. 25

Jedná o složitý systém, zvaný Rh komplex, z nichž nejdůležitější je antigen D. Pokud se tento antigen u člověka na krvinkách vyskytuje, označuje se jedinec jako Rh pozitivní (RhD + ) 85 % populace bělochů. Pokud není, označuje se člověk jako Rh negativní (RhD ) 15 % populace bělochů. 2.3.2.1 Geny Rh systému Tento systém je kódován na 1. chromozomu, na třech těsně spjatých lokusech. Na prvním lokusu je gen C alely C a c. Na druhém lokusu je gen D alely D a d. Na třetím lokusu je gen E alely E a e. Může se vyskytnout stav, kdy chybí jedna i více alel. V případě, že chybí všechny alely, jde o tzv. Rh null syndrom, který se může projevovat hemolytickou anémií. Na určitém lokusu mohou být vždy jen 2 alely ze 6, proto počet možných genových kombinací je 8: cde, Cde, cde, cde, Cde, cde, CdE, CDE. 8 haplotypů je párováno do 36 genotypů. RH je označení pro geny kódující RhD nebo RhCE protein a RHAG je označení pro geny kódující glykoproteiny asociované s Rh RhAG. 2.3.2.2 Antigeny Rh systému Nejprve byl rozpoznán antigen D, později byly zjištěny další antigeny C, c, E, e. Antigeny nejsou stejnorodé, skládají se z více podjednotek nebo se na jejich místě může vyskytovat více alel příbuzně specifických. Např. na D alele slabší alela D, na alele C alela CW, CU, CX, na alele E alela EW, EU. V současnosti tvoří Rh systém nejméně 45 nezávislých antigenů (Tesařová a kol, 2008). Mezi hlavní patří C, C W, c, D, E, e. Alela d neprodukuje antigen, neexistuje. Netvoří se ani protilátka anti d, ale písmeno d se používá k označní D negativního jedince. Rh antigeny jsou kodominantní. Existují různé nomenklatury označování antigenů, genů Rh systému. Používá se CDE nomenklatura a nomenklatura dle Fishera a Wienera, založená na faktu, zda je jedinec Rh pozitivní nebo Rh negativní, tedy R a r. Následující tabulky ukazují četnosti jednotlivých antigenů, Rh komplexů a fenotypů v populaci [tab. 6 Výskyt jednotlivých antigenů ve střední Evropě (Pecka, Malý, Dejmková, 1998), tab. 7 Četnost Rh komplexu ve střední Evropě (Eckstein, 1994), tab. 8 Výskyt fenotypů Rh systému (Eckstein, 1994)]. 26

Antigen Rh e D c C E CW Četnost 96,5 % 82,2 % 80,3 % 64,6 % 27,2 % 2,1 % Tab. 6: Výskyt jednotlivých antigenů ve střední Evropě CDE nomenklatura CDE cde cde cde Cde cde CDE CdE Wienerova nomenklatura R1 r R2 R0 r' r'' RZ ry Četnost 40,52 % 39,17 % 14,16 % 2,69 % 0,94 % 0,62 % 0,23 % 0,01 % Tab. 7: Četnost Rh komplexu ve střední Evropě Fenotyp CcDee CCDee ccddee CcDEe ccdee ccdee ccdee Ccddee ccddee CCDEe CcDEE CCddee CcddEe Wienerova nomenklatura R1r R1R1 rr R1R2 R2r R2R2 R0 r'r r''r RZR1 RZR2 r'r' r'r'' Tab. 8: Výskyt fenotypů Rh systému 27 Výskyt 33,97 % 17,18 % 15,34 % 12,42 % 11,89 % 2,18 % 2,17 % 0,74 % 0,49 % 0,19 % 0,06 % 0,01 % 0,01 %

a) Antigen D D antigen představuje soubor epitopů na povrchu extramembranozní části RhD proteinu (Tesařová, 2008). Pokud se D antigen vyskytuje, je jedinec D pozitivní / Rh pozitivní. Při chybění genu D u bělochů, chybí i D polypeptid a nejsou D epitopy a jedinec je D negativní / Rh negativní. V současné době rozeznáváme 37 epitopů. Exprese antigenu D na erytrocytech varíruje od nejsilnějšího u D ke slabšímu u D weak a D variantního. Změna exprese antigenu může být kvantitativní a kvalitativní. Kvantitativní změna = Weak D dříve označovaný jako D U. Vzniká bodovými mutacemi RHD genů, jejichž důsledkem jsou změny v intramembranózní části proteinu a následně nezabudování proteinu do Rh komplexu. Kvalitativní změna = Variant D. Změny jsou v extramembranózní části proteinu a jsou důsledkem přeskupení RHD nebo RHCE genů, bodových mutací, nonsence mutací a delecí nukleotidů. Následkem toho mohou chybět některé epitopy, mění se tvar proteinu a pro jedince s normálním antigenem se jeví jako cizí. Nejčastější a nejzávažnější variantou pro potransfuzní reakce a HON je DVI varianta. Pokud se člověk, který má D weak nebo D variant stane pacientem, transfundují se mu D negativní erytrocyty. Ale pokud by se takovýto člověk stal dárcem erytrocytů, musí být tento krevní přípravek považován za D pozitivní. b) Antigeny C, c a E, e Jedná se o alelické páry genů. Polymorfismus C, c je dán substitucí 4 aminokyselin proteinu RhCcEe, polymorfismus E, e je dán záměnou pouze jediné aminokyseliny (Tesařová, 2008). Slabé C se může vyskytovat u haplotypu DCE, C u u haplotypu Dce a EW u haplotypu DcE. Pokud jsou c a e, C a e, C a E, c a E tvořeny stejným RHCE genem, mohou vznikat společné CE antigeny. Ke společným antigenům patří antigeny ce (f), Ce, CE, ce. c) Antigeny VS a V Typická je nízká frekvence výskytu. Dochází k náhradě jedné aminokyseliny v transmembránové části a jsou spojovány se slabým e antigenem. 28

d) Antigen G Tento antigen se nachází na RhD i RhC proteinech. e) Antigeny CW a CX Vznikají konformačními změnami proteinu jako následek záměny jediného nukleotidu RHCE. Erytrocyty CW pozitivní jsou téměř vždy C pozitivní, ale antigen je na nich slabší. Vyskytuje se u haplotyů DCe, ale i dce, dce, DCE. CX je produkt Dce haplotypu. 2.3.2.3 Protilátky Rh systému Rh protilátky jsou zřídkakdy přirozené, nejčastěji bývají imunního typu IgG. A to následkem nevhodné transfuze nebo po těhotenství. Mohou být tedy příčinou časného i pozdního typu potransfuzní reakce a hemolytického onemocnění novorozence. Reagují v enzymatických testech a v NAT. Protilátky anti e, anti Ce, anti f se mohou vyskytovat jako tepelné autoprotilátky při autoimunní hemolytické anémii. a) Anti D Jde o nejčastější protilátku, je typu IgG. V současné době ztrácí význam z důvodu převodu identické krve a profylaxe matek a těhotných žen. Rh negativním ženám, které porodily Rh pozitivní dítě, se preventivně aplikuje anti D protilátka. Jde o klinicky navozenou supresi protilátkami zprostředkované imunitní odpovědi (Tesařová, 2008). Mechanismem suprese je maskování D antigenu protilátkou, destrukce opsonizovaných erytrocytů a zeslabení protilátkové odpovědi vlivem na antigen specifické B lymfocyty. Profylaxe je podána i při potratech a invazivním gynekologickém vyšetření a úrazech břišní dutiny. Jde o to, aby erytrocyty RhD + plodu, které se při fetomaternálním krvácení dostanou do oběhu matky, nezpůsobily tvorbu imunní protilátky anti D. b) Anti C, CW Anti C je zpravidla směs protilátek anti CC W, často je provázena protilátkou anti D. Vyskytuje se u Rh negativních osob, D pozitivní ji tvoří zřídka. Je to způsobeno tím, že C 29

je slabý antigen a díky obsahu G antigenu na erytrocytech jej jedinci D pozitivní a C negativní nerozeznávají jako cizí. Anti CW je vzácná protilátka, která se vytvoří u osob se znakem C, které jsou C W negativní. c) Anti E Po anti D nejčastější protilátka, vyskytují se často společně. Může být i přirozená. d) Anti c Často je provázena protilátkou anti E. Vytváří se převážně u osob s fenotypem R 1R1 nebo r'r'. e) Anti e Velmi vzácná protilátka, protože jedinců, kteří mají antigen e je 96,5% f) Anti G Protilátky se specifitou anti C + D mohou obsahovat anti G složku a mohou se vyskytovat jako anti D + G, anti C + D + G, anti C + G. Anti C + D u žen imunizovaných v graviditě (manžel je C negativní) má charakter protilátky anti D + G. Podobně D negativní příjemce po transfuzi D negativní C pozitivní krve si vytvořil anti C + G, imitující anti C + D (Tesařová, 2008). 2.3.2.4 Význam Rh systému pro transfuzi D antigen je velmi silný. Často stačí parenterální podání i 0,1 ml D pozitivní krve, aby vyvolal tvorbu protilátek (Eckstein, 1994). První podání D pozitivní krve není nebezpečné, protože ještě nejsou vytvořeny protilátky. Nebezpečná je až následná transfuze D pozitivní krve, kdy dojde k reakci antigenu s vytvořenou protilátkou. Pacient D pozitivní může dostat D negativní krev. Nejen D antigen je důležitý pro transfuzi. K imunizaci dochází u osob, které jsou v 30

některém znaku homozygotní R1R1, R2R2. U některých pacientů, např. hematologických, se při transfuzi dodržuje kompatibilita i v celém Rh fenotypu. Pokud má pacient vytvořenou protilátku, musí vždy dostat krev bez tohoto antigenu, jinak hrozí hemolytická reakce. 2.3.3 Kell systém Jméno tomuto systému dala v roce 1945 těhotná žena, paní Kellacher, u níž byla poprvé popsána protilátka anti K. Tento skupinový systém je složitější než se původně předpokládalo. Nejdříve byl objeven antigen Kell K a následně bylo zjištěno, že k němu patří i antigen Cellano k (opět odvozeno od jména těhotné ženy), který je vysokofrekventní. Posléze se přidaly další antigeny. 2.3.3.1 Geny Kell systému Genetické vztahy jsou komplikované a podobně jako u Rh systému se dědí jako komplex. Tento komplex genů leží na 7 chromozómu, má 3 lokusy. Na lokusu 1 jsou alely K a k, na lokusu 2 jsou alely Kp a a Kpb a na lokusu 3 alely Js a a Jsb. Na lokusu Kk je ještě alela K0, která se vyznačuje chyběním antigenů Kell a lze prokázat pouze Kx substanci. Podobně jako u Rh systému musí existovat 8 haplotypů. Existuje tedy 8 haplotypů, z nichž však byly prokázány zatím jen 4: KKpbJsb, kkpbjsb, kkpajsb, KKpbJsa (Pecka, 1998). Četnost výskytu fenotypů ukazuje tabulka 9 (Tesařová, 2008). Fenotyp K+k K+k+ K k+ Kp (a+b ) Kp (a+b+) Kp (a b+) Js (a+b ) Js (a+b+) Js (a b+) K0 Četnost 0,2 % 8,8 % 91,0 % vzácně 2,3 % 97,7 % 0% vzácně 100 % výjimečně Tab. 9: Četnost výskytu fenotypů 31

2.3.3.2 Antigeny Kell systému Antigeny Kell jsou po antigenu D nejvíce imunogenní. Jsou tvořeny působením transferáz z prekurzorové substance Kx. Erytrocyty, kterým chybí substance Kx mají výrazně sníženou expresi antigenů Kell systému. To má vliv i na membránu erytrocytů a jejich přežívání. Pokud Kx chybí, přežívání je zkráceno a objevuje se akantocytóza, anizocytóza a hemolýza. Tato abnormalita se nazývá Mc Leod fenotyp. Vyskytuje se pouze u mužů, protože je vázán na chromozom X. Četnost výskytu antigenů ve střední Evropě ukazuje tabulka 10 (Eckstein, 1994). Antigen K k Kpa Kpb Jsa Jsb Četnost 8% 92 % 0,02 % 99,98 % 100 % Tab. 10: Četnost výskytu antigenů ve střední Evropě 2.3.3.3 Protilátky Kell systému Přirozená protilátka anti K, typu IgM, se vyskytuje vzácně. Je chladového typu a reaguje při 4 C. Mnohem častěji se vyskytuje imunní protilátka typu IgG., která reaguje v NAT. Protilátka anti k je velmi vzácná. Může se vytvořit u homozygotů fenotypu KK, kterých je pouze 0,2 %. 2.3.3.4 Význam antigenů Kell systému pro transfuzi Protože antigen Kell je velmi imunogenní, vyšetřuje se rutinně u dárců krve. U dětí, mladých lidí, žen ve fertilním věku, hematologických a dialyzovaných pacientů se transfunduje fenotypově identicky. Zajištění transfuze u pacienta s protilátkou anti k je velmi obtížné, protože pouze 2 z 1000 lidí jsou Cellano negativní. 32

Kell antigen je důležitý i z důvodu HON. Protilátky Kell systému suprimují erytropoezu fetu, proto může vzniknout těžší forma HON již při nižším množství přítomné protilátky, než u jiných typů inkompatibilit (Tesařová, 2008). 2.3.4 Lewis systém Není pravým krevním skupinovým systémem, protože jeho antigeny jsou rozpustné glykolipidy, které se na povrch erytrocytů navazují sekundárně z plazmy. Asi 30 % Le substance se neadsorbuje a zůstává rozpuštěno v plazmě (Pecka, Malý, Dejmková, 1998). 2.3.4.1 Geny Lewis systému V tomto systému jsou typické interakce mezi geny Lewis, ABH a geny související s vyučovatelstvím Se, se. Všechny geny se nachází na chromozomu 19 a dědí se nezávisle. V systému Lewis jsou 2 alely Le a le. Nejčastější fenotyp je Le (a b+) 72 %, následuje s 22 % fenotyp Le (a+b ) a se 6 % fenotyp Le (a b ). 2.3.4.2 Antigeny Lewis systému V systému jsou 2 antigeny. V přítomnosti nonsekretorského genu se je produktem genu Le enzym, katalyzující tvorbu antigenu Le a. Výsledný fenotyp erytrocytů je Le (a+b ). V přítomnosti sekretorského genu Se a interakci Le genu a H genu dochází ke konverzi původní Lea substance na Leb substanci. Výsledný fenotyp erytrocytů je Le (a b+). Pokud je u jedince homozygocie alely le, nevzniká Le substance a výsledný fenotyp je Le (a b ). Lewis antigeny jsou tvořeny z prekurzorového řetězce, podobně jako ABH antigeny, pomocí transferáz. Antigeny nejsou přítomné ihned po narození, objevují se do 3 měsíců věku. Antigenní síla kolísá, např. při těhotenství mizí, vzniká získaný null fenotyp a může se vytvořit protilátka. 2.3.4.3 Protilátky Lewis systému Protilátky anti Lea a anti Leb jsou typu IgM, vzácně IgG, dobře reagují v solném prostředí při pokojové teplotě nebo v chladu. Většinou nejsou aktivní při 37 C. 33