MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí VLASTNOSTI, VÝSKYT A STANOVENÍ PERFLUOROVANÝCH LÁTEK V PROSTŘEDÍ Pavlína Karásková Bakalářská práce Vedoucí: Ing. Jitka Bečanová Brno, Česká republika, rok 2010
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Ing. Jitky Bečanové a že jsem použila pouze uvedenou literaturu a experimentální výsledky dosažené v laboratořích Centra pro výzkum toxických látek v prostředí.. datum. Pavlína Karásková
Děkuji své školitelce Ing. Jitce Bečanové za odborné vedení mé bakalářské práce, její účast a cenné rady při experimentech. Dále děkuji Centru pro výzkum toxických látek v prostředí za poskytnutí laboratoří a materiálu.
ANOTACE Cílem této práce bylo zmonitorovat výskyt perfluorovaných látek v životním prostředí a míru kontaminace těmito látkami. PFCs se vyskytují ve všech matricích životního prostředí včetně bioty. Jednou z nich je vzduch, se kterým jsou lidé v přímém kontaktu. Člověk je ovšem vystaven působení nejen okolního prostředí, ale i pracovního prostředí, potažmo domácnosti. Naším cílem bylo popsat kontaminaci domácího prachu těmito látkami a jejich analytické stanovení. Během stanovení perfluorovaných látek dochází ke kontaminaci vzorku prostředím laboratoře a použitými technikami. Praktická část této práce byla zaměřená na zjištění pozaďové kontaminace běžně používaných extrakčních technik (ultrazvuk spojen s SPE). Pro tuto extrakční metodu proběhlo testování pozaďové koncentrace PFCs během jednotlivých kroků úpravy vzorku. ANNOTATION The aim of this work is the monitoring of perfluorinated compounds (PFCs) in the environment and the level of contamination by these substances. PFCs are present in all matrices, including biota. Air is one on these matrices directly surrounding people. Not only the natural environment but also indoor environment, including household, affects human body. Contamination of the house dust by these substances and their analytical determination was the aim of this study. The background contamination of analysed sample during extraction and determination is a problem. This study was designed to detect background contamination commonly used extraction techniques (ultrasound combined with SPE). For this extraction method was carried out testing of background concentrations of PFCs during sample preparation steps.
OBSAH I. ÚVOD A CÍLE PRÁCE... 7 II. TEORETICKÁ ČÁST... 8 1. STRUKTURA PERFLUOROVANÝCH SLOUČENIN (PFCs)... 8 2. NOMENKLATURA PFCs... 9 3. FYZKÁLNÍ A CHEMICKÉ VLASTNOSTI... 10 3.1 Fyzikální a chemické vlastnosti fluoru... 10 3.2 Fyzikální a chemické vlastnosti PFCs... 11 4. SYNTÉZA PFCs... 12 4.1 Elektrochemická fluorace (ECF)... 12 4.2 Telomerace (TM)... 12 5. PRŮMYSLOVÉ VYUŽITÍ PFCs... 13 5.1. Povrchová úprava tkanin... 13 5.2 Obalové materiály... 13 5.3 Vodní hasicí pěny (AFFF)... 14 5.4 Pokovování... 14 5.5 Fotolitografie a polovodiče... 14 5.6 Fotografický průmysl... 14 5.7 Další použití... 14 6. VÝSKYT V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ... 15 7. DEGRADACE V PROSTŘEDÍ... 16 8. TOXIKOLOGICKÉ VLASTNOSTI... 17 8.1 Toxikologické studie... 17 8.1.1 Studie toxicity na zvířatech... 18 8.1.2 Obecná populační studie vývojová toxicita u novorozenců... 18 8.1.3 Toxikologická studie zaměstnanců... 18 9. METODY EXTRAKCE, SEPARACE A DETEKCE... 19 9.1 Extrakční techniky... 19 9.2 Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC)... 20 9.3 Hmotnostní spektrometrie (MS)... 20 9.3.1 Princip MS... 20 9.3.2 Ionizace... 21 9.3.3 Ionizace elektrosprejem (ESI)... 21
9.3.4 Hmotnostní analyzátory... 22 9.3.5 Kvadrupólový analyzátor (Q)... 22 9.3.6 Hybridní analyzátor QTRAP... 22 9.3.7 Hmotnostní spektrum... 23 9.3.8 Multiple reaction monitoring (MRM)... 23 9.4 Spojení HPLC-MS/MS pro stanovení PFCs v prachu a vzduchu... 23 III. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 25 10. PŘÍSTROJE A POMŮCKY... 25 11. CHEMIKÁLIE... 25 12. PŘÍPRAVA VZORKŮ A EXTRAKCE... 26 12.1 Měření pozaďových kontaminací stříkačkových filtrů... 26 12.2 Úprava designu solid-liquid extrakce... 26 12.3 Opakovatelnost extrakční techniky... 27 12.4 Podmínky analytického stanovení... 27 13. VÝSLEDKY... 27 IV. ZÁVĚR... 36 V. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK... 37 VI. SEZNAM PŘÍLOH... 39 VII. LITERATURA... 40
I. ÚVOD A CÍLE PRÁCE Perfluorované látky (PFCs) patří z environmentálního hlediska mezi persistentní organické polutanty (POPs) a jako takové jsou monitorovány světovými organizacemi (UNECE - United Nations Economic Commission for Europe; OECD - Organisation for Economic Co-operation and Development; UNEP - United Nations Environment Programme program OSN). Jejich výroba a použití jsou limitovány několika mezinárodními úmluvami (Stockholm Convention on persistent organic pollutant; CLRTAP - Convention on Long-Range Transboundary Air Pollution). Pro Evropskou unii a tím i Českou Republiku je zavazující směrnice Evropského parlamentu a rady 2006/122/ES ze dne 12. prosince 2006. PFCs jsou poměrně nové sloučeniny. Ačkoliv jsou průmyslově vyráběny teprve od 50. let 20. století, díky jejich hojnému používání dochází k výrazné kontaminaci životního prostředí. Díky atomům fluoru v molekule se jedná o látky velmi stabilní. Jsou odolné vůči chemickému, fotochemickému, termickému a biochemickému rozkladu. Mají potenciál k dálkovému transportu, jsou proto přítomny i v oblastech, kde nebyly nikdy vyráběny ani používány. Tento aspekt umocňuje i schopnost bioakumulace v živočišných tkáních. Z tohoto důvodu mohou být koncentrace PFCs v organismech na vrcholech potravních pyramid i několikanásobně vyšší než u organismů na nižších potravních stupních. Cílem této práce bylo zmonitorovat výskyt PFCs v životním prostředí a míru kontaminace těmito látkami. Najít matrici, ve které se perfluorované látky vyskytují a která je v přímém kontaktu s člověkem, nebo s prostředím, v němž se nachází. Jednou z matric, kterou je člověk neustále obklopen je vzduch. Proto bylo našim cílem monitorovat kontaminace vzduchu a částic ve vzduchu PFCs. Protože je člověk ovšem vystaven působení nejen okolního prostředí, ale i pracovního prostředí, potažmo domácnosti, bylo naším cílem popsat kontaminaci domácího prachu těmito látkami. S problémem stanovení perfluorovaných látek je spojen i problém pozaďových kontaminací. PFCs se vyskytují téměř ve všech matricích, proto je těžké se jim vyhnout i při vlastním analytickém stanovení. Pokud tedy chceme měřit koncentrace PFCs v reálných matricích, je potřeba nejdříve zjistit úroveň kontaminace laboratoře, přístrojového vybavení a všech stupňů přípravy vzorku. Jednou z možných cest kontaminace stanovovaných látek může být extrakční technika. Tato práce byla zaměřená na zjištění pozaďové kontaminace běžně používaných extrakčních technik (ultrazvuk spojen s SPE). Pro tuto extrakční metodu proběhlo testování pozaďové koncentrace PFCs během jednotlivých kroků úpravy vzorku. 7
II. TEORETICKÁ ČÁST 1. STRUKTURA PERFLUOROVANÝCH SLOUČENIN (PFCs) Polyfluorované látky jsou sloučeniny obsahující hydrofobní alkylový řetězec s proměnlivým počtem uhlíku (obvykle C4 až C16) a hydrofilní část, která může být zcela nebo částečně fluorovaná. Je-li hydrofilní část zcela fluorována jsou pak molekuly nazývány jako perfluorované (PFCs) [1]. U látek, které mají jen částečně fluorovanou hydrofilní část molekuly určuje její vlastnosti pozice a počet fluorů [2]. Molekuly, které obsahují mezi hydrofilní částí a zbylým plně fluorovaným uhlíkatým řetězcem nefluorovanou skupinu CH 2 -CH 2 - se nazývají telomery. Ty jsou považovány za prekurzory polyfluorovaných alkylsloučenin PFASs vyskytujících se v prostředí [1]. Hydrofobní část molekuly může být substituována různými funkčními skupinami, podle jejichž povahy se mohou vyskytovat v iontové i neiontové formě. Iontové surfaktanty mohou být ve vodných roztocích disociovány na ionty (kladné i záporné). Existují i sloučeniny, které ve své molekule obsahují jak kladně tak záporně nabité skupiny. Na základě přítomnosti nabitých skupin se PFCs dělí do čtyř skupin [2]: aniontové PFCs hydrofobní část je aniont (př. R f COO - Na + ) kationtové PFCs hydrofobní část je kationt (př. C 7 F 15 CONH(CH 2 ) 3 N + (CH 3 ) 3 I - ) amfoterní PFCs v izoelektrickém bodě mají jednu kationtovou a jednu aniontovou skupinu neiontové PFCs nedisociují na ionty (C 7 F 15 CH 2 CH 2 O(CH 2 CH 2 O) n H) PFCs zahrnují několik základních skupin sloučenin. Jsou to perfluoroalkylkarboxylové kyseliny (PFCAs), perfluoroalkylsulfonáty (PFASs), telomerní alkoholy (FTOHs), nasycené a nenasycené telomerní kyseliny (FTAs a FTUAs), jejichž struktura je vyobrazena na obr.1 [3]. Obr. 1: Struktura základních skupin PFCs [3] 8
2. NOMENKLATURA PFCs Aby bylo možné se o dané struktuře vyjadřovat přesně, je potřeba ujasnit názvosloví. Jelikož jsou perfluorované sloučeniny nové polutanty, není ještě zcela vyvinuto české názvosloví. Z angličtiny pochází zkratka PFC perfluorinated compound, PFAC perfluoroalkyl compound nebo PFAS poly- nebo perfluorinated alkyl substance. V češtině je obecně používána zkratka PFOS perfluorované organické sloučeniny. Zkratka PFOS však v angličtině určuje již danou sloučeninu a to perfluorooktansulfonan. V této práci bude užito pro obecný název perfluorované sloučeniny zkratka PFCs a jednotlivé názvy sloučenin budou určeny zkratkami z angličtiny. Tabulky 1, 2 a 3 obsahují seznam sloučenin, které jsou studovány v této práci, jejich anglické zkratky, sumární vzorce a molekulové hmotnosti. Jedná se o 12 perfluoroalkylkarbo-xylových kyselin (PFCAs), z nichž jedna je izotopicky značená, 6 perfluoroalkylsulfonanů (PFASs) taktéž s jedním izotopicky značeným a 5 fluorotelomerních alkoholů (FTOHs) s jedním značeným. Tabulka 1:Perfluoroalkylkarboxylové kyseliny (PFCAs) [3] název zkratka vzorec M r perfluorobutanová kyselina PFBA C 4 HF 7 O 2 214,0396 perfluoropentanová kyselina PFPeA C 5 HF 9 O 2 264,0474 perfluorohexanová kyselina PFHxA C 6 HF 11 O 2 314,0552 perfluoroheptanová kyselina PFHpA C 7 HF 13 O 2 364,0603 perfluorooktanová kyselina PFOA C 8 HF 15 O 2 414,0708 značená perfluorooktanová kyselina PFOA [M+4] 13 C 12 4 C 4 HF 15 O 2 418,0402 perfluorononanová kyselina PFNA C 9 HF 17 O 2 464,0786 perfluorodekanová kyselina PFDA C 10 HF 19 O 2 514,0864 perfluoroundekanová kyselina PFUnDA C 11 HF 21 O 2 564,0942 perfluorododekanová kyselina PFDoDA C 12 HF 23 O 2 614,1020 perfluorotridekanová kyselina PFTrDA C 13 HF 25 O 2 664,1098 perfluorotetradekanová kyselina PFTeDA C 14 HF 27 O 2 714,1176 9
Tabulka 2:Perfluoroalkylsulfonany (PFASs) [3] název zkratka vzorec M r perfluorobutansulfonan draselný KPFBS C 4 F 9 SO 3 K 338,1901 perfluorohexansulfonan sodný NaPFHxS C 6 F 13 SO 3 Na 422,0972 perfluoroheptansulfonan sodný NaPFHpS C 7 F 15 SO 3 Na 472,1050 perfluorooktansulfonan draselný KPFOS C 8 F 17 SO 3 K 538,2214 značený perfluorooktansulfonan sodný NaPFOS [M+4] 13 C 12 4 C 4 F 17 SO 3 Na 526,0823 perfluorodekansulfonan sodný NaPFDS C 10 F 21 SO 3 Na 622,1285 Tabulka 3: Fluorotelomerní alkoholy (FTOHs) [3] název zkratka vzorec M r perfluorobutylethanol (4:2* FTOH) FBET C 6 H 5 F 9 O 264,0907 perfluorohexylethanol (6:2 FTOH) FHET C 8 H 5 F 13 O 364,1063 perfluorooktylethanol (8:2 FTOH) FOET C 10 H 5 F 17 O 464,1220 perfluorodecylethanol (10:2 FTOH) FDET C 12 H 5 F 21 O 564,1376 značený perfluorodecylethanol FDET [M+4] 13 C 12 2 C 2 10 H 2 H 3 F 21 O 568,1344 * u fluorotelomerních alkoholů jsou uváděny poměry 4:2, 6:2, 8:2 a 10:2, přičemž první číslo udává počet plně fluorovaných atomů uhlíku a druhé číslo je počet nefluorovaných uhlíků sousedících s hydroxylovou skupinou [4]. 3. FYZKÁLNÍ A CHEMICKÉ VLASTNOSTI Pro pochopení vlastností perfluorovaných látek je potřeba se nejprve podívat na vlastnosti samotného fluoru. Fluor má totiž některé specifické vlastnosti, kterými se odlišuje od ostatních halogenů nebo dokonce všech prvků periodické soustavy, a tím dává charakteristické vlastnosti fluorovaným látkám [2]. 3.1 Fyzikální a chemické vlastnosti fluoru V přírodě se fluor vyskytuje pouze ve sloučeninách (např. v zemské kůře je 544 ppm fluoru) a jeho hlavními přírodními zdroji fluoru jsou minerály kazivec (fluorit) CaF 2, kryolit Na 3 [AlF 6 ] a fluorapatit Ca 5 (PO 4 ) 3 [5]. Tabulka 4 uvádí některé důležité vlastnosti fluoru, které se mohou podílet na specifických vlastnostech PFCs. 10
Tabulka 4: Vybrané atomové a fyzikální vlastnosti fluoru [6] Atomová vlastnost číselná hodnota Fyzikální vlastnost číselná hodnota atomové číslo 9 teplota tání [ C] -218,6 počet stabilních izotopů 1 teplota varu [ C] -188,1 atomová hmotnost 18,998 403 hustota [g.cm -3 ] 1,513 ionizační energie [kj.mol -1 ] 1680,6 ΔH tání [kj.mol] 0,51 elektronová afinita [kj.mol -1 ] 332,6 ΔH výp. [kj.mol] 6,54 iontový poloměr F - [pm] 133 oxidační potenciál [V] 2,65 van der Waalsův poloměr [pm] 135 elektronegativita 4,0 vzdálenost F-F v F 2 [pm] 143 Pro strukturu perfluorovaných látek jsou nejvýznamnější vysoké hodnoty ionizační energie, redox potenciálu, elektronové afinity, elektronegativity fluoru a jeho obtížná polarizovatelnost [2]. 3.2 Fyzikální a chemické vlastnosti PFCs Fluor je v iontové formě jeden z nejreaktivnějších prvků. Vázaný je však velmi stabilní. Z tohoto důvodu jsou plně fluorované uhlovodíky na vzduchu stálé (dokonce při teplotách převyšujících 150 C), nehořlavé, odolné vůči působení silných kyselin, zásad, oxidačních činidel a fotolýze [2]. Díky vysoké ionizační energii a nízké polarizovatelnosti fluoru jsou inter- a intramolekulární interakce velmi slabé. To má za následek nízké teploty varu PFCs oproti uhlíkatým homologům (T V C 8 F 18 = 97 C; T V C 8 H 18 = 125 C) a vyšší teploty tání [7]. PFCs jsou obecně látky těkavé. Tlak vodní páry klesá se rostoucí délkou uhlíkatého řetězce a molekulovou hmotností [8]. PFCs jsou oleofobní i hydrofobní povahy. Tato vlastnost se hojně využívá u ochranných nátěrů, povrchové úpravě tkanin, koberců či obalových materiálů na potraviny [7]. 11
4. SYNTÉZA PFCs 4.1 Elektrochemická fluorace (ECF) První z možností výroby PFCs, elektrochemická fluorace (ECF), byla detailně popsána Josephem H.Simonsem, který tuto metodu v roce 1937 vynalezl a patentoval [9]. ECF je založena na reakci mezi organickou surovinou např. 1-oktansulfonylfluoridem (C 8 H 17 SO 2 F) a bezvodým fluorovodíkem (HF) při napětí 5-7 V. Elektrický proud způsobí, že vodíkové atomy z uhlíkové kostry jsou nahrazeny atomy fluoru [2] jak je znázorněno na obr.2. Obr.2: Přiklad procesu elektrochemické fluorace [10] Výsledným produktem je látka se strukturou obdobnou výše uvedenému perfluoroktansulfonyl fluoridu (POSF). Během procesu ECF může docházet k fragmentaci a přeskupení uhlíkového skeletu. To vede ke vzniku různě dlouhých plně fluorovaných uhlíkových řetězců a směsi lineárních, rozvětvených a cyklických izomerů. Typicky 70-85% ze směsi tvoří lineární a 15-30% rozvětvené izomery [2]. 4.2 Telomerace (TM) Druhá možnost výroby PFCs,telomerace, byla původně vyvinuta Haszeldinem v roce 1949. Poté byla tato metoda přizpůsobena společností Du Pont Company pro radikálovou polymeraci ethylenu [10]. Komerčně se využívá reakce tetrafluoroethylenu s pentafluoroethyljodidem [2]. Produktem reakce je směs látek lišících se v délce uhlíkatého řetězce. Na rozdíl od ECF, u TM vznikají pouze lineární produkty, které však nejsou plně fluorovány, ale mají perfluorovaný lineární alkylový řetězec [2]. 12
5. PRŮMYSLOVÉ VYUŽITÍ PFCs Největším výrobce perfluorovaných látek byla a je společnost 3M Company (Minnesota Mining and Manufacturing Company). 3M produkuje jak finální komerční výrobky, tak i produkty, které jsou prodány jiným společnostem pro další zpracovávání. 5.1. Povrchová úprava tkanin Sloučeniny příbuzné perfluorooktansulfonátu (PFOS) jsou využívány jako ochranné vrstvy tkanin (koberce, textil, kůže) proti nečistotám jako je mastnota, voda a špína [11]. Díky aplikaci perfluorované látky na povrch perfluorovaným řetězcem orientovaným směrem od povrchu (obr.3) dojde ke snížení povrchového napětí a tím i ochraně povrchů před nečistotami [10]. Obr. 3: Povrchová úprava tkanin [10] 5.2 Obalové materiály U obalových materiálů dochází s využitím stejného mechanismus ochrany jako u ochrany tkanin ke zvýšení jejich odolnosti vůči smáčení tekutinami. Proto jsou tyto matriály hojně využívány při obalování potravin (sáčky, krabičky, papírové talíře apod.) a jako průmyslové obaly [12]. 13
5.3 Vodní hasicí pěny (AFFF) Hasící pěny obsahující fluor byly vyvinuty pro hašení hořlavých tekutin. Samotná voda má při hasebním zásahu tendenci klesnout pod hořící látku a není tak příliš účinná [12]. Hlavními složkami těchto pěn jsou kromě vody (69-71%), butyl carbitol (20%), amfoterní deriváty fluoroalkylamidu (1-5%), alkylsulfáty (1-5%), perfluoroalkylsulfonáty (0,5-1,5%), triethanolamin (0,5-1,5%) a tolyltriazol (0,05%) [13]. 5.4 Pokovování Látky příbuzné PFOS se používají ke snížení povrchového napětí pokovovacích roztoků. Přídavek perfluorované látky zabraňuje úniku aerosolu, který může obsahovat potenciálně škodlivé látky, z vany, kde pokovování probíhá [11]. Perfluorované látky našly uplatnění zejména při chromování, anodickém a kyselém moření [14]. 5.5 Fotolitografie a polovodiče Fotolitografie je nejdůležitějším krokem při výrobě polovodičů. Díky tomuto procesu dochází k minimalizaci polovodičových součástek, které jsou tak levnější, rychlejší a tím podporují rozvoj elektrotechniky [14]. 5.6 Fotografický průmysl Ve fotografickém průmyslu jsou PFCs aplikovány jako ochranná vrstva fotografických filmů, papírů a tiskových desek [14]. Zde působí perfluorované látky jako antistatická činidla, redukují tření, čímž zdokonalují přenos ve foto-zařízeních (kamerách, tiskárnách, projektorech) [11]. 5.7 Další použití PFCs jsou dále součástí průmyslových a domácích čistících prostředků, nátěrových hmot a aditiv, hydraulických kapalin pro letecký průmysl, pesticidů, retardátorů hoření a adheziv. Jsou známy i aplikace v lékařství a hornictví [14]. 14
6. VÝSKYT V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Malé množství látek obsahujících fluor se přirozeně vyskytují v biosféře jako produkty biologických a geochemických procesů. Některé druhy zelených rostlin produkují monofluorooctovou kyselinu (CH 2 FCOOH). Všechny fluorované látky produkovány biologicky však obsahují pouze jeden atom fluoru [15]. PFCs jsou látky antropogenního původu tzn. že se do prostředí dostávají pouze lidskou činností [16]. Zbytky perfluorokarboxylových kyselin mohou být emitovány do ovzduší pomocí přímých a nepřímých zdrojů. Mezi přímé zdroje patří především výroba a používání PFCAs, zatímco nepřímé zdroje jsou dány chemickými reakcemi v prostředí, které vedou ke vzniku těchto látek, nebo jejich degradaci (obr.4) [17]. APFO perfluorooktanoát amonný, APFN perfluorononanoát amonný, AFFF vodní hasící pěna (aqueous fire-fighting foam) Obr. 4: Nepřímé a přímé emisní zdroje PFCs [17] Perfluorované látky mají potenciál k dálkovému transportu, jsou tak nalézány i v místech, kde se nevyrábí ani nepoužívají [14] a to i v arktických oblastech [18-21]. Díky svým vlastnostem se dostávají do všech složek životního prostředí. Existují mnohé studie stanovení těchto látek ve vodě [18, 22-28], vzduchu [23, 26, 29-34], půdě [35] a hlavně v tělech různých živočišných druhů [19-21, 36-39] včetně člověka [40-42]. Příklady stanovení PFCs v jednotlivých složkách životního prostředí jsou uvedeny v příloze I-III. 15
7. DEGRADACE V PROSTŘEDÍ Perfluorované látky jsou z environmentálního hlediska řazeny mezi persistentní organické polutanty (POP). V roce 2009 byly na konferenci v Ženevě přidány na seznam látek Stockholmské úmluvy. Základními ekotoxikologickými POP charakteristikami jsou schopnost k dálkovému transportu, toxicita, persistence a bioakumulace viz. tabulka 5 [14]. Tabulka 5: POP charakteristiky pro PFOS [14] kritérium potenciál k dálkovému atmosférickému transportu toxicita persistence bioakumulace shoda s kritériem ANO/NE ANO ANO ANO ANO poznámka tlak páry = 3,31.10-4 Pa atmosférický poločas života > 2 dny odhadovaná hodnota vycházející z fotolytického poločasu života > 3,7 let subchronická expozice: úmrtnost u opic při dávce 4,5 mg/kg/den reproduktivní toxicita: úmrtnost u štěňat při dávce 1,6 mg/kg/den akutní toxicita u ryb: LC 50 * = 4,7 mg/l extrémně persistentní, nedegrabilní při chemických a biologických testech nalezeny vysoce zvýšené koncentrace u predátorů hypoteticky spočítaný BMF** = 22-160 BCF*** u ryb =2796-3100 *LC 50 - Lethal Concentration - letální dávka - koncentrace látky ve vdechovaném vzduchu, která po stanovené době způsobí smrt daného procenta (50) určeného druhu zvířat **BMF - Biomagnification factor - bioobohacovací faktor - poměr koncentrace chemické látky v predátorovi a jeho kořisti nejčastěji vztaženo na obsah lipidů ***BCF - Bioconcentration factor- biokoncentrační faktor - poměr koncentrace chemické látky v biotě vůči koncentraci v zevním prostředí Transformace a degradace perfluorovaných látek v životním prostředí jsou řízeny různými fyzikálními, chemickými a biologickými mechanismy. Ty mohou být jak abiotické např. hydrolýza a fotolýza, tak biotické, zejména mikrobiálními transformace [20]. V životním prostředí jsou dnes PFCs a zejména PFOS a PFCAs všudypřítomné. Dříve nebyly zdroje znečištění zcela známé [20]. Dnes jsou za prekurzory považovány hlavně fluorotelomerní alkoholy [4, 20]. PFOS je sice málo těkavý, některé jeho prekurzory jsou však značně volatelní: N-ethyl perfluorooktansulfonamidoethanol (N-EtFOSE), N-methyl perflurooktansulfonamidoethanol 16
(N-MeFOSE), methyl perfluorooktansulfonamid (MeFOSA), ethyl perfluorooktansulfonamid (EtFOSA) a heptadekafluorooktansulfonamid (FOSA). Tyto látky se pak mohou vypařovat do atmosféry, kde dochází k jejich degradaci [16]. Rychlost reakce těchto prekurzorů v atmosféře závisí především na jejich fotochemické reaktivitě (reakce s hydroxylovými ionty). Konečným produktem degradace je při aerobních podmínkách PFOA a při anaerobních PFOS viz. obr. 5 [4, 20, 43]. Obr.5: Schéma mikrobiální degradace N-EtFOSE v odpadním kalu [43] 8. TOXIKOLOGICKÉ VLASTNOSTI S ohledem na chemické a fyzikální vlastnosti a průmyslové využití se jako potenciální látky s toxikologickými účinky jeví perfluorooktanová kyselina (PFOA) a perfluorooktansulfonan (PFOS). Toxicitu těchto látek významně ovlivňuje jejich osud v prostředí a transportní mechanismy [44], přesto přesný mechanismus toxického účinku není dosud zcela znám [10]. 8.1 Toxikologické studie Existuje několik toxikologických studií perfluorovaných látek, které jsou zaměřeny na různé druhy toxicity (akutní, subchronická, chronická, dermální). Jako pokusná zvířata při testech toxicity jsou používáni potkani [45-50], myši [46], králíci [48] a opice [51, 52]. Význam mají i toxikologické studie u lidí, a to jak u běžné populace tak u pracovníků, kteří přicházeli s PFCs do styku během výkonu povolání [53-55]. 17
První zpráva o přítomnosti organického fluoru u lidí byla podána Tavesem a jeho spolupracovníky v roce 1968. V roce 1976 se poprvé prokázalo, že fluor se v lidském těle vyskytuje ve formě perfluorooktanové kyseliny (PFOA) nebo perfluorosulfonanu (PFOS), toto bylo poté několikrát potvrzeno [42, 56-62]. 8.1.1 Studie toxicity na zvířatech Souhrnné studie toxicity dávají podrobné informace o letálních dávkách a nepříznivých účincích na různé organismy [16, 63]. Testy akutní toxicity byly prováděny na hlodavcích (potkani, myši, morčata), subchronická toxicita byla zkoumána u opic rodu Cynomolgus a míra podráždění kůže a očí byla studována zejména u králíků albínů, ale i u potkanů. Podle výsledků studií jsou PFOS a PFOA přednostně distribuovány do krevního séra, ledvin a zejména jater [64]. Hodnoceny byly taktéž perfluoroalkylkarboxylové kyseliny (PFCAs) a podíl jejich toxicity na celkové toxicitě PFCs. PFCAs s delšími řetězci jsou méně eliminovány močí, a tím jsou potenciálně toxičtější. Na rychlost jejich vylučování z organismu má vliv i hladina testosteronu. Vykastrováním samců a samic docházelo k vylučování PFCAs rychleji [49]. 8.1.2 Obecná populační studie vývojová toxicita u novorozenců Díky všudypřítomnému výskytu, persistenci a bioakumulačním vlastnostem jsou PFOS a PFOA nalézány v krvi běžné populace po celém světě. Existuje celá řada studií, které se zabývají zejména přechodem PFCs z matky na plodu [56-62]. Většina studií má obdobné výsledky. Prozatím nejsou zcela potvrzena spojení mezi koncentrací PFCs a účinkem na plod (porodní váha a délka, motorický a mentální vývoj apod.). Avšak Midash dokázal, že PFOS i PFOA jsou schopny průchodu přes placentu [61]. 8.1.3 Toxikologická studie zaměstnanců Jak bylo uvedeno v kapitole 4, PFCs jsou látky průmyslově vyráběné. Z tohoto důvodu jsou nejvíce exponovány osoby, které se přímo na výrobě těchto sloučenin podílí, nebo PFCs zpracovávají na konečné produkty. Dotazníkové studie u zaměstnanců zhodnotily výskyt různých zdravotních obtíží (rakovinová bujení, onemocnění jater, žaludeční vředy, žlučové kameny, zánět žlučníku a močového měchýře apod.) ve spojení s expozicí PFCs [53-55]. Klinické testy však neprokázaly výrazné změny v parametrech hematologických, jaterních, štítné žlázy a moči u exponovaných osob [53]. Žádná výše uvedená studie neprokázala, že by expozice PFCs ovlivnila vznik benigních či maligních nádorových onemocnění [53-55]. 18
9. METODY EXTRAKCE, SEPARACE A DETEKCE 9.1 Extrakční techniky Extrakčních technik při stanovení PFCs je velká řada, liší se zejména dle použité matrice a druhu stanovaných PFCs. Využití jednotlivých extrakčních technik v závislosti na matrici je přehledně znázorněno na obrázku 6. Obr. 6: Extrakční a čistící metody pro stanovení PFCs v environmentálních a lidských matricích [65] Pro extrakci PFCs z pevných matric (především prachu) se využívá zejména extrakce ultrazvukem s následnou filtrací [31, 34]. Jako extrakční činidlo je většinou použit methanol (acetonitril) v kombinaci s kyselinou mravenčí. Navážka prachu se převede do centrifugační nádobky, kam se přidá odpovídající množství extrakčních rozpouštědel a roztok se vloží do ultrazvuku [34]. Po uplynutí doby extrakce je vzorek buď centrifugován nebo filtrován přes prázdnou SPE kolonku opatřenou filtrem [31] nebo přímo měřen [34]. Nelze však vyloučit i jiné postupy např. tlakovou extrakci rozpouštědlem (PSE) [66] nebo extrakci podle Soxhleta [67]. 19
Další možností pro extrakci perfluorovaných látek z tuhých matric (především bioty) je použití tzv. ion-pair extrakce [38, 68-70], poprvé popsané Hansenem [71]. Tento postup je založen na iontové reakci řetězce perfluorované látky s tetrabutyl ammonium hydrogensulfátem v alkalickém prostředí (ph 10). Vzniklý objemný iontový pár je buď vytřepáním, nebo ultrazvukem převeden do nepolárního methyl-terc-butyl etheru. Po centrifugaci je odebrána alikvotní část organického rozpouštědla a postup opakován (2-3x). Tento typ extrakce byl využit i při extrakci PFCs ze sedimentů [72] a ukazuje se být univerzálním extrakčním postupem pro extrakci PFCs z pevných matric bez nutnosti čištění. Příprava vzorku, extrakce a prekoncentrace PFCs by měla obsahovat co nejmenší počet kroků. Stanovení perfluorovaných látek je totiž velmi náchylné na vnější kontaminaci ze vzduchu, laboratorního skla, přístrojů i z oděvu pracovníka. Aby se eliminoval vliv vnějšího znečištění na výsledné koncentrace PFCs, je zapotřebí znát pozaďové kontaminace (blank) každé z používaných metod. Tímto krokem určíme míru kontaminace během přípravy vzorků, jejich extrakci a během vlastního analytického stanovení. 9.2 Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) HPLC se separační chromatografická metoda. K separaci látek dochází mezi dvěmi fázemi, v případě HPLC je stacionární fází sorbent vázaný na koloně a mobilní kapalina proudící kolonou. Při styku stacionární a mobilní fáze s analytem dochází k vzájemným interakcím, které jsou předpokladem pro separaci látek [73]. 9.3 Hmotnostní spektrometrie (MS) Hmotnostní spektrometrie je separační metoda, která převádí vzorek na ionizovanou plynnou fázi a vzniklé ionty jsou separovány dle hodnoty podílu jejich hmoty a náboje m/z. MS tak stanovuje relativní četnost iontů dle m/z. Jedná se o destrukční metodu. 9.3.1 Princip MS Základní procesy této techniky: odpaření vzorku ionizace separace iontů hmotnostním filtrem detekce iontů 20
9.3.2 Ionizace Ionizace je proces, při kterém se z elektricky neutrálního atomu, molekuly nebo radikálu stává iont dodáním dostatečného množství energie [74]. Existuje celá řada ionizačních technik, z nichž dnes mají největší praktický význam [75]: ESI (ionizace elektrosprejem), APCI (chemická ionizace za atmosférického tlaku, APPI (fotoionizace za atmosférického tlaku) pro spojení HPLC-MS ESI, MALDI (ionizace laserem za účasti matrice) pro analýzu biomolekul EI (elektronová ionizace) pro spojení GC-MS V experimentální části této práce je využívána ionizace elektrosprejem, proto je dále podrobněji popsána. 9.3.3 Ionizace elektrosprejem (ESI) Ionizace elektrosprejem patří mezi tzv. měkké ionizační techniky. To znamená, že při ionizaci nedochází ke fragmentaci molekuly, ale pouze k jejímu nabití. Analyt vystupující z chromatografické kolony, při spojení HPLC-MS, je kontinuálně přiváděn do iontového zdroje kovovou kapilárou. Na tuto kapiláru je vkládáno vysoké napětí 1-5 kv, které vytváří elektrostatické pole. Na výstupu z kapiláry vznikají kapičky, které jsou odpařovány sušícím plynem (nejčastěji dusík), čímž dojde ke zvýšení povrchové hustoty náboje. Podle povahy vkládaného napětí tak vznikají protonované molekulární ionty nebo deprotonované molekulární ionty. Vzniklé ionty jsou vtahovány systémem potenciálů vložených na elektrody do analyzátoru s vysokým vakuem. Obr.7: Ionizace elektrosprejem [76] 21
9.3.4 Hmotnostní analyzátory Hmotnostní analyzátory jsou zařízení, které rozlišují ionty podle jejich m/z. Běžné typy hmotnostních analyzátorů [77]: time-of-flight (TOF) kvadrupólový analyzátor (Q) lineární iontová past (LIT) kvadrupólová iontová past (QIT) V současné době se při stopových analýzách environmentálních vzorků přechází k používání trojitých kvadrupólů. 9.3.5 Kvadrupólový analyzátor (Q) Kvadrupólový analyzátor si lze představit jako čtyři hyperbolické nebo válcovité rovnoběžné tyčové elektrody, na které je přiváděno stejnosměrné napětí a složka radiofrekvenčního pole. Protilehlé elektrody mají vždy stejné potenciály. Napětí vložená na tyčové elektrody jsou zvolena v daném čase tak, aby mezi tyčemi proletěly jen ionty o určité hodnotě m/z nebo s hodnotami m/z v určitém intervalu [74, 77]. 9.3.6 Hybridní analyzátor QTRAP Hybridní analyzátor spojuje výhody kvadrupólu a lineární iontové pasti. Jedná se v podstatě o trojitý kvadrupól, kde třetí kvadrupól (Q3) může pracovat jako lineární iontová past. V prvním kvadrupólu (Q1) dojde k izolaci prekurozorového iontu. Ve druhém kvadrupólu (Q2), který zastává funkci kolizní cely, nastane disociace prekurzorového iontu, vzniká tak široké spektrum produktových iontů. Produktové ionty putují z Q2 do Q3, který může pracovat jako lineární iontová past (LIT), nebo opět jako kvadrupól. LIT akumuluje produktové ionty a po optimálním naplnění pasti jsou všechny zachycené ionty skenovány na detektoru. Většina matrice je odstraněna v Q1, nedochází tak k zanášení LIT. Použitím hybridního analyzátoru se tak výrazně zvýší citlivost [78, 79]. Obr. 8: Hybridní trojitý kvadrupól / lineární iontová past QTRAP [78] 22
9.3.7 Hmotnostní spektrum Hmotnostní spektrum je záznam relativní četnosti iontových druhů v závislosti na m/z [74]. Obecně platí, že nejintenzivnější pík je nazýván hlavní (base peak) a jeho intenzita je považována za 100%. K tomuto píku jsou vztaženy intenzity ostatních píků ve spektru. Druhým významným píkem ve spektru je pík molekulární. Svou polohou naznačuje jaká je molární hmotnost zkoumané látky. U měkkých ionizačních technik tzn. i u ESI je nejvýznamnějším píkem právě pík molekulární, neboť zde nedochází k fragmentaci mateřské molekuly. 9.3.8 Multiple reaction monitoring (MRM) Pro zlepšení detekčních limitů jsou využívány dva přístup: SIM (selected ion monitoring) a MRM (multiple reaction monitoring). V SIM módu je nepřetržitě monitorován jediný iont, ostatní ionty nejsou detekovány. Je využívaný v případě, že je k dispozici pouze jednoduchý MS, nebo v případě, že látka se není schopna v kolizní cele štěpit na dceřiné ionty. Pokud je látka lehce štěpitelná, využíváme tzv. multiple reaction monitoring. Ten již vyžaduje použití MS/MS techniky [80]. MRM jako kvantitativní technika obecně poskytuje vyšší selektivitu než SIM mód. U MRM je předem zvolen jeden nebo více prekurzorových iontů. Pro každý prekurzorový iont je vybrán jeden specifický produktový iont a tomu je umožněno projít do další analyzační etapy a poté být detekován [81]. Poměr intenzit prekurzorového a produktového iontu je právě zmiňovaný multiple reaction monitoring. 9.4 Spojení HPLC-MS/MS pro stanovení PFCs v prachu a vzduchu Z příloh I-III je patrné, že ke stanovení PFCs ve vzduchu je častěji používána plynová chromatografie (GC) ve spojení s hmotnostní spektrometrií (MS) [29, 30, 33, 34, 82]. To vyplývá z povahy vzorku. Takto se stanovují PFCs, které jsou těkavé a jako takové je snazší je vnášet do GC než do LC. Přesto jsou známa i stanovení PFCs ve vzduchu, ale především v prachu pomocí HPLC-MS/MS. Dinglasan ve své práci použil jak GC/MS pro stanovení těkavých produktů transformace a telomerní alkoholy, tak LC-MS/MS pro netěkavé metabolity (PFOA). Při využití LC- MS/MS použil ionizaci ESI v negativním módu, napětí kapiláry 2,9 kv a trojitý kvadrupól jako analyzátor. Jednalo se však o stanovení biodegradace flurotelomerů, nicméně telomerní alkoholy jsou těkavé a je možné předpokládat jejich přítomnost ve vzduchu [4]. 23
Murakami podal první zprávu o kontaminaci pouličního prachu perfluorovanými sloučeninami. Analýze byl podroben pouliční prach z Tokya. Analyty byly z prachu vyextrahovány tlakovou extrakcí rozpouštědlem (PLE). Separace probíhala pomocí HPLC, gradientovou elucí. Jako mobilní fáze byly použity acetonitril a destilovaná voda s přídavkem octan amonného. Jako detekční metody byla zvolena MS/MS s použitá ESI v negativním módu. Teplota kapiláry byla 350 C. Ve vzorcích prachu byla detekována přítomnost pěti PFCs PFOS, PFOA, PFNA, PFDA, PFUdA [66]. Stěžejní prací pro praktickou část této práce byl článek publikován Katem. Analyzoval prach z domácností vysoce výkonnou metodou on-line SPE-HPLC-MS/MS. Prach byl extrahován methanolem a kyselinou octovou v ultrazvukové lázni. Separace byla prováděna HPLC gradientovou elucí vody a acetonitrilu s přídavkem octanu amonného (ph=4). Ionizační technikou byl rozžhaveným elektrosprejem (HESI) v negativním módu. Napětí kapiláry bylo nastaveno na hodnotu -3000 V a teplota kapiláry na 285 C. Hmotnostní spektrometr pracoval v SIM módu a detekoval přítomnost 17 PFCs, přičemž limit kvantifikace byl < 4 ng/g [31]. 24
III. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 10. PŘÍSTROJE A POMŮCKY systém na přípravu ultračisté vody SIMPLICITY 185; Millipore (USA) váhy PL202-S2 METTLER TOLEDO (Švýcarsko) vortex typ classic VELP SCIENTIFICA (Itálie) ultrazvuková lázeň PS03000A; Powersonic (USA) kapalinový chromatograf Agilent 1100 (USA) (obr.9a) hmotnostní spektrometr QTRAP5500, AB SCIEX (USA)(obr.9B) stříkačkové filtry (tabulka 6) Tabulka 6: Označení použitých stříkačkových filtrů označení filtru materiál průměr velikost pórů objem [mm] [μm] vzorku [ml] N nylon 25 0,45 ~ <137 C nylon 25 0,45 2-10 <137 B nylon 30 0,45 ~ ~ S PES 30 0,22 ~ <30 Z nylon 13 0,45 1-10 <30 zádržný objem [μl] Obr. 9A: Kapalinový chromatograf Agilent 1100 [83] Obr 9B: - AB SCIEX QTRAP 5500 [84] 11. CHEMIKÁLIE octan amonný CH 3 COONH 4 - SIGMA ALDRICH (Německo) kyselina mravenčí HCOOH - SIGMA ALDRICH (Německo) methanol (MeOH) - SIGMA ALDRICH (Německo) redestilovaná voda 25
12. PŘÍPRAVA VZORKŮ A EXTRAKCE 12.1 Měření pozaďových kontaminací stříkačkových filtrů Z důvodu předpokládané kontaminace během extrakčních technik bylo nutné změřit pozaďové kontaminace každého stupně přípravy vzorku. Pro tento účel byla vybrána vata, jako simulace stanovované matrice (domácího prachu). Byly měřeny koncentrace 16 perfluorovaných látek. Vzorky byly připraveny do centrifugačních zkumavek následujícím postupem. V první fázi bylo postupováno podle publikace uveřejněné Katem. Bylo odváženo 300 mg nečištěné vaty, přidány 2 ml 0,1M kyseliny mravenčí (HCOOH) a 2 ml MeOH (SIGMA ALDRICH). Zkumavka byla uzavřena zátkou a promíchána na vortexu po dobu 10 s. Následně byly zkumavky vloženy do ultrazvukové lázně na 10 minut. Směs ze zkumavky byla přesunuta do injekční stříkačky opatřené filtrem a směs byla přefiltrována. K analýze na HPLC byl do minivialek odebrán 1 ml extraktu. Tímto postupem byly připraveny dvě paralelní sady vzorků za využití pěti různých stříkačkových filtrů s různým typem membrán, velikostí, zádrží vzorku s označením N,C,B,S,Z (Tab. 6) tzn. celkem 10 vzorků a dva paralelní blanky pro zjištění potenciální kontaminace z vaty (vzorky sady 091015_01). Blanky obsahovaly pouze MeOH a HCOOH a prošly stejným postupem. Po analýze této sady vzorků byl vyloučen filtr s označením Z (dle tabulky 6), neboť měl malý průměr a nedocházelo tak ke kvantitativnímu převedení vzorku za zkumavky do stříkačky. 12.2 Úprava designu solid-liquid extrakce Další sada vzorků (091015_02) byla připravena výše uvedeným postupem, přičemž byla použita přečištěná vata (označení typ filtru + vata). Tento postup extrakce však nebyl příliš efektivní. Byl zde problém s kvantitativním převedením směsi ze zkumavky do stříkačky. Proto byla další sada vzorků připravena přímo ve stříkačce. Ústí stříkačky byla utěsněna u jedné sady vzorků parafilmem (označení typ filtru + parafilm), u druhé byly použity kohouty na SPE kolonky (označení typ filtru + kohout). Parafilm dobře netěsnil, proto byl z dalších experimentů vyloučen. Po analýze těchto vzorků (sada 091015_2) a jejich porovnáním s blanky byla vyhodnocena pozaďová kontaminace filtrů a nejlepší design experimentu. Jako vyhovující byly označeny filtry značeny písmeny B a N (dle tabulky 6). Za použití těchto filtrů byla připravena další sadu vzorků (označení 091027). 26
12.3 Opakovatelnost extrakční techniky Poslední sada vzorků (označením 091027) posloužila k ověření správnosti dat naměřených v předchozích krocích. Zde byly použity pouze dva filtry, které se vykazovaly nejnižší kontaminaci a paralelním měřením 7 vzorků bylo zjištěno, zda je kontaminace filtrů náhodná, či přetrvávající. 12.4 Podmínky analytického stanovení Vzorky byly analyzovány na přístroji Agilent 1100. Pro analýzu byla využita gradientová eluce mobilní fáze pomocí binární pumpy. První minutu protékala systémem pouze směs 55% MeOH a 45% 5mmol octanového pufru, u které nebylo upravováno ph. Hodnota ph pufru tak byla 7. Od druhé do 11 minuty tvořilo mobilní fázi ze 70% MeOH a z 30% směs 55% MeOH a 45% 5mmol octanového pufru. Program poté pokračoval promýváním směsi MeOH a pufru po dobu 7 minut, aby došlo k opětovnému ustanovení rovnováhy na koloně. Průtok mobilní fáze byl nastaven na 200 μl/min. Nástřik na kolonu byl 5 μl. Pro separaci byla vybrána kolona SYNERGI 4u Vision RP 80A o rozměrech 50 x 2 mm (Phenomenex, USA). Teplota kolony byla 20 C. Po separaci na koloně kapalinového chromatografu vstupovaly separované složky do hmotnostního spektrometru. Napětí na kapiláře v iontovém zdroji mělo hodnotu 4500 V a teplota v iontovém zdroji dosahovala teploty 450 C. Dále bylo potřeba nastavit parametry dusíku, který je vpouštěn do iontového zdroje i kolizní cely. Jako detektor byl použit elektronásobič, jehož napětí bylo nastaveno na 2000 V. 13. VÝSLEDKY Pro identifikaci perfluorovaných sloučenin byla použita zoptimalizovaná chromatografická metoda a optimální podmínky pro hmotnostní detektor. Jednotlivé MRM přechody 17 analyzovaných látek a jednotlivé parametry hmotnostního detektoru jsou uvedeny v tabulce 7. Tabulka zobrazuje MRM přechody standardů perfluoroalkylkarboxylových kyselin a perfluoroalkylsulfonanů (2 přechody pro každou z látek), jejich deklastrační a vstupní potenciály, kolizní energie a výstupní potenciály na kolizní cele. PFCs v měřených vzorcích byly kvantifikovány na základě změřených kalibračních roztoků (koncentrace 0,1 ng/ml - 100 ng/ml) a sestrojené kalibrační závislosti. 27
Tabulka 7: MRM přechody pro jednotlivé perfluorované látky Q1 Q3 ID DP EP CE CXP Q1 Q3 ID DP EP CE CXP 212,8 169,1 PFBA -20-8 -12-18 299,1 80,2 PFBS -45-13 -70-8 212,8 59,1 PFBA -20-8 -25-10 299,1 99,1 PFBS -45-13 -40-8 262,8 218,8 PFPA -40-9 -10-20 399,1 79,9 PFHxS -55-8 -60-10 262,8 140,8 PFPA -30-9 -5-9 399,1 99 PFHxS -55-8 -45-10 312,7 269 PFHxA -35-8 -13-25 448,7 79,9 PFHpS -50-7 -100-9 312,7 119 PFHxA -35-8 -26-9 448,7 99 PFHpS -50-7 -85-9 363 319 PFHpA -55-12 -15-25 498,7 79,8 PFOS -55-8 -120-10 363 168,8 PFHpA -55-12 -24-17 498,7 99,1 PFOS -55-8 -90-10 413 369 PFOA -45-7 -17-35 598,9 79,8 PFDS -45-10 -120-15 413 168,8 PFOA -45-7 -24-15 598,9 99 PFDS -45-10 -115-15 463 418,8 PFNA -40-11 -15-30 463 218,8 PFNA -40-11 -24-9 512,9 469 PFDA -50-5 -18-35 512,9 218,8 PFDA -50-5 -26-19 562,9 519 PFUnDA -45-8 -20-45 562,9 268,8 PFUnDA -45-8 -26-35 613 569 PFDoDA -45-12 -22-35 613 318,8 PFDoDA -45-12 -26-23 662,9 619 PFTrDA -50-13 -19-25 662,9 168,8 PFTrDA -50-13 -36-15 713 669 PFTeDA -65-13 -22-25 713 168,8 PFTeDA -65-13 -34-17 Q1 - MRM přechod na prvním kvadrupólu - kvantifikační Q3 - MRM přechod na třetím kvadrupólu kvalifikační Time - čas skenu jednoho MRM přechodu [ms] DP - declustering potential (deklastrační potenciál) [V] EP - entrance potential - vstupní potenciál [V] CE - collision energy - kolizní energie [V] CXP - collision cell exit potential - výstupní potenciál na kolizní cele [V] Obrázek 10 znázorňuje separaci perfluoro-alkylkarboxylových kyselin a perfluoroalkylsulfonanů dle délky jejich alkylového řetězce. Barvy v chromatogramu odlišují jednotlivé MRM přechody. Pro kvantifikaci jednotlivých látek v měřených vzorcích byly použity pouze první z dvojice MRM přechodů pro danou sloučeninu s vyšší intenzitou (v tabulce 7 zvýrazněné žlutou barvou). Pro optimalizaci podmínek separace bylo připraveno 7 kalibračních vzorků standardů v rozmezí koncentrací 0,1-100 ng/ml. Tyto vzorky byly proměřeny a kalibrační křivky byly analyzovány pomocí lineární regrese (Grafy 1 a 2). Limity detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ) byly vypočítány dle Grahamovy metody z kalibračních diagramů. Srovnání MRM 28
módů a limitů detekce s poměrem signál/šum (S/N) byly zpracováno softwarem Analyst 3.1. Tato data jsou uvedena v tabulce 8. 1.10e6 1.00e6 8.00e5 A Intensity, cps 6.00e5 4.00e5 1.63 2.00e5 0.00 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 Time, min XIC of -MRM (12 pairs): Exp 2, 299.1/80.2 Da ID: PFBS from Sample 12 (kalibrace 10 ng/ml) of 100205.wiff (Turbo Spray) Max. 5.1e5 cp 6.6e5 6.0e5 5.0e5 B 1.71 Intensity, cps 4.0e5 3.0e5 2.0e5 1.0e5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 Time, min Obr 10: A Standardy perfluoroalkylkarboxylových kyselin (PFCAs) B Standardy perfluoroalkylsulfonanů (PFASs) Graf 1: Kalibrační graf perfluoroalkylkarboxylových kyselin (PFCAs) plocha píku 6,00E+07 5,00E+07 4,00E+07 3,00E+07 2,00E+07 1,00E+07 0,00E+00 Kalibrační graf perfluoroalkylkarboxylových kyselin 0 20 40 60 80 100 c [ng/ml] PFBA PFPA PFHxA PFHpA PFOA PFNA PFDA PFUnDA PFDoDA PFTrDA PFTeDA 29
Graf 2: Kalibrační graf perfluoroalkylsulfonanů (PFASs) Kalibrační graf perfluoroalkylsulfonanů 1,00E+08 9,00E+07 plocha píku 8,00E+07 7,00E+07 6,00E+07 5,00E+07 4,00E+07 3,00E+07 2,00E+07 1,00E+07 0,00E+00 PFBS PFHxS PFHpS PFOS PFDS 0 20 40 60 80 100 c [ng/ml] Tabulka 8: Regresní koeficienty, limity detekce a kvantifikace a poměr signál/šum pro jednotlivé perfluorované látky látka regresní koeficient LOD - limit of detection - limit detekce LOQ - limit of quantification - limit kvantifikace S/N - poměr signál/šum LOD LOQ S/N (1ng/ml) PFBA 0,9961 0,108 0,329 42,6 PFPA 0,9995 0,135 0,48 46,3 PFHxA 0,999 0,201 0,684 63,1 PFHpA 0,9997 0,132 0,413 38,1 PFOA 0,9838 0,086 0,278 152,6 PFNA 0,9678 0,147 0,494 351 PFDA 0,9653 0,189 0,553 254 PFUnDA 0,9468 0,269 0,739 365,9 PFDoDA 0,8974 0,203 0,486 296,4 PFTrDA 0,9467 0,214 0,53 426,3 PFTeDA 0,9935 0,242 0,853 344,8 PFBS 0,9863 0,112 0,432 562,7 PFHxS 0,9918 0,091 0,344 769,8 PFHpS 0,9517 0,043 0,134 1104,5 PFOS 0,9504 0,017 0,069 1121 PFDS 0,9524 0,051 0,155 2043,9 30
Výsledky v tabulce 9 shrnují výsledky extrakcí nečištěné vaty. Tato sada vzorků sloužila především ke zvýšení manuální zručnosti při přípravě vzorků a procesu extrakce. Tabulka 9:Koncentrace perfluorovaných sloučeni u sady vzorků 091015_01 látka koncentrace [ng/ml] blank 1 blank 2 N1 N2 C1 C2 B1 B2 S1 S2 Z1 Z2 PFBA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFPA ND ND ND ND < LOD ND ND ND ND ND ND ND PFHxA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFHpA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFOA < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD ND < LOD < LOD ND ND ND ND PFNA < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD ND ND < LOD < LOD ND ND PFDA ND ND ND ND ND ND ND ND < LOD < LOD ND ND PFUnDA < LOD < LOD ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFDoDA < LOD < LOD ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFTrDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0,0215 ND PFTeDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFBS ND ND < LOD ND < LOD < LOD ND ND < LOD ND ND ND PFHxS ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFHpS ND ND < LOD ND < LOD < LOD ND < LOD ND ND ND ND PFOS ND 0,00468 0,00459 0,00458 0,00408 0,0042 ND ND ND ND ND ND PFDS ND ND 0,0182 0,0182 0,0181 0,018 ND ND ND ND ND ND ND - not detected - nedetekováno <LOD - <limit of detection - pod limitem detekce Nicméně již výsledky z tabulky 9 ukazují na kontaminaci vzorků perfluorovanými látkami (PFCs). Cílem této fáze bylo zjistit, jak se jednotlivé složky (vata, použitý filtr) podílejí na pozaďové kontaminaci extrakční techniky. Z důvodu pravděpodobných ztrát během extrakce, bylo nutné změnit designu experimentu. Pro další měření byly vybrány filtry s označením N,C,B s S. Filtr s označením Z byl vyloučen z důvodu malé kapacity a průměru (13 mm). Výsledky analýz sady vzorků označené 091015_02 jsou uvedeny v tabulce 10. Na základě těchto výsledků byl nalezen nejlepší design experimentu, při kterém nedocházelo k únikům mimo extrakční nádobky a mohlo být provedeno vyhodnocení kontaminace používaných filtrů. Filtry s označením B a N ukázaly, že mají nejmenší pozaďovou kontaminaci, proto byly použity pro další experimety (sada vzorků 091027). Ty měly ukázat, zda je kontaminace filtrů náhodná, nebo jde o přetrvávající stav. Vybrané chromatogramy (obrázek 11 a12) znázorňují záznam separace perfluorovaných látek při extrakci ve zkumavce a následné filtraci přes filtr označený písmenem C (obrázek 11A,B) a při extrakci přímo ve stříkačce, jejíž ústí bylo uzavřeno parafilmem a filtrace proběhla taktéž 31
přes filtr C (obrázek 12A,B). Chromatogram s označením A je analyzován metodou pro perfluoroalkylkarboxylové kyselinya záznam B pro perfluoroalkylsulfonany. Z chromatogramu je vidět, jaká je úroveň pozaďové kontaminace při jednotlivých modifikacích extrakcí a jaká je úroveň šumu. Na pozaďové kontaminace se podílí především použitý filtr, protože ve změřených blancích rozpouštědel je kontaminace minimální. Sada vzorků se označením 091027 již měla ukázat, zda je kontaminace filtrů PFCs měřena opakovaně. Pro tuto sadu vzorků byly vybrány filtry N a B, které v předchozích analýzách dosahovaly nejlepších výsledků. Z výsledků je vidět, že kontaminace těchto filtrů je skutečně nízká a po opakování měření zůstává přibližné konstantní. Některé z látek jsou ovšem pod limitem detekce, což znamená, že byly nalezeny a mohou ovlivňovat naměřené koncentrace v reálných vzorcích. 32
Tabulka 10:Koncentrace perfluorovaných sloučenin u sady vzorků 091015_02 látka blank MeOH+HCOOH blank MeOH+HCOOH koncentrace [ng/ml] N1+vata N2+vata C1+vata C2+vata B1+vata B2+vata S1+vata S2+vata N1+parafilm N2+parafilm PFBA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFPA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND < LOD ND PFHxA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFHpA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFOA < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD ND < LOD < LOD ND ND ND ND PFNA ND ND ND ND < LOD < LOD ND < LOD ND < LOD ND ND PFDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFUnDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND < LOD < LOD PFDoDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFTrDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFTeDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFBS ND ND < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD 0,000216 < LOD 0,00271 < LOD PFHxS ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFHpS ND ND < LOD ND < LOD ND ND ND ND ND ND ND PFOS ND ND 0,0046 0,00458 0,00946 0,0084 0,0055 0,00387 0,0506 0,0375 ND ND PFDS ND ND 0,0187 ND ND ND ND ND ND ND ND ND látka koncentrace [ng/ml] C1+parafilm C2+parafilm B1+parafilm B2+parafilm S1+parafilm S2+parafilm N1+kohout N2+kohout C1+kohout C2+kohout B1+kohout B2+kohout PFBA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFPA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFHxA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFHpA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFOA ND < LOD < LOD ND < LOD < LOD ND ND ND ND ND ND PFNA ND ND ND ND ND ND ND < LOD ND ND ND ND PFDA < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD ND < LOD < LOD < LOD PFUnDA < LOD < LOD < LOD ND ND < LOD ND ND < LOD < LOD ND ND PFDoDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFTrDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFTeDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFBS 0,00208 0,000224 < LOD ND 0,0223 0,0126 ND ND < LOD < LOD ND ND PFHxS ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFHpS ND ND ND ND ND ND < LOD < LOD ND ND ND ND PFOS ND ND ND 0,00451 ND ND 0,00657 0,00488 ND ND ND 0,00456 PFDS ND 0,0186 ND ND 0,02 ND ND ND 0,018 ND ND 0,0181 33
A B Obr. 11: Extrakce PFCs ve zkumavce a následná filtrace přec filtr C A B Obr. 12: Extrakce ve stříkačce s parafilmem a následná filtrace přes filtr C 34
Tabulka 11: Koncentrace perfluorovaných sloučenin u sady vzorků 091027 látka blank 1 MeOH+ HCOOH blank 2 MeOH+ HCOOH blank 1 MeOH+ HCOOH blank 2 MeOH+ HCOOH koncentrace [ng/ml] B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 PFBA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFPA ND ND ND ND ND < LOD < LOD < LOD 0,00617 0,0206 ND 0,00882 0,0129 0,0457 0,0242 ND ND ND PFHxA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFHpA ND ND 0,0196 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFOA ND ND 0,0105 < LOD ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND < LOD ND ND ND PFNA ND ND < LOD < LOD ND ND ND ND ND ND ND < LOD ND ND ND < LOD < LOD < LOD PFDA ND ND < LOD < LOD ND ND ND ND ND ND ND < LOD ND ND ND < LOD < LOD < LOD PFUnDA ND ND < LOD ND ND ND ND ND < LOD < LOD ND ND ND < LOD < LOD ND ND ND PFDoDA ND ND < LOD < LOD ND ND ND ND < LOD ND ND ND < LOD ND ND ND ND ND PFTrDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFTeDA ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFBS ND ND ND ND 0,02 0,0222 0,0042 0,0074 0,00798 0,0194 < LOD 0,0419 0,0479 0,0544 0,0549 0,0304 0,0391 0,0402 PFHxS ND ND ND ND ND 0,0132 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFHpS ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PFOS ND ND ND ND 0,00472 ND ND ND ND ND ND ND ND 0,0042 ND ND ND ND PFDS ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 35