1.ÚVOD V posledních letech je věnována značná pozornost možnosti zlepšení zdravotního stavu člověka úpravou střevní mikroflóry. Probiotika jsou v popředí zájmů mnoha vědeckých institucí. Vědci se zaměřují na témata genetických modifikací mikroorganismů, které nabízejí šanci posílit probiotické vlastnosti bakterií. Potravinářský průmysl v návaznosti na nejnovější vědecké poznatky připravuje nové potraviny, jejichž konzumace napomáhá snižování rizika vzniku mnoha chronických a infekčních onemocnění. Teoretická část práce se zabývá shrnutím současných poznatků o schopnosti probiotických kultur kysaných mléčných výrobků regulovat složení a rovnováhu střevní mikroflóry a přispívat tak k pozitivnímu vlivu na zdraví člověka. Také je zde pojednáno o látkách povzbuzujících životaschopnost a aktivitu probiotických bakterií v tlustém střevě. Cílem experimentální části bylo zhodnotit kvantitativní zastoupení probiotických kmenů u různých kysaných mléčných výrobků v tržní síti brněnských supermarketů za období listopad 2006 - únor 2007. Byl stanoven celkový počet probiotických mikroorganismů mléčné fermentace a zvlášť počet bakterií rodu Bifidobacterium v kysaných mléčných výrobcích, které měly na obale deklarován obsah této probiotické kultury. Kysané mléčné výrobky byly srovnány mezi sebou podle stanoveného počtu mikroorganismů. Hledal se vztah mezi počtem stanovovaných mikroorganismů a obsahem tuku, resp. přítomností ochucující složky. Hodnoty počtu stanovovaných mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích byly porovnány i s platnými legislativními požadavky. 1.1 Funkční potraviny Funkčních potravin patří v oblasti lidské výživy mezi nejsledovanější témata. Jsou to potraviny, které obsahují kromě své nutriční hodnoty také složky mající v lidském organismu určitou specifickou fyziologickou a zdraví prospěšnou funkci. Nejsou zaměřeny na léčení konkrétních nemocí, působí na organismus preventivně, takže vytvářejí předpoklady pro udržení zdraví (1). - 7 -
Označení designer foods, pharmafoods, nutriceutika jsou synonymy pro funkční potraviny. Často zmiňovanými termíny v souvislosti s funkčními potravinami jsou probiotika, prebiotika a symbiotika (1). Do popředí zájmu se dostávají probiotické potraviny, mezi nimiž dominují fermentované mléčné výrobky s přídavkem probiotických bakterií. Probiotické potraviny obsahují živé probiotické kmeny, které vytvořily fermentovaný výrobek nebo byly přidány do potravin bez znatelného ovlivnění jejich organoleptických vlastností (1). Podle průzkumu trhu se v zemích EU zájem o nutričně modifikované výrobky zvyšuje. V současnosti se vyvíjejí stále nové kmeny probiotických kultur s lepšími funkčními vlastnostmi a předmětem dalších vědeckých výzkumů zůstává hypocholesterolemické a antikarcinogenní působení probiotických bakterií (15). Probiotické potraviny jsou v České republice zastoupeny na trhu v obdobném rozsahu a sortimentu jako v ostatních členských státech EU. Významně převažují fermentované mléčné výrobky (32). 1.2 Fermentované mléčné výrobky Podle Vyhlášky Ministerstva zemědělství ČR č.77/2003 Sb. se jako fermentovaný mléčný výrobek označuje výrobek, který je získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi za použití mikroorganismů mléčného kysání, tepelně neošetřený po kysacím procesu. Tato vyhláška též stanovuje pro jednotlivé skupiny kysaných mléčných výrobků množství bakterií použité mikrobiální kultury (2). 1.2.1 Sortiment kysaných mléčných výrobků Mezi kysané mléčné výrobky patří: jogurt (nízkotučný nebo odtučněný, se sníženým obsahem tuku, smetanový), jogurtové mléko, acidofilní mléko, kefír, kefírové mléko, kysané mléko nebo smetanový zákys, kysaná nebo zakysaná smetana, kysané podmáslí, kysané mléčné výrobky s bifidokulturou (2). Podle použité suroviny a kultur mikroorganismů lze rozdělit kysané mléčné výrobky na následující sortiment. - 8 -
1.2.1.1 Kysané mléčné výrobky s použitím termofilních kultur Jedná se především o jogurty a jogurtová mléka. Jogurtové kultury (Streptococcus salivarius subsp. thermophilus a Laktobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus v poměru 1:1) (3). Ve finálním výrobku musí být podle výše zmíněné vyhlášky koncentrace živých mikroorganismů 10 7 v 1g. Jogurtové výrobky mohou kromě základní jogurtové kultury obsahovat i kultury probiotické (3). 1.2.1.2 Kysané mléčné výrobky s použitím mikroorganismů Lactobacillus acidophillus nebo Bifidobacterium bifidum Acidofilní mléko. Je vyráběno z 1 dílu pasterovaného mléka, které je po záhřevu na 37 o C až 40 o C zaočkováno 1% až 2% kultury Lactobacillus acidophillus a 9 dílů pasterovaného mléka zakysaného smetanovým zákysem, tj. s použitím kultur Laktococcus lactis subsp.lactis, Laktococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetilactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris (4). Kysaný mléčný nápoj (biokys) je vyráběn z 1 dílu mléka zakysaného Lactobacillus acidophillus a 9 dílů pasterovaného mléka, zakysaného probiotickými kulturami Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum a Pedicoccus acidolacti (4). Mléčná mikroflóra výrobku musí podle výše zmíněné vyhlášky obsahovat koncentraci živých kultur Laktobacillus acidophilus v počtu 10 6 v 1g. Kysané podmáslí. Podmáslí je smetanovým zákysem fermentovaný vedlejší produkt vznikající při výrobě másla. K inokulaci se používají jogurtové kultury společně s kulturami Bifidobacterium bifidum a Bifidobacterium longum (4). Některé mléčné výrobky se během zpracování fortifikují prebiotiky, které přispívají k růstu bifidobakterií. Přídavek prebiotik (většinou oligosacharidy) zvyšuje stabilitu bifidobakterií během skladování výrobku (28). 1.2.1.3 Kysané mléčné výrobky s použitím bakterií mléčného kvašení a kvasinek Vedle mléčného kysání zde probíhá i alkoholové kvašením laktózy za vzniku ethanolu a oxidu uhličitého, který dodává výrobků mírně štiplavou chuť, pěnovitou konzistenci a příznivě působí na vylučování žaludečních šťáv v trávicím traktu. Obsah alkoholu závisí na délce zrání. Po 48 h při 20 o C je obsah alkoholu 0,5-0,9 % (3). - 9 -
Kefír a kefírové mléko. Kultura k přípravě kefíru má buďto formu kefírových zrn, nebo se jedná o čisté směsné kultury. Základem kefírové kultury jsou Laktobacillus acidophilus, Laktobacillus delbrueckii a Laktobacillu kefir, kvasinky Klayveromyces marxianus var. Marxianus a Candida kefir. Tato směsná kultura se míchá se smetanovou aromatickou kulturou o složení Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis biovar diacetilactis. Největší část mikroflóry tvoří streptokoky a tyčinkovité bakterie. Kefír má dle Vyhlášky Mze ČR č. 77/2003 Sb. obsahovat bakterie mléčného kysání v koncentraci 10 6 v 1 g a kvasinky v koncentraci 10 4. Kefírové mléko má ve stejném množství obsahovat bakterie mléčného kvašení v koncentraci 10 6 kvasinek v koncentraci 10 2 (2, 4). 1.2.1.4 Zakysané smetany Smetana je zakysaná smetanovým zákysem v množství 1 % až 2 % a po naplnění do expedičních obalů inkubována při teplotě 18 o C až 23 o C po dobu 16 hodin. Do krémovitých smetan je před zakysáním přidáván škrob. Podle druhu mohou mít různý obsah tuku od 12% do 40% (3). Tabulka 1 Druhy a minimální počty živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (Podle přílohy č. 2 k Vyhlášce Ministerstva zemědělství ČR č. 77/2003 Sb.) a Druh výrobku Acidofilní mléko Jogurty*) Kysané mléko, vč. smetanového zákysu, podmáslí a kysané smetany Kefír Kefírové mléko Kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou Použité mikroorganismy Lactobacillus acidophilus a další mezofilní, příp. termofilní kultury bakterií mléčného kvašení protosymbiotická směs Streptococcus salivarius subsp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus monokultury nebo směsné kultury bakterií mléčného kvašení zákys připravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících laktózu Kluyveromyces marxianus i nezkvašujících laktózu Sacharomyces unisporus, Sacharomyces cerevisiae, Sacharomyces exignus a dále Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve vzájemném společenství zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléčného kvašení v symbióze Bifidobacterium sp. v kombinaci s mezofilními a termofilními bakteriemi mléčného kvašení Mléčná mikroflóra výrobku v 1 g 10 6 Lactobacillus acidophilus 10 7 10 6 bakterie mléčného kvašení 10 6 a kvasinky 10 4 bakterie mléčného kvašení 10 6 a kvasinky 10 2 10 6 bifidobakterie - 10 -
1.3 Vliv fermentace mléka na zlepšení nutričních vlastností výrobku. Mléko je biologická tekutina velmi složitého charakteru. Normální kravské mléko má bílou nebo mírně nažloutlou barvu. Jsou zde rozpuštěny nebo emulgovány různé látky a plyny. Obsah vody je asi 87 %, obsah sušiny 13 %. Sušinu tvoří bílkoviny, laktóza, mléčný tuk, vitamíny a minerální látky. Mléko je významným a lehce dostupným zdrojem kvalitních živin ve výživě člověka. Bakterie mléčného kysání mají v mléčných výrobcích svůj nutriční význam. Fermentačními procesy bakteriálními kulturami se zlepší stravitelnost a využitelnost mléka. Dochází k částečnému štěpení proteinů, lipidů a sacharidů. Zvyšuje se též vstřebatelnost a využitelnost minerálních látek. Proto jsou nutričně a dieteticky kysané mléčné výrobky velmi významné (3). 1.3.1 Vliv fermentace na bílkovinnou složku výrobku Bílkoviny kysaných mléčných výrobků jsou lépe stravitelnější. Kasein je v nich koagulován. Většinou dochází ke kaseinolýze. Část mléčných bílkovin se štěpí bakteriálními proteázami (polypeptidázy, peptidázy) již při fermentaci na peptidy a volné aminokyseliny. Další část proteinů je koagulována kyselinou mléčnou (produkovanou bakteriemi mléčného kvašení), takže trávicí enzymy je mohou díky takto zvětšenému povrchu proteinů rychleji štěpit (6). Činností mikroflóry je v kysaných mléčných výrobcích zvýšen obsah některých volných aminokyselin (tryptofan, methionin, lyzin) (7). Z hlediska množství aminokyselin v mléce se kasein, laktalbumin a laktglobulin navzájem doplňují. Kasein obsahuje všechny esenciální aminokyseliny. Nejvíce obsahuje lysinu, nejméně cystinu a tryptofanu, kterých je zase optimální množství v laktalbuminu a laktglobulinu (6). Fosforylované peptidy, vznikající enzymovou hydrolýzou kaseinu, vytvářejí v zakysaném mléce rozpustné komplexy s vápníkem a významně zvyšují jeho biologickou dostupnost (12). Ze zakysaného mléka byly také izolovány hydrolyzáty kaseinu, které působí jako ACE-inhibitory s významným antihypertenzním účinkem (9). Hydrolyzáty kaseinu, α-laktalbumin, β-laktoglobulin, threonin, cystein se uplatňují i jako růstové faktory bifidobakterií (8,9). - 11 -
1.3.2 Vliv fermentace na sacharidovou složku výrobku Laktóza se během fermentativních pochodů v intestinálním ústrojí hydrolyzuje působením bakteriální β-galaktosidasy na D-galaktosu a D-glukosu, která se dále jejich enzymatickou činností mění na kyselinu mléčnou. Kyselina mléčná se ve fermentovaných mléčných výrobcích vyskytuje ve dvou optických izomerech. Pravotočivá L (+) kyselina mléčná je kompletně v lidském organismu metabolizována, levotočivá D (-) kyselina mléčná se přeměňuje jen omezeně a pozvolna. Lactobacillus acidophillus a bifidobakterie produkují převážně L (+) kyselinu mléčnou, kterou člověk snáze metabolizuje (7). Přítomnost kyseliny mléčné též potencuje vstřebávání aminokyselin sliznicí střeva (7). Působením mléčné kyseliny je kasein, který je přítomen v koloidním roztoku v podobě komplexu vazby kalciumkaseinátu-kalciumfosfátu, nestabilní a vede k tvorbě mléčného koagulátu. Kyselina mléčná odštěpuje vápník vázaný na kasein a vzniká volný kasein a mléčnan vápenatý (10, 12). Enzymovou hydrolýzou kaseinu vznikají kaseinfosfopeptidy. Ty vytvářejí v zakysaném mléce rozpustné komplexy s vápníkem. Tyto dva popsané mechanismy významně zvyšují biologická dostupnost vápníku. Kysané mléčné výrobky tak mají důležitou úlohu v prevenci osteopatií (11, 12, 17). Mezi nejvýznamnější rod, který zkvašuje laktózu na kyselinu mléčnou patří rod Laktobacillus. Podle produktů katabolického metabolismu se rozděluje tento rod na tzv. homofermentativní mléčné bakterie, které při zkvašování sacharidů produkují pouze kyselinu mléčnou a na tzv. heterofermentativní mléčné bakterie, které produkují vedle kyseliny mléčné ještě např. kys. octovou, etanol, glycerol a CO 2. Mezi homofermentativní druhy rodu Laktobacillus patří Laktobacillus delbrueckii, Laktobacillus acidophilus, Laktobacillus plantarum a Laktobacillus casei. Dále sem patří rody Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus. Mezi heterofermentativní druhy rodu Laktobacillus patří Laktobacillus fermentum, Laktobacillus brevis, Laktobacillus buchneri. Dále mezi heterofermentativní patří rod Leuconostoc (13). Jak už bylo zmíněno, je laktóza bakteriálními laktázami rozštěpena na monosacharidy glukózu a galaktózu. Dále probíhá u těchto sacharolytických bakterií glykolýza. Dochází k přeměně hexos (glukosy, galaktózy nebo fruktózy) na pyruvát. Ten je pak dále metabolizován u různých kmenů mikroorganismů odlišným způsobem (13, 14). U homofermentativních mléčných bakterií je pyruvát redukován za součinnosti NADH na laktát. Při tomto kvašení získávají mléčné bakterie volnou energii nezbytnou - 12 -
k růstu v anaerobním prostředí. Množství vzniklé kyseliny mléčné je u různých druhů kolísavé (13, 15). Heterofermentativní mléčné baktrie na rozdíl od homofermentativních neobsahují enzym aldolasu, který štěpí hexosa 1,6-bisfosfát ve dva triosafosfáty. Proto převádějí hexosy oxidačním mechanismem hexosafosfátového zkratu v ribosa 5-fosfát a oxid uhličitý. Tato pentosa 5-fosfát se pak enzymaticky štěpí na acetylfosfát a glyceraldehyd 3-fosfát. Z acetylfosfátu vzniká za součinnosti NADH ethanol. Glyceraldehyd 3-fosfát je glykolýzou přeměněn v pyruvát a pak na laktát (13). Metabolická dráha přeměny glukózy u homo, heterofermentativních bakterií a bifidobakterií kysaných mléčných výrobků (podle Maxy a Rady, 2002). - 13 -
Částečné odbourání laktózy na glukózu a galaktózu dostačuje, aby kysané mléčné výrobky mohli konzumovat i lidé s laktózovou intolerancí (16). Galaktóza je ve střevě resorbována rychleji než laktóza. Je důležitou složkou mozkových cerebrosidů. Podle Griegera a Holce (1990) přispívá též k rychlejší regeneraci intimy, což může mít protektivní účinky při ateroskleróze (6). Doprovodnou reakcí enzymové hydrolýzy laktosy je transgalaktosylace. β- galaktosidasa katalyzuje přenos galaktosylu, uvolněného po rozštěpení vazby mezi glukosou a galaktosou, na jiný sacharid přítomný v prostředí. V nejjednodušším případě jde o hydrolýzu za vzniku volné galaktosa. V ostatních případech vznikají galaktooligosacharidy, které se v malé míře mohou uplatňovat jako prebiotikum (14,19). Některé mléčné výrobky se během zpracování fortifikují prebiotiky, které jsou probiotickými bakteriemi ve střevě zkvašovány a přispívají tím k jejich růstu (25). 1.3.3 Vitamíny a využití vápníku kysaných mléčných výrobků V mléce je nedostatečné množství vitamínu D, K, E a kyseliny folové (3, 6, 20). Při pravidelné konzumaci kysaných mléčných výrobků jsou bakterie mléčného kysání schopny tento deficit vitamínů regulovat (20). Probiotické kultury produkují některé vitaminy. V lumenu syntetizují vitamín K, biotin, kyselinu listovou, kyselinu nikotinovou a pantotenovou, vitamíny B1, B2, B6 a B12 (21). Využití vápníku z kysaných mléčných výrobků je zmíněn v kapitole 1.3.2. - 14 -
1.4 Probiotika 1.4.1 Historie názvu Pojem probiotikum je řeckého původu a v překladu znamená pro život. I. I. Mečnikov je zakladatelem učení o probioticích a autorem koncepce antibiózy. V ní jde o potlačování růstu a jiných životních projevů jednoho mikroorganizmu jiným mikroorganizmem. Roku 1907 publikoval práci, v které jako první upozornil na příznivé zdravotní účinky konzumace fermentovaných mléčných výrobků (23). V roce 1917 Alfred Nissle publikoval práci o objevu nového kmene Escherichia coli, který nevykazuje patogenní vlastnosti a má inhibiční vliv na růst jiných mikrobů. Bakterie byla označena jménem svého objevitele a rokem, kdy byly její vlastnosti popsány. Lyofilizovaná biomasa E.coli kmene Nissle1917, sérotypu O6:K5:H1, se v klinické praxi používá jako probiotikum pod názvem Mutaflor (37). V roce 1965 byly jako probiotické označeny faktory, které jsou produkovány mikroorganismy a mají příznivý účinek pro podporu růstu jiných mikroorganismů. V roce 1996 Salminen a Schaafsma dále rozšířili definici probiotik. Salminen definuje probiotika jako živé mikrobiální kultury nebo mikrobiálními kulturami vzniklé mlékárenské produkty, které příznivě ovlivňují zdraví a stav výživy hostitele. Schaafsma definuje probiotika jako živé mikroorganismy, které v určitém množství mají příznivý zdravotní efekt přesahující základní výživnou hodnotu. V témže roce přikročil k definici pojmu probiotika Michael de Vrese. Probiotikem rozuměl přípravek nebo výrobek, který obsahuje živé, definované mikrorganismy, v dostačujícím množství, které jsou schopny změnit mikroflóru v určitém kompartmentu hostitele a vyvolají příznivý zdravotní efekt. V roce 1999 je probiotikum definováno jako doplněk stravy obsahující živé mikroorganismy, které prospěšně ovlivňují hostitele tím, že zlepšují mikrobiální rovnováhu v jeho střevech. V současné době je všeobecně přijímána definice, že probiotikum je živá mikrobiální součást potraviny, která při konzumaci dostatečného množství vykazuje příznivé účinky na zdraví konzumenta (22, 25, 26). - 15 -
1.4.2 Formy probiotik Probiotické mikroorganismy jsou nejčastěji používány jako doplňky stravy nebo jako součást některých mléčných výrobků. V případě doplňků stravy jde nejčastěji o lyofilizované kultury složené z jednoho nebo více druhů probiotických bakterií. Jsou vyráběny ve formě kapslí, tobolek nebo tablet.. Preparáty jsou strukturovány tak, že ochranná vrstva zabraňuje působení žaludeční kyseliny a trávicích enzymů na mikroorganismy. Vnitřní struktura tablet u některých preparátů obsahuje také vrstvu vitamínů a minerálních látek. Jsou složeny z různých kmenů laktobacilů, bifidobakterií a streptokoků (8). Zakysané mléčné výrobky s obsahem probiotické mikroflóry bývají nejčastěji vyráběny jako speciální nápoje, jogurty a jejich různé formy (8). Forma, ve které je probiotikum do trávicího ústrojí aplikováno, musí obsahovat dostatečné množství metabolicky aktivních bakterií schopných přežívat v trávicím ústrojí (kapitola 1.8). Usuzuje se, že v České republice jsou probiotické potraviny zastoupeny na trhu v obdobném rozsahu a sortimentu jako v ostatních členských státech EU. Významně převažují fermentované mléčné výrobky (60%). Lze očekávat rozšiřování sortimentu potravin obsahujících probiotika a prebiotika vzhledem k tomu, jak se hromadí další důkazy o zdravotních přínosech probiotik (24). 1.5 Probiotické mikroorganismy Všechny známé bakterie s probiotickým účinkem patří do skupiny bakterií mléčného kvašení, která zahrnuje rody Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium a Enterococcus. K probiotickým mikroorganismům se zařazují i kvasinky a nepatogenní Escherichia coli kmene Nissle 1917 (O6:K5:H1) (15). Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a Streptococcus thermophilus jsou sice řazeny mezi probiotika, ale tyto bakterie jen málo přežívají průchod horní částí gastrointestinálního traktu (5). Pozitivní vliv na lidské zdraví však mohou mít i jejich komponenty buněčných stěn (7, 21). - 16 -
Tabulka 2. Nejčastější komerčně dostupné kmeny bakterií s probiotickým účinkem (8, 15, 24, 25) Lactobacily L. acidophilus (L. acidophilus NCFM, L. acidophilus DDS-1, L. acidophilus SBT-2062, L. acidophilus LA-1/LA-5) L. rhamnosus (L. rhamnosus GG, L. rhamnosus GR-1, L. rhamnosus 271, L. rhamnosus LB 21) L. casei Shirota L. casei Immunitas L. paracasei CRL 431 L. delbrueckii subsp. bulggaricus L. reuteri (L. reuteri SD 2112/MM2) L. salivarius UCC 118 L. brevis L. cellobiosus L. curvatus L. fermentum L. plantarum G + koky Lactococcus lactis subsp. cremonis Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Enterococcus faecium Streptococcus diacetylactis Streptococcus. intermedius E. coli (sérotyp O6:K5:H1) Bifidobakterie B. bifidum B. adolescentis B. animalis B. infantis B. longum B. breve B. lactis B. thermophilum Kvasinky Saccharomyces boulardii - 17 -
1.5.1 Požadavky na vlasnosti probiotického kmene Probiotické bakterie se v některých svých vlastnostech odlišují od jogurtových nebo smetanových kultur využívaných k výrobě kysaných mléčných výrobků. Probiotický bakteriální kmen musí splňovat následující požadavky. 1.5.1.1 Zdravotní prospěšnost Kmeny bakterií s probiotickým účinkem musí mít schopnost kolonizace tračníku a adherence ke střevní mukóze, čímž zamezují adhezi patogenních mikroorganismů mít schopnost tvorby antimikrobiálních látek mít schopnost imunomodulace mít schopnost modulace funkce střevních epitelií mít antagonistický vliv na patogenní flóru Užitečnost pozitivně ovlivňovat zdravotní stav hostitele musí být měřitelná a klinicky dokumentovatelná. Musí tedy mít prokazatelně pozitivní vliv na zdraví hostitele (7, 23, 24, 25, 27). 1.5.1.2 Mikrobiolgické požadavky Kmeny bakterií s probiotickým účinkem musí být humánního původu, izolované ze stejného živočišného druhu jako je předpokládaný příjemce být u nich možnost přesného taxonomického zařazení, podrobná definice a typizace Schopnost kolonizace střeva a imunomodulace je vázána na vlastnosti určitého kmene a nemůže být extrapolována na jiné kmeny, byť téhož bakteriálního druhu. být netoxické a nepatogenní geneticky stabilní mít schopnost přežívat, růst a být metabolicky aktivní v trávicím ústrojí příjemce být rezistentní proti žaludeční kyselině, žlučovým kyselinám a pankreatickým šťávám být potencionálně rezistentní proti antimikrobiálním substancím původní mikroflóry příjemce (22, 23, 25, 27). - 18 -
1.5.1.3 Technologické požadavky Kmeny bakterií s probiotickým účinkem musí být natolik rezistentní, aby se nepoškodily v průběhu technologického zpracování, transportu a skladování. Musí také být přítomny v aktivní formě v dostatečném množství ve fermentovaném výrobku v době konzumu. Výběr vhodných probiotických kultur je také zaměřen na schopnost vytvořit příznivé organoleptické vlastnosti probiotické potraviny nebo schopnost tyto vlastnosti neovlivňovat (27, 31). 1.6 Relativita definice probiotik Požadavky na lidský původ probiotik jsou relativizovány skutečností, že Streptococcus boulardii má probiotické účinky a není lidského původu (23). Některé probiotické účinky vykazují nejenom živé mikroorganismy, ale i jejich neživé formy a určité komponenty buněčných stěn (7, 21). Za inhibici nádoru jsou zodpovědné muramyl peptidy, složky peptidoglykanů, buněčných stěn. Jejich protinádorové účinky jsou pravděpodobně založeny na aktivaci makrofágů (7, 23). Z výše uvedeného vyplývá potřeba, aby se definice probiotik stále vyvíjela v návaznosti na nejnovější vědecké poznatky. 1.7 Legislativní úprava probiotik V rámci EU zatím neexistuje žádný legislativní předpis, který by upravoval uvádění potravin s cíleně přidanými mikroorganismy na trh. V příloze č.2 k Vyhlášce MZe ČR č. 77/2003 Sb. - Fyzikální, chemické a mikrobiologické požadavky na jednotlivé mléčné výrobky a na druhy mikroorganismů mléčného kysání - jsou uvedeny druhy a minimální množství živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (2). - 19 -
1.8 Faktory ovlivňující přežití probiotické kultury ve výrobku a její následné schopnosti kolonizace tlustého střeva Přežití probiotické kultury ve výrobku závisí na interakci mezi přítomnými druhy, velikosti inokula, teplotě a trvání fermentace, skladovací teplotě, konečné kyselosti, použitém kmeni a složení fermentačního média (27, 28). Aby fermentované mléčné výrobky plnily svůj dietetický účel, musí být konzumovány co nejdříve po výrobě, nejpozději do 5 dnů. Výrobky s prodlouženou expirační dobou tento účel nesplňují. Veškerá mikroflóra je zde značně oslabena buď překysáním výrobku nebo přídavkem konzervačních látek (15). Nevyhovující jsou mléčné výrobky termizované, kde mikroflóra je částečně nebo zcela zlikvidována. Zbylé metabolity bakterií mléčného kysání ještě minimální účinky ve výživě mají, ale rozhodující je aktivní mikroflóra výrobku, která usměrňuje zejména nežádoucí mikrobiální pochody v intestinálním traktu člověka (15). Probiotické bakterie jsou v tlustém střevě v dostatečném množství prokazatelné jen po dobu přijímání potraviny s probiotiky. Nekolonizují tlusté střevo trvale. Proto je důležitá jejich pravidelná konzumace v dostatečném množství (23, 29). K dosažení potřebné koncentrace probiotických bakterií ve střevě je nutné, aby denzita těchto bakterií v konzumovaném mléčném výrobku nebo potravinovém doplňku činila 10 10. Jiní autoři uvádějí pro zajištění pozitivního účinku denní příjem10 8 až 10 9 probiotických buněk. Toto množství odpovídá konzumaci 100 g výrobku s obsahem 10 6 až 10 7 jednotek tvořících kolonie v 1 ml denně (28). Také jiní autoři se shodli, že terapeutické minimum probiotického produktu by mělo mít živých buněk probiotických bakterií při denní konzumaci 100 g výrobku hodnotu alespoň 10 6 jednotek tvořících kolonie v 1 ml (30, 7). Kromě výše zmíněných požadavků na denzitu probiotických mikroorganismů ve výrobku, má také velký vliv na prodloužení přežívání těchto mikroorganismů v gastrointestinálním traktu fortifikace výrobku prebiotiky (kapitola 1.10). 1.9 Růstové faktory Bifidobakterie vykazují v mléce pouze slabý nárůst. Potřebují přídavek růstových faktorů, aby dosáhly požadovaného počtu. Růst bifidobakterií podporuje například κ- kasein, α-laktalbumin,β-laktoglobulin, kvasničný extrakt, threonin, cystein, pepton, dextrin, maltosa a hydrolyzáty kaseinu, D-glukózamin, α-ethyl-n-acetyl-d-glukózamin, - 20 -
N-karboetoxy-D-glukózamin, N-acetylglukózamin, N-acetyl-laktoamin, N-Ndiacetylchitobióza a N-acetylneuraminová kyselina. Růst bakterie Lactobacillus acidophilus stimuluje kaseinový hydrolyzát, koncentrát syrovátkových bílkovin, fruktosa, rajčatová šťáva, kyselina octová a minerální látky (15, 25, 28). Vzhledem k nákladnosti obohacování výrobků aminosacharidy se některé výrobky fortifikují prebiotickými oligosacharidy, které jsou v tlustém střevě specificky těmito bakteriemi fermentovány. Patří mezi ně galaktooligosacharidy, inulin, rafinosa, fruktooligosacharidy a jiné (25). 1.10 Prebiotika V průběhu užívání probiotikých potravin nebo doplňků je možno probiotické kmeny ve stolici prokazovat. Za několik dní po přerušení přísunu tyto kmeny mizí. Hledají se metody dlouhodobé kolonizace kmenů probiotických bakterií do tlustého střeva. Řešení nabízí koncepce prebiotik (7). Prebiotika jsou definována jako složky potravy, které nejsou hydrolyzovány savčími enzymy v horní části gastrointestinálního traktu ani zde nejsou absorbovány. Nedotčené prochází do tlustého střeva, kde selektivně stimulují růst bakterií a zároveň tím potlačují růst enteropatogenů (25, 29). Některá prebiotika slouží i jako vazebná místa pro enteropatogenní toxiny. Jde tedy o kompetetivní inhibici (25). Enzym permeasa rodu Bifidobacterium je indukovaná galaktooligosacharidy. Ta zajišťuje transport trisacharidů a tetrasacharidů do buňky. Z tohoto důvodu bifidobakterie přerůstají ostatní střevní mikroorganismy při podávání nestravitelných oligosacharidů. Bifidobakterie pak tvoří kyseliny s krátkým řetězcem z galaktooligosacharidů rychleji než ostatní bakterie mléčného kvašení (34). Prebiotika jsou tedy schopna selektivně podporovat růst jen takových střevních mikroorganizmů, které je dokáží využít pro svůj růst. S tímto cílem je komerčně vyráběno mnoho prebiotických látek. Mezi nejčastěji používaná prebiotika patří deriváty laktosy, tj. laktulosa, kyselina laktobionová, dále galaktooligosacharidy, isomaltooligosacharidy, fruktooligosacharidy a inulin (35). Galaktooligosacharidy a fruktooligosacharidy působí jako rozpustná vláknina. Snižují zpětnou resorpci cholesterolu a žlučových kyselin v tenkém střevě a snižují tak hladinu cholesterolu v krvi. V tlustém střevě se mikrobiálně štěpí na jednoduché - 21 -
organické kyseliny. Např. kyselina propionová se vstřebává a v játrech snižuje endogenní produkci cholesterolu (24, 35, 36). Pro příznivé ovlivňování růstu a aktivity probiotických bakterií, musí být minimální denní příjem fruktooligosacharidů 1g. U galaktosacharidů se množství pohybuje kolem 2,5 g / den a u laktulosy 3 g / den (35). Většina v současnosti využívaných prebiotik se dnes využívají jako přísady do některých funkčních potravin (32). 1.11 Mikroflóra trávicího traktu člověka Druhové složení intestinální flóry se během ontogenetického vývoje jedince mění. Je ovlivněno tělesnou kondicí, stářím, pohlavím, podnebím, stravou, stresem, léky, zdravotními komplikacemi a stavem imunitního systému hostitele. U zdravých lidí při správné životosprávě bývá zastoupení mikroorganismů konstantní. Působení endogenních a exogenních vlivů na tuto rovnováhu vyvolává zvýšení počtu patogenních bakterií v tlustém střevě. Též u starých a imunitně oslabených jedinců může být příznivá intestinální mikroflóra redukována a nahrazena patogenními kmeny (20). 1.11.1 Bakteriální kolonizace GIT novorozenců a dětí Při narození je GIT novorozence sterilní. V prvních dnech a měsících života se rychle kolonizuje za vzniku relativně stabilní mikroflóry. Kinetika výskytu mikrobů ve střevním traktu představuje základní složku adaptace na život mimo dělohu. Ke kolonizaci bakteriemi dochází při průchodu vaginou během porodu. Nejprve se ve střevech usídlují fakultativní anaeroby jako jsou Escherichia coli, Clostridium sp., Streptococcus sp., Lactobacillus sp., Bacteroides sp., Bifidobacterium sp. a Enterococcus faecium. Tyto bakterie jsou schopny metabolizovat zbytky kyslíku, které mohou do střev proniknout, a tak vytvářet přísně anaerobní prostředí (8, 25). Složení bakterií, které budou střevní trakt osídlovat jako další, závisí především na potravě, kterou dítě přijímá. Ke konci prvního týdne u dětí kojených mateřským mlékem převažují bifidobakterie (až 85 % intestinální flóry), zatímco nekojené děti mají o řád nižší počty bifidobakterií a vyšší obsah enterokoků a streptokoků. Dospělého typu střevní mikroflóry je dosaženo ve věku 1 2 let (15, 25). - 22 -
1.11.2 Mikrobiální zastoupení v GIT u dospělých lidí Ve střevním obsahu dospělých lidí je identifikováno více než 400 bakteriáních druhů. 95% z těchto bakterií je anaerobních. Dominantní zastoupení (86%) má čeleď Bacteriadaceae. Mezi hlavní rody tvořící tuto skupinu patří Bacteroides, Clostridium, Bifidobacterium, Eubacterium, Peptococcus, Fusobacterium a Peptostreptococcus. Ve zbytku se nacházejí druhy fakultativně anaerobních bakterií. Patří k nim Enterobacterium sp., Lactobacillus sp., Enterococcus sp. a Megasphaera sp. Bifidobakterie jsou 4. nejrozšířenější skupinou mikroorganismů (15, 38). V trávicím ústrojí zdravého člověka se hlavní podíl mikroorganismů nachází v tlustém střevě. Odhaduje se, že střevo dospělého člověka obsahuje 1,0 až 1,5 kg mikroorganismů (20). Celková metabolická aktivita střevních mikroorganismů se vyrovná metabolické činnosti jater. Více než 60 % bakteriálních species nebylo ještě prozkoumáno, protože jsou nekultivovatelné (37). 1.12 Preventivní a terapeutické účinky probiotických kultur kysaných mléčných výrobků Střevní bakterie jsou v bezprostředním kontaktu se střevním epitelem a místním imunitním systémem. Imunitní systém zde představuje lymfoidní tkáň sdruženou se střevem (gut-associated lymphoid tissue). Funkční porucha má za následek nedostatečnou obranu proti patogenním střevním mikroorganismům, nedostatečnou imunologickou toleranci na potravinové antigeny včetně antigenů prospěšných mikroorganismů vyúsťující v nadměrnou imunitní přecitlivělost. Takovouto poruchu mohou navodit patogenní mikroorganismy, perorálně podávané širokospektré antibiotika, imunosupresivní a cytostatické preparáty, toxické látky v potravě a stresové situace (20). Dysbalance zastoupení intestinální mikroflóry je spojena se vznikem mnoha chorob. Probiotické bakterie působí normalizačně na střevní mikroflóru a udržují nebo obnovují fyziologickou rovnováhu v zažívacím traktu. Zmírňují obtíže způsobené změnou složení střevní mikroflóry po léčbě antibiotiky, infekcích gastrointestinálního traktu, radioterapii, chirurgických zákrocích, onemocnění jater a ledvin, při stresu, stárnutí a poruchách imunity. Důsledkem jejich pravidelné aplikace bývá náprava symptomů jako jsou průjmy a zácpa. Probiotika mají též pozitivní vliv na snižování cholesterolu. - 23 -
Kmeny probiotických bakterií podporují tvorbu makrofágů a jiných nespecifických buněčných faktorů a stimulují imunitu zvýšením počtu IgA protilátek (7). Probiotické bakterie mají schopnost fermentovat laktózu a i jiné cukry na karboxylové kyseliny s krátkým řetězcem (mléčnou, octovou, propionovu, máselnou), produkují vitamíny skupiny B, K a jsou schopné dehydroxylovat a dekonjugovat žlučové kyseliny. Tím brání jejich přeměnu na fekální sekundární žlučové kyseliny, které se zúčastňují patogeneze vzniku rakoviny tlustého střeva. Jsou schopné přeměňovat bilirubin na urobilinogen a cholesterol na koprostanol, čímž zmenšují možnost jeho resorpce z trávicího traktu (15). Karboxylové kyseliny s krátkým řetězcem, vznikající fermentací, lokálně dodávají energii střevním epiteliálním buňkám, snižují ph, zvyšují absorpci vápníku, železa a hořčíku a příznivě ovlivňují metabolizmus glukózy a lipidů v játrech a podporují střevní motilitu (19). Podle Steera a kol. (2000) prospěšná intestinální mikroflóra ovlivňuje chuť k jídlu, stimuluje imunitní systém, peristaltiku střeva, absorpci minerálů, renální a hepatální funkci potlačují v trávicím traktu mikroby způsobující průjmy, dyspepsie, dysmikrobie a kolitidy a má i antikancerogenní aktivitu (8). V průběhu ontogenního vývoje se tyto prospěšné bakterie ze střeva ztrácí a u starších osob je jich už velmi málo. Nahrazují je jiné, pro zdraví jedince méně výhodné druhy (38). Podle práce Ferenčíka a Ebringera (2002) se pokládá za jednu z hlavních příčin stárnutí akumulace chronických infekcí a latentních toxikóz navozených nevhodnou skladbou střevní mikroflóry, kdy převažují enterobakterie, enterokoky a klostridie. Též u imunitně oslabených jedinců může příznivá intestinální mikroflóra vymizet a bývá nahrazena výše zmíněnými kmeny (20). Z tohoto vyplývá, že v průběhu života vzniká potřeba regulovat složení střevní mikroflóry. To se dá uskutečnit pomocí probiotických kultur, které bývají účinnou složkou kysaných mléčných výrobků. 1.12.1 Role probiotických bakterií ve fermentačních procesech v tlustém střevě Po požití potravy následuje řada procesů, během kterých dochází k rozložení potravy na jednotlivé složky a k absorpci živin v tenkém střevě. Zbytky potravy postupují z tenkého střeva dále do jednotlivých oddílů tlustého střeva. Převažujícími procesy v tlustém střevě jsou fermentace a absorpce vody a živin. Mikroorganizmy, trvale - 24 -
usídlené v tlustém střevě, mají za úkol fermentovat látky přijaté potravou, které projdou nestráveny tenkým střevem. Jedná se o odolné škroby, neškrobové polysacharidy, oligosacharidy a proteiny. Oligosacharidy mohou být v menší míře využívány také bakteriemi produkujícími plyn. Tvorba plynu je nežádoucím vedlejším efektem pravidelné konzumace prebiotik. Vhodné je prebiotikum s vysokým stupněm selektivity pro bakterie rodů Bifidobacterium a Lactobacillus (35). U dospělého jedince se denně dostane do tlustého střeva průměrně 60-80 g potravy, která je částečně fermentována na kyselinu mléčnou a mastné kyseliny s krátkým řetězcem. Jedná se převážně o acetát, propionát, butyrát, dále se transformují na oxid uhličitý, vodík, metan, fenolické sloučeniny, aminy a amoniak. Dochází tak k acidizaci prostředí, ale i ke vzniku prokarcinogenních látek nežádoucími hnilobnými bakteriemi. Působením kyseliny mléčné produkované probiotickými bakteriemi se inhibuje růst těchto hnilobných bakterií. Kyselina mléčná a mastné kyseliny s krátkým řetězcem se tvoří hlavně v první části tlustého střeva. Fenolické a dusíkaté sloučeniny se tvoří v části sestupné a distální, v které nejčastěji dochází ke vzniku chorob gastrointestinálního traktu, jako je například střevní karcinom nebo ulcerativní kolitida (8). Probiotické bakterie produkují při fermentativních procesech kyselinu mléčnou a octovou, což má za následek snížení ph intestinálního obsahu. Kyselina octová (zvláště její nedisociovaná forma) prochází cytoplazmatickou membránou a tak usmrcuje patogenní, potencionálně patogenní a hnilobné bakterie odpovědné za tvorbu NH 3. Kyselina octová a mléčná regulují metabolickou aktivitu dalších intestinálních mikroorganismů (7). Snížené ph intestinálního obsahu redukuje degradaci aromatických kyselin, ze kterých vznikají další hnilobné produkty. Inhibicí hnilobných bakterií se snižuje tvorba N-nitroso sloučenin, fenolových produktů z tyrosinu a tryptofanu, metabolitů žlučových steroidů, amoniaku a bakteriálních toxinů typu biogenních aminů (histamin, tyramin, kadaverin). Dochází i k inhibici aktivity mikrobiálních enzymů, jejichž produkty metabolických přeměn ovlivňují systémové funkce člověka a tím i celkové zdraví. Produkty hnilobných bakterií, tj. amoniak, fenol p-kresol, indol a skatol, mohou způsobovat průjmy, selhávání oběhového systému a hepatální poruchy. Zvláště jsou-li játra poškozena cirhózou a stárnutím. Dochází i k nervovým poruchám vlivem amoniakální nerovnováhy (15, 21). - 25 -
Fermentací vznikající kyseliny s krátkým řetězcem lokálně dodávají energii střevním epiteliálním buňkám, zvyšují absorpci vápníku, železa, hořčíku a příznivě ovlivňují metabolizmus glukózy a lipidů v játrech a podporují střevní motilitu (15). 1.12.2 Bakteriociny Největší význam má v produkci bakteriocinů Laktobacillus acidophilus, který má široké antimikrobiální spektrum účinnosti. Potlačuje růst koliformních bakteri. Podobné účinky má i Laktobacillus bulgaricus, jehož metabolit bulgaricin má inhibiční vliv na hnilobné bakterie (15, 20, 30). Tabulka 3. Bakteriocidní metabolity probiotických bakterií kysaných mléčných výrobků (15) Bakteriální kmen L.acidophilus L.bulgaricus L.plantarum L.brevis L.reuteri L.helveticus L.casei Lactococcus lactis Lactococcus lactis ssp.cremoris antibakteriální produkt acidolin acidophilin laktocidin bulgaricin laktolin laktobacilin laktobrevin reuterin reutericin laktocin látka podobná laktocinu nisin diplokocin - 26 -
1.12.3 Terapeutické účinky probiotických kultur kysaných mléčných výrobků 1.12.3.1 Jaterní choroby Probiotika a prebiotika se mohou uplatnit se v léčení jaterní encefalopatie. Následkem tvorby organických kyselin, oxidu uhličitého a poklesem ph střevního obsahu dochází k redukci mikrobiálních kmenů obsahujících ureázu a deaminázy, což vede k poklesu amoniaku a dalších toxických produktů ve střevě (23). 1.12.3.2 Vliv na stimulaci imunity Probiotické bakterie kysaných mléčných výrobků prospěšným způsobem regulují jak imunitní eliminaci antigenů patogenních mikroorganismů, tak i imunologickou toleranci na potravinové antigeny. Mechanismus tohoto působení je zabránění adheze patogenních mikroorganismů na střevní epitel. Podstatou působení probiotických kultur kysaných mléčných výrobků je imunomodulační účinek na ty imunitní mechanismy, které se uplatňují v obraně proti patogenním mikroorganismům v gastrointestinálním traktu, a naopak imunosupresivní účinek na reakce imunitní přecitlivělosti na potravinové antigeny. Důležitou úlohu má při tom dodržování správné rovnováhy mezi prozánětlivými a protizánětlivými cytokiny sekretovanými TH1 a TH2 lymfocyty a stimulace tvorby sekrečního IgA (20). Imunomodulační účinek probiotických kultur kysaných mléčných výrobků se odráží i ve zvýšené rezistenci člověka na nádory tlustého střeva a jater. Tento účinek je připisován snížené aktivitě prokarcenogenních enzymů (20). Bakterie mléčného kvašení a bifidobakterie ve střevě člověka mají schopnost neustále stimulovat imunitu tím, že neustále aktivizují buněčné mikrofágy. Tohoto jevu je možno využít i při léčbě imunodeficentních stavů. Zejména to platí o Bifidobacterium longum, Lactobacilus acidophilus, Lactobacilus casei ssp. rhamnosus a Lactobacilus helveticus (15). 1.12.3.3 Kolorektální karcinom Etiologie kolorektálního karcinomu souvisí s činností potencionálně patogenních střevních bakterií. Bakterie jsou schopny ovlivňovat tvorbu karcinomu produkcí enzymů, které mění ve střevě prekarcinogeny v karcinogen. Tyto enzymy jsou ß- glukoronidáza, ß-glukozidáza, azoreduktáza a nitroreduktáza. Vznikající karcinogenní metabolity jsou nitrosaminy, sekundární žlučové kyseliny, heterocyklické aminy, - 27 -
fenolové a indolové složky, nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky, azoslučeniny a amoniak (15). Probiotické bakterie vytvářejí ve střevě mikroprostředí, které inhibuje pomnožení různých patogenních druhů, hnilobných a méně prospěšných bakterií produkující enzymy schopné přeměňovat prokarcinogeny z potravy na účinné karcinogeny. Lactobacillus acidophillus a bifidobakterie, produkující větší množství organických kyselin s krátkým řetězcem, inhibují vznik karcinogenních produktů snížením aktivity enzymů potencionálně patogenních bakterií. Jedná se především o Lactobacillus casei GG, Lactobacillus acidophillus a Bifidobacterium bifidum (39, 8, 15). 1.12.3.4 Vliv na snižování cholesterolu Některé probiotické bakterie mají vliv i na snižování sérového cholesterolu. Produkují enzym hydroxymetylglutarát, který inhibuje hydroxymetylglutaryl-koenzym A reduktázu, což je enzym účastnící se syntézy cholesterolu. Po pravidelné konzumaci jogurtu s probiotickými kulturami bylo popsáno snížení cholesterolu v krvi (15). Dalším mechanismem snižování sérového cholesterolu je, že kmeny Lactobacillus acidophilus asimilují cholesterol z prostředí za vzniku koprostanolu nebo inhibují absorpci cholesterolových micel střevní stěnou po rozkladu soli žlučových kyselin, kdy volný cholesterol se nemůže vstřebat (15, 35). 1.12.3.5 Zánětlivá střevní onemocnění Projevují se poruchami střevní funkce a častými záněty střevní sliznice. Typický je snížený výskyt bakterií Lactobacillus sp. a Bifidobacterium sp. a větší množství anaerobních koků a bakterií redukujících sulfáty (8). Sulfát redukující bakterie (rod Desulfovibrio) znemožňují tvorbu volných mastných kyselin s krátkým řetězcem. Ty pak nejsou dostupné pro metabolismus kolonocytů, motilitu a prokrvení mukózy. Produkcí toxického hydrogensulfidu potlačují oxidaci butyrátu a ten vyvolává reverzibilní vzestup střevní permeability. Pokles volných mastných kyselin s krátkým řetězcem je důležitým činitelem v udržování patogenity zánětu sliznice tlustého střeva (8, 23). - 28 -
1.12.3.6 Gastroenteritida Příčinou nemoci je konzumace potravy kontaminované patogenními mikroorganizmy nebo jejich toxiny. Mezi nejčastější patogenní rody patří Shigella, Salmonella, Listeria, Yersinia, Campylobacter, Vibrio a E. coli, Clostridium perfringens. Zdravá střevní mikroflóra tvoří silnou bariéru proti vstupu patogenů a mikroorganizmy, produkující velké množství SCFA (např. Bifidobacterium sp. a Lactobacillus sp.) dokážou růst patogenů omezit (8). 1.12.3.7 Pseudomembranózní enterokolitida Jde o nejzávažnější gastrointestinální nežádoucí účinek antibiotické léčby. Jako příčina vzniku se obvykle uvádí narušení normální střevní mikroflóry. Příčinou bývá přerůstání kmenů Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens a Candida albicans. Probiotika mohou mít příznivý účinek na úpravu střevní rovnováhy. Zvláště Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus bulgaricus a Streptomyces boulardii (40). 1.12.3.8 Vliv na inhibici růstu bakterií způsobujících průjmová onemocnění U nemocí provázených silným průjmem salmnelózového a shigelózového typu dochází k ústupu onemocnění po podání acidofilního mléka ze 43% u trpících salmonelózou a 67% u trpících schigelózou. Při kontinuálním podávání jsou všechny symptomy nemoci vyléčeny (15). Lukášová a Smrčková (2003) uvádí, že vápník v mléce a mléčných výrobcích zvyšuje rezistenci k salmonelovým infekcím snížením luminální cytologické aktivity nebo porušením dostupnosti železa pro patogenní mikroorganismy (12). - 29 -
2. CÍL PRÁCE Zhodnocení kvantitativního zastoupení probiotických kmenů bakterií v různých kysaných mléčných výrobcích v tržní síti brněnských supermarketů za období listopad 2006 - únor 2007. Stanovení celkového počtu probiotických mikroorganismů mléčné fermentace a zvlášť počtu bakterií rodu Bifidobacterium v kysaných mléčných výrobcích, které měly na obale deklarován obsah dané probiotické kultury. Porovnání kysaných mléčných výrobků podle počtu mikroorganismů a následné srovnání počtů mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích mezi sebou dle: různého obsahu tuku v kysaných mléčných výrobcích přítomnosti ochucující složky výrobku Hledání vztahu mezi počtem stanovovaných mikroorganismů a obsahem tuku, resp. přítomností ochucující složky. Porovnání hodnoty počtu stanovovaných mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích s platnými legislativními požadavky. - 30 -
3. MATERIÁL A METODY 3.1 Materiál Kysané mléčné výrobky použité ke stanovení byly zakoupeny v síti brněnských supermarketů. Rozbory byly prováděny ke konci spotřební lhůty jednotlivých výrobků, kdy by počty probiotických kmenů bakterií měly stále odpovídat příslušné vyhlášce. Byly sledovány vzorky vyrobené v období listopad 2006 - únor 2007. Základní členění kysaných mléčných výrobků a předepsané minimální množství živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích jsou uvedeny ve Vyhlášce Ministerstva zemědělství č.77/2003 Sb. 3.1.1 Seznam kysaných mléčných výrobků použitých k rozboru DANONE (ČR): Vzorek č.1. Activia bílá - jogurt s bifidokulturou, 3% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp. Vzorek č.2. Activia nápoj kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou, ochucený, 2% tuku, deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp. Vzorek č.3. Activia nápoj kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou, bílý, 1,6 % tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp. Vzorek č.4. Actimel jogurtové mléko s L. casei imunitass, bílé, 1,1% tuku deklarovaná probiotická kultura: Lactobacillus casei imunitass výrobce: Danone - Polsko Vzorek č.5. Actimel jogurtové mléko s L. casei imunitass, ochucené, 1,1% tuku deklarovaná probiotická kultura: Lactobacillus casei imunitass výrobce: Danone - Polsko OLMA (ČR): Vzorek č.6. Revital aktive - jogurt s probiotickou kulturou, bílý, 3% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus Vzorek č.7. Revital aktive - probiotický kysaný mléčný nápoj se sníženým obsahem tuku a aktivními složkami, bílý, 1% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus - 31 -
MLÉKÁRNA VALAŠSKÉ MEZIŘÍČÍ (ČR): Vzorek č.8. Kefírové mléko nízkotučné s ABT kulturou, bílé, 1,1% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus Vzorek č.9. Kefírové mléko nízkotučné s ABT kulturou, ochucené, 0,8% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus Vzorek č.10. Acidofilní mléko plnotučné s ABT kulturou, bílé, 3,6% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus Vzorek č.11. Valašská kyška, bílá, kysaný mléčný výrobek s bifidogenní kulturou, 1,5% tuku, deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus Vzorek č.12. Jogurtové mléko Pohádka s probiotickou kulturou, ochucené, 1% tuku, deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp. HOLLANDIA (ČR): Vzorek č.13. Jogurt selský bílý s probiotickou kulturou, bílý, 3,5% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus Vzorek č.14. Krémový jogurt s probiotickou kulturou, s vitamíny a selenem, bílý, 3,5% tuku, deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus Vzorek č.15. Krémový jogurt s probiotickou kulturou, s vitamíny a selenem, ochucený, 3% tuku, deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus Vzorek č.16. Jogurt selský s probiotickou kulturou, ochucený, 3% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus Vzorek č.17. Jogurtové mléko (BiFi drink) ovocné s cereáliemi a probiotickou kulturou, 3% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus Vzorek č.18. Tesco Jogurt krémový s probiotickou kulturou, ochucený, 3% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus Vzorek č.19. Tesco - Jogurt bílý krémový s probiotickou kulturou, bílý, 3,7% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus - 32 -
Vzorek č.20. Tesco Drink jogurtový, ochucený, 0,7% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp. MEGGLE (ČR): Vzorek č.21. Probia drink. Ochucené jogurtové mléko s probiotickou kulturou, 0,8% tuku, deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium longum BB536 Vzorek č.22.acidko PET Acidofilní mléko s probiotickou kulturou, bílé, 1% tuku, deklarová probiotická kultura: Lactobacillus acidophilus Vzorek č.23.acidko PET Acidofilní mléko s probiotickou kulturou, bílé, 3,6% tuku, deklarová probiotická kultura: Lactobacillus acidophilus Vzorek č.24. Jogurtový krém s probiotickou kulturou, ochucený, 2,5% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium longum BB536 KUNÍN (ČR): Vzorek č.25. Nápoj Lactiv. Kysaný mléčný výrobek, ochucený, 0,7% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp. Vzorek č.26. Acidofilní mléko, bílé, 1,5% tuku deklarovaná probiotická kultura: Lactobacillus acidophilus MORAVIA Lacto (ČR): Vzorek č.27. Šlehané podmáslí, bílé, 1% tuku deklarovaná probiotická kultura: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. LACTOS (A): Vzorek č.28. Probiotický jogurtový nápoj, ochucený, 1% tuku deklarovaná probiotická kultura: Lactobacillus casei, Bifidobacterium BB12, Lactobacillus acidophilus LA5 Vzorek č.29. Classic - Probiotický jogurtový nápoj, bílý, 1% tuku deklarovaná probiotická kultura: Lactobacillus casei, Bifidobacterium BB12, Lactobacillus acidophilus LA5 YOPLAIT (ČR): Vzorek č.30. Jogurt se sníženým obsahem tuku, ochucený, 2,2% tuku deklarovaná probiotická kultura: Bifidobacterium sp. - 33 -