Použití probiotických bakterií při výrobě kvasu

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství a mikrobiologie a výživy rostlin Použití probiotických bakterií při výrobě kvasu Diplomová práce Vedoucí práce: Vypracovala: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Bc. Jitka Švancarová Brno 2010

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Použití probiotických bakterií při výrobě kvasu vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne podpis diplomanta.

3 Dovoluji si poděkovat všem, kteří přispěli svými radami, ochotou a časem k vypracování této diplomové práce, zejména Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D., Jagodě Šušković, Ph.D., DrSC. Blažence Kos, izv. Prof., DrSC. Jasně Beganović, doc., Andreji Leboš Pavunc, dipl. Ing. a Kseniji Habjanič, dipl. Ing. Dále bych chtěla poděkovat vedení Fakulty technologie potravin a biotechnologie univerzity v Záhřebu za umožnění pobytu v Chorvatsku, kde jsem spolupracovala na projektu Using probiotic bacteria in sourdough. V neposlední řadě děkuji celé mé rodině za psychickou a finanční podporu.

4 Annotation The aim of diploma thesis was to summarize knowledge about production and using of fermented flour as a sourdough. Because cereals compose considerable part of the human food, this diploma thesis is focused on quality improving. It deals with probiotic strains and its effect on human health. In practical part thesis, there is devoted to multi-strain probiotic strains what could be used for sourdough production in future. Particular commercial samples, which are used in bakeries, are compared too. Different parameters of commercial sourdough can be seen from the results. During the experiments, it was resulted that by using probiotic strains we reach the same acidification. Moreover very strong antimicrobial activity against bakery pathogens was registered. Key words: sourdough, probiotic strains, microorganisms, cereals. Abstrakt Cílem diplomové práce bylo shrnutí poznatků o výrobě a využití fermentované mouky v podobě kvasu. Protože cereálie tvoří značnou část lidské potravy, diplomová práce se zaměřuje na zlepšení jejich kvality. Pojednává zejména o probiotických kmenech a jejich účincích na zdraví člověka. Praktická část je věnována multikulturní směsi probiotických kmenů, které by mohly být v budoucnosti používány pro produkci kvasu. Kvas s těmito kmeny je porovnáván s komerčními vzorky, které pekárny používají. Z výsledků je vidět, že každý komerční kvas vykazuje rozdílné parametry. Během měření bylo zjištěno, že používáním probiotických kmenů se dosáhne stejné kvality okyselení jako při použití komerčních vzorků. Přitom je navíc dosaženo vyšší hygienické kvality, protože byla zaznamenána jejich velice silná antimikrobiální aktivita proti patogenům v mouce. Klíčová slova: kvas, probiotické kmeny, mikroorganismy, cereálie.

5 Obsah 1 ÚVOD CÍLE PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Probiotika Mikroorganismy s probiotickými vlastnostmi Lactobacillus Grampozitivní koky Bifidobakterium ssp Kvasinky Prebiotika Symbiotika Cereálie jako substrát probiotik Enkapsulace probiotik za použití cereálií Kvas Historie kvasu Ekologie kvasu Výroba kvasu Typ I Typ II Typ III MATERIÁLY A METODA ZPRACOVÁNÍ Charakteristika materiálu Použité mikroorganismy Živná média Použité chemikálie API Použité nástroje a přístroje Použité metody Uchovávání mikroorganismů Kultivace mikroorganismů API API 50 CHL API 20 STREP SDS - PAGE buněčných proteinů Izolace DNA RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Příprava supernatantní kultury pro určení antimikrobiální aktivity Určení antimikrobiální aktivity turbidimetrickou metodou Stanovení vyprodukované mléčné kyseliny v těstě Určení koncentrace těkavých kyselin Určení počtu živých mikroorganismů přítomných v těstě nepřímou metodou VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE Identifikace kmenů bakterií mléčného kvašení Testování antimikrobiální aktivity

6 5.3 Fermentace pšeničné mouky Předběžný pokus Fermentace pšeničné mouky směsnou kulturou bakterií mléčného kvašení Fermentace směsi hladké pšeničné a žitné mouky se směsnou kulturou bakterií mléčného kvašení ve třech fázích Fermentace těsta ve třech fázích použitím komerčního vzorku suchého kvasu Fermentace žitného těsta s Böcker Reinzucht Sauerteig für mehr Brot - Aroma (vzorek B1) Fermentace bílé pšeničné mouky s Böcker Reinzucht Sauerteig Weitzen für weitzentypisches aroma (vzorek B2) Fermentace bílé pšeničné mouky Böcker Le Chef Ernst Böcker Gmbh a Co DE Minden (vzorek B3) ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA

7 1 ÚVOD Ve vyspělých zemích se čím dál více objevují civilizační choroby, které jsou způsobeny stresem, vysokým pracovním vypětím, nedostatkem pohybu a pravděpodobně nejvíce špatným stravováním. Soubor těchto faktorů pak většinou vyúsťuje v problémy se zažíváním, zácpou, průjmy, obezitou a mnohými dalšími neduhy, jež provázejí populaci s vysokou životní úrovní. Řešením zdravotních komplikací u jednotlivců většinou bývá změna životního stylu, avšak ne vždy se podaří skloubit zásady zdravého životního rytmu s vysokým pracovním tempem. Částečně se dá předcházet mnohým onemocněním jiným stravováním majícím pozitivní vliv na zdraví organismu. Taková strava zahrnuje konzumaci funkčních potravin, mezi které se řadí probiotika, prebiotika a symbiotika. Nejčastějším potravinářským výrobkem s probiotickým účinkem jsou mléčné výrobky. Produkce nemléčných potravin s probiotickým účinkem je pro současný potravinářský průmysl výzvou. Všeobecnou snahou je výroba vysoce kvalitních potravin s maximálním využitím čistě přírodních surovin. V tomto ohledu se do stravy nebo sladkostí přidávají různé kmeny mikroorganismů. V posledních letech jsou zkoumány obiloviny a výrobky z nich jako potenciální funkční potravina. Z celosvětové produkce tvoří cereálie 73 % a pokrývají tak z více než 60 % spotřebu vlákniny, bílkovin, vitamínů, energie a minerálů potřebných pro lidský organismus. Za doložení počátku zájmu o obiloviny (cereálie) ve vztahu ke zdraví lze považovat Hippokratovo doporučení z 5. století před Kristem jíst celozrnný chléb pro jeho příznivý vliv na činnost střev. Aplikace cereálií nebo jejich částí jako funkčních potravin lze shrnout do následujících možností: - substráty pro kvašení a růst probiotických mikroorganismů, zejména Lactobacillus a Bifidobacterium, - vláknina, která má mnoho blahodárných účinků na lidský organismus a je nezbytnou částí stravy, - prebiotika obsahující nestravitelné sacharidy, - enkapsulační materiál zajišťující lepší stabilitu probiotik. 8

8 2 CÍLE PRÁCE Cílem této práce je shrnout poznatky o probiotických bakteriích, jejich vlivu na lidské zdraví a o substrátu který je vyžadován pro jejich optimální růst a přežití. Dále se zaměruje na mikrobiologickou a technologickou charakterizaci kvasu používaného pro výrobu chleba. Praktická část se věnuje fenotypovému a genotypovému potvrzení používaných bakterií pro fermentaci mouky pomocí metod API, SDS - PAGE a izolace DNA. Dílčím experimentem bylo optimalizovat parametry pro produkci kvasu pomocí probiotických bakterií, k nimž řadí množství přidaného inokula a vody. Dále byla zjišťována schopnost probiotických bakterií inhibovat některé druhy bakterií, které mohou být potenciálními patogeny. Multikulturní směs startovacích kultur obsahující vybrané kmeny bakterií mléčného kvašení, charakterizovaná jako probiotika na Fakultě technologie potravin University v Záhřebu, byla vyhodnocená jako vhodná startovací směs pro výrobu kvasu. Hlavním experimentem bylo srovnání použitých probiotických a komerčních startovacích kultur k výrobě fermentovaného těsta. 9

9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Probiotika Slovo probiotika je řeckého původu pro bios, v překladu znamená pro život. Definice probiotik není jednoznačná, nejpřesnější verzi použil Havenaar a Huis in t Veld v roce 1992, kteří uvádí probiotika jako živé mikroorganismy mající příznivý účinek na lidskou i zvířecí střevní mikroflóru. Tento účinek je však podmíněn dostatečným množstvím živých bakterií. Prvními potravinami s probiotickými účinky byly v Evropě kysané mléčné výrobky. Dnes se ale nabídka potravin s příznivými vlastnostmi rozšířila i mezi ostatní mléčné a masné výrobky, nápoje a jiné kvašené výrobky, např. šťávu z kysaného zelí. Z tohoto pohledu se záměrně přidávají do mléčných výrobků druhy Bifidobacterium a Lactobacillus. Lidské zdraví výrazně ovlivňuje střevní mikroflóra, která je jedním z faktorů zajišťujících správné trávení potravy. V dnešní době je znám princip, jak probiotika pozitivně ovlivňují rovnováhu mikroorganismů v trávícím traktu, proto se potravinářský průmysl snaží vyvinout nové funkční potraviny s probiotickým účinkem. Charalampopoulos (2002) uvádí, že cereálie jsou potravinou, u které je také možné dosáhnout probiotických účinků. Šušković (2001) tvrdí, že mikroflóru ve střevě můžeme rozdělit do 3 skupin. Do první řadíme bakterie zdraví prospěšné, skládající se z bifidobakterií, laktobacilů a dalších druhů bakterií mléčného kvašení. Druhá skupina je považována za neprospěšnou. Patří sem Enterobacteriaceae a různé druhy rodu Clostridium. Poslední skupina zahrnuje všechny ostatní bakterie, které působí neutrálně. Podle Kovaříkové a Erbena (2007) je velice důležité, aby se vytvořila rovnováha mezi enteropatogenními bakteriemi, neutrálně působícími a probiotickými mikroorganismy. Účinnost probiotik závisí na jejich odolnosti vůči prostředí trávícího traktu, schopnosti přežít a množit se. Vlivy způsobující narušení bilance ve střevě můžeme vidět v Tabulce 1. 10

10 Tab. 1 Faktory způsobující narušení rovnováhy mikroorganismů ve střevě (Šušković, 2001) Exogení faktory Endogení faktory Užívání antibiotik Dostupnost živin Přehnaná hygiena Diety Stres Hodnota ph ve střevě Stárnutí Redoxní potenciál Cestování Průjem Poruchy peristaltiky Antagonismus baktérií Onemocnění jater nebo ledvin Synergismus baktérií Radiační záření Vrstva mucinu Chemoterapie Lysozym Percinózní anémie Obrana Poruchy imunitního systému Nejdůležitější vlastností pro přežití probiotických mikroorganismů je odolnost vůči žlučovým kyselinám a snášení teplot do 40 C. Bylo definováno 20 kritérií, které charakterizují kmeny s probiotickým vlastnostmi, nejvýznamnější jsou tyto: - musí být zdravotně nezávadné (humánní původ), - nesmí být patogenní, - musí mít antagonistický vliv na patogenní střevní mikroflóru, - musí být dostatečně rezistentní, aby dokázaly přežít technologický zákrok, ani nesmí nijak negativně ovlivňovat organoleptické vlastnosti potraviny, - nízké ph ani žlučové kyseliny je nepoškozují, - zůstávají živé po celou dobu trvanlivosti potraviny, - jsou schopny dalšího růstu a přichytávají se na epitelární buňky střev, - prokazují pozitivní vliv na zdraví. Všechny známé bakterie s probiotickým účinkem patří do skupiny bakterií mléčného kvašení, která zahrnuje druhy Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus a Bifidobacterium. Z vyjmenovaných mikroorganismů jsou jako probiotika, která lze přidávat do potravin, komerčně dostupné pouze některé kmeny rodů Lactobacillus, Bifidobacterium a Enterococcus, lze však využívat i další druhy, např. Lactococcus, Pediococcus aj. 11

11 3.1.1 Pozitivní vliv probiotik na lidský organismus Jak uvádí Šušković (2001), už v 19. století byl objeven význam střevní mikroflóry pro organismus, jako ochranného faktoru proti případným patogenním mikroorganismům Mečnikovem během jeho výzkumu cholery. O mnoho desetiletí později byl tento poznatek zásadně rozvinut. Byl proveden pokus na zvířatech, kterým byla podávána pouze antibiotika. Ukázalo se, že myši byly daleko více náchylné k infekcím způsobeným Salmonella typhimurium, Shigella flexneri a Vibrio cholerae. Potlačení nežádoucích bakterií je způsobeno produkcí antibakteriálních substancí, které se skládají z primárních metabolitů, jako je kyselina mléčná, oxid uhličitý, acetaldehyd, peroxid a bakteriociny, které úspěšně inhibují růst patogenů. Lactococcus lactis produkuje nisin, Pediococcus pentosaceus tvoří pediocin a Lactobacillus helveticus vytváří lactin. Ouwehand a Elaine (2006) předpokládají, že probiotické bakterie mají blahodárný vliv na permeabilitu bariéry střevního traktu, která je při střevních onemocněních snížena. Probiotika ji dokáží podpořit a zlepšit její funkčnost i v průběhu nemoci. Není přesně objasněno, jak probiotika ovlivňují střevní trakt během oslabení nemocí, ale předpokládá se, že působí i na imunitní systém. Svačina a kol (2008) uvádí, že bifidobakterie produkují imunologické látky, které mají antibiotický a antimodulační účinek bránící růstu nežádoucí mikroflóry (Escherchia coli, Proteus, Staphyllocccus aureus, Salmonella typhosa), jež se může podílet na vzniku toxických produktů fermentace, jako jsou amoniak, aminy, nitrosaminy, fenoly, indoly a další. Reakčními produkty nestrávených polysacharidů, které jsou fermentovány probiotickými mikroorganismy se stávají mastné kyseliny, které jsou zdrojem energie pro buňky střevního epitelu, jež se snadněji prokrvuje. Dále vznikají některé aminokyseliny, polyaminy, růstové faktory, vitamíny a antibiotika. Tyto substance kryjí významnou část potřeb střevní sliznice, která se není schopná vyživovat pouze z krve, a podílejí se na řadě metabolických procesů (Lipská a Visokai, 2009). Šušković (2001) tvrdí, že antimutagenní aktivita probiotik je způsobena denaturací β-glukuronidasy, β-glukosidasy, nitroreduktasy, azoreduktasy, a 12

12 steroid-7-α-dehydroxylasy. Tyto enzymy jsou známé pro podporu vzniku karcinogenů. Laktobacily umějí také degradovat nitrosaminy, jež jsou potravinovými prekarcinogeny. Laktosová intolerance nedovoluje značné části populace konzumaci potravin obsahující laktosu. Probiotické bakterie proměňují laktósu v kyselinu mléčnou, která zdravotní potíže nepůsobí. Potraviny obsahující probiotické bakterie mají také schopnost snižovat koncentraci cholesterolu v krvi, protože zabraňují navazování na žlučové kyseliny, a odchází tak z těla ven. Lipská a Visokai (2009) tvrdí, že v poslední době se o střevní mikroflóře uvažuje jako o cílové preventivní struktuře odpovídající na složení potravy. Objem metabolitických procesů je tu srovnatelný s játry. Hvízdalová (2009) uvádí, že probiotika byla testována z pohledu vlivu na fyziologické vlastnosti organismu laboratorních zvířat, u nichž se vyskytují chronická bakteriální a virová onemocnění. V průběhu experimentu byl odhalen synergický terapeutický účinek probiotik Bacillus subtilis, Lactobacillus lactis působící na symptomy nemocí. Zároveň bylo zaznamenáno snížení množství stafylokoků v krvi a na kůži pokusných zvířat. Bylo zjištěno, že snížení výskytu nebo úbytek počtu charakteristických znaků patogenních procesů je u sledovaných zvířat patrné díky použití probiotik v potravinách a pro lékařské účely. Probiotika také potlačila růst bakterie Staphylococcus aureus v organismu laboratorních zvířat a na jejich kožním porostu. Na Obrázku 1 můžeme vidět vlivy probiotik na lidský organismus, jako je aktivace imunitního systému, podpora mucinózní bariéry, syntéza vitamínů, působení na metabolismus žlučových kyselin, produkce mastných kyselin s krátkým řetězcem a snižování ph v tlustém střevě. 13

13 Obr 1. Působení probiotik v těle Mikroorganismy s probiotickými vlastnostmi Probiotické mikroorganismy patří mezi bakterie mléčného kvašení, které tvoří velkou přirozenou skupinu nesporulujících, nepohyblivých grampozitivních koků a tyčinek fermentujících sacharidy za fakultativně anaerobních podmínek a tvořících kyselinu mléčnou. Bakterie mléčného kvašení se vyskytují ve fermentovaných potravinách jako jsou mléčné a masné výrobky, v zelenině, rostlinách a v tlustém střevě zvířat a lidí. Bakterie mléčného kvašení prodlužují dobu údržnosti potravin díky inhibici nežádoucí mikroflóry, a to snižováním ph, redoxního potenciálu a produkcí látek antimikrobiální povahy. Mají také podíl na vzniku organoleptických látek dodávajících potravině aroma. Dle Šušković (2001) má probiotický účinek také rod Bifidobacterium. Probiotické mikroorganismy byly přidávány po mnoho let do potravy, aniž by byl zaznamenán jakýkoliv jejich nepříznivý efekt na gastrointestinární soustavu lidí a zvířat. 14

14 Lactobacillus Elmeleigy a Carlstorm (2003) tvrdí, že bakterie rodu Lactobacillus jsou tyčinky, které se většinou spojují v dlouhé řetízky. Některé mohou způsobovat kažení potravin, naopak jiné jsou nezbytnou součásti mléčného průmyslu. Burdychová (2007) uvádí, že jsou fakultativně anaerobní. Nepohybují se a vyskytují se i ve dvojicích. Jejich metabolismus je fermentativní. Pro svůj růst vyžadují velké množsví růstových látek (aminokyseliny, vitamíny, nukleotidy, mastné kyseliny atd.) Zdroj uhlíku i energie jim poskytují sacharidy. Můžeme je nalézt v mléce, mléčných výrobcích, na povrchu rostlin, zelenině, ovocných šťávách atd. Podle Goktepe (2005) je Lactobacillus nejznámějším probiotickým rodem, hlavně kvůli své přítomnosti v mléčných produktech. Ačkoliv jsou anaerobní a získávají svoji energii fermentací, mohou žít v přítomnosti kyslíku díky své peroxidasové aktivitě. Konečným produktem fermentace sacharidů je kyselina mléčná, která se tvoří přes pyruvát. Charakteristickým znakem pro tento rod je schopnost přežít při nízkém ph. Možnost růstu v kyselém prostředí dává laktobacilům konkurenceschopnost v prostředí bohatém na živiny. Jen velice zřídka jsou patogenní. Lactobacillus acidophillus se nachází v trávícím ústrojí savců. Příznivě působí na tamní mikroflóru. Používá se při výrobě acidofilního mléka a dalších mlékárenských a farmaceutických produktů. Presumptivní kmeny Lactobacillus acidophillus vytvářejí na tuhé selektivní půdě charakteristické kolonie (Obr. 2). Obr. 2 Kolonie Lactobacillus acidophyllus 15

15 Dle Goktepe (2006) je Lactobacillus rhamnosus nejstudovanějším probiotickým lactobacilem. Je stabilní vůči žlučovým kyselinám a nízkému ph. Bylo dokázáno, že Lactobacillus rhamnosus přežije 4 hodiny při ph 3 v žaludeční šťávě. In vitro bylo možné pozorovat, jak je schopen přilnout k epitelovým buňkám. Vykazuje antibakteriální aktivitu pro široké spektrum mikroorganismů. Ačkoliv bylo in vitro dokázáno, že působí jako antagonista vůči Salmonella typhimurium u myší, nebylo možné tento poznatek převést do experimentu in vivo. Z výzkumů vlivu probiotik na vznik zubního kazu vyplývá, že Lactobacillus rhamnosus má podíl na snížení množství bakterie Streptococcus mutans. Další významnou bakterií mléčného kvašení je Lactobacillus reuterii, který je v přírodě velice rozšířený. Může být izolován z různých potravin a gastrointestinálního traktu zvířat. Produkuje 3-hydroxypropionalaldehyd, jež vykazuje relativně širokospektrální protimikrobiání aktivitu. Rennenberg (2008) tvrdí, že druh Lactobacillus sanfranciscensis byl nalezen pouze v kvasu. Nadto se vyskytuje v kváscích po celém světě. Je používán na výrobu tzv. vestfálského perníku (severozápad Německa), italského panettone a samozřejmě kvasového chleba ze San Francisca. De Vuys a Neysens (2004) uvádí, že Lactobacillus sanfranciscencis se původně jmenoval Lactobacillus sanfrancisco nebo Lactobacillus brevis ssp lindneri. Poprvé byl nalezen ve francouzském chlebu ze San Francisca jako faktor odpovědný za produkci kyselin. Patří mezi obligátně heterofermentativní bakterie mléčného kvašení, které mohou produkovat vysoké dávky kyseliny mléčné a octové z maltosy. Z tohoto důvodu napomáhá v kvasových chlebech kynutí tím, že produkuje plyn a okyseluje těsto Grampozitivní koky Charalampopulos (2009) tvrdí, že rody Lactococcus a Streptococcus pocházejí z čeledi Streptococcaceae. Rod Streptococcus zahrnuje asi 67 druhů grampozitivních koků známých pro svou převážnou patogenitu. Oproti tomu, druhy Streptococcus termophilus jsou známé GRAS ( generally reconized as a safe status, v překladu obecně považovány jako bezpečné ), díky své dlouhé historii jejich používání v potravinářském průmyslu. Je to možné jen proto, že Streptococcus termophilus má ztracený nebo inaktivovaný gen virulence, který charakterizuje patogení streptokoky. 16

16 Streptokoky jsou nesporulující koky o velikosti cca 2 µm. Mohou být oválné až vejčité, vyskytují se po dvojicích nebo v řetízcích. Optimální teplota jejich růstu je cca 37 C. Dokáží fermentovat laktosu na kyselinu mléčnou. V alkalickém prostředí mohou produkovat z glukosy ethanol, kyselinu octovou a mravenčí. Jak vyplývá z názvu, Streptococcus thermophilus preferuje růst při vyšší teplotě. Optimum je 50 C, dokáže ale přežít i záhřev na 60 C po dobu 30 minut. Jeho základním požadavkem na výživu je především dostatek aminokyselin, proto může jako médium využít mléko (Charalampopoulos, 2009). Symbióza v jogurtové kultuře se odehrává tím způsobem, že Streptococcus thermophilus produkuje kyselinu mravenčí a oxid uhličitý. Dochází tak ke stimulaci růstu Lactobacillus bulgaricus. Ten produkuje aminokyseliny, které stimulují růst Streptococcus thermophilus. Velmi kritický je obsah kyslíku (více jak 4 mg/kg), který proces zpomaluje (Šustová, 2008). Goktepe (2006) poukazuje na to, že pomocí molekulárních metod byly monitorovány bakterie mléčného kvašení v dozrávajících sýrech. Ukázalo se, že dominantní mikroflóru zde tvoří Lactobacillus a Streptococcus thermophilus. Další studie byly zaměřeny na způsoby snižování cholesterolu v krvi. U pacientů s hypercholesterolemií se užíváním kysaného mléka obsahujícího Enterococcus faecium a Streptococcus thermophilus snížil LDL cholesterolu. Z rodu Streptococcus se vyštěpil podobný rod Lactococcus. Jeho ovoidní buňky jsou fakultativně anaerobní o velikosti 0,5 1,2 µm, optimální teplota se pohybuje kolem 30 C. Metabolismus vykazuje homofermentativní aktivitu. Je důležitou součástí čistých mlékařských kultur při výrobě smetany, másla, kyselého mléka, tvarohů a sýrů. Charalampopoulos (2009) uvádí, že rod Lactococcus tvoří mezofilní skupina streptokoků skládající se ze 6 hlavních druhů. Nejdůležitější z nich je druh Lactococcus lactis pro svou fermentační schopnost. Dělí se do tří subspecies Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. hordniae a Lactococcus lactis ssp. lactis, který zahrnuje biovar diacetylactis. Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diaceylactis je významný pro tvorbu diacetylu. Sloučenina poskytuje aroma kysaným mléčným výrobkům. Za přítomnosti 17

17 fruktosy vytváří hlavně oxid uhličitý a kyselinu octovou. Štěpí kyselinu citrónovou, kdy se ve značné míře tvoří acetoin a z něj se oxidací vzdušným kyslíkem tvoří diacetyl Bifidobakterium ssp. Dle Burdychové (2007) jsou bakterie rodu Bifidobacterium tyčinkovitého tvaru o různé délce. Jsou grampozitivní a striktně anaerobní. Nacházejí se ve velké koncentraci ve stolici kojenců krmených mateřským mlékem. Růst bifidobakterií podporují prebiotika (laktulosa, inulin, algináty atd.) Jsou obsaženy v řadě kysaných mléčných výrobků a výživových doplňcích. Řada z nich má probiotické schopnosti. Optimální teplota růstu je mezi C při ph 6,5 7. V přítomnosti oxidu uhličitého dokáží kyslík tolerovat. Mezi bakterie s probiotickým účinkem řadíme Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longhum, která je známa pro svou přítomnost v kyselém mléce, Bifidobacterium bifidum a další. Dle Tamime (2005) Bifidobacterium ssp. patří k jednomu z mála druhů mikroorganismů, které mají schopnost produkovat vitamín B 12 (kobalamin). Je důležitým kofaktorem metabolismu aminokyselin, cukrů, mastných kyselin a nukleových kyselin. Bifidobakterie také tvoří vitamin K, známý pro svou postranslační karboxylaci glutamátu. Bifidobacterium bifidum je nejlépe rozpoznatelnou bakterií rodu Bifidobacterium, protože se od ostatních fylogeneticky odlišuje. Buňky mají pelikulární tvar a často se objevují v rozvětvených řetízcích. Nejčastější bifidobakterií je Bifidobacterium longum, jehož kolonie se zřídka kdy větví. Jsou velice podobné bakterii Bifidobacterium breve (Charalampopoulos, 2009) Kvasinky Jsou eukaryotické, heterotrofní a většinou jednobuněčné organismy, jež se rozmnožují pučením nebo dělením. Mohou vytvářet podlouhlé buňky, které pučí pouze na pólech a zůstávají tak spojeny v dlouhá vlákna, která se nazývají pseudomycelium. V určitých místech se mohou tvořit blastospory, svazky kratších elipsoidních buněk. U jiných druhů se může tvořit pravé mycelium, jež vzniká příčným dělením protáhlých buněk. I zde vznikají blastospory. Tvorba mycelia je charakteristickým znakem organismů majících silný aerobní metabolismus. 18

18 Hlavním průmyslovým významem kvasinek je výroba alkoholických nápojů a pekařského droždí. Dokáží zkvašovat glukosu a přitom produkovat ethanol a oxid uhličitý. Sacharomyces boulardii je nepatogenní kvasinkou s optimem růstu 37 C. Je rezistentní proti žaludečním kyselinám. Za poslední dvě desetiletí bylo proti průjmům vyzkoušeno mnoho probiotických bakterií, ale ač mnoho z nich fungovalo pro velkou část populace, žádná nevykazovala účinnost na všechny pacienty. V osmdesátých letech byla světu představena Sacharomyces boulardii, která se používá jako kvasinka předcházející průjmům pro pacienty užívající antibiotika. Sacharomyces boulardii má mnoho výhod proto, aby se stala ideálním probiotikem. Ačkoliv se tyto kvasinky přirozeně vyskytují na povrchu ovoce lychee, dokáží dobře růst i při teplotě prostředí trávícího traktu člověka. Přestože dobře přežívá cestu zažívacím ustrojím, organismus ji eliminuje, jakmile se přestane orálně podávat (Karpa, 2003). Tato kvasinka byla podávána dětem společně s antibiotiky. Děti měly očividně menší problémy s průjmy. Výsledky ukázaly, že je třeba se soustředit na nejslibnější kmeny (Lactobacillus rhamnosus, Bacillus coagulans a Sacharomyces boulardii) v dávkách 5 40 KTJ denně. Ač nejpoužívanějšími probiotiky jsou Lactobacillus a Bifidobacteria, druhy Sacharomyces boulardii (Sacharomyces cerevisie) se užívají také. Jelikož patří mezi eukaryotní mikroorganismy, jsou přirozeně rezistentní proti všem antibiotikům (Charalampopoulus, 2009). V případě jednoho pacienta, který šestkrát zkolaboval během osmi měsíců díky průjmům způsobeným Clostridium difficile, mu po tři měsíce byl podáván vancomycin spolu s kvasinkou Sacharomyces boulardii a průjem se už neobjevil (Karpa, 2003). 19

19 Tab. 2 Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (Vyhl. 77/2003, Sb.) Název kysaného výrobku Použitá mlékařská kultura Lactobacillus acidophylus, Acidofilní mléko mezofilní a termofilní kultury Protosymbiotická směs Streptococcus salivarius ssp. Jogurty thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Monokultury nebo směsné Kysané mléko kultury bakterií mléčného kvašení Kvasinky Kluyveromyces marxianus, Sacharomyces Kefír cerevisiae, Leuconostoc, Lactococcus a Acetobacter Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a Kefírové mléko symbiotické termofilní bakterie Bifidobacterium ssp. Kysaný mléčný výrobek v kombinaci s mezofilními a s bifidokulturou termofilními bakteriemi mléčného kysání Mléčná mikroflóra v 1g 10 6 Lactobacilus acidophylus bakterií mléčného kvašení, 10 4 kvasinky 10 6 bakterií mléčného kysání, 10 2 kvasinky 10 6 bifidobakterie 20

20 3.2 Prebiotika Dle Šušković (2001) je strava ochuzená o vlákninu důvodem civilizačních chorob. V současnosti je hlavním problémem zácpa, průjem, obezita, hemoroidy, kardiovaskulární onemocnění, cukrovka, rakovina tlustého střeva apod. Strava bohatá na vlákninu je výbornou prevencí proti těmto potížím. Štěpné produkty vlákniny jako např. pektiny, xylany, celulosa a oligosacharidy (inulin), které jsou v tenkém střevě nestravitelné a procházejí nezměněny až do tlustého střeva, plní svoji funkci tím, že slouží jako substrát pro mikrobiální enzymy. Souhrnně se tyto látky nazývají prebiotika. Jakmile dorazí do tlustého střeva, začne mikroflóra prebiotika selektivně fermentovat. Jsou na ně zaměřeny především probiotické bakterie Bifidobacterium a Lactobacillus (Tannock, 2002). Prebiotika by měla tvořit asi 10 % energetického příjmu potravy, a 20 % objemu přijaté stravy. Pokud jsou poměry dodrženy, můžeme mluvit o funkčně plnohodnotné potravě, která je schopna ovlivňovat tělesné funkce a působit preventivně proti některým chorobám. Jejich izolované podávání (xylosacharidů a fruktosacharidů) zvyšuje populaci bifidobakterií ve střevě a snižuje ph stolice. Dle Svačiny a kol. (2008) by měl dospělý člověk přijmout g vlákniny. Hlavním metabolickým substrátem kolonocytů je butyrát. Oligofruktosa a inulin selektivně stimulují růst probiotických kmenů, aniž by docházelo k obdobným změnám u anaerobů, klostridií a koliformní mikroflóry (Lipská a Visokai, 2009). V in vitro experimentech se ukázalo, že frukto-oligosacharidy jsou specificky fermentovány bifidobakteriemi. Později se tato informace potvrdila ve zkoušce u lidských dobrovolníků, kteří užívali inulin a oligofruktósu. Bifidobakterie se pak staly dominantními v jejich trávícím ústrojí. Předpokládá se, že prebiotika také podporují absorpci vápníku ze stravy. Není přesně známo, jakým procesem se zvýšená absorpce realizuje, nicméně tento fakt je podložen praktickými výzkumy (Tannock, 2002). 21

21 Dle Šušković (2001) jsou nezbytná jistá kritéria, aby se doplňky potravy mohly nazývat prebiotiky: - nesmí být hydrolyzovány v tenkém střevě, - musí být selektivním substrátem pro jeden druh, nebo omezený počet prospěšných bakterií, které stimuluje v růstu nebo aktivizuje jejich metabolismus, - musí být schopné pozměnit střevní mikroflóru tak, aby její kompozice byla zdraví prospěšnější, například zvyšovat počet sacharolytických druhů a snižovat množství bakterií typu Clostridium a Enterobacteriaceae. 3.3 Symbiotika Symbiotika jsou kombinací probiotik a prebiotik. Jsou to potraviny, či potravní doplňky vznikající smícháním probiotických bakterií s jejich substrátem (prebiotikem). V tabulce 3 můžeme vidět srovnání všech skupin funkčních potravin. Šušković (2001) uvádí, že koncept symbiotik byl navržen k charakterizaci potravy a potravních doplňků, které zlepšují lidské zdraví, souhrně nazývaných jako funkční potraviny. Název, dle Kalače (2003), vzniknul z pozorovaného jevu synergismu, což znamená, že zdravotní přínos kombinace obou složek je větší než součet přínosů každé z nich aplikované samostatně. Pro symbiotika platí údaje uvedené pro jejich jednotlivé složky. Přednostně se doporučují pro kojence a starší osoby. U nekojených dětí pomáhají zlepšovat skladbu mikroflóry střevního traktu. U lidí ve věku asi 55 let poměrně klesá četnost bifidobakterií. Obě skupiny jsou citlivé vůči infekčním onemocněním a symbiotika mohou pomoci tuto dispozici zmírnit. 22

22 Tab. 3 Srovnání probiotik, prebiotik a symbiotik (Crow, 2006) Skupina definice příklad Probiotika Prebiotika Symbiotika Potravní doplněk s živými laktobacily, mikroorganismy, bifidobakterie, které pozitivně enterokoky, ovlivňují rovnováhu streptokoky ve střevě. Nestravitelná část potravy, která selektivně Fruktooligosacharidy, podporuje růst střevní mikroflóry inulin, nebo omezuje galaktooligosacharidy množství bakterií ve střevě a tím zlepšuje zdraví. Směs probiotik a prebiotik, která má Fruktooligosacharidy, pozitivní vliv na zdraví a pomáhá bifidobakterie, probiotikům, aby lacticol, bezpečně prošla lactobacily trávícím traktem Pozitivní vliv na zdraví Kmeny probiotických bakterií zlepšují zdraví konzumenta. Podporují růst mikroflóry během jejího oslabení. Ovlivňují vyskytující se mikroflóru. Není problém, aby bez změny prošly tenkým střevem. Je možné, aby malá dávka byla ve všech potravinách Společný efekt obou částí. Přežití probiotik při průchodu trávícím traktem má vyšší účinnost. Možnosti vývoje v budoucnu Produkce symbiotik, která podpoří přežití probiotik při průchodu střevním traktem. Výroba nových multifunkčních prebiotik, která budou podporovat mikroflóru. Jsou odvozována z polysacharidů vlákniny. Vývoj nových symbiotik na základě molekulárních technik využívajících probiotické enzymy. 3.4 Cereálie jako substrát probiotik Charalampopoulos (2009) uvádí, že fermentace kyseliny mléčné je dlouho zavedená metoda, která se uplatňuje v Asii a Africe k produkci různých forem potravin (nápoje, kaše atd.) Cereálie, hlavně kukuřice, žito, proso a čirok se nechají nasát čistou vodou na půl až 2 dny, přičemž zrna změknou tak, že je snazší rozdrtit nebo pomlít v kaši. Během hnětení, které trvá 1 3 dny, probíhají různé kvasné procesy společně s mléčným kvašením. Během fermentace se začíná snižovat ph, které zároveň zvyšuje kyselost hmoty. 23

23 V západních zemích se používájí cereálie (žito a pšenice) pro produkci kvasu, který je tradičně vyráběn přidáním už předfermentovaného kvalitního kvasu. Tyto startovací kultury mohou být charakterizovány jako kultura směsných kmenů a jsou dodávány v malých dávkách do pekáren. Počet laktobacilů v plně fermentovaném kvasu je více jak 10 9 KTJ/g. Dobrý růst bakterií mléčného kvašení předpovídá, že včleněním lidských probiotických kmenů do substrátu s upravenými podmínkami by bylo možné produkovat fermentované potraviny s definovanými a konstantními vlastnostmi. Pokud by se tyto potraviny vhodně skombinovaly s probiotiky a prebiotiky, mohly by mít ve výsledku významný podíl na dobrém prospívání zdraví (Charalampopoulos, 2009). Probiotické produkty jsou obvykle založeny na principu viability kultury, která je měřítkem probiotické aktivity čili schopnosti kmene dosáhnout vysoké populace buněk. Koncetrace přibližně 10 7 v 1 ml v době, kdy je produkt konzumován, je považována za funkční (Gomes a Malcata, 1999). Marklinder a Löner (1992) uvádí, že rychlé dosažení vysokého počtu buněk a určitého stupně kyselosti je výsledkem docílení kratších časů fermentace a zvyšení viability specifických kmenů. Tím se předchází růstu nežádoucí mikroflóry pocházející ze syrového materiálu. Proto je adaptibilita probiotických bakterií v substrátu kritériem ve výběru kmenů probiotik. Charalampopoulus (2009) uvádí, že Lactobacillus a Bifidobacterium mají jisté požadavky na výživu. Především na sacharidy, aminokyseliny, peptidy, mastné kyseliny, soli, deriváty nukleových kyselin a vitamíny. Nároky na výživu se mohou kmen od kmene velice lišit. Hlavními komponenty obilovin jsou škrob, voda volná a vázaná na vlákninu, monosacharidy jako je glukosa, stachylosa, xylosa, fruktosa, maltosa, arabinosa a glycerol. Obsah záleží na druhu materiálu, prostupu výroby a množství přidané vody. Tabulka 4 udává složení obilovin ve srovnání s mlékem. Obiloviny mají vyšší obsah některých esenciálních vitamínů, vlákniny a minerálů (fosfor), ale nižší obsah zkvasitelných cukrů (obvykle méně než 1 % v pšeničném těstě). 24

24 Tab. 4 Složení obilovin ve srovnání s mlékem na 100 g (Charalampopoulus, 2009) Parametr Pšenice Slad Mléko Voda (g) ,4 Bílkoviny (g) 13,3 13,1 3,5 Tuky (g) 2 1,9 3,5 Sacharidy (g) 71 77,4 4,9 Vláknina (g) 2,3 5,7 - Popel (g) 1,7 2,4 0,7 Vápník (mg) Fosfor (mg) Železo (mg) 3,3 4 Stopy Draslík (mg) Thiamin (mg) 0,55 0,49 0,03 Riboflavin (mg) 0,12 0,31 0,17 Niacin (mg) 4, ,1 Hořčík (mg) Ve studii Charalampopouluse a kol. (2002) bylo zjištěno, že lidské kmeny Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophylus a Lactobacillus fermentum izolovaný z obilovin, mohou být kultivovány ve sladovém, krupičném a pšeničném extraktu bez jakýchkoliv přídavků. Dle výsledků slad podporoval růst lépe než krupice a pšenice zásluhou zvýšeného množství maltosy, sacharosy, glukosy, fruktosy a volných aminokyselin. 3.5 Enkapsulace probiotik za použití cereálií Dle Charalampopouluse a kol. (2002) byly v posledních letech použity metody enkapsulace za účelem zlepšení životnosti probiotických kmenů. Bylo zkoumáno použití škrobu s vysokým podílem amylosy. Kmeny rodu Bifidobacterium, které byly izolované ze zdravých jedinců, byly adherovány na amylosové škrobové granule. Studie in viro ukazují, že tyto podmínky vedou ke zvýšenému přežití probiotických bakterií. In vivo byl tento poznatek také monitorován měřením počtu bifidobakterií ve výkalech myší, které enkapsulované bakterie užily orálně. Bylo zjištělo, že bakterie přežívají až 6 krát lépe než ty, co nejsou enkapsulované ve škrobu. 25

25 Modifikovaná metoda využívá kalcium alginát pro mikroenkapsulaci probiotických bakterií v jugurtu. Ve srovnání s neenkapsulovanými bakteriemi je inkorporací škrobu jako prebiotik s alginátem zlepšena životnost bakterií. Přežití enkapsulovaných kultur bylo ve všech případeh vyšší než u volných buněk. Techniky jako je sprejové sušení, by mohly být používány k produkci malých uniformních mikrosfér obsahující živé probiotické bakterie (O Riordan a kol., 2001). 3.6 Kvas Nejstarobylejší a nejpřirozenější pro nakypření těsta je použití chlebového kvasu. Smícháme-li žitnou mouku s vodou v poměru cca 1 : 1, dojde k tomu, že vodou aktivované enzymy ze zrna začnou pomalu rozkládat škrob na jednodušší cukry a jejich přítomnost vitalizuje spory kvasinek a bakterie obsažené v mouce. Oxid uhličitý a další nízkomolekulární látky (kyselina octová a mléčná), dodávající typicky nakyslou chlebovou vůni a chránící kvas před napadením bakteriálními či plísňovými kulturami, jsou výsledkem práce těchto mikroorganismů. Kvas je směsí převážně mouky a vody, která je metabolicky aktivována heterogenní populací bakterií mléčného kvašení a kvasinkami. Hlavními metabolickými aktivitami je okyselování (bakterie mléčného kvašení), formování aroma (bakterie mléčného kvašení a kvasinky) a kynutí (bakterie mléčného kvašení a kvasinky), které se odráží ve fermentovaném těstě snížením ph (cca 4) a dosažením požadované chuti a vůně kvasového chleba. Různé kvasy jsou běžně používanými surovinami pro výrobu kynutého chleba, protože zlepšují jeho chuť a kvalitu. Dalšími produkty, do kterých se používá kvas, mohou být krekry, pizza a variace sladkého pečeného zboží. Stabilita zrání kvasu záleží na jeho mikroflóře, která pochází z mouky a dalších ingrediencí, metabolické aktivitě (např. amylasová aktivita mouky nebo mikroorganismů) a specifických technologických parametrech (chemická a enzymatická kompozice mouky, kvasu, teplota skladování, ph, redoxní potenciál a vlhkost těsta). Následkem ekologické diverzity se stejné kvasy od sebe pokaždé liší v závislosti na metabolické aktivitě mouky (Vuyst, 2009). 26

26 Produkce kvasu vždy byla a stále je zdlouhavý proces. V tradiční výrobě chleba je kvašení na jedné straně zaměřeno na kultivaci kvasinek a laktobacilů za účelem získání dostatečného množství oxidu uhličitého pro kynutí těsta a na druhé straně je kvašení podmínkou pro výrobu žitného chleba (Brandt, 2006). Dle Rennenberga (2008) je žitný chléb velice oblíbený ve východní a severní Evropě. Žitná mouka má vysokou amylasovou aktivitu a ačkoliv je inhibována kyselostí kvasu, degraduje během pečení škrob tak, že hotová střídka je velice vlhká. V jiných částech Evropy, kde se produkuje pšeničný chléb, byl kvas nahrazen pekařským droždím. Stále je ale nutné, aby pro speciality, jako je francouzská baguette a panettone ze severní Itálie byl použit kvas. V mezinárodní terminologii je použit pro kvas termín sourdough nicméně česká terminologie pro něj užívá více termínů. Dle toho, zda je vyroben pouze z žitné mouky (kvas), a nebo z pšeničné mouky s přídavkem kvasnic. Hovoříme potom o omládku, který zraje cca 1 h a nebo poliši, jež zraje 2 hodiny a má jiné parametry. Obr. 3 Kvas 27

27 3.6.1 Historie kvasu Používání kvasu pravděpodobně souvisí se začátky pěstování obilovin. Už v pradávných dobách (4000 př. n. l.), lidé uměli přeměnit syrové zrno mletím, kvašením a pečením na chutnou a výživnou stravu. První zmínky o kvasu byly nalezeny v egyptských hrobkách. Egypťané pravděpodobně jako první realizovali velkovýrobu chleba, aby mohli nasytit tisíce dělníků pracujících na stavbě pyramid (Rennenberg, 2008). Dle Raynera (2009) byl první kvasový chléb výsledkem spontánního kvašení pšeničné kaše. Po celé Evropě, Asii, na Středním východě, v Africe a v Jižní Americe se nacházejí pozůstatky kvašeného piva a pšeničné kaše. Vysoký zájem lidí o kvas je zaznamenán v Bibli v knize Exodus, ve které židovští otroci prchající z egyptské nadvlády ve spěchu nechali v Egyptě svůj kvas. Po pádu Římské říše pekařské řemeslo téměř zaniklo. Přežilo jen díky tomu, že se v klášterech a opatstvích pečení chleba zachovávalo. Veřejní pekaři se znovu objevili ve 12. století, kdy pomohli miliónům lidí přežít války, hladomor a nemoci. Američtí průkopníci také převáželi kvas ve svých vozech při cestě na západ. Byl tak populární, že sourdough (v doslovném překladu kyselé těsto ) se stalo přezdívkou pro zlatokopy v dobách zlaté horečky kolem roku 1848 (Rennenberg, 2008). Nutnost používání kvasu poklesla s použitím průmyslově vyráběného pekařského droždí, které se začalo vyrábět Mautnerem ve Vídni v roce Je ovšem potřeba zmínit, že kvas byl pro pekaře do 20. století levnější variantou. První komerčně produkované kváskové startéry, vyvinuté kolem roku 1910 byly inspirované metodami výroby kvasnic pro použití v pivovarech a lihovarech. Doručovaly se pekařům každý týden a zajišťovaly konstantní kvalitu produkce kvasu. Takto je kvas připravován dodnes (Brandt, 2006). Rennenberg (2008) uvádí, že v San Franciscu je v každé pekárně původní kvas, nazývaný také jako mother sponge (rodná houba). Je kontinuálně používán, udržován a pečlivě obnovován od doby, kdy byla konkrétní pekárna založena. S nadsázkou lze podotknout, že zdejší kvasy jsou nejstaršími obyvateli San Francisca. Žádná pekárna nemá stejný kvas, protože jeho vlastnosti se mění s podmínkami (teplota, vlhkost a obnovování) a protože obsahuje různé kmeny Lactobacillus sanfranciscensis a 28

28 kvasinek. Každá pekárna produkuje jiný chléb, protože metabolická aktivita mikroorganismů je rozhodující pro chuť chleba. Produkce kvasu je nezbytná pro produkci žitného chleba. Inhibice endogenních amyláz okyselením zaručuje degradaci škrobu a dosáhnutí potřebného objemu chleba. Proto zvyšující se užívání pekařského droždí doprovázela rostoucí potřeba látky vhodné k okyselení (tzv. okyselující přípravky), zejména v Německu a Rakousku, kde je dlouhá tradice produkce žitného chleba. Ve 20. létech 19. století se dostal na trh první okyselující přípravek (směs mouky a kyseliny mléčné). Protože aroma tohoto přípravku nebylo uspokojující, spotřebitelé si vyžádali vývoj nového produktu sušeného kvasu, který se stal dostupným v roce 1970 (Bradnt, 2006). Kučerová (2004) uvádí, že v posledním desetiletí 20. století se začal rozšiřovat způsob přípravy kvasů zkráceným postupem z dodávané startovací kultury bez pozvolného pomnožování. Předfermentovaná kultura mléčných bakterií se rozmíchá s moukou a vodou přímo na potřebný objem kvasu. Obr. 4 Pečení chleba ve středověku Ekologie kvasu Vuyst a Neyens (2005) uvádí, že mouka a další ingredience nejsou vůbec mikrobiologicky sterilní. Když se smíchá voda s moukou, mikroorganismy se začnou množit. Konkurenční kvasinky spolu s bakteriemi mléčného kvašení dosáhnou daleko většího počtu kolonií tvořících jednotek než ostatní mikroflóra. Poměr bakterií mléčného kvašení ku kvasinkám je přibližně 100 : 1. Ačkoliv jisté ingredience, jako je 29

29 cukr a sůl nebo další aditiva podporují růst kvasinek i bakterií mléčného kvašení, je obtížné stanovit korelaci mezi určitými typy kvasinek a bakteriemi mléčného kvašení, protože vždy je mouka jiná a záleží také na poměru voda : mouka. Mikroflóra syrových obilovin se skládá z kvasinek a hub, řádově KTJ/g, zatímco mouka obsahuje KTJ/g. Bakterie, které nacházíme v kynutém kvasu jsou mezofilní gramnegativní aeroby (Pseudomonas) a fakultativní anaeroby (Enterobacteriaceae) stejně tak dobře jako grampozitivní bakterie mléčného kvašení (Lactobacillus casei, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum a Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Pediococcus acidilacti, Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc a Weissella). Samozřejmě se zde vyskytuje nežádoucí Staphylococcus aureus, Bacillus cereus a další. V obilovinách a v moukách byly detekovány kvasinky Candida, Cryptococcus, Pichia, Rhodotorula, Torulaspora, Troichospora, Saccharomyces a Sporobolomyces. Mělo by být zdůrazněno, že Saccharomyces cerevisiae není přítomná v syrových materiálech. Její výskyt v kvasu může být vysvětlen aplikací pekařského droždí ve většině pekařských úkonů. Ze zástupců plísní můžeme v obilovinách nalézt rody Cladosporium, Drechslera, Fusarium, Helminthosporium s Ulocladium z polí a Aspergillus s Penicillium ze skladovacích prostor (Vuyst a Neyens, 2005). Jakmile se mouka dostane do styku s vodou, vyskytující se amylasy začnou hydrolyzovat škrob na jeho podjednotky (sacharosa a maltosa). Maltasy štěpí maltosu na glukosu a fruktosu, které mohou být velice dobře metabolizovány kvasinkami. Laktobacily nejvíce využívají produkty metabolismu kvasinek. Směs se po čase dostane do vyvážené symbiózy mezi mikroorganismy. Nout (2005) uvádí, že dominanci laktobacilů vysvětluje několik faktorů. Především je to metabolismem sacharidů, který je vysoce přizpůsoben substrátu v těstě, zejména maltose a fruktose. Využití maltosy v důsledku přítomnosti enzymu maltosofosforylasy má za následek větší využití energie, než je tomu u homofermentativní deradace maltosy. Za druhé je to podmínkami růstu Lactobacillus sanfranciscensis s ohledem na teplotu a ph, které jsou adekvátní při fermentaci v kvasu. Třetím faktorem dominance jsou produkované antimikrobiální látky při fermentaci. Kompetitivita heterofermentativních laktobacilů se převážně spoléhá na důmyslné 30

30 využití maltosy. Zdrojem maltosy je mouka nebo Lactobacillus amylovorus, který je přítomný v druhém typu kvasu. Maltosa je štěpena fosforylasou bez dodání ATP. Vzhledem k velkému množství maltosy a působení Lactobacillus sanfranciscensis spolu s Lactobacillus reuterii je do substrátu uvolňována glukosa, která vzniká při fosforylasové reakci. Vyprodukovaná glukosa je metabolizována ostatními laktobacily a kvasinkami, které maltosu nevyužívají (Nout, 2005). Spontánní fermentace kvasu prováděná v laboratoři ukazuje, že kvalitní typ mouky je zdrojem stabilních autochtoních bakterií mléčného kvašení a hraje hlavní roli v produkci stabilního kvasu (Van der Meulen a kol., 2007). Dle Nouta (2005) je nejvýznamnější metabolickou aktivitou v kvasu produkce nízkomolekulárních organických kyselin laktátu a acetátu, a také oxidu uhličitého. Produkce plynu je důležitá pro kynutí těsta. Podmínkou pro pečení žitného chleba je okyselení, protože nízké ph inhibuje α-amylasy mouky. Mimo to aktivuje proteasy obilovin poskytující peptidy a aminokyseliny, které mohou být metabolizovány na prekurzory látek vytvářejících aroma. U pšeničného těsta kvasinky a bakterie způsobí nakynutí díky lepku, který zadrží vznikající oxid uhličitý. U kvasu je získání potřebného objemu složitější než u průmyslového pekařského droždí, protože laktobacily vždy převyšují počtem kvasinky 10x 100 x a nízké ph inhibuje jejich metabolismus. V každé zemi jsou požadavky na kvas jiné. Ve střední, severní a východní Evropě je tradicí žitný chléb, pro jehož výrobu je třeba kvas s vyšším TTA ( total titrable amount, v překladu celkové titrační množství ). V jižní Evropě, kde je nejoblíbenější pšeničný chléb, jsou preferovány pšeničné omládky a poliše s nižším titračním číslem. Kyselost je způsobena vznikajícími kyselinami, z nichž převažuje kyselina mléčná a kyselina octová. Kyselost a enzymy laktobacilů, které denaturují proteiny, jsou příčinou slabé síly lepku a hustší konzistence produktu (McGee a Harold, 2004). Nout (2005) uvádí, že se Lactobacillus franciscensis používá jako akceptor elektronů kyslík nebo fruktosu, která je při reakci redukována na manitol. Fruktosa je přítomna ve frukto-glukanech, ze kterých se vyvazuje kvasinkami Candida humilis a Candida milleri. Dostupnost fruktosy ovlivňuje senzoricky důležitý poměr láktát : acetát, jenž je regulován dle požadavků na určitý druh výrobku. 31

31 Dle Brandta (2006) hraje kyselina octová významnou roli v konečné kvalitě chleba (trvanlivost a aroma). Její produkci je možné řídit aerací nebo přidáváním fruktosy. Je však důležité znát, že také kvasinky jsou schopné fruktosu vyvazovat z frukto-oligosacharidů. Hlavními látkami, odpovídajícími za aroma hotového výrobku, jsou: - methional (aroma vařených brambor), - fenylacetaldehyd (aroma medu), - 2-metylbutanal, - 3-metylbutanal, - kyselina octová. Dle Nouta (2005) peptidy a aminokyseliny hrají důležitou roli jako prekurzory chuťových látek v pečených výrobcích z kvasu a promítají se do fyzikálních vlastností těsta. Screeningem genomu Lactobacillus sanfranciscensis bylo zjištěno, že tato bakterie nemá danou proteolytickou aktivitu. Místo toho produkuje kyseliny, které aktivují proteasy mouky. Vznikající peptidy transportuje Lactobacillus sanfranciscensis do buňky, kde jsou vneseny do systému hydrolas a proteinas. Ve srovnání s ostatními bakteriemi mléčného kvašení přítomnými v kvasu se kmeny Lactobacillus sanfranciscensis vyznačují nejvyšší aktivitou aminopeptidas, dipeptidas, tripeptidas a iminopeptidas. V průběhu fermentace Lactobcillus pontis produkuje ornitin, jež je aromatická aktivní aminokyselina, která podporuje pečenou chuť chleba. Ornithin je tvořen cestou arginin-deaminasy. Lactobacillus pontis má k dispozici arginin/ornitin antiporter, který umožňuje transport argininu do buňky a ornitinu z buňky, během této konverze je uvolňována energie. Při pečení je ornitin tepelně konvertován na 2 acetyl 1 pyrolin, jež je nositelem typické pečené chutě chlebové kůrky (Nout, 2005). 32