Hmotnostní spektrometrie Miroslav Polášek Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského Akademie věd v České republiky Dolejškova 3, 182 23 Praha 8
Co je hmotnostní spektrometrie? Fyzikálně chemická metoda pro: identifikaci neznámých sloučenin, kvantifikaci známých sloučenin, objasňování struktury iontů v plynné fázi, stanovení fyzikálních a chemických vlastností iontů a molekul prostřednictvím měření hmotnosti a četnosti (eventuálně také rychlosti vzniku) iontů v plyné fázi, obvykle s vysokou citlivostí, specificitou citou a rychlostí, často i ve velmi složiých směsích.
Hlavní procesy v hmotnostní spektrometrii Příprava vzorku Převod vzorku do plynné fáze Ionizace vzorku Analýza iontů Detekce iontů Zpracování dat Interpretace spekter někdy probíhá současně nebo v opačném pořadí Hmotnostní spektrometr
Co je hmotnostní spektrometr? Přístroj pro přípravu, analýzu a detekci iontů v plynné fázi Základní součásti: vstupní systém iontový zdroj iontová optika analyzátor(y) detektor(y) vakuový systém výkonová elektronika řídící elektronika (data systém)
Iontový zdroj je zařízení pro přípravu iontů, zpravidla zde také dochází k převodu vzorku do plynné fáze. Existuje mnoho způsobů přípravy iontů v MS: Elektrický výboj, elektronová ionizace, Penningova ionizace, ionizace izace přenosem náboje, electron attachment, chemická ionizace (pozitivní i negativní), FAB (fast atom bombardment), FIB (fast ion bombardment), MCI (massive cluster impact), PD (plasma desorption), ionizace polem, fotoionizace, REMPI (resonance-enhanced enhanced multiphoton ionization), termosprej, elektrosprej, APCI (atmospheric pressure chemical ionization) a její varianty (APPI, a pod.), MALDI (matrix-assisted assisted laser desorption ionization) a její varianty (SELDI, tj. surface-enhanced enhanced laser desorption and ionization, a pod.), ICP (inductively coupled plasma), atd...
Analyzátory jsou zařízení schopná rozlišovat ionty v plynné fázi na základě měření jejich fyzikálních vlastností m v ½ m v 2 m/q (magnet) (elektrostatický analyzátor) (kvadrupól) f (iontová cyklotronová rezonance, ICR) t ( time of flight, TOF)
Co je hmotnostní spektrum? graf závislosti iontového proudu dopadajícího na detektor na hmotnosti iontů; m/z (Th) Není fyzikální konstantou, závisí na způsobu ionizace a konstrukci hmotnostního spektrometru Hmotnostní í spektrum je obrazem chemické reaktivity iontů v plynné fázi (tj. mechanizmů a kinetiky monomolekulárních i bimolekulárních reakcí), případně také transportních a elektrochemických procesů v kondenzované fázi
C H 3 - O N O e - C H 3 m/z 61 N O O MH. CH 5 C H 3 N O H m/z 62 O CH 5 H 3 C H 3 N O H m/z 62 O 30 NO CH 3 NO NO 2 CH 3 M. NO relative intensity 15 NO 2 46 61 CH 3 MH. 10 20 30 40 50 60 m/z
Malá exkurze do historie I. Joseph J. Thomson (1856-1940) On the Masses of the Ions in Gases at Low Pressures Philosophical Magazine, 1899, 48:295, p.547-567 Rays of Positive Electricity and their Application to Chemical Analysis, Longmans, Green and Co. Ltd., London, 1913
Malá exkurze do historie II. Francis W. Aston (1877-1945, Nobelova cena 1922) Isotopes and Atomic Weights. Nature, 1920, 105, p. 617 The Mass-Spectra of Chemical Elements. Phil. Mag., 1920, 39, p. 611
Organická hmotnostní spektrometrie benzen ethylen R.Conrad, 1930 H. R. Steward, A. R Olson, 1931 40. 70. léta 20. století intenzivní studium vztahu struktury organických sloučenin a jejich hmotnostních spekter teorie monomolekulárních reakcí (kvazirovnovážná teorie, RRKM) aktivace iontů, tandemová hmotnostní spektrometrie, vysoké rozlišení chemická ionizace, studium reakcí iontů s molekulami vývoj instrumentace (analyzátory: kvadrupól, ICR, TOF) spojení plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GCMS) omezení: tenze par alespoň 10-3 Pa, malý hmotnostní rozsah analyzátorů
Organická hmotnostní spektrometrie Klasický příklad: vznik tropyliových iontů z toluenu P.N. Rylander, S. Meyerson H.M. Grubb, J. Am. Chem. Soc.79 (1957) 842 H relative intensity CH 3 91 92 77 15 91 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 m/z (Th) 95 H 2 C 50 45 49 relative intensity CD 3 H 33 H 2 C H 28 39 H 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 m/z (Th) 91 23 0 CH 3 H H 17 H H relative intensity 92 Hyperplocha potenciální energie C 7 H 8. energie v kcal/mol 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 m/z (Th)
Malá exkurze do historie III. V. Čermák, V. Hanuš, Č. Jech, J. Cabicar,, 1953
Ionizace netěkavých sloučenin FAB (fast atom bombardment) Barber M., Bordoli R.S., Sedgwick R.D., Tyler, A.N.Nature, 1981, 293, p.270-275 FIB (fast ion bombardment) Liquid SIMS (secondary ion mass spectrometry) Pevná látka (polární) rozpuštěná v kapalné matrici je bombardována rychlými (10-30keV) atomy nebo ionty (Xe, Cs ). Při tom dochází k rozprašování (sputtering) iontů do plynné fáze. V. Havlíček, A. Jegorov, P. Sedmera, M. Ryska, Org. Mass Spectrom., 28 (1993) 1440 Cyklosporin A
MALDI Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization M. Karas, F. Hillenkamp Anal. Chem., 1988, 60, p.2299-2301 Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida Y., Yoshida T. Rapid Commun. Mass Spectrom., 1988, 2, p.151 K. Tanaka, (*1959) Nobelova cena 2002 F. Hillenkamp (*1936) http://nobelprize.org/chemistry/laureates/2002/chemadv02.pdf
Elektrosprej (ESI) J.B.Fenn (*1917) Nobelova cena 2002 Yamashita, M.; Fenn, J.B.; Journal of Physical Chemistry, 88, 1984, p 4451-4459, Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F.; Whitehouse, G.M.; Science, 246, 1989, p 64-71 Hemoglobin http://nobelprize.org/chemistry/laureates/2002/chemadv02.pdf Vícenásobně nabité ionty: m 1 = (M n 1 M(H )/n 1 m 2 = (M n 2 M(H )/n 2 n 2 = n 1 1 (2,3, ) M(α-chain) = 15126.7 Da M(β-chain) = 15860.5 Da
a n b n c n Sekvenování proteinů N H 2 R NH O NH R OH nh O R n O Enzymatické stěpení např. Trypsinem (C-konec argininu a lysinu) LC MS analýza zpracování dat J.R. Yates, III, J. Mass Spectrom., 33 (1998) 1-19 Aminokyselina x n y n z n monoizotopická hmotnost Glycine Gly G 57.02147 Alanine Ala A 71.03712 Serine Ser S 87.03203 Proline Pro P 97.05277 Valine Val V 99.06842 Threonine Thr T 101.04768 Cysteine Cys C 103.00919 Isoleucine Ile I 113.08407 Leucine Leu L 113.08407 Asparagine Asn N 114.04293 Aspartic acid Asp D 115.02695 Glutamine Gln Q 128.05858 Lysine Lys K 128.09497 Glutamic acid Glu E 129.0426 Methionine Met M 131.04049 Histidine His H 137.05891 Phenylalanine Phe F 147.06842 Arginine Arg R 156.10112 Tyrosine Tyr Y 163.06333 Tryptophan Trp W 186.07932
Neomezený hmotnostní rozsah TOF analyzátoru MALDI MS imaging Mikroskopie poskytující ionformace o chemickém složení povrchu zobrazovaného vzorku
Soft-landing phenomena Preparativní hmotnostní spektrometrie Modifikace povrchů