T lymfocyty RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK, FN Motol
Klasifikace T lymfocytů Lymfocyty exprimující TCR ab nebo gd Lymfocyty exprimující koreceptory CD4 a CD8 Regulační T lymfocyty Intraepiteliální lymfocyty NK-T lymfocyty
Rozdělení podle typu TCR Typ ab je u většiny savců převládající, tyto lymfocyty se diferencují v thymu a rozeznávají peptidy v komplexu s MHC Typ gd se může vyvíjet i mimo thymus a rozeznává buď nativní antigeny nebo jednoduché organické látky (např. aminy), zřejmě se uplatňují při obraně proti specifickým patogenům
T buněčný receptor je podobný Fab fragmentu protilátky, je ale vždycky vázaný na membránu
Rozdělení podle exprese CD4/CD8 T lymfocyty typu ab nesou na povrchu molekuly CD8 (koreceptor pro MHC I. třídy) nebo CD4 (koreceptor pro MHC II. třídy) Většina CD8+ T buněk jsou cytotoxické lymfocyty Většina CD4+ T buněk jsou pomocné (helper) T lymfocyty (Th)
Koreceptory CD4 a CD8 Molekuly MHC se váží svými nepolymorfními úseky na molekuly CD4 a CD8: CD8 váže molekuly MHC I. třídy a může se současně navázat na stejný komplex MHC I.- peptid, který je rozpoznán T-buněčným receptorem CD4 váže molekuly MHC II. třídy a může se současně navázat na stejný komplex MHC II.- peptid, který je rozpoznán T-buněčným receptorem
Vazebná místa pro CD4 a CD8 na molekulách MHC I. a II. třídy
MHC gp I. jsou přítomny na všech jaderných buňkách organizmu. MHC gp II. pouze na buňkách předkládajících antigen
T buněčný receptorový komplex je tvořen proteiny rozeznávajícími antigen a invariantními signálními proteiny, které zajišťují jeho signální funkci (ITAM = Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)
Vývoj T lymfocytů T lymfocyty se vyvíjejí podobně jako B Prekurzory T buněk migrují z kostní dřeně do thymu, kde probíhá přeskupení genů kódujících TCR a:b T receptory jsou podrobeny pozitivní a negativní selekci Buňky, které přežily (2-4%), opouštějí thymus a migrují do periferních lymfoidních orgánů
Buněčná organizace thymu
Epiteliální buňky thymu tvoří síť obklopující vyvíjející se thymocyty
Během vývoje v thymu u thymocytů probíhají změny v expresi povrchových molekul, podle toho je možno rozlišit určitý stupeň jejich vývoje (pt=pre T cell receptor)
Thymocyty v různém stupni vývoje se nacházejí v různých částech thymu
Vývoj T lymfocytů v thymu Do thymu migrují prothymocyty z kostní dřeně Po první fázi přeskupení genů pro TCR (část b a d) se objeví pre-tcr (obdoba pre-bcr) + CD3 Ve druhé fázi se přeskupují geny pro TCRa a poté vzniká definitivní TCR, složený z a a b řetězců + CD3
Vývoj T lymfocytů v thymu POZITIVNÍ SELEKCE : Probíhá v kortexu přežívají pouze ty buňky, které dokážou vázat vlastní MHC proteiny (asi 10-30%) Tyto buňky pak exprimují buď CD4 nebo CD8, podle toho, váže-li příslušný TCR MHC I. nebo II. třídy
Vývoj T lymfocytů v thymu NEGATIVNÍ SELEKCE: Probíhá v kortiko-medulární části Jsou eliminovány všechny potenciálně autoreaktivní thymocyty, které vážou svým TCR s vysokou afinitou komplexy MHC molekul s vlastními peptidy, přítomnými v thymu (předkládají je epiteliální buňky a DC)
Receptorová výbava T lymfocytů Migrace, aktivace i efektorové funkce jsou závislé na buněčných interakcích zprostředkovaných adhezivními molekulami: Selektiny (lymphocyte homing) Integriny (adheze ke sliznicím) Imunoglobulinová skupina (interakce lymfocytů navzájem)
Vstup lymfocytů z krve do lymfatických uzlin vyžaduje působení adhezivních molekul a chemokinů
Receptorová výbava T lymfocytů Skupina selektinů: Obsahuje tři strukturně příbuzné adhezivní receptory označované podle typů buněk, na kterých se vyskytují L leukocytární E endoteliální P platelet, trombocytární
L-selektiny a vaskulární adresiny
Integriny zajišťují adhezi T lymfocytů k endotelu nebo sliznici
Imunoglobulinová skupina adhezivních molekul zajišťuje interakce lymfocytů váže se na adhezivní molekuly různých typů, včetně integrinů, jiných členů imunoglobulinové skupiny a lektinů
Lymfocyty z krve vstupují do lymfoidních tkání přes stěny cév První krok je vazba L-selektinu na GlyCAM-1 a CD34 Lokální chemokiny (např. CCL21) stimulují chemokinové receptory na T buňkách, což vede k aktivaci LFA-1 To vede k pevné vazbě T buňky na ICAM- 1 a k prostupu endotelem Metaloproteinázy narušují mezibuněčné spoje endotelu a umožňují penetraci
Buňky předkládající antigen (APC)
Nezralé DC pohlcují antigeny ve tkáních (molekuly MHC II jsou obarveny zeleně a lysozomální proteiny červeně) Po pohlcení antigenu DC migrují do lymfatických uzlin, kde dozrávají a exprimují velké množství komplexů MHC:peptid a kostimulační molekuly
Interakce T lymfocytů s APC Aby se z klidového T lymfocytu stala aktivovaná buňka, musí se setkat s antigenem na povrchu APC O udržení kontaktu mezi lymfocytem a APC se starají adhezivní molekuly
Povrchové molekuly z imunoglobulinové skupiny zajišťují interakce mezi lymfocyty a APC. Vazba ICAM-3 : DC-SIGN je specifická pro dendritické buňky.
Přechodné adhezivní interakce mezi T buňkami a APC jsou stabilizovány rozpoznáním specifického antigenu
Signál 1 je antigen specifický interakce peptid:mhc s TCR. Signál 2 je kostimulační CD80/86 s CD28. Signál 3 je cytokinový a nasměruje T buňku k diferenciaci na různé funkce
Naivní T buňky mohou přežívat řadu let jako malé klidové lymfocyty V případě, že jsou aktivovány, rychle se dělí a vytvářejí klon efektorových T lymfocytů CD28 závislá kostimulace aktivovaných T buněk indukuje expresi T buněčného růstového faktoru IL-2 a jeho vysokoafinitního receptoru
Vysokoafinitní IL-2 receptor je složený ze tří řetězců a je přítomen pouze na aktivovaných T buňkách
Aktivované T buňky sekretují a reagují na IL-2 Klidové T buňky exprimují pouze IL-2 receptor střední afinity Aktivované T buňky exprimují vysokoafinitní IL-2 receptor (složený ze všech tří subjednotek) a produkují IL-2 Vazba IL-2 na jeho receptor signalizuje T buňce, že má vstoupit do buněčného cyklu IL-2 indukuje proliferaci T buněk
Tolerance Antigen prezentující buňka může T buňku buď aktivovat, nebo inaktivovat Pokud APC dodá pouze kostimulační signál (signál 2), nestane se nic Pokud T buňka rozezná antigen bez přítomnosti kostimulačního signálu, je inaktivována Tento mechanizmus umožňuje indukci tolerance k vlastním antigenům
Tolerance k antigenům vlastních tkání vychází z rozpoznání antigenu bez přítomnosti kostimulace
Nutnost poskytnutí signálu 1 i 2 je podstatná pro zabránění odpovědi proti vlastním antigenům
Efektorové T buňky mohou reagovat na své cílové buňky bez kostimulace Jakmile je naivní T buňka jednou aktivovaná signálem 1 a 2, sekretuje a odpovídá na IL-2 a stane se efektorovou buňkou. Každý další kontakt se specifickým antigenem spustí její efektorové funkce bez nutnosti dalšího stimulačního signálu. Cytotoxická T buňka může takto zabíjet virem infikované cíle, které exprimují pouze peptid:mhc komplex a nedávají kostimulační signál.
Variabilita signálu 3 od APC zajišťuje diferenciaci naivních CD4 buněk do různých efektorových směrů
Úloha efektorových T buněk v buňkami zprostředkované a v humorální imunitní odpovědi k reprezentativním patogenům
Cytotoxické CD8 T lymfocyty Naivní CD8 T buňky se vyvíjejí do cytotoxických T buněk, které jsou velmi destruktivní Proto naivní CD8 buňky vyžadují větší kostimulační aktivitu než CD4 Nejsilnější je kostimulace zralými DC, které poskytují vysokou kostimulační aktivitu Většina CD8 odpovědí vyžaduje zapojení CD4 T buněk ty musí rozpoznat stejný antigen na APC
Cytotoxická T buňka indukuje v cílové buňce apoptózu
Subpopulace CD4 T lymfocytů CD4 T buňky se diferencují do různých subpopulací efektorových T buněk: Th1, Th2, Th17 a T-regulační Tyto subpopulace jsou definovány na základě sekrece různých cytokinů
Diferenciace CD4 T buněk do Th1 nebo Th2 určuje, jestli převáží humorální nebo buněčná složka
Th1 buňky mají hlavní úlohu při aktivaci makrofágů: aktivují je hlavně pomocí IFN-g do vysoce mikrobicidního stavu. Ty pak mohou zabíjet intracelulární patogeny. Naopak Th2 buňky makrofágy inaktivují produkcí IL-10.
Th1 buňky koordinují odpověď na intracelulární patogeny (Mycobacterium, Leishmania)
Různé typy efektorových T buněk produkují různé efektorové molekuly Th2 buňky jsou specializované na imunitní odpověď proti parazitům a na vznik alergické odpovědi. Poskytují pomoc při aktivaci B buněk a sekretují B buněčné růstové faktory IL-4, IL-5, IL-9 a IL-13. Subpopulace Th17 podporuje akutní zánět tím, že pomáhá shromažďovat neutrofily do místa infekce
Různé typy efektorových T buněk produkují různé efektorové molekuly
Regulační T lymfocyty Heterogenní skupina buněk s různým typem vývoje První skupina se vyvíjí v thymu a označuje se jako přirozené regulační lymfocyty (natural Treg). Exprimují FoxP3. Jejich hlavní funkcí je zabránit autoimunitním reakcím. Při selhání této funkce vznikají autoimunitní syndromy.
Regulační T lymfocyty Druhá skupina jsou tzv. adaptivní regulační lymfocyty, vyvíjejí se v periferii z naivních CD4 buněk. Je to heterogenní skupina s různými fenotypy a vlastnostmi. Jednou z jejích hlavních skupin je subpopulace Th3, je součástí slizničního imunitního systému. Kontroluje imunitní reakce ve sliznicích a její nedostatek se projevuje autoimunitními poruchami a záněty ve střevě. Produkují IL-4, IL-10 a TGF-b
Regulační T lymfocyty Další skupinou adaptivních regulačních buněk je subpopulace Tr1, její původ je nejasný Produkují inhibiční cytokiny IL-10 a TGF-b, ale ne IL-4 (tím se liší od Th3)
Funkce regulačních buněk: - Autoimunitní reakce - Alergie - Protinádorová imunita - Periferní tolerance
Superantigeny Superantigeny jsou odlišnou skupinou antigenů, která není zpracovávána na peptidy a rozeznávána MHC molekulami, fragmentace superantigenu naopak ničí jeho biologickou aktivitu Superantigen má dvě vazebná místa: na vnější stranu MHC II molekul a na Vb oblast většiny TCR, (mimo vazebné místo pro antigen) Bakteriální nebo virové superantigeny: Stafylokokový enterotoxin (syndrom toxického šoku), mitogeny (LPS, rostlinné lektiny), protilátky proti CD3 nebo TCR
Superantigeny Superantigen propojí MHC gp II na povrchu jakýchkoli APC s TCR přítomnými na povrchu velké části T buněk (až 10% všech) To dává T lymfocytu signál podobný normálnímu aktivačnímu signálu přes TCR a vede k rychlé aktivaci velkého množství T buněk
Stanovení počtu T lymfocytů Průtoková cytometrie Stanovení povrchových molekul CD3 (všechny T lymfocyty), CD4, CD8 Subpopulace Th1 a Th2, Th17 měření intracelulárních cytokinů IFN-g a IL-4 a IL- 17 po aktivaci Stanovení Treg intracelulární detekce FoxP3
Funkční testy T lymfocytů Test blastické transformace schopnost odpovídat na polyklonální stimuly Mitogeny: phytohemaglutinin (PHA) Concanavalin A (ConA), Pokeweed mitogen (PWM) Specifické antigeny: tetanus, candida, PPD, virové antigeny Měří se inkorporace 3H-thymidinu
Funkční testy T lymfocytů Modifikace pro průtokovou cytometrii měří se inkorporace značeného bromodeoxyuridinu do DNA CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) fluorescenční barvení cytoplazmy buněk, dá se pak zjistit, kolikrát se buňka rozdělila
Funkční testy T lymfocytů Stanovení povrchových aktivačních molekul na lymfocytech po aktivaci Eprese CD69 časný aktivační marker Exprese CD25 (a podjednotka IL-2R) Exprese HLA-DR Exprese CD71
Cytotoxické testy Aktivované CD8 T lymfocyty zabíjejí cílové buňky Zabíjení cílů je možno detekovat různými způsoby Cílové buňky jsou označeny radioaktivním chrómem mrtvá buňka chróm uvolní Cílové buňky jsou značeny fluorochromem a je u nich detekována apoptóza