Cytometrické metody pro stanovení proliferace lymfocytů. RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK a FN Motol

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Cytometrické metody pro stanovení proliferace lymfocytů. RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK a FN Motol"

Simona Holubová
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Cytometrické metody pro stanovení proliferace lymfocytů RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK a FN Motol

2 Funkční testy lymfocytů Stanovení proliferace lymfocytů Schopnost lymfocytů reagovat na antigen Důležité pro diagnostiku imunodeficitů i pro výzkum Fáze aktivace, mitóza, klonální expanze

3 Aktivace lymfocytů Specifické antigeny (tetanus, varicella, pneumococcus, candida apod.) Nevýhoda stimulace jen malého množství specifických lymfocytů Polyklonální aktivátory stimulují nezávisle na specifitě TCR Polyklonální mitogeny Mitogen Phytohemaglutinin (PHA) Concanavalin A (ConA) Pokeweed mitogen (PWM) Lipopolysacharid (LPS) Odpovídající populace T lymfocyty T lymfocyty T i B lymfocyty B lymfocyty

4 Superantigeny proteiny se dvěma vazebnými místy pro MHC gp II a druhé pro vnější stranu Vβ regionu TCR superantigen je specifický pro jeden až několik různých Vβ domén, kterých je superantigen tak může aktivovat 1-20% T lymfocytů polyklonální mitogeny spouštějí v zásadě stejné reakce jako antigeny podobný efekt dosáhneme protilátkami proti TCR nebo CD3

5 Cytometrické metody detekce proliferace Měření povrchových aktivačních markerů (CD69, CD71, CD25, HLA-DR) Kvantifikace vznikajících blastů v procesu blastické transformace Kvantifikace celkové DNA (PI, EB) Měření intracelulárních aktivačních markerů (Ki-67) Inkorporace značených prekurzorů do nově syntetizované DNA (thymidin, BrdU, EdU,) Obarvení cytoplazmy nebo membrány buněk (CFSE, Oregon Green, CellVue Claret apod.)

6 Blastogeneze lymfocytů Intracelulární změny a přeměna klidových lymfocytů na lymfoblasty: T buněčné blasty jsou velké lymfocyty s výrazným objemem cytoplazmy

7 FASCIA Flow Cytometric Assay of specific cell-mediated immune response in activated whole blood Kvantifikuje blasty vznikající při aktivaci lymfocytů Development and evaluation of a flow-cytometric assay of specific cell-mediated immune response in activated whole blood for the detection of cell-mediated immunity against varicella-zoster virus. Svahn A, Linde A, Thorstensson R, Karlen K, Andersson L, Gaines H. J Immunol Methods Jun 1; 277(1-2): Heparinizovaná krev zředěná médiem 1:8 + mitogeny Kultivace 3-7 dní Značení CD3, CD4, CD8, lýza erytrocytů a měření

8 Měří se BD Trucount a vypočítá se absolutní počet proliferujících buněk/ml Možnost multiplexu s povrchovými znaky

9 Nestimulované, 72 h kultivace PHA, 72 h kultivace

10 Měření celkové DNA etidium bromid, propidium jodid, hexidium jodid tzv. interkalační barviva s červenou fluorescencí barvivo se vmezeří mezi páry bazí dvojité šroubovice DNA nejsou specifická pro DNA, proto vyžaduje použití RNAzy barvení předchází permeabilizace buněk (-20 o C) nedává informaci o nově syntetizované DNA, nekoreluje s 3 H-thy Development of a propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytotoxicity assays. Dengler W.A., Anti-Cancer Drugs 09/1995; 6(4):522-32

11 Ki-67 Proliferating cell associated protein Jaderný protein role v regulaci buněčného dělení Intenzivně studovaný v souvislosti s proliferací nádorových buněk Exprimovaný během všech aktivních fází buněčného dělení Není exprimovaný v klidové fázi Specifický a kvantitativní indikátor proliferace Korelace s BrdU 0,80 0,93 Korelace s Oregon green 0,94-0,98 (Soarez et al., 2010)

12 Ki-67 Výhody: jednoduché provedení k buňkám v kultuře se nic nepřidává Biolegend anti Ki67 APC Lymfocyty 72 h s PHA celkem levná varianta značení buněk běžný intracelulární protokol možnost současného stanovení dalších antigenů

13 CD3+ NS PHA CD4+

14 Komerční reagencie anti-human Ki-67 Antibody BioLegend ( (AF488, AF647, APC, BV421, BV510, BV605, BV711, Pacific Blue, PE, PE- Cy7, PerCP-Cy5.5) BD Pharmingen ( (AF488, AF555, AF647, AF700, FITC, PE-Cy7, PerCP-Cy5.5)

15 Inkorporace 3 H-thymidinu Zlatý standard detekce proliferace, používá se od r Metoda s vysokou citlivostí Inkorporace značeného thymidinu se měří na β-counteru, výsledek v cpm Typické hodnoty nestimulovaných lymfocytů ~1.300 cpm Stimulované lymfocyty (PHA) ~ cpm Stimulační index (stimulované/nestimulované) U zdravých dárců SI nad 50 Výsledky jsou relativní ke zdravé kontrole

buněk (během S fáze) Substituce thymidinu Značení BrdU protilátkou

16 Bromodeoxyuridin (BrdU) 5-bromo-2-deoxyuridin syntetický nukleotid, analog thymidinu Inkorporace do nově syntetizované DNA dělících se buněk (během S fáze) Substituce thymidinu Značení BrdU protilátkou vyžaduje permeabilizaci buněk a denaturaci DNA (kyselina, teplo, nukleáza apod.)

17 BrdU Na posledních 2-24 h ke kultuře přidáme BrdU (18µg/ml, Sigma) Buňky harvestujeme a označíme povrchové antigeny Denaturace a permeabilizace: 70% etanol, deoxyribonukleáza, Tween20 Anti-BrdU značená protilátka Poměr BrdU pozitivních k celkovému počtu buněk Dobrá korelace s inkorporací 3H-thymidinu (r=0,934 pro ConA)

18 BrdU Nevýhoda: nešetrný protokol pro denaturaci DNA může mít za následek destrukci buněčné morfologie a antigenních determinant, na které se váže protilátka Kity s DNAzou jsou relativně drahé (cca Kč/100 testů) Varianta ELISA levnější ( Kč/1000 testů)

19 Komerční reagencie SIGMA ( 5-Bromo-2 -deoxyuridine, 100mg (496.-Kč) Anti BrdU protilátky: BioLegend ( ebioscience ( BrdU Staining Kit for Flow Cytometry (APC, PE, FITC) Kč Abcam ( Serotec ( FITC, AF647, AF488, PE, APC (cca Kč/100 testů)

20 EdU (5-ethynyl-2 deoxyuridine) novější alternativa k BrdU detekce je založena na tzv. click reakcí mezi azidem a alkenovou skupinou alkenová skupina je obsažena v ethynylu azid je konjugován s Pacific Blue, AF647 nebo AF488 nízké pozadí, vysoká citlivost

21 Struktura analogů nukleosidu Ethynyl du Brom du

22 Princip click reakce Click značení nevyžaduje denaturaci DNA Fluorochrom s azidem reaguje s alkenovou skupinou na dsdna EdU vestavěný do DNA

23 EdU protokol Přidáme EdU do buněčné kultury, inkubace (2-24h) Buňky harvestujeme naznačíme protilátkami proti povrchovým antigenům dle potřeby (nelze použít PE) Inkubujeme 15 min s fixačním roztokem, promyjeme Inkubujeme 15 min s permeabilizačním roztokem, promyjeme Inkubujeme 30 min s reakčním pufrem, promyjeme Měříme na cytometru

24 NS PHA

25 Komerční soupravy Invitrogen (Life Technologies) Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit Cena Kč / 50 testů

26 Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) CFSE MW=557 Používán od roku 1994 Lipofilní molekula, která je minimálně fluorescenční, dokud není transportována do buňky Do buňky proniká pasivní difuzí V buňce esterázy štěpí acetylové skupiny a molekula se stává výrazně fluorescenční Succinimidyl ester se váže kovalentně k volným aminoskupinám na makromolekulách v cytoplazmě Nenavázaný zbytek se z buňky vyloučí

27 CFSE WANG et al.,2005 Komplexy CFSE zůstávají v buňce během celého vývoje a dělení detekováno ještě po 8 týdnech Polovina CFSE se dostává do dceřiných buněk při každém dělení nebo při buněčné fúzi CFSE není předáváno okolním buňkám v kultuře

28 CFSE koncentrace Doba kultivace CFSE 4 h 1 24 h 48 h 72 h 5µM 95% 53% 33% 28% 2.5µM 97% 90% 85% 84% Doporučené koncentrace: Výrobce (Invitrogen): 5µM 2,5µM (Garza et al., 2011) 0.5µM 95% 90% 89% 88% 0.05µM 94% 93% 92% 90% 0 (blank) 97% 95% 93% 92% Stanovení životnosti lymfocytů trypanovou modří - třídenní kultivace Garza et al., 2011

29 CFSE FITC Excitace Emise Cell Trace Violet Pacific Blue CellVue Claret PerCP

30 CFSE protokol - lymfocyty Celá řada modifikací barvícího postupu Lymfocyty v 1 ml PBS (nesmí obsahovat sérum), minimálně přidáme CFSE (několik µl podle požadované koncentrace) Inkubace 15 minut za občasného míchání Přidáme 4 ml PBS s 2% FCS Promyjeme 3x (poslední promytí v komplet. médiu) Spočítáme buňky a naředíme na koncentraci

31 Kultivace 72 h PBMC % divided

32 Vyhodnocení Proliferující frakce: procento buněk, které se rozdělí jednou nebo vícekrát % buněk nebo MFI populace, SI Nezajímá nás, kolikrát se buňka rozdělí, ale kolik vznikne nových buněk Srovnáváme pacienta se zdravou kontrolou Frekvence prekurzorů: procento rodičovské populace, které odpovídá na mitogenní stimulaci

33 Komerční soupravy Life Technologies (Invitrogen) CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry ( Kč/ testů) CellTrace Violet Cell Proliferation Kit, for flow cytometry ( Kč/ testů) ABCAM CFSE - Cell Labeling Kit ( Kč) ebioscience CFSE Cell Proliferation Dye efluor 450 Cayman Chemicals CFSE Cell Division Assay Kit SIGMA ( CellVue Claret Far Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit ( Kč/10 testů)

34 Ekonomické hledisko Metoda FASCIA 0 Propidium jodid 9 Cena Kč/test CFSE 5-50 CellTrace Violet 8-80 BrdU ELISA * 50 Ki H-thymidin * 140 *Stanovení v tripletech Ceny nezahrnují náklady na izolaci a kultivaci buněk FASCIA s BD Trucount 230 BrdU 250 EdU 250 CellVue Claret 520

Podobné dokumenty

Nové metody v průtokové cytometrii. Vlas T., Holubová M., Lysák D., Panzner P.

Nové metody v průtokové cytometrii Vlas T., Holubová M., Lysák D., Panzner P. Průtoková cytometrie Analytická metoda využívající interakce částic a záření. Technika se vyvinula z počítačů částic Počítače