MikroRNA v diagnostice gynekologických nádorových onemocnění

1 / 14 MikroRNA v diagnostice gynekologických nádorových onemocnění RNDr. LUDĚK ZÁVESKÝ, Ph.D. Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN, Albertov 4, 775 15, Praha 2 ludek.zavesky@vfn.cz E-LEARNINGOVÝ ČLÁNOK Kľúčové slová: karcinom ovaria - karcinom endometria - karcinom cervixu - mikrorna - exprese - nádorová onemocnění - diagnostické biomarkery Príspevok je určený pre lekárov špecializácií Laboratórne, diagnostické, zobrazovacie a vyšetrovacie odbory - Laboratórna medicína, vrátane vyšetrovacích metód Gynekologické odbory - Gynekológia a pôrodníctvo Gynekologické odbory - Onkológia v gynekológii Onkologické odbory - Klinická onkológia Interdisciplinárne odbory - Lekárska genetika Interdisciplinárne odbory - Molekulárna biológia Štrukturovaný abstrakt: Mezi gynekologická nádorová onemocnění patří především karcinom ovaria, endometria a cervixu. Pravděpodobnost přežití je u pacientek s těmito onemocněními silně vázána na záchyt v časných stádiích. Nalezení nových diagnostických biomarkerů je tak důležitým cílem současných výzkumů. MikroRNA jsou malé jednořetězcové molekuly RNA objevené relativně nedávno. Jsou regulátory exprese genů na post-transkripční úrovni a podílí se na regulaci všech základních životních procesů v buňkách. Ovlivňují genovou expresi vazbou na cílové mrna, která vede k blokaci translace a štěpení mrna. Jejich výskyt není omezen jen na buňky, ale mikrorna se vyskytují také v tělních tekutinách. Vzhledem k tomu, že diferenciální exprese určitých mikrorna je často asociovaná s mnoha patologickými procesy, detekce deregulovaných mikrorna v diagnosticky relevantních vzorcích (např. krvi, plazmě/séru, moči) se může stát základem nových diagnostických postupů. U gynekologických nádorových onemocnění přinesly výzkumy v posledních letech nové poznatky také v této oblasti.

2 / 14 V tomto článku je ukázán přehled cirkulujících a extracelulárních mikrorna, které byly nejnověji nalezeny deregulovány u karcinomu ovaria, endometria a cervixu, především ve vzorcích krve, séra/plazmy a moči, a ukazující slibný diagnostický potenciál pro tato onemocnění. Ciele príspevku Článek přináší základní představení regulačních molekul mikrorna, přehled jejich deregulované exprese, zjištěné v nejnovějších vědeckých výzkumech u hlavních gynekologických nádorových onemocnění karcinomu endometria, ovaria a cervixu a asociovaných vzorcích krve (vč. séra, plazmy) a moči. MikroRNA s konzistentně zvýšenou či sníženou expresí u patologických vzorků se mohou stát základem nových diagnostických postupů jako nové biomarkery pro tato onemocnění. Obsah: 1. Úvod 2. Diagnostika gynekologických nádorových onemocnění 3. Exprese cirkulujících mikrorna u karcinomu endometria 4. Exprese cirkulujících a extracelulárních mikrorna u karcinomu ovaria 5. Exprese cirkulujících mikrorna u karcinomu cervixu 6. Závěr 1. Úvod Gynekologická nádorová onemocnění zahrnují především karcinom vaječníku (= karcinom ovaria, dg. C56), karcinom těla děložního (= karcinom endometria, dg. C54), karcinom hrdla děložního (= karcinom cervixu, dg. C53, D06).

3 / 14 Karcinom ovaria je celosvětově osmý nejběžnější karcinom u žen, který je zodpovědný za šestou nejvyšší onkologickou mortalitu v rozvinutých zemích. Z gynekologických nádorů je nejzhoubnější. Karcinom endometria je nejběžnější gynekologické nádorové onemocnění a šestý nejběžnější typ nádorového onemocnění žen celosvětově, který je však čtvrtým nejběžnějším nádorovým onemocněním u žen v rozvinutých zemích. Karcinom cervixu je celosvětově třetí nejběžnější ženský karcinom a současně druhý nejzhoubnější karcinom v rozvojových zemích 1. Z nově diagnostikovaných případů těchto nádorů v České republice v roce 2011 představoval karcinom endometria 48 %, karcinom ovaria 27 %, karcinom cervixu 25 % 2. Tato data jsou srovnatelná s daty ze Slovenska, kde byly nově registrované případy v roce 2009 v následujících poměrech: karcinom endometria 43 %, karcinom ovaria 26 %, karcinom cervixu 30 % 3. Podobné poměrné zastoupení bylo v roce 2009 také v SRN (karcinom endometria 48,5 %, karcinom ovaria 31,2 % a karcinom cervixu 20,3 %) 4. V České republice byl index mortality/incidence v roce 2013 u karcinomu ovaria 0,69, u karcinomu těla děložního 0,25, nádorů hrdla děložního 0,11 5. Průměrná hodnota 5-letého přežití pro ženy s nádorovými onemocněními je 57 %. U karcinomu ovaria je tato hodnota 37 %, u karcinomu endometria 70 %, u karcinomu děložního hrdla 65 % 4. Zatímco u karcinomu ovaria je většina případů diagnostikována v pozdních stádiích, u karcinomu

4 / 14 endometria a cervixu převažuje zachycení onemocnění v časných stádiích. Např. ve stádiu T1 je zachyceno 47 % případů u karcinomu cervixu (15 % ve stádiu T2), a 60 % případů u karcinomu endometria (8 % ve stádiu T2). Naproti tomu ve stádiu T1 je u karcinomu ovaria zachyceno pouze 18 % a ve stádiu T2 jen 7 % pacientek 4. Záchyt onemocnění v časných stádiích zvyšuje pravděpodobnost přežití a je tedy základním předpokladem pro zlepšení nepříznivých klinických dat a prognózy pro pacientky. Např. v USA vede zachycení karcinomu ovaria v lokalizovaných stádiích k 92% pětiletému přežití, klesajícímu přes 72% u regionálních stádií až k 27% u nejpokročilejších stádií 8. 2. Diagnostika gynekologických nádorových onemocnění Standardní diagnostika probíhá v rámci komplexního gynekologického vyšetření zahrnujícího anamnézu, gynekologické bimanuální vyšetření včetně vyšetření per rektum, sonografické vyšetření vaginální sondou, případnou bioptickou verifikaci, CT, MR, PET/CT příslušných oblastí, či další fakultativní vyšetření a staging založený na histologickém vyšetření po primární operaci. Biochemické a hematologické vyšetření zahrnuje diagnostické markery v séru (např. CA-125, HE-4, apod.). MikroRNA jako nový potenciální diagnostický nástroj pro gynekologická nádorová onemocnění Rozsáhlá skupina malých nekódujících molekul RNA, tzv. mikrorna, se stala v současnosti jedním z velmi perspektivních témat biomedicínského výzkumu. Jedná se o v průměru 22 nukleotidů dlouhé, jednořetězcové molekuly RNA, které mají zásadní roli v post-transkripční regulaci exprese genů. První mikrorna byla popsána teprve v roce 1993 9. Biogeneze mikrorna začíná v buněčném jádru, ve kterém se transkripcí genů pro mikrorna vytváří dlouhý primární transkript, pri-microrna. Oblasti kódující geny pro mikrorna se nachází jak mezi proteinkódujícími geny, tak přímo v oblastech proteiny-kódujících genů, především v oblasti jejich intronů. Z velké části se tedy jejich geny nachází v oblastech DNA, která bývala dříve označována jako tzv. junk DNA ( odpadní DNA ). Dalším enzymatickým štěpením pri-microrna vzniká asi 70 až 100 nukleotidů dlouhá vlásenka (pre-microrna), která je transportována do cytoplazmy, kde dochází k jejímu dalšímu enzymatickému štěpení. Výsledkem je nakonec jednořetězcová molekula mikrorna, vázaná v enzymatickém komplexu, která se váže především na 3 netranslatovanou oblast (3 -UTR) mrna dle zásad komplementarity bází. Výsledkem této vazby a působení v enzymatickém komplexu dochází k inhibici translace a dále k případnému enzymatickému štěpení cílových mrna 9. Každým rokem přibývají nově objevené druhy mikrorna pro různé organismy, u člověka přesáhl počet známých mikrorna 2 tisíce. MikroRNA se podílí na regulaci všech klíčových buněčných funkcí. Regulují např. procesy buněčného dělení, růstu, metabolismu,

5 / 14 apoptózy; souvisí se zánětlivými procesy a imunitním systémem. U nádorových onemocnění jsou mikrorna spojeny např. s proliferací buněk, migrací, invazivitou, angiogenezí, ale také rezistencí k chemoterapeutickým přípravkům. Velice zjednodušeně bychom mohli klasifikovat dvě skupiny mikrorna ve vztahu ke karcinogenezi. Tumor-supresorové mikrorna regulují mrna onkogenů; v případě nižší exprese takové mikrorna roste množství onkogenu v buňce. Naopak, onkogenní mikrorna mají za cíl svého působení tumor supresorové geny, tedy jejich mrna. Vyšší exprese onkogenní mikrorna tak vede k potlačení tumor supresorů. Jedna mikrorna může regulovat stovky mrna, a jednotlivé mrna mohou být regulovány vícero mikrorna. Tento fakt (mimo jiné) velmi komplikuje rozpletení sítě jejich spletitých regulačních vazeb 9. MikroRNA, přestože mají především buněčné funkce, mají i další funkce v buněčné signalizaci a jsou přítomny i jako různé extracelulární frakce. Jejich výskyt tak není omezen pouze na buňky a tkáně, ale jsou ve značných množstvích přítomny i v tělních tekutinách. Jedná se o tzv. cirkulující mikrorna, jejichž dvě hlavní skupiny představují 1) nebuněčná frakce mikrorna ( cell-free micrornas ), obsažená v supernatantu po oddělení buněčných složek centrifugací, 2) mikrorna vázané v buňkách nebo buněčných elementech (např. krevních destičkách) a vyskytující se v tělních tekutinách. Je nutné připomenout jeden základní fakt, totiž, že mikrorna jsou značně odolné vůči působení RNáz, tedy enzymů štěpících RNA. Nebuněčná, tedy extracelulární mikrorna, je obsažena vázaná buď v komplexu s AGO-proteiny, nebo je obsažená v exozómech či jiných vesikulech, apoptotických tělíscích nebo je vázána v lipoproteinových partikulích 12. Tato extracelulární mikrorna je však samozřejmě původem také z buněk, do vnějšího prostředí se dostává buď aktivním transportem, nebo jako produkt rozpadu buněk. Na počátku cesty mikrorna je buňka, ale i v rámci buňky existují organely původně buněčného původu. V lidských buňkách tedy existují mikrorna, které se vyskytují nejen v cytoplazmě, ale také v mitochondriích. U tkání existují jak obecně exprimované mikrorna, tak tkáňově specifické mikrorna. Oba tyto typy se buď formou řízeného transportu či eliminace, nebo uvolnění při apoptóze, mohou dostat do cirkulace nebo do různých tělních tekutin. Existence mikrorna byla poprvé prokázána ve 12 tělních tekutinách (mateřské mléko, kolostrum, sliny, seminální tekutina, slzy, moč, plodová voda, mozkomíšní mok, plazma, pleurální tekutina, peritoneální tekutina a bronchiální laváž) relativně nedávno, v roce 2010 13. Uvedené tekutiny se lišily spektrem a množstvím detekovaných mikrorna, i koncentrací celkové RNA. Do roku 2010 drtivá většina výzkumu mikrorna s klinickým zaměřením považovala za hlavní zdroj klinického materiálu pouze vzorky tkání a buněčných linií. Výskyt mikrorna v tělních tekutinách se dříve

6 / 14 nepředpokládal z důvodu vysoké koncentrace RNáz. Během posledních pěti let však velmi rychle přibývá publikací ukazujících diagnostický a prognostický význam u různých typů cirkulujících mikrorna. Pro diagnostické účely je nezbytná správná detekce potenciálních biomarkerů, nezatížená technickými chybami, dostatečná sensitivita a specificita, znalosti biologické variability a také jasná diferenciální exprese mezi patologickými a kontrolními vzorky (na dostatečně reprezentativním souboru pacientů), která je detekovatelná nejlépe v časných stádiích onemocnění v diagnosticky relevantních vzorcích (např. krev, plazma/sérum, moč). V případě mikrorna u gynekologických nádorových onemocnění jsme sice stále na začátku, ale existují již pilotní studie, které sledovaly expresi mikrorna v krvi (plná krev, sérum, plazma) a moči, které ukázaly, že právě zde se může skrývat zdroj nových diagnostických markerů, exprimovaných rozdílně u pacientek a kontrol 14. Přestože zjištění přesného původu extracelulárních mikrorna ve vzorcích krve (vč. plazmy či séra) i moči je v současnosti technicky nemožné, diagnostický potenciál ukrytý v těchto vzorcích existuje. Krev jako nejběžnější zdroj diagnostického klinického materiálu obsahuje směs mikrorna různého původu. MikroRNA v krvi mohou pocházet ze všech jejích hlavních složek červených a bílých krvinek, i krevních destiček. U nádorových onemocnění se v cirkulaci také vyskytují další buňky, především nádorové buňky včetně buněk kmenových. Separací krevních buněk a buněčných elementů získáme plazmu nebo sérum, které obsahují velké množství extracelulárních mikrorna. Moč je zdrojem buněčných i nebuněčných mikrorna, pocházejících z filtrované krevní plazmy a buněk různého původu 14. Jako zdroj mikrorna (buněčného i extracelulárního charakteru) byla původně zkoumána především u onemocnění urogenitálního traktu 16. Převažují zde studie zaměřené na karcinom močového měchýře. Až v posledních letech přibývá studií mikrorna z moči také u jiných typů nádorových onemocnění, např. karcinomu prsu 17. V další části se zaměříme na přehled výzkumů extracelulárních mikrorna u gynekologických nádorových onemocnění, zahrnujících vzorky plné krve, séra, plazmy a moči. 3. Exprese cirkulujících mikrorna u karcinomu endometria 3.1. Plazma První z několika málo existujících studií u karcinomu endometria 18 nalezla zvýšenou expresi mir-99a, mir-100 a mir-199b v plazmě, a asociaci jejich snížené exprese se zvýšenou expresí mtor kinázy v tkáních endometriodního typu karcinomu endometria. Kombinovaná exprese plazmatických mir-99a/mir-199b vedla k dosažení 88% sensitivity a 93% specificity.

7 / 14 Autoři se v další studii zaměřili na analýzu 16 mikrorna, a zjistili, že dvě mikrorna byly exprimovány méně (mir-9 a mir-301b) a sedm mikrorna více (mir-92a, mir-141, mir-200a, mir-203, mir-449a, mir-1228, a mir-1290) v plazmě u nádorových pacientek ve srovnání s kontrolními. Kombinovaná exprese mir-9/mir-1228 a mir-9/mir-92a se ukázala jako dobrý klasifikátor nádorových a nenádorových vzorků plazmy (hodnoty AUC ~0,9) 19. Rozsáhlá profilační studie vzorků séra identifikovala mezi 754 mikrorna čtyři so zvýšenou expresiou mikrorna (up-regulované) (mir-222, mir-223, mir-186 a mir-204). Následně z nich odvozená kombinovaná exprese vedla k vysokému AUC: 0,927 20. V nejnovější studii 21 jiní autoři nalezli signifikantně zvýšenou expresi mir-15b, mir-27a a mir-223 (hodnoty AUC ~0,8) v plazmě pacientek s endometroidním karcinomem endometria. Exprese mir-27a a CA125 se ukázala jako možná klasifikační kombinace (AUC: 0,894). 3.2. Moč Dosud jediná pilotní studie publikovaná ve dvou rozdílně tematicky zaměřených publikacích přinesla první poznatky o expresi mikrorna v moči u karcinomu endometria (a ovaria) 22, 23. V této studii jsme nalezli mir-106b u karcinomu endometria signifikantně méně exprimovanou (down-regulovanou) ve srovnání s močí kontrolních pacientek za použití extracelulární frakce (cell-free) moči, a případně mir-21 se signifikantně zvýšenou expresí 23. V naší studii se nepodařilo nalézt signifikantní rozdíly mezi čistě exozomálními mikrorna mezi patologickými a kontrolními vzorky. Přehled deregulovaných extracelulárních mikrorna u karcinomu endometria je uveden v tabulce 1. Tab. 1: Karcinom endometria - přehled deregulovaných extracelulárních mikrorna Zvýšená exprese mikrorna Snížená exprese mikrorna Typ vzorku mir-99a, mir-100, mir-199b Krevní plazma mir-92a, mir-141, mir-200a, mir-9 and mir-301b Krevní plazma mir-203, mir-449a, mir-1228, mir-1290 mir-222, mir-223, mir-186, Krevní sérum mir-204 mir-15b, mir-27a, mir-223 Krevní plazma mir-21 mir-106b Moč (cell-free) Citace 18 19 20 21 22, 23 4. Exprese cirkulujících a extracelulárních mikrorna u karcinomu ovaria 4.1. Plná krev V první studii zaměřené na plnou krev z roku 2010 byly mezi 147 deregulovanými mikrorna u recidivujících pacientek 31 nalezeny 4 mikrorna, které byly s prokazatelně signifikantně změněnou expresí, tedy se zvýšenou expresí (mir-30c1*) či se sníženou expresí (mir-342-3p, mir-181a* a mir-450b-5p) u pacientek s karcinomem ovaria ve srovnání s kontrolními pacientkami.

8 / 14 4.2. Sérum a plazma V roce 2008 byla publikována první studie zaměřená na nádorové exozómy v séru u karcinomu ovaria 32. V této studii byla nalezena korelace mezi mikrorna obsaženými v nádorech a v séru, ale EpCAM pozitivní exozómy nebyly detekovatelné v séru kontrolních pacientek. Proto se následující studie zaměřily na detekci mikrorna z celé frakce séra či plazmy. Resnick et al. 33 nalezli mir-21, 92, 93, 126 a 29a se zvýšenou expresí, a mir-155, 127 a 99b se sníženou expresí u pacientek s karcinomem ovaria v jejich krevním séru. Xu et al. 34 prokázali zvýšenou expresi mir-21 v séru asociovanou s pokročilými stádii, nižší diferenciací a zkráceným celkovým přežitím pacientek s karcinomem ovaria. mir-21 je známá onkogenní mirna, která byla nalezena jako up-regulovaná již dříve v nádorových tkáních ovaria (viz 35 ). Zvýšená exprese v séru byla detekována také u mir-92a, jež byla asociována s postižením regionálních lymfatických uzlin a pokročilým stádiem onemocnění 36. Tři mikrorna z rodiny mir-200 (mir-200a, mir-200b a mir-200c) byly nalezeny se zvýšenou expresí v séru v jiné studii 37, což odpovídá jejich obvyklé zvýšené expresi v nádorových tkáních ovaria. V plazmě u 360 pacientek s karcinomem ovaria a 200 kontrolních pacientek byla u pacientek s karcinomy ovaria nalezena vyšší exprese mir-205 v jiné studii. Dále u nich byla detekována nižší exprese let-7f, asociovaná se špatnou prognózou přežití, a při porovnání časných a pokročilých stádií se zvýšená exprese ukázala u stádií III a IV 38. V jiné práci, analyzující 18 serózních karcinomů, 12 kontrol a jejich mikrorna v séru se ukázala nejvýraznější a nejsignifikantnější snížená exprese u mir-132, mir-26a, let-7b, mir-145, a mir-143 39. Karcinom ovaria je heterogenní nádorové onemocnění s potenciálním vlivem ostatních tkání gynekologického traktu při jeho vzniku 40. Z tohoto hlediska je zajímavá studie Suryawanshi et al. 41, která identifikovala společně deregulované mikrorna v krevní plazmě u endometriózy a endometrioidního typu karcinomu ovaria. Jednalo se o mikrorna se zvýšenou expresí: mir-21, mir-191, mir-16, mir-15b, mir-1977, mir-1979, mir-1973, mir-1974, mir-4284, a mir-195. Recentní studie kombinující metodu sekvenování nové generace a real-time PCR u séra pacientek s karcinomem ovaria, ukázala mir-22, mir-93 a mir-451 jako up-regulované mikrorna (první dvě zmíněné jako nejvíce konzistentní), a mir-106b jako signifikantně down-regulovanou, tedy se sníženou expresí 42. Jiná nejnovější práce 43, analyzující mikrorna v séru pacientek s karcinomem ovaria, přinesla řadu mikrorna převážně se sníženou expresí. U těchto mikrorna byla nalezena minimálně desetinásobně snížená exprese: mir-106a, mir-126, mir-146a, mir-150, mir-16, mir-17, mir-19b, mir-20a, mir-223, mir-24, a mir-92a. Zajímavý je tento výsledek např. u mir-92a, která se v dřívějších studiích ukázala obvykle jako up-regulovaná, a to i u vzorků tkání. Příčiny této nekonzistence nebyly dosud vysvětleny. V uvedené studii byly nalezeny tři up-regulované mikrorna (mir-1274a, mir-625-3p, a mir-720), ale neměly dobrou diskriminační schopnost mezi nádorovými a kontrolními vzorky.

9 / 14 Studie zaměřená na 4 kandidátní mikrorna z plazmy (mir-21, mir-34a, mir-200b a mir-205) zahrnující 51 pacientek s karcinomem ovaria, 25 zdravých žen a 25 pacientek s benigními pánevním nálezem byla publikována recentně 44. V této studii se ukázala pouze mir-200b se signifikantně zvýšenou expresí u pacientek s karcinomem ovaria v porovnání s benigními nálezy. U exprese mir-21 je patrná nekonzistence s výše uvedenými studiemi, kde byla nalezena její zvýšená exprese. Podobně sporné jsou výsledky pro mir-205. Další práce byla publikována také v roce 2015 45. V ní byla nalezena snížená exprese let-7i-5p, mir-122, mir-152-5p a mir-25-3p v séru u pacientek se serózním karcinomem ovaria (20 pacientek) v porovnání benigními serózními cystadenomy (20 pacientek). 4.3. Moč V naší pilotní studii jsme v extracelulární frakci moči (cell-free) a jejích mikrorna nalezli mir-92a signifikantně up-regulovanou a mir-106b down-regulovanou u karcinomu ovaria ve srovnání s kontrolními pacientkami. V této studii s omezeným počtem vzorků jsme nenalezli signifikantní rozdíly mezi před- a po-operačními vzorky moči, stejně tak se nepodařilo nalézt signifikantní rozdíly mezi čistě exozomálními mikrorna mezi patologickými a kontrolními vzorky 46, 47. V rozsáhlejší studii publikované téhož roku a zaměřené na mikrorna v moči u serózních adenokarcinomů ovaria byla nalezena upregulovaná exprese mir-30a-5p 48. U této mikrorna autoři ukázali specifickou asociaci s ovariální tkání. Přehled deregulovaných cirkulujících a extracelulárních mikrorna u karcinomu ovaria je uveden v tabulce 2. Tab. 2: Karcinom ovaria - přehled deregulovaných cirkulujících a extracelulárních mikrorna Zvýšená exprese mikrorna Snížená exprese mikrorna Typ vzorku Citace mir-16, mir-30c-1*, mir-187, mir-191, mir-383, mir-423-3p, mir-499-3p, mir -574-5p, mir-1181, mir-1228, mir-1253, mir-1254, mir-1289, mir-1908, mir-1915 mir-21, mir-141, mir-200a, mir-200b, mir-200c, mir-203, mir-205, mir-214 mir-21, mir-29a, mir-92, mir-93, mir-126 mir-28-3p, mir-29a, mir-106b, mir-138-2*, mir-146a, mir-155, mir-181a*, mir-181a-2*, mir-192, mir-342-3p, mir-450b-5p, mir-616*, mir-628-5p, mir-1287, let-7f-1* mir-99b, mir-127, mir-155 Plná krev EpCAM-pozitivní exozómy v krevním séru Krevní sérum mir-21 Krevní sérum mir-92 Krevní sérum mir-200a, mir-200b, Krevní sérum mir-200c mir-205 let-7f Krevní plazma 31 32 33 34 36 37 38

10 / 14 mir-21, mir-191, mir-16, mir-15b, mir-1977, mir-1979, mir-1973, mir-1974, mir-4284, mir-195 mir-132, mir-26a, let-7b, mir-145, and mir-143 Krevní sérum filtrované přes 0.2 µm filtr Krevní plazma mir-22, mir-93 mir-106b Krevní sérum mir-1274a, mir-625-3p, mir-720 mir-106a, mir-126, mir-146a, mir-150, mir-16, mir-17, mir-19b, mir-20a, mir-223, mir-24, and mir-92a, mir-106b, mir-191, mir-193a-5p, mir-30b, mir-30a-5p, mir-30c, mir-320, and mir-328 Krevní plazma (ultracentrifugovaná bez exozómů) mir-200b Krevní plazma let-7i-5p, mir-122, mir-152-5p, mir-25-3p Krevní sérum mir-92a mir-106b Moč (cell-free) 39 41 42 43 44 45 46, 47 Poznámka: Tučně uvedeny nejkonzistentněji deregulované mikrorna po Benjamini-Hochberg adjustaci dat. 5. Exprese cirkulujících mikrorna u karcinomu cervixu 5.1. Sérum První studie zaměřená na expresi mikrorna v séru u karcinomu cervixu byla publikována v roce 2012. V ní byla u nádorových vzorků nalezena snížená exprese mir-218, jakožto jediné testované mikrorna, která byla asociována s pozdními stádii a metastázami v lymfatických uzlinách 64. Další recentní práce byly zaměřeny na testování více druhů mikrorna. Ve studii Chen et al. 65 bylo analýzou 89 mikrorna zjištěno šest mikrorna se zvýšenou expresí (mir-1246, mir-20a, mir-2392, mir-3147, mir-3162-5p, a mir-4484) jak ve vzorcích tkání, tak ve vzorcích séra. Pomocí těchto mikrorna bylo možné predikovat metastázy v lymfatických uzlinách s vysokou sensitivitou a specificitou. V následné studii byla sledována exprese mir-20a a mir-203 v séru pacientek s karcinomem cervixu 66. Ukázalo se, že obě sledované mikrorna v séru měly zvýšenou expresi u patologických vzorků. Pro odlišení pacientek s metastatickým postižením lymfatických uzlin od negativních pacientek byla mir-20a vhodnější (AUC 0,734 ± 0,058) než mir-203 (AUC 0,658 ± 0,061). 5.2. Plazma Nejnověji You et al. 67 zkoumali expresi vybraných tří mikrorna (mir-127, mir-205 a mir-218) u karcinomu cervixu v krevní plazmě (68 pacientek), RNU6b byla použita jako endokontrola. Autoři nalezli zvýšenou expresi u mir-127 (sensitivita 76 %, specificita 84 %, AUC 0,820) a mir-205 (sensitivita 72 %, specificita 82 %, AUC 0,843).

11 / 14 Přehled deregulovaných extracelulárních mikrorna u karcinomu cervixu je uveden v tabulce 3. Tab. 3: Karcinom cervixu - přehled deregulovaných extracelulárních mikrorna Zvýšená exprese mikrorna mir-1246, mir-20a, mir-2392, mir-3147, mir-3162-5p and mir-4484 Snížená exprese mikrorna mir-218 Typ vzorku Krevní sérum Krevní sérum mir-20a, mir-203 Krevní sérum mir-127, mir-205 Krevní plazma Citace 64 65 66 67 6. Závěr V posledních letech byly identifikovány nové zdroje potenciálních diagnostických markerů v různých tělních tekutinách a frakcích extracelulární mikrorna. U gynekologických nádorových onemocnění jsou to především plazma/sérum, plná krev, moč, kde v rámci pilotních studií byly nalezeny různé kandidátní diagnostické mikrorna. Hlavní současné překážky v zavedení nových diagnostických mikrorna markerů do klinické praxe jsou: 1) nedostatečné množství pacientek ve studiích, 2) odlišné způsoby odběru a zpracování vzorků, 3) různé technologické platformy pro izolaci a analýzy exprese mikrorna, 4) chybějící relevantní endokontroly, 5) případné etnogeografické faktory, 6) nejasná biologická variabilita exprese mikrorna, 7) nejasný heterogenní původ extracelulárních mikrorna vzhledem k nádorové patogenezi,

12 / 14 8) nedostatečná sensitivita a specificita. Nekonzistentní výstupy a malý překryv potenciálních diagnostických mikrorna jsou výsledkem těchto nepříznivých faktorů. Další studie a rozsáhlé mezinárodní validace by měly přispět nejen k vyřešení uvedených problémů, ale především k následnému nalezení relevantních diagnostických markerů a jejich zavedení do klinické praxe. Poděkování Výzkum gynekologických nádorových onemocnění byl podpořen projektem Univerzity Karlovy v Praze (PRVOUK-P27/LF1/1), Ministerstvem zdravotnictví ČR (FN Brno, FNBr 65269705), Nadačním fondem Avast, a společnostmi ČEPS, a.s., Ferona, a.s., a ČEZ, a.s.

13 / 14 Online zdroje: Epidemiologie zhoubných nádorů v České republice Epidemiologie zhoubných nádorů v České republice CZ http://www.svod.cz/ nádory - epidemiologie - incidence - mortalita Položky do slovníka: mikrorna MikroRNA (microrna, mirna). Malé regulační molekuly jednořetězcové RNA, uplatňující se v posttranskripční regulaci genové exprese v klíčových buněčných procesech a vyskytující se jak v buňkách, tak v extracelulárních frakcích tělních tekutin (včetně krve, moči, mateřského mléka, apod.). Vazbou na komplementární oblasti cílové mrna a ve vazbě v enzymatickém komplexu blokují translaci a dochází ke štěpení mrna. Mohou mít využití v budoucích diagnostických, prognostických a terapeutických aplikacích u různých onemocnění. Onkologické odbory mikrorna - regulační molekuly - postranskripční regulace genové exprese - RNA Literatúra: 1 Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians 2011; 61(2):69 90. 2 Zdravotnická ročenka ČR 2013. 276 s. Institute of Health Information and Statistics of the Czech Republic 2014. [Citované 2016-05-17] Online: http://www.uzis.cz/katalog/rocenky/zdravotnicka-rocenka-ceske-republiky ISSN 1210-9991, ISBN 978-80-7472-135-9. 3 Diba CS (ed.) Incidencia zhubných nádorov v Slovenskej republike 2009. Národné centrum zdravotníckych informácií, Národný onkologický register SR 2015; 193 s. ISBN 978-80-89292-44-8 4, 6, 7 Waldmann A, Eisemann N, Katalinic A. Epidemiology of malignant cervical, corpus uteri and ovarian tumours - Current data and epidemiological trends. Geburtshilfe und Frauenheilkunde 2013; 73 (2): 123-129. 5 Dušek L, Mužík J, Kubásek M, Koptíková J, Žaloudík J, Vyzula R. Epidemiologie zhoubných nádorů v České republice [online]. Verze 7.0 [2007], Masarykova univerzita 2005. [Citované 2016-4-12] Online: http://www.svod.cz. ISSN 1802 8861. 8 Siegel R, Ma J, Zou Z, Jemal A. Cancer statistics, 2014. CA: A Cancer Journal for Clinicians 2014; 64(1): 9 29. http://dx.doi.org/10.3322/caac.21208. 9, 10, 11 Iorio M, Croce C. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Molecular Medicine 2012; 4(3): 143-159. 12 Turchinovich A, Weiz L, Burwinkel B. Extracellular mirnas: The mystery of their origin and function. Trends in Biochemical Sciences 2012; 37(11): 460-465. 13 Weber JA, Baxter DH, Zhang SL et al. The MicroRNA Spectrum in 12 Body Fluids. Clinical Chemistry 2010; 56: 1733-41. 14, 15 Zavesky L, Jandakova E, Turyna R et al. New perspectives in diagnosis of gynaecological cancers: Emerging role of circulating micrornas as novel biomarkers. NEOPLASMA 2015; 62 (4): 509-520. 16 Mlcochova H, Hezova R, Stanik M, Slaby O. Urine micrornas as potential noninvasive biomarkers in urologic cancers. Urologic Oncology 2014; 32 (1):41. http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2013.04.011 17 Erbes T, Hirschfeld M, Rucker G et al. Feasibility of urinary microrna detection in breast cancer patients and its potential as an innovative non-invasive biomarker. BMC Cancer 2015; 15:193. doi: 10.1186/s12885 015-1190 4. 18, 25 Torres A, Torres K, Pesci A et al. Deregulation of mir-100, mir-99a and mir-199b in tissues and plasma coexists with increased expression of mtor kinase in endometrioid endometrial carcinoma. BMC Cancer 2012; 12:369.

14 / 14 19, 26 Torres A, Torres K, Pesci A et al. Diagnostic and prognostic significance of mirna signatures in tissues and plasma of endometrioid endometrial carcinoma patients. International Journal of Cancer 2013; 132 (7): 1633-1645. 20, 27 Jia WH, Wu YZ, Zhang Q, Gao G, Zhang CY. Identification of four serum micrornas from a genome-wide serum microrna expression profile as potential non-invasive biomarkers for endometrioid endometrial cancer. Oncology Letters 2013; 6 (1): 261-267. 21, 28 Wang L, Chen YJ, Xu K, Xu H, Shen XZ, Tu RQ. Circulating micrornas as a Fingerprint for Endometrial Endometrioid Adenocarcinoma. PLOS ONE 2014; 9 (10). e110767 DOI: 10.1371/journal.pone.011076 22, 29, 46, 62 Zavesky L, Jandakova E, Turyna R et al. Evaluation of Cell-Free Urine micrornas Expression for the Use in Diagnosis of Ovarian and Endometrial Cancers. A Pilot Study. Pathology & Oncology Research 2015; 21 (4): 1027-1035. 23, 24, 30, 47, 63 Zavesky L, Jandakova E, Turyna R et al. Supernatant versus exosomal urinary micrornas. Two fractions with different outcomes in gynaecological cancers. NEOPLASMA 2016; 63 (1): 121-132. 31, 49 Hausler SFM, Keller A, Chandran PA et al. Whole blood-derived mirna profiles as potential new tools for ovarian cancer screening. British Journal of Cancer 2010; 103: 693-700. 32, 50 Taylor DD, Gercel-Taylor C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecologic Oncology 2008; 110: 13-21. 33, 51 Resnick KE, Alder H, Hagan JP, Richardson DL, Croce CM, Cohn DE. The detection of differentially expressed micrornas from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform. Gynecologic Oncology 2009; 112: 55-9. 34, 52 Xu YZ, Xi QH, Ge WL, Zhang XQ. Identification of serum microrna-21 as a biomarker for early detection and prognosis in human epithelial ovarian cancer. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 2013; 14: 1057-60. 35 Zavesky L, Jancarkova N, Kohoutova M. Ovarian cancer: Origin and factors involved in carcinogenesis with potential use in diagnosis, treatment and prognosis of the disease. Neoplasma 2011; 58: 457-68. 36, 53 Guo F, Tian J, Lin Y, Jin YM, Wang L, Cui MH. Serum microrna-92 expression in patients with ovarian epithelial carcinoma. Journal of International Medical Research 2013; 41: 1456-61. 37, 54 Kan CWS, Hahn MA, Gard GB et al. Elevated levels of circulating microrna-200 family members correlate with serous epithelial ovarian cancer. BMC Cancer 2012; 12: 627. 38, 55 Zheng H, Zhang L, Zhao Y et al. Plasma mirnas as diagnostic and prognostic biomarkers for ovarian cancer. PLoS ONE 2013; 8 (11): e77853. 39, 56 Chung YW, Bae HS, Song JY, et al. Detection of microrna as novel biomarkers of epithelial ovarian cancer from the serum of ovarian cancer patients. International Journal of Gynecological Cancer 2013; 23: 673-9. 40 Erickson BK, Conner MG, Landen Jr CN. The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology 2013; 209(5): 409-414. 41, 57 Suryawanshi S, Vlad AM, Lin HM et al. Plasma MicroRNAs as novel biomarkers for endometriosis and endometriosisassociated ovarian cancer. Clinical Cancer Research 2013; 19(5): 1213-1224. 42, 58 Ji T, Zheng ZG, Wang FM et al. Differential microrna expression by solexa sequencing in the sera of ovarian cancer patients. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 2014; 15(4): 1739-1743. 43, 59 Shapira I, Oswald M, Lovecchio J et al. Circulating biomarkers for detection of ovarian cancer and predicting cancer outcomes. British Journal of Cancer 2014; 110(4): 976-983. 44, 60 Kapetanakis NI, Uzan C, Jimenez-Pailhes AS et al. Plasma mir-200b in ovarian carcinoma patients: distinct pattern of pre/post-treatment variation compared to CA-125 and potential for prediction of progression-free survival. Oncotarget 2015; 6 (34): 36815-36824. 45, 61 Langhe R, Norris L, Abu Saadeh F et al. A novel serum microrna panel to discriminate benign from malignant ovarian disease. Cancer Letters 2015; 356 (2): 628-636. 48 Zhou J, Gong GH, Tan H et al. Urinary microrna-30a-5p is a potential biomarker for ovarian serous adenocarcinoma. Oncology Reports 2015; 33 (6): 2915-2923. 64, 68 Yu J, Wang Y, Dong RF, Huang XY, Ding SN, Qiu HF. Circulating microrna-218 was reduced in cervical cancer and correlated with tumor invasion. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 2012; 138 (4): 671-674. 65, 69 Chen J, Yao D, Li Y et al. Serum microrna expression levels can predict lymph node metastasis in patients with early-stage cervical squamous cell carcinoma. International Journal of Molecular Medicine 2013; 32 (3): 557-567. 66, 70 Zhao S, Yao D, Chen JY, Ding N. Circulating mirna-20a and mirna-203 for screening lymph node metastasis in early stage cervical cancer. Genetic Testing and Molecular Biomarkers 2013; 17(8): 631-6. 67, 71 You WZ, Wang YG, Zheng JZ. Plasma mir-127 and mir-218 Might Serve as Potential Biomarkers for Cervical Cancer. Reproductive Sciences 2015; 22 (8): 1037-1041.