Izolace nukleových kyselin

Podobné dokumenty
Seminář izolačních technologií

Seminář izolačních technologií

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..

Molekulárně biologické metody v mikrobiologii. Mgr. Martina Sittová Jaro 2014

RNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013)

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie

Izolace nukleových kyselin

In vitro testování scaffoldů pro tkáňové inženýrství. Mgr. Jana Horáková

Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202)

IZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini)

Hybridizace nukleových kyselin

Izolace nukleových kyselin

První testový úkol aminokyseliny a jejich vlastnosti

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha

IZOLACE DNA POMOCÍ CTAB PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR

Metody práce s proteinovými komplexy

IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT NUCLEOSPIN FOOD)

Imunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky

Metody molekulární biologie

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů

MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200

Analýza magnetických mikročástic mikroskopií atomárních sil

2. Srovnání postupů izolace DNA kolonky vs. paramagnetické částice

Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů:

Příprava vzorků pro proteomickou analýzu

PŘÍBALOVÁ INFORMACE. GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit IDNA050 IDNA250. In vitro diagnostický zdravotnický prostředek

IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT GENELUTE)

Srážení, extrakce a centrifugace

Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky.

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

ehled metod molekulární biologie využívaných v patofyziologii

Ivo Papoušek. Biologie 6, 2017/18

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová

Zkušební okruhy k přijímací zkoušce do magisterského studijního oboru:

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE

Ivo Papoušek. Biologie 8, 2015/16

MagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit

Izolace DNA plazmidu puc18 metodou alkalické lyze (protokol).

Izolace proteinů ze savčích buněk

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

Název: Vypracovala: Datum: Zuzana Lacková

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

Separační metody používané v proteomice

Projekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují

Základní praktická cvičení z molekulární biologie

Exprese rekombinantních proteinů

Molekulární biotechnologie č.9. Cílená mutageneze a proteinové inženýrství

Elektromigrační metody

Biologické materiály k biochemickému vyšetření

Tkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MagPurix Viral/Pathogen Nucleic Acids Extraction Kit B

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

List protokolu QIAsymphony SP

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

PLANÁRNÍ (PLOŠNÁ) CHROMATOGRAFIE

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE I PŘÍPRAVA TKÁNĚ K IZOLACI DNA

Metody testování humorální imunity

Tematické okruhy k SZZ v bakalářském studijním oboru Zdravotní laborant bakalářského studijního programu B5345 Specializace ve zdravotnictví

Název: (Ne)viditelná DNA?

EXTRAKČNÍ METODY. Studijní materiál. 1. Obecná charakteristika extrakce. 2. Extrakce kapalina/kapalina LLE. 3. Alkalická hydrolýza

BUNĚČ ORGANISMŮ KLÍČOVÁ SLOVA:

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR

Pulzní gelová elektroforéza Při konvenční gelové elektroforéze je rozdělení molekul je podmíněno rychlejším průchodem menších molekul pórovitou

EXTRAKCE, CHROMATOGRAFICKÉ DĚLENÍ (C18, TLC) A STANOVENÍ LISTOVÝCH BARVIV

MagPurix Bacterial DNA Extraction Kit

strojů umožň lní vstupní infiltraci Mgr. Silvie Dudová, RNDr. Iva Burešová, Drahomíra Kyjovská

Tématické okruhy pro státní závěrečné zkoušky

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE I PŘÍPRAVA TKÁNĚ K IZOLACI DNA

Rozpustnost Rozpustnost neelektrolytů

Zpráva o postupu projektu TA

1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru

Chemická reaktivita NK.

Specifická izolace microrna pomocí magnetizovatelných mikročástic

Typy nukleových kyselin. deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA).

Sada pro získání DNA ze zeleniny/ovoce Kat. číslo

DYNEX nabízí komplexní řešení v oblasti zpracování a analýzy biologických materiálů pomocí molekulárně biologických metod.

Hydrofobní chromatografie

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN

KATALOG DIAGNOSTICKÝCH SETŮ S K A L A B 2018

GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

prokaryotní Znaky prokaryoty

BÍLKOVINY HLÍZ BRAMBOR

Ing. Milan Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ

Praktický kurz Příprava buněčného lyzátu, izolace celkové RNA pomocí kolonek/tripure reagent, stanovení koncentrace RNA

Biologie buňky. systém schopný udržovat se a rozmnožovat

Nukleové kyseliny (NK)

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

studium množství určitého transkriptu v daném vzorku a v množství dané molekuly mrna v dané buňce a v daném

1. Definice a historie oboru molekulární medicína. 3. Základní laboratorní techniky v molekulární medicíně

Klonování DNA a fyzikální mapování genomu

Transkript:

Izolace nukleových kyselin

Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které se po lyzi buněk nebo virových částic stávají součástí hrubých lyzátů a jejichž přítomnost by bránila účinnému a specifickému působení enzymů používaných k jejich analýze a úpravám přečišťovací enzymy

Materiál pro izolaci nukleových kyselin Výchozím materiálem mohou být: Jednotlivé buňky (např. prokaryotických organizmů nebo kvasinek) Genomová Plazmidová Tkáně a orgány eukaryot, které jsou nejdříve homogenizovány Virové částice purifikované centrifugačními technikami Nukleové kyseliny v elektroforetických gelech Produkty PCR reakcí

Metodické principy využívané při izolaci nukleových kyselin Rozrušení buněčných stěn nebo virových nukleokapsidů působením Enzymů (lysozym a celulázy) Detergentů (dodecylsulfát sodný) Enzymatické kroky pro odstranění kontaminant Proteináza K nebo pronáza E RNáza nebo DNáza Kroky využívající různou rozpustnost Fenolová extrakce Adsorpce na pevný podklad Centrifugace Precipitace

Typy metod pro izolaci nukleových kyselin 1. Metody využívající rozdílné rozpustnosti Zahrnují fenolové extrakce a etanolové nebo izopropanolové precipitace (srážení) Obecně rozšířené, široké aplikace Vhodné pro vysokomolekulární genomové NK 2. Metody adsorpční DNA se váže na křemičité sklo v přítomnosti chaotropní látky Vhodné zejména pro rychlou purifikaci plazmidů a malých fragmentů 3. Centrifugace v hustotním gradientu Izopyknické centrifugace v gradientu CsCl Vhodné při velkém množství a pro vysokou čistotu Možnost frakcionace podle velikosti v sacharózových gradientech

Typická fenolová extrakce Promíchání lyzátu buněk s roztokem fenolu, případně se směsí fenolu a chloroformu. Fenol je organické rozpouštědlo používané k oddělení proteinů od nukleových kyselin. Proteiny jsou hydrofobní a zůstávají v organické fázi, zatímco NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze. Chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím kroku. Centrifugace, při níž dojde k oddělení spodní organické fáze, tvořené fenolem (případně směsí fenolu a chloroformu), mezifáze, tvořené denaturovanými proteiny a zbytky buněk, a horní vodné fáze, v níž jsou rozpuštěny nukleové kyseliny. Vysrážení nukleových kyselin etanolem, případně izopropanolem. Účinnému vysrážení nukleových kyselin přítomných v nízkých koncentracích se napomáhá snížením teploty a přídavkem solí. Shromáždění precipitátu nukleových kyselin centrifugací a rozpuštění získaného sedimentu ve vhodném roztoku.

Základní složky roztoků NaCl iontová síla Tris hydrochlorid pufrovací činidlo EDTA chelatační činidlo (ochrana před působením nukleáz)

Izolace plazmidové DNA Výskyt u bakterií Topologie molekuly Dvouřetězcová DNA Kružnicový tvar Malá velikost Více kopií v buňce Metody založené na denaturaci a renaturaci Alkalická lyze Lyze varem

Alkalická lyze pro izolaci plazmidové DNA 1. Kultivace buněk v přítomnosti antibiotika 2. Šetrné odstranění buněčné stěny (lysozym) 3. Přídavek roztoku s NaOH Denaturace bakteriálního chromozomu ČÁSTEČNÁ DENATURACE PLAZMIDU 4. Přídavek neutralizačního roztoku Vysrážení chromozomální DNA s proteiny RENATURACE PLAZMIDOVÉ DNA 5. Odstranění bakteriální DNA centrifugací 6. Purifikace plazmidové DNA

Izolace RNA Izolace RNA fenolovou extrakcí je podobná izolaci DNA s následujícími rozdíly: Inhibitory RNáz, sterilní boxy, DEPC-H 2 O, rukavice! Extrakce v guanidinových solích Fenolové extrakce při ph 5-6 Odstranění DNA DNázami bez RNáz Selektivní srážení RNA pomocí LiCl Afinitní chromatografie na olido-dt kolonách pro izolaci mrna

Izolace mrna mrna tvoří pouze malý podíl z celkové RNA, proto je její izolace obtížná Pro izolaci se využívají Tradiční metody, kdy se nejprve izoluje celková RNA, která je následně separovaná na mrna, rrna a trna Metody využívající afinitu poly(a) konce u mrna a biotinem značené oligo(dt) sondy Sonda se v lyzátu selektivně váže na mrna, aniž by interagovala s DNA nebo jinými RNA Hybridní molekuly biotinylované dt-a mrna jsou imobilizovány na pevném podkladu pokrytém streptavidinem

Streptavidinem pokryté mikrozkumavky Streptavidinem pokryté magnetické částice

Adsorpční metody Využívají schopnost nukleových kyselin adsorbovat se na povrchy z oxidu křemičitého (kolonky do centrifugačních mikrozkumavek) v přítomnosti chaotropní soli (Vogelstein and Gillespie, 1979) guanidin thiokyanát guanidin hydrochlorid jodid sodný (NaI) Síla vazby závisí na Typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) Iontové síle ph roztoku Promývání pro odstranění proteinů a dalších kontaminant Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H 2 O Rychlá metoda, vysoký výtěžek (malé fragmenty), vysoká čistota

Mechanismus interakce DNA s oxidem křemičitým

Analýza a kvantifikace SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA Vhodná metoda pro měření vzorků, které jsou Dostatečné koncentraci Dostatečně čisté bez významného množství kontaminant. Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm.