UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOGNOZIE IZOLACE ROSTLINNÝCH ORGANEL A STUDIUM TRANSPORTNÍCH DĚJŮ

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOGNOZIE IZOLACE ROSTLINNÝCH ORGANEL A STUDIUM TRANSPORTNÍCH DĚJŮ Diplomová práce DANA KETTNEROVÁ Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Jan Martin, Ph.D. Hradec Králové 2015

Vedoucí katedry: Doc. RNDr. Jiřina Spilková, CSc. Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Jan Martin, Ph.D. Datum zadání: 26. 9. 2012 Datum odevzdání: 14. 8. 2015 Datum obhajoby: 14. 9. 2015 Oponent diplomové práce:

Prohlášení Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové dne 14. 8. 2015..

Poděkování Děkuji svému školiteli PharmDr. Janu Martinovi, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady a konzultace, které mi poskytl při vypracování této diplomové práce.

Obsah 1 ÚVOD... 8 2 CÍL PRÁCE... 10 3 METODIKA PRÁCE... 11 4 SEZNAM SYMBOLŮ A ZKRATEK... 12 5 TEORETICKÁ ČÁST... 15 5.1 Charakterizace rostlinné buňky... 15 5.2 Buněčná stěna... 15 5.2.1 Charakterizace buněčné stěny... 15 5.2.2 Složení buněčné stěny... 16 5.2.3 Komunikace zprostředkovaná buněčnou stěnou... 17 5.2.4 Typy buněčné stěny... 17 5.2.5 Jednotlivé složky buněčné stěny... 19 5.2.5.1 Polysacharidy... 19 5.2.5.1.1 Celulóza... 19 5.2.5.1.2 Hemicelulózy... 19 5.2.5.1.3 Pektiny... 21 5.2.5.1.4 Kalóza... 22 5.2.5.2 Proteiny... 22 5.2.5.3 Organické látky... 24 5.2.5.4 Anorganické látky... 26 5.2.6 Funkce buněčné stěny... 26 5.2.7 Izolace buněčné stěny... 26 5.2.7.1 Příklad izolace buněčné stěny... 28 5.3 Cytoplazmatická membrána plazmalema... 28 5.3.1 Definice... 28 5.3.2 Funkce plazmalemy... 29 5.4 Protoplast... 30 5.4.1 Definice... 30 5.4.2 Využití... 31 5.4.3 Izolace protoplastů... 32 5.4.3.1 Mechanická izolace... 32 5.4.3.2 Enzymatická izolace... 33 5

5.4.3.2.1 Historie... 33 5.4.3.2.2 Provedení enzymatické izolace... 34 5.4.3.2.3 Výhody a limity enzymatické izolace... 35 5.4.3.2.4 Faktory ovlivňující izolaci... 35 5.4.3.2.5 Purifikace protoplastů... 40 5.4.3.2.6 Vyhodnocení úspěšnosti izolace... 42 5.4.3.2.7 Stanovení výtěžnosti izolace... 43 5.4.3.2.8 Příklady enzymatických izolací... 43 5.5 Chloroplasty... 47 5.5.1 Definice... 47 5.5.2 Izolace... 49 5.5.3 Souhrn... 71 5.5.3.1 Složky izolačního a resuspendačního pufru... 72 5.5.3.2 Izolace detailní příklad... 73 5.6 Vakuoly... 76 5.6.1 Definice... 76 5.6.2 Funkce vakuoly... 77 5.6.2.1 Zachování homeostázy cytoplasmy... 77 5.6.2.2 Zásobní funkce... 77 5.6.2.3 Odpadní, detoxifikační funkce... 78 5.6.2.4 Zprostředkování interakcí... 78 5.6.2.5 Funkce lysozomálního kompartmentu, význam pro vodní hospodářství a růst buněk... 78 5.6.3 Výskyt látek ve vakuolách a jejich význam pro rostlinnou buňku... 78 5.6.3.1 Meziprodukty buněčného metabolismu... 78 5.6.3.2 Anorganické ionty... 79 5.6.3.3 Rezervní sacharidy... 79 5.6.3.4 Rezervní bílkoviny... 79 5.6.3.5 Sekundární metabolity... 79 5.6.3.6 Hydrolytické enzymy... 79 5.6.4 Izolace vakuol... 79 5.6.5 Souhrn... 92 6 DISKUSE... 93 7 ZÁVĚR... 96 6

8 POUŽITÁ LITERATURA A ZDROJE... 97 9 ABSTRAKT... 108 10 ABSTRACT... 109 7

1 ÚVOD Již od pradávna se lidé učili používat jednotlivé rostliny buď jako zdroje potravy pro sebe či pro svá domácí zvířata nebo jako léčivé rostliny využitelné pro léčbu nejrůznějších nemocí. Nemůžeme zapomenout na úlohu rostlin jako zdroje pro textilní materiál. Naši předkové však neměli o mnohém využití rostlin, tak jak je známe dnes, ani potuchy. My už v dnešní době známe struktury rostlinné buňky velmi detailně a umíme toho využívat. Víme o obsahu látek v jednotlivých rostlinných druzích, z nichž jsme již celou řadu schopni syntetizovat chemicky. Nicméně tomuto období předcházelo období domněnek, pokusů a omylů. Pojem buňka byl poprvé použit v 17. století Robertem Hookem, který pozoroval pomocí primitivně vyrobeného mikroskopu buňky korku. Zásadní posun však přinesl až objev mikroskopu Antoni van Leeuwenhoekem v roce 1665. Mikroskopem byla otevřena brána do mikrosvěta. Leeuwenhoek byl tímto světem fascinován a své mikroskopické preparáty zachycoval i pomocí kreseb. Následovaly další vědecké a technické objevy. Vývoj nových přístrojů poskytl lepší podmínky pro vědeckou činnost a tak se počátkem 20. století začaly množit vědecké objevy. Přístroje ještě nebyly dostatečně přesné, takže o přesné analýze nemohla být řeč. I proto vznikala řada konfliktů mezi vědci, neboť jedni se domnívali, že učinili důležitý objev, pro který mají důkazy. Jiná skupinka však vzápětí přišla s diametrálně odlišným závěrem a bylo to tvrzení proti tvrzení. Přesnější vědecká práce mající vypovídající hodnotu byla umožněna až s vývojem nových a spolehlivých metod a přístrojů. Syntéza chemikálií, přesné analytické, chromatografické a další metody umožnily podrobnější studium rostlinné buňky. Jednotlivé části rostlinné buňky jsou dnes detailně popsány, je známa jejich stavba i chemické složení, což usnadňuje přípravu izolačních postupů. Pro řadu rostlinných struktur jsou již známy izolační postupy zaručující poměrně vysokou výtěžnost požadované struktury a otevírají možnosti ke studiu fyziologických i patologických procesů v rostlinné buňce, genetické manipulaci, ovlivnění procesů uskutečňovaných v rámci rostlinné buňky, včetně ovlivnění produkce velmi specifických sloučenin nacházejících se v rostlinné buňce a to sekundárních metabolitů. Sekundární metabolity jsou farmaceuticky cenné látky, a proto probíhá v této oblasti intenzivní výzkum s cílem porozumět jejich syntéze, faktorům syntézu ovlivňujícím, jejich transportům. Znalost izolačních metod jednotlivých organel 8

rostlinné buňky může v tomto výzkumu pomoci. Díky izolaci jednotlivých organel mohou být pomocí výzkumu in vitro pochopeny transportní procesy, přesně lokalizována kumulace jednotlivých látek, potvrzen výskyt jednotlivých enzymů a jejich charakterizace, studovány podmínky vedoucí k optimální syntéze sekundárních metabolitů apod. 9

2 CÍL PRÁCE Tato diplomová práce s názvem Izolace rostlinných organel a studium transportních dějů se zabývá popisem jednotlivých rostlinných buněčných organel a struktur, jejich funkcí a postupy, které umožňují jejich izolaci. Cílem práce bylo: 1. Zjistit informace o struktuře a funkci jednotlivých organel rostlinné buňky 2. Seznámit se s postupy využívanými pro izolaci těchto organel 3. Vyhodnotit jednotlivé izolační postupy na základě četnosti jejich použití 4. Zhodnotit využití jednotlivých izolačních metod 10

3 METODIKA PRÁCE Zpracování této diplomové práce se skládalo z několika fází. Nejprve byly prohledány abstraktové a fulltextové internetové databáze: ScienceDirect, Google Scholar, PubMed, Plant Physiology, ResearchGate, Web of Science a Springer, pomocí kterých bylo vyhledáno co největší množství informací týkajících se metod určených k izolaci jednotlivých částí rostlinné buňky. Na základě tohoto předběžného průzkumu bylo vytipováno několik rostlinných buněčných struktur, u nichž bylo k dispozici dostatečné množství odborných článků a zároveň se jevily jako zajímavé i z hlediska farmaceutického. Další fází bylo vyhledání informací o jednotlivých strukturách. O jejich stavbě, funkci a následně o metodách využívaných pro jejich izolaci. K tomu bylo využito uvedených zdrojů a internetového vyhledávače Google. Byla snaha seřadit izolační metody chronologicky, případně podle prováděných modifikací či rostlinného druhu použitého při izolaci. Nakonec bylo provedeno zhodnocení jednotlivých izolačních metod, jejich kladů, záporů a omezení. Případně faktorů ovlivňujících izolaci a zhodnocení jednotlivých složek roztoků využívaných při izolaci a ovlivňujících stabilitu izolovaných struktur. 11

4 SEZNAM SYMBOLŮ A ZKRATEK ADP AgNO 3 AGPs ATP BSA Ca 2+ CaCl 2 CaCO 3 Ca(H 2 PO 4 ) 2 CAM CHAPS CH 3 COOH Cl - CO 2 CPW DEAE-dextran DNA DTE DTT GRPs EDTA EGTA FDA HCl HEPES HMS pufr HRGPs HS pufr HSA Hyp 4 adenosindifosfát dusičnan amonný arabinogalaktanové proteiny adenosintrifosfát hovězí sérový albumin vápenaté ionty chlorid sodný uhličitan vápenatý dihydrogenfosforečnan vápenatý (superfosfát) Crassulacean Acid Metabolism (metabolismus kyselin u tučnolistých) 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1- propansulfonát (detergent) kyselina octová chloridové ionty oxid uhličitý promývací roztok pro buňku a protoplast diethylaminoethyl deoxyribonukleová kyselina dithioerythritol dithiotreitol proteiny bohaté na glycin kyselina ethylendiamintetraoctová kyselina ethylen-glykol-tetraoctová fluorescein diacetát kyselina chlorovodíková 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonová kyselina pufr skládající se z HEPES, MgSO 4 a sorbitolu glykoproteiny bohaté na hydroxyprolin pufr skládající se z HEPES a sorbitolu lidský sérový albumin (human serum albumin) 4-hydroxyprolin 12

K + KHCO 3 K 2 HPO 4 KOH KCl Lys MES MgSO 4 MgCl 2 MnCl 2 MS médium MTT MW Na + Na 2 CO 3 NADP + NaHCO 3 NaCl NaClO 2 NaNO 3 NO 3 - Na 4 P 2 O 7.10 H 2 O PEG PMSF PPi Pro 4 PRPs Pn PVP PVPP Ser SiO 2 TAE draselné ionty hydrogenuhličitan draselný hydrogenfosforečnan draselný hydroxid draselný chlorid draselný lysin kyselina 2-(N-morfolino)ethan sulfonová síran hořečnatý chlorid hořečnatý chlorid manganatý Murashige a Skoog médium 3-(4,5 dimethylthiazol 2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid molekulová hmotnost sodné ionty uhličitan sodný nikotinamidadenindinukleotidfosfát hydrogenuhličitan sodný chlorid sodný chloritan sodný dusičnan sodný dusičnanové ionty dekahydrát difosforečnou tetrasodného polyethylenglykol fenylmethylsulfonyl fluorid anorganický pyrofosfát 4-prolin proteiny bohaté na prolin polymerizační stupeň polyvinylpyrrolidon polyvinylpolypyrrolidon serin oxid křemičitý tris acetát 13

TBE Tricin Tris Tyr UV záření tris borátový pufr N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycin trisaminomethan tyrosin ultrafialové záření 14

5 TEORETICKÁ ČÁST 5.1 Charakterizace rostlinné buňky Rostlinné buňky se, spolu s buňkami prvoků, řas, hub, rostlin a živočichů, řadí mezi buňky eukaryotní. Jedná se o buňky, které se na Zemi objevily o tři miliardy let později než buňky prokaryotní. 1) Rostlinná buňka se skládá z buněčné stěny a protoplastu. Povrch protoplastu je tvořen cytoplazmatickou membránou. Protoplast obsahuje cytoplazmu, v té se nachází jádro (nukleus), buněčné organely (ribozomy, plastidy, mitochondrie) a soustava membrán (tzv. endomembránový systém - Golgiho aparát, endoplazmatické retikulum, vezikulární útvary). Mezi vezikulární útvary patří např. vakuoly, lysozómy, mikrotělíska, peroxyzómy, glyoxyzómy. Funkčně jsou tyto útvary velmi různorodé, vzhledově jde o drobné váčky s membránou na povrchu. Základní strukturou cytoplazmy jsou cytosol a cytoskelet, zvnějšku je cytoplasma ohraničena plazmatickou membránou (plazmalemou). Cytoskelet zajišťuje na buněčné úrovni pohyb a zároveň tvoří opěrnou soustavu buňky. Skládá se z vláknitých a trubičkovitých bílkovinných útvarů. Jedná se o mikrotubuly, mikrofilamenta a intermediální filamenta. Tyto útvary jsou tvořeny bílkovinami tubulinem, aktinem a myozinem. Cytosol tvoří převážnou část vnitřního prostředí buňky, v němž jsou rozptýleny organely a membránová soustava buňky. Jedná se o základní nestrukturovanou substanci, tvořenou zejména vodou (75 85 %), organickými a anorganickými látkami, bílkovinami (10-20 %), lipidy (2-3 %), sacharidy (1 %) a řádově 1 % popelovin. (Přibližné obsahy jsou platné u vyšších rostlin). 2) 5.2 Buněčná stěna 5.2.1 Charakterizace buněčné stěny Buněčná stěna je vnější strukturou rostlinné buňky. Tuto strukturu obsahují, s výjimkou některých řas a spermatických, někdy i vaječných, buněk cévnatých rostlin, všechny rostlinné buňky. Právě buněčná stěna odlišuje buňku rostlinnou od buňky živočišné. Buněčná stěna vzniká jako výsledek činnosti zejména Golgiho aparátu. Hemicelulózy a pektiny jsou syntetizovány přímo v cisternách Golgiho aparátu. Glykoproteiny jsou částečně syntetizovány v drsném endoplazmatickém retikulu (2) (4) 2) 3) 3) 4) 15

(bílkovinná část glykoproteinů), jejich syntéza je dokončena glykosylací v cisternách Golgiho aparátu. Odtud jsou všechny zmíněné stavební jednotky buněčné stěny ve vezikulech transportovány k plazmalemě, s kterou splývají a dostávají se do prostoru buněčné stěny. K biosyntéze celulózy však dochází přímo v místě vzniku budoucí mikrofibrily. K syntéze potřebný enzym celulózosyntáza je součástí plazmalemy. Nízkomolekulární prekurzory celulózy jsou transportovány z cytoplazmy. Buněčná stěna je ve většině případů prakticky zcela propustná. Může však být i nepropustná, jak je tomu např. u zkorkovatělých buněčných stěn korku, či částečně propustná např. u některých buněk endodermis primární kůry stonků a kořenů. 1) 2) 3) 4) 7) 5.2.2 Složení buněčné stěny Buněčná stěna se skládá z celulózových mikrofibril a amorfní matrix. Její struktura je přirovnávána k železobetonu. Celulózové mikrofibrily zde představují železné pruty a amorfní složky odpovídají betonové výplni. Ve stavbě buněčné stěny existují taxonomické rozdíly, rovněž se liší složení primární a sekundární stěny. Buněčná stěna je u všech rostlinných buněk složena ze dvou vrstev střední lamely a primární stěny. Střední lamela vzniká v ontogenezi z přepážky (tzv. buněčné destičky) mezi dceřinými buňkami splýváním váčků odškrcených z Golgiho komplexu. Tyto váčky obsahují látky pektinové povahy. Z pektinů převládají pektiny kyselé povahy. Hlavní složkou kyselých pektinů je kyselina galakturonová, která vytváří řetězce homogenní nebo heterogenní. Homogenní řetězce jsou tvořeny pouze z molekul kyseliny galakturonové, u heterogenních řetězců jsou přítomny kromě molekul kyseliny galakturonové též molekuly dalších sacharidů, např. rhamnózy. Na snížení rozpustnosti střední lamely a především na zvýšení její pevnosti se podílejí vápenaté a hořečnaté ionty. Tyto ionty se váží v jednotlivých řetězcích na volné karboxylové skupiny kyseliny galakturonové, čímž řetězce propojí a zvýší celkovou pevnost střední lamely. Ke střední lamele se dostředivě přikládá primární stěna, která sílí přikládáním dalšího materiálu, jako jsou pektiny, celulóza či hemicelulóza. U některých buněk se jako produkt sekundárního růstu vytváří další vrstva - tzv. sekundární stěna. Nejprve 16

dochází k ukládání přechodné lamely. K této lamele se následně přikládají lamely sekundární stěny. Buněčnou stěnu tvoří čtyři skupiny polymerů: celulóza, proteiny, pektin a hemicelulózy. Minoritně se vyskytuje kalóza. 1) 2) 3) 4) 7) 5.2.3 Komunikace zprostředkovaná buněčnou stěnou K propojení a možnosti vzájemné komunikace jednotlivých buněk slouží tzv. plazmodezmy. Jedná se o kanálky o průměru přibližně 50 nm, kterými procházejí cytoplazmatické spoje, jež propojují sousedící protoplasty. Tento vzájemně propojený protoplazmatický celek, díky němuž může docházet k transportu látek mezi buňkami, nazýváme symplast. Velikost plazmodezmů je značná, mají však limitovanou, a pravděpodobně i regulovatelnou, propustnost. Počet plazmodezmů na jednu buňku může být velký (až 10000), některé buňky však nemusí plazmodezmy obsahovat vůbec. Tento jev nepropojenosti s ostatními buňkami je však u rostlin velmi ojedinělý. Jednotlivé prostory mezi mikrofibrilami a micelami celulózy tvoří dohromady tzv. apoplast, tedy kontinuum propojených prostor buněčných stěn. Díky tomuto kontinuu dochází k transportu látek nejen v rámci tohoto kontinua, ale i k povrchu protoplastu. Tato transportní dráha se nazývá apoplastická dráha. Volně se zde mohou pohybovat voda a molekuly látek bez elektrického náboje, jejichž molekula je menší než velikost pórů v buněčné stěně. Komplikovanější je to však v případě iontů, neboť u těch dochází k interakcím se strukturou buněčné stěny. Např. u kyselých pektinů dochází k interakci s disociovanými karboxylovými skupinami kyseliny galakturonové. 1) 2) 3) 4) 7) 5.2.4 Typy buněčné stěny Rozlišujeme dva typy buněčné stěny primární a sekundární. Tyto typy se navzájem liší nejen stavbou, ale i chemickým složením. Primární buněčnou stěnu najdeme u buněk rostoucích, vzniká přidáváním nových mikrofibril mezi mikrofibrily již existující. Mikrofibrily utváří síť, která je pro primární buněčnou stěnu charakteristická. Růst buněčné stěny vyžaduje rozvolnění struktury (regulace fytohormonem auxinem), zvýšený příjem vody buňkou, intenzivnější respiraci a v neposlední řadě zvýšení syntézy proteinů. 1) 2) 3) 4) 7) 17

Primární buněčná stěna je dostatečně mechanicky odolná, zároveň však umožňuje dostatečnou expanzi buňky v případě zvýšení vnitřního tlaku, čímž zabraňuje jejímu prasknutí. 48) Matrix primární stěny je velmi hydratovaná a skládá se z hemicelulóz, pektinů a bílkovin. V matrix stěny jsou uloženy celulózové mikrofibrily. Obsah celulózy v primární buněčné stěně je přibližně 20 % suché hmotnosti stěny. Sekundární stěna se nachází u buněk již nerostoucích a zvětšuje se pouze tloustnutím, tedy přikládáním nových vrstev. Sekundární stěna se ukládá dostředivě, díky čemuž dochází k značnému zmenšení lumen buňky. Rigidita sekundární stěny je dána absencí pektinů a značným podílem celulózy (40 %, např. u trichomů bavlníku však až 90 %). V sekundární stěně chybí glykoproteiny, které naopak tvoří značný podíl struktury primární stěny. Přítomny jsou hemicelulózy a bílkoviny, které však nejsou totožné s těmi ve stěně primární. Velmi důležitou součástí sekundární stěny je lignin. Sekundární stěna se může vytvářet rovnoměrně po celém povrchu primární stěny, nebo jen na některých místech. I při rovnoměrném ukládání na primární stěnu se však vytváří neztloustlá místa, která se zpravidla vyskytují v místě plazmodezmů a zabezpečují neporušení kontinuity symplastu. I přes značné tloustnutí si sekundární stěna zachovává jistou míru pružnosti. Ukládání dalších anorganických či organických látek do buněčné stěny nebo na její povrch může značně měnit vlastnosti stěny. Častým procesem je lignifikace (dřevnatění). Při lignifikaci je do prostor buněčné stěny ukládána organická látka - lignin (dřevovina). Sekundární stěna je důležitá zejména u specializovaných buněk, které mají zpevňující funkci a jsou zásadní pro vedení vody. U těchto buněk se již zpravidla nenachází protoplast, který po utvoření sekundární stěny většinou zcela odumírá. Specializované buňky, jedná se zejména o vodivé elementy xylému, nabývají plné funkčnosti až po odumření protoplastu. 1) 2) 3) 4) 7) 18

5.2.5 Jednotlivé složky buněčné stěny 5.2.5.1 Polysacharidy 5.2.5.1.1 Celulóza Celulóza je polysacharid skládající se z molekul D-glukózy (β1 4), určuje architekturu buněčné stěny. Její molekuly jsou uspořádány do micel, které tvoří mikrofibrily široké 10 25 nm. Mikrofibrily jsou stabilizovány intermolekulárními i intramolekulárními vodíkovými můstky. Prostor mezi mikrofibrilami a micelami umožňuje pohyb vody, iontů a malých molekul (např. monosacharidů a oligosacharidů) v rámci buněčné stěny. Mikrofibrily vytvářejí makrofibrily o průměru 0,5 μm a délce až 4 μm. Takto je vytvořena celulózová kostra buněčné stěny, která je prostoupena matrix necelulózových molekul (hemicelulóz, pektinu, proteinů). Pevnost celulózových mikrofibril je obrovská, shodná s pevností ocelového drátu majícího stejný průměr. 1) 2) 3) 4) 7) 43) Vlastnosti mikrofibril, jako je stupeň polymerizace, šířka a krystalinita jsou velmi variabilní a závisí na zdroji a stáří rostlinné tkáně. Stupeň polymerizace celulózy je u primární buněčné stěny poměrně nízký, vyšších hodnot nabývá u sekundární buněčné stěny. Obsah této vláknité komponenty buněčné stěny se u jednotlivých rostlin a jejich částí výrazně liší a může nabývat hodnot od 2 4 % obsahu v buněčné stěně endospermu obilnin až po obsah 94 % v buněčné stěně chlupů semen bavlníku. Studium fyzikálních a chemických vlastností celulózy se zpravidla provádí na frakci, která zůstane po extrakci buněčné stěny vodnými chelatačními činidly a silnými zásadami. Jedná se o frakci tzv. α celulózy. Pokud se jedná o lignifikované rostlinné tkáně, je často v postupu vedoucímu k izolaci frakce α celulózy zahrnut krok využívající extrakci pomocí NaClO 2 a CH 3 COOH. Frakce α celulózy vždy obsahuje glykoprotein extenzin a některé neglukózové zbytky. 43) 5.2.5.1.2 Hemicelulózy Jedná se o skupinu heterogenních polysacharidů, jejichž základní kostru tvoří monosacharidové jednotky propojené β-(1 4) glykosidickou vazbou v ekvatoriální konfiguraci. Skupina hemicelulóz zahrnuje xyloglukany, xylany, manany, glukomanany a β-(1 3, 1 4) glukany. U všech suchozemských rostlin se v buněčné stěně vyskytují všechny zmíněné skupiny až na β-(1 3, 1 4) - glukany, 19

které se vyskytují pouze u řádu Poales a u několika dalších rostlin. Mezi jednotlivými rostlinnými druhy a rostlinnými tkáněmi nalezneme velké rozdíly v detailní struktuře a množství vyskytujících se hemicelulóz. Jejich nejdůležitějším přínosem pro buněčnou stěnu je její posílení pomocí interakcí s celulózou, popř. i ligninem. Hemicelulózy jsou syntetizované v Golgiho aparátu pomocí glukosyltranferáz. Většina hemicelulóz může být extrahována alkalickou extrakcí. 49) Xyloglukany Xyloglukany jsou v rostlinných buňkách nejčastěji se vyskytující hemicelulózy. Byly nalezeny u každého rostlinného pozemského druhu s výjimkou oddělení Charophyta (parožnatky). Tvoří přibližně 20 % suché váhy buněčné stěny u dvouděložných rostlin a 2 % u jednoděložných rostlin. Poprvé byly xyloglukany izolovány a popsány v roce 1961 (Kooiman). Molekula xyloglukanu je tvořena z polysacharidu celulózy (tvořeného jednotkami β D - (1 4) glukózy) a jednotkami D - xylopyranózy v postranních řetězcích, na kterou mohou být eventuálně navázány další substituenty. Jednotky xylózy jsou na molekuly glukózy vázány α - (1 6) glykosidickými vazbami. 4) 43) 44) 45) 49) Xylany Jedná se o velmi rozmanitou skupinu polysacharidů, jejichž společným rysem je výskyt polysacharidového řetězce tvořeného monosacharidovými jednotkami xylózy propojenými β-(1 4) glykosidickými vazbami. Obvyklou modifikací xylanů je substituce glukuronosylovými a 4 O methyl glukuronosylovými zbytky vázanými α-(1 2) vazbou. Takto substituované xylany jsou známy pod názvem glukuronoxylany a jsou hlavní složkou necelulózových polysacharidů sekundární buněčné stěny dvouděložných rostlin. U commelinidů (mezi ně se řadí i obsáhlý řád Poales) patřících mezi jednoděložné rostliny tvoří xylany přibližně 20 % primární buněčné stěny a představují hlavní necelulózové polysacharidy buněčné stěny. Struktura těchto xylanů obvykle obsahuje zbytky arabinózy navázané na základní polysacharidový řetězec a tak se tyto xylany označují jako arabinoxylany a glukuronoarabinoxylany. Většina xylanů je v různé míře acetylována, zejména pak xylany v buněčných stěnách dvouděložných rostlin. 20

Manany a glukomanany Jedná se o polysacharidy, jejichž řetězec je tvořen molekulami manózy vázanými navzájem β-(1 4) glykosidickými vazbami. Jejich kostru tvoří buď samotná manóza (manany, galaktomanany) či manóza a glukóza (glukomanany a galaktoglukomanany). Manany a glukomanany jsou často acetylovány. β-(1 3, 1 4) glukany β-(1 4) vázané glukany střídané jednotlivými β-(1 3) vazbami jsou známy u travin. Tyto glukany mají v primární buněčné stěně důležitou roli při expanzi buňky. Jejich množství v buněčné stěně je závislé na vývojové fázi buňky. β - (1 3, 1 4) glukany se nachází u řádu Poales, rodu Equisetum, oddělení Charophyta, u kmene Rhodophyta (ruduchy), jejich výskyt se předpokládá i u játrovek. Tyto glukany se nevyskytují u dvouděložných rostlin. 49) 5.2.5.1.3 Pektiny Pektiny jsou heterogenní polysacharidy obsahující velké množství zbytků kyseliny galakturonové. Kyselina galakturonová tvoří průměrně 70 % struktury pektinů. Skupina pektinů zahrnuje homogalakturonan, rhamnogalakturonan I a substituované galakturonany rhamnogalakturonan II a xylogalakturonan. Pektiny tvoří přibližně 35 % struktury primární stěny dvouděložných a jednoděložných rostlin s výjimkou lipnicovitých, 2 10 % primární buněčné stěny travin a dalších commelinidů a až 5 % stěn dřevnatých pletiv. Pektiny se hojně vyskytují v buněčných stěnách obklopujících rostoucí a dělící se buňky, ve stěnách buněk měkkých částí rostliny, ve střední lamele a buněčných rozích. Pektiny jsou též přítomny v místech sloužících k propojení buňky se sekundární buněčnou stěnou, jako je xylém a vláknité buňky dřevnatého pletiva. Tvoří složku buněčné stěny všech vyšších rostlin, stěny nahosemenných, kapraďorostů, mechorostů a rodu Chara. Pektiny hrají pravděpodobně důležitou roli ve stavbě a funkci primární i sekundární buněčné stěny a jejich izolace se ukazuje jako klíčová pro pochopení jejich struktury a funkce. Tyto znalosti jsou následně využitelné při modifikaci struktury buněčné stěny, což je výhodné například ke zvýšení produkce biopaliv z odolné rostlinné lignocelulózové biomasy. 21

Pektiny se podílejí na růstu a vývoji rostlin, morfogenezi, obranyschopnosti, vzájemné buněčné adhezi, struktuře buněčné stěny, buněčné signalizaci, expanzi buňky, pórovitosti stěny, vazbě iontů, hydrataci semen, opadávání listů. Pektiny se rovněž využívají jako želatinizující a stabilizující látky v potravinářském a kosmetickém průmyslu. Mají pozitivní vliv na zdraví člověka, např. snižují hladinu cholesterolu a glukózy, podporují imunitu. Využití zaznamenávají i ve výrobě speciálních produktů jako jsou jedlé a biodegradovatelné filmy, adheziva, pěny, změkčovadla, povrchové modifikátory pro lékařské přístroje, materiály pro biomedicínskou implantaci, materiály určené pro podání léku. 50) Jsou též schopny vázat Mg 2+ a Ca 2+. 51) Pektiny se snadno extrahují kyselinou za horka nebo chelatačními činidly. Některé pektiny však mohou být extrahovány pouze alkalicky (např. plavuně), což je důvod, proč je definování pektinů podle extrahovatelnosti nepřesné. 49) 5.2.5.1.4 Kalóza Kalóza je nevětvený polymer tvořený z monomerů D glukózy. Na rozdíl od celulózy jsou však jednotlivé monomery propojeny β(1 3) glykosidickou vazbou. Vlákno kalózy zaujímá díky těmto vazbám helikální strukturu a vytváří duplexy či triplexy. Kalózu nalezneme především u specializovaných buněk a v charakteristických fázích vývoje buněčné stěny. Vyskytuje se v sítkách sítkovic, pylových láčkách, podílí se na tvorbě fragmoplastu dělících se buněk. Objevuje se při mechanickém poškození pletiv, kdy brání vniknutí patogenních agens do buňky. 51) 52) 5.2.5.2 Proteiny HRGPs Jedná se o velice dobře prozkoumanou skupinu glykoproteinů bohatých na hydroxyprolin, jejichž zastoupení je v buněčné stěně největší. V buněčné stěně byly popsány tři skupiny glykoproteinů obsahujících ve své struktuře hydroxyprolin a to lektiny (výskyt pouze u čeledi Solanaceae), arabinogalaktanové proteiny (AGPs) a extenziny. Lektiny a AGPs jsou rozpustné složky buněčné stěny extrahovatelné solemi, zatímco extenziny jsou nerozpustné glykoproteiny, což byl jeden z důvodů, proč bylo zpočátku jejich studium velice obtížné. 22

Pojem HGRPs se u dvouděložných druhů rostlin používá k popisu extenzinů. Extenziny představují pro buněčnou stěnu největší zdroj prolinu a hydroxyprolinu. 55) Přesto, že jsou jednotlivé součásti buněčné stěny objevovány a zkoumány již poměrně dlouhou dobu (zhruba od 40. let 19. století), extenziny byly objeveny poměrně nedávno. Stalo se tak v roce 1960, kdy Lamport a Northcote izolovali ze suspenzní kultury buněk Acer pseudoplatanus (javoru klene) a kalusové kultury Nicotiana tabacum (tabáku virginského) primární buněčnou stěnu, která obsahovala enzymy a složku bohatou na hydroxyprolin. Přítomnost hydroxyprolinu naznačovala, že se jedná o strukturální protein. Následně byl zkoumán růst buněk javoru klene za přítomnosti 18 O 2. Tento experiment prokázal, že je molekulární kyslík přímým zdrojem kyslíku hydroxylu, což je významný objev vzhledem k tomu, že hydroxyl hydroxyprolinu představuje vazebné místo pro sacharidy. 53) Lamport vyslovil v roce 1965 domněnku, že proteiny buněčné stěny bohaté na hydroxyprolin, které byly provizorně pojmenovány extenziny, jsou zodpovědné za změny plasticity primární stěny buňky. Změna plasticity buněčné stěny umožňuje růst buňky pomocí její expanze. Lamport předpokládal, že pokud se extenziny skutečně podílejí na plasticitě buňky, pak představují řetězce, které propojují jednotlivé polysacharidy. V tom případě by musely být extenzin a polysacharidy propojeny kovalentní vazbou. Tento předpoklad potvrdil v roce 1969 při svém výzkumu prováděném na buněčné stěně izolované z buněk suspenzní kultury rajčete. Při tomto pokusu byly po vhodné enzymatické degradaci buněčné stěny izolovány HRGPs, u kterých byly následně prokázány vazby sacharid protein, čímž byla potvrzena Lamportova domněnka o kovalentní vazbě mezi extenzinem a polysacharidy. 54) Izolace umožnila též detailní analýzu struktury glykoproteinu, kterou bylo zjištěno, že extenziny obsahují arabinózu, galaktózu, hydroxyprolin a další aminokyseliny (valin, serin, threonin, lysin, tyrosin a isodityrosin). 55) Pro strukturu extenzinů je typická repetice aminokyselinových sekvencí Ser - - Pro 4 a Tyr Lys Tyr. Extenzinový prolin je pomocí specifických propylhydroxyláz hydroxylován. Následná glykosylace probíhá s největším úspěchem u proteinu obsahujícího Hyp 4. Proteiny obsahující Hyp 3/2/1 vykazující nižší stupeň glykosylace. 52) 55) 56) 57) 23

Zejména díky přítomnosti lysinu mají extenziny bazický charakter. Syntéza extenzinů roste při napadení buňky patogeny či při jejím poranění. Role extenzinů však není prozatím zcela objasněna. 52) PRPs Další skupinu glykoproteinů představují glykoproteiny bohaté na prolin, které byly identifikovány především pomocí studií využívajících rekombinantní DNA. 55) PRPs postrádají oproti extenzinům aminokyselinovou sekvenci Ser - Pro 4. GRPs Jedná se o proteiny bohaté na glycin. Obsah glycinu v peptidovém řetězci může u některých GRPs převyšovat 65 % (rod Petunia). 55) AGPs Arabinogalaktanové proteiny jsou rozpustné glykoproteiny buněčné stěny s vysokým obsahem sacharidů. Sacharidy tvoří většinou 90 95 % molekuly AGP. Nejčastěji obsahuje struktura AGP sacharidové zbytky galaktózy a arabinózy, v menším množství pak mohou být přítomny zbytky rhamnózy, kyseliny glukuronové a dalších monosacharidů. Sacharidy jsou vázány O glykosidickou vazbou na hydroxyprolin, serin a threonin. Předpokládá se, že se díky svým agregačním vlastnostem a lepivosti AGPs podílejí na zachycování pylu na blizně a poskytují sacharidové prekurzory pro růst stěny pylové láčky. Rovněž je popsán jejich podíl na udržení vodní rovnováhy v buňce. Možný je i vliv na diferenciaci buněk, který byl pozorován u zárodečných buněk mrkve. 56) 5.2.5.3 Organické látky Lignin Lignin je amorfní výrazně se větvící heteropolymer. Jeho základní stavební jednotky tvoří tři alkoholy s aromatickým jádrem (kumarylalkohol, sinapylalkohol, koniferylalkohol). Stavební jednotky jsou syntetizovány v cytoplazmě, odkud se následně transportem dostávají do buněčné stěny. V buněčné stěně jsou pomocí peroxidáz přeměňovány na reaktivní radikály, které spolu náhodně polymerizují. 24

Vazba ligninu v buněčné stěně je chemická. Díky ukládání ligninu v mikrokapilárních prostorách stěny dochází k omezení či naprostému potlačení apoplastického transportu. Lignin způsobuje větší pevnost buněčné stěny, zároveň však působí i na snížení její pružnosti. 4) Lignin se vyskytuje v zdřevnatělé sekundární stěně a střední lamele rostlin, výjimečně i v zdřevnatělých primárních buněčných stěnách (např. jehličnany, epidermis cykasů, listnaté dřeviny s tvrdými listy). Představuje 15 35 % sušiny dřeva (ale až 50 % u jehličnanů). Lignin zastává funkci mechanickou (zpevňuje buněčnou stěnu), izolační (zdřevnatělé stěny se stávají nepropustnými pro vodu a plyny) a ochrannou. 51) Kutin, suberin Kutin, suberin jsou hydrofobní polymery, jejichž stavební jednotky tvoří mastné kyseliny, hydroxykyseliny s dlouhými řetězci a malé množství fenolických látek. Oba polymery se v buněčných stěnách vyskytují v kombinaci s vosky. Díky kombinaci těchto hydrofobních polymerů s vosky se prohlubuje snížení propustnosti buněčné stěny pro vodu. 4) Suberin má chemické složení podobné ligninu. Jeho strukturu můžeme rozdělit na alifatickou a aromatickou část. Alifatickou část tvoří mastné kyseliny, dikarboxylové kyseliny, hydroxymastné kyseliny a vyšší alkoholy. Aromatická část je tvořena deriváty kyseliny hydroxyskořicové. Suberin se nejvíce vyskytuje v sekundárním krycím pletivu pletivu korkovém. Můžeme ho však nalézt i v dalších rostlinných strukturách, jako jsou např. exodermis, endodermis a Casparyho proužky v kořenech. Plní zpravidla funkci izolační. Kutin je typický pro vnější stěny buněk epidermis prýtu. Je uložen v buněčné stěně buněk epidermis a spolu s vosky vytváří na povrchu buněčné stěny ochrannou vrstvu - kutikulu. 4) Kutin představuje pro buňky izolační a ochranný polymer. 51) 4) 51) Sporopolenin Z dalších organických látek se může v buněčné stěně nacházet sporopolenin, vyskytující se v buněčné stěně pylových zrn a spor. Představuje směs polymerů skládající se z dlouhých řetězců mastných kyselin, fenylpropanoidů, fenolických látek, karotenoidů. Přesná struktura sporopoleninu nebyla popsána. Jeho funkcí je ochrana buňky před vnějším prostředím. 4) 51) 25

Vosky Vosky jsou estery vyšších mastných kyselin a vyšších jednosytných alifatických alkoholů. Mastné kyseliny mohou být nasycené i nenasycené Vosky tvoří vnější vrstvu kutikuly a stejně jako kutin mají ochrannou a izolační funkci. 51) 5.2.5.4 Anorganické látky Z anorganických látek se v buněčné stěně vyskytují např. kyselina křemičitá, SiO 2, CaCO 3 (inkrustace buněčných stěn trav a přesliček). 4) 5.2.6 Funkce buněčné stěny Buněčná stěna zastává pro buňku především funkci ochrannou. Uděluje buňce a posléze i rostlině tvar, pro rostlinu je podpůrnou strukturou, která jí mimo jiné umožňuje vzpřímenou polohu. Brání prasknutí buňky, chrání ji před napadením patogenními organismy, před vlivy vnějšího prostředí. Její prostor slouží jako zásobárna (např. pro apoplastický vápník, polysacharidy) či místo k uložení odpadních metabolitů a přebytečných minerálních solí. Vytváří bariéru proti úniku vody z rostlinného organismu. Buněčné stěny pak společně vytvářejí systém vodivých pletiv, díky němuž dochází k transportu vody a rozpuštěných minerálních látek v rostlině. Buněčná stěna se též podílí na procesu buněčného dělení, morfogeneze, polarity růstu, přenosu signálů mezi buňkami. 2) 49) 5.2.7 Izolace buněčné stěny Jedním ze základních důvodů pro provádění pokusů o izolaci buněčné stěny byla snaha zodpovědět otázky týkající se její struktury a složení, které vyvstaly v podstatě ihned po objevení skutečnosti, že se v rostlinné buňce nachází jak buněčná stěna taka cytoplazmatická membrána. Velkou otázkou bylo, zda jsou v rostlinné buněčné stěně přítomny proteiny. V roce 1888 přichází Julius Wiessner s velmi odvážným tvrzením, že buněčná stěna proteiny obsahuje a zároveň, že rostoucí buněčná stěna představuje živou strukturu. Výsledky výzkumů prováděných v následujících letech s cílem získat odpověď na tuto otázku se však různily, stejně jako materiály a metody využívané při snaze izolovat buněčnou stěnu. 26

Tupper Carey a Priestley uskutečnili v roce 1924 první izolaci buněčné stěny z meristematického pletiva bobu obecného (Vicia faba). Provedli frakcionaci izolovaných buněčných stěn a jednotlivé frakce (proteiny, pektiny, celulóza, a další) zanalyzovali se závěrem, že buňky zkoumaného meristematického pletiva obsahují buněčnou stěnu, kterou kromě jiných komponent tvoří i proteiny. Výsledky tohoto výzkumu však zpochybnil v roce 1926 Wood, který z histochemických dat vyvodil zcela jiný závěr. Wood tvrdil, že se v celulózových buněčných stěnách nevyskytují žádné proteiny, a pokud ano, pak jejich obsah nepřesahuje 0,001 %. Výsledky izolací dalších vědců výskyt proteinů v buněčné stěně spíše potvrzovaly. Bohužel však nikdo z nich nedokázal stoprocentně zaručit, že tyto proteiny náleží buněčné stěně a nejedná se o kontaminanty pocházející z cytoplazmy. Díky tomu rostla potřeba objevit takové metody, které by umožnily odlišit specifické proteiny buněčné stěny od kontaminujících proteinů pocházejících z cytoplazmy. Úplně prvním krokem tak byla snaha o popsání metod, které by umožnily izolaci požadované subcelulární struktury. Pro izolaci buněčné stěny lze teoreticky využít přibližně čtyři metody, mezi které se řadí: selektivní extrakce (enzymatická či chemická), autolýza, osmotická lýza buňky, prasknutí buňky a následná diferenciální centrifugace jejích subcelulárních struktur. Nejméně náročná na provedení je posledně zmíněná metoda zakončená diferenciální centrifugací. 47) Jedním z důvodů proč i nadále roste ve vědě zájem o izolaci buněčné stěny s navazující možností detailnějšího studia skladby a funkce buněčné stěny je snaha nalézt takové rostliny, které budou vhodným zdrojem pro produkci biopaliva, zároveň však budou využitelné jako krmiva pro hospodářská zvířata. K nalezení takovéto plodiny je třeba správného vyhodnocení vlastností a z toho vyplývající teoretické využitelnosti, při čemž se vědec bez předchozí detailní znalosti buněčné stěny neobejde. Pro biopaliva mohou být využitelné traviny a to hned několika způsoby. Mohou se použít jako zdroj sacharidů využitelných pro následnou fermentaci vedoucí k získání ethanolu, dále k přímému vzniku energie prostřednictvím spalování anebo získáním využitelného oleje pyrolýzou. Zvyšování obsahu ligninu v buněčné stěně vede k většímu zisku energie prostřednictvím přímého spalování, zároveň však vyšší obsah ligninu snižuje vzniklé množství ethanolu při fermentaci a 27

využitelnost plodiny jako krmiva pro užitková zvířata. Obsah ligninu hraje zcela zásadní roli ve využitelnosti biomasy. 46) Poznatky získané izolací a následným studiem skladby buněčných stěn mají svůj význam i v oblasti nutrice lidí a zvířat. A díky obsahu přírodních vláken v buněčné stěně též v textilním a papírenském průmyslu. 48) 5.2.7.1 Příklad izolace buněčné stěny Izolace buněčné stěny Hatfield R. D. a kol. 2009 Do 50 ml centrifugačních zkumavek bylo naváženo 5 g zmražených vzorků stonků C3 a C4 travin. Rozmražené vzorky byly třikrát suspendovány v pufru (50 mm TAE, ph 6,7, 2,5 ml/g vzorku), sonikovány 10 min. a centrifugovány při 3200 x g 20 min. Pufrový extrakt byl oddělen od nerozpustného rezidua. Všechny tři pufrové extrakty byly spojeny dohromady, zmraženy v tekutém dusíku a až do využití pro stanovení rozpustných fenolů skladovány při 80 C. Ke každému nerozpustnému reziduu byl přidán TAE pufr (50 mm, ph 6,7). Vzorky byly umístěny do vodní lázně o teplotě 90 C. Po 2 hod. k nim byla pro odstranění škrobů přidána α amyláza a amyloglukosidáza a byly přemístěny na 2 hod. do vodní lázně o teplotě 55 C. Do každé zkumavky byl přidán 90 % ethanol tak, aby byla koncentrace ethanolu ve zkumavce 80 %. Vzorky byly zamíchány a centrifugovány 15 min. při 3200 x g. Nerozpustná rezidua, která zůstala po extrakci škrobů, byla z důvodu odstranění cytoplazmatických kontaminant intenzivně promývána (1 ml rozpouštědla na gram čerstvé rostlinné tkáně) sérií rozpouštědel: 80 % ethanol (dvakrát), chloroform:methanol (2:1, jedenkrát) a aceton (třikrát). Každé promytí zahrnovalo 10 min. sonikaci, centrifugaci (3200 x g po dobu 15 min.) a odstranění rozpouštědla. Závěrečné nerozpustné reziduum (buněčné stěny) bylo vysušeno vzduchem v digestoři a následně podrobeno strukturální analýze. (46) 5.3 Cytoplazmatická membrána plazmalema 5.3.1 Definice Plazmalema je dynamická buněčná struktura o tloušťce 5 10 nm, která odděluje cytoplazmu od buněčné stěny. 2) 28

Velmi důležitou událostí, která umožnila studium struktury biologické membrány, se stal vynález mikroskopu - 1676 Anton van Leeuwenhoek. Od 17. století mohla díky využití mikroskopu vznikat řada modelů membrány, které postupně vedly až k objevení modelu fluidní mozaiky, jehož autory jsou Singer S. J. a Nicolson G. L. Spolu s uveřejněním modelu fluidní mozaiky byla též autory vyslovena domněnka o tekutosti lipidové dvojvrstvy, v níž se proteiny pohybují volně. Šlo o vůbec první model, který propojil do společného modelu v té době existující teorie o lipidové dvojvrstvě a membránových proteinech. S tím souvisel i nový vhled na problematiku membránových kanálů a popisu transportních dějů uskutečňovaných v buněčných membránách. 8) Plazmalema se skládá z dvojité vrstvy lipidů s proteiny. Lipidy jsou zastoupeny třemi třídami. Jedná se o glycerofosfolipidy, sfingolipidy a steroly. Většina lipidů se nachází ve formě fosfolipidů, nejvíce jsou zastoupeny: fosfatidylcholin, fosfatidylethanolamin, fosfatidylinositol, fosfatidylserin. 8) Samotnou strukturu membrány tvoří tak, že jejich nepolární části směřují k sobě a polární hlavičky směřují do vnějšího prostředí, stejně jako dovnitř buňky. Proteiny mohou v membráně zaujímat různá postavení. Mohou být v dvojité vrstvě zabudovány (tzv. integrální proteiny), nebo se mohou vyskytovat na povrchu (periferní proteiny). 2) 5.3.2 Funkce plazmalemy Plazmalema představuje velmi selektivní bariéru mezi okolním a vnitřním prostředím buňky, z čehož vyplývá její důležitost pro existenci a správné fungování rostlinné buňky. Její hlavní rolí je regulace přenosu látek a signálů mezi vnitřním a vnějším prostředím buňky, stejně jako mezi jejími jednotlivými částmi. Zajišťuje kontrolu nad permeabilitou buňky, volnou difuzí látek rozpustných ve vodě, zasahuje do procesů absorpce, sekrece a exkrece. Skrze plazmalemu je regulován přenos signálů v rámci pletiv, orgánů a celého organismu. Díky propojení s buněčnou stěnou a cytoskeletem má podíl na integraci mechanických a chemických signálů. Dále vykazuje enzymatickou činnost, je tedy schopna štěpit některé substráty. Podílí se na tvorbě buněčné stěny, syntetizuje její základní složky. Pro většinu transportních procesů uskutečňovaných skrze plazmalemu je rozhodující transmembránový protonový gradient. 2) 29

5.4 Protoplast Pojem protoplast použil poprvé Hanstein v roce 1880 k pojmenování živé hmoty ohraničené rostlinnou buněčnou membránou. 18) 5.4.1 Definice Protoplast je silně nehomogenní útvar, na jehož povrchu se nachází cytoplazmatická membrána (plazmalema). Jedná se v podstatě o buňku bez buněčné stěny, což je důvod, proč bývá někdy protoplast označován termínem nahá buňka. Protoplast se využívá při popisu buněk rostlinných, bakteriálních a buněk hub zbavených buněčné stěny. 4) 5) 6) 14) U rostlin je protoplast tvořen protoplazmou ( živou částí buňky) a útvary neprotoplazmatickými ( neživou částí buňky ). Protoplazmu můžeme dále rozčlenit na cytoplazmu, karyoplazmu (protoplazma buněčného jádra), plastidoplazmu (protoplazma plastidů) a chondrioplazmu (protoplazma mitochondrií). Karyoplazma je charakteristická vysokým obsahem nukleoproteinů. Na povrchu je karyoplazma ohraničena jadernou blánou (karyotékou). Karyotéka je perforovaná a odděluje karoplazmu od cytoplazmy. Skrz karyotéku je realizován transport bílkovin (histonů a enzymů) nutných pro syntézu DNA a RNA. V opačném směru probíhá transport nukleových kyselin z karyoplazmy do cytoplazmy. Cytoplazma zahrnuje Golgiho aparát, ribozomy, cytoskelet a endoplazmatické retikulum. Mezi neprotoplazmatické útvary, které mohou (zejména díky vakuole) tvořit významnou část rostlinných buněk, řadíme vakuoly, intracisternální fáze (mezimembránový prostor plastidů a mitochondrií, vnitřní fáze Golgiho aparátu, endoplazmatického retikula), nejrůznější krystaly, zásobní látky (škrobová zrna, tukové krůpěje, bílkovinné globule) a vnitřní prostory organel. 4) 5) 6) Vnější plazmatická membrána protoplastu je plně vystavena podmínkám vnějšího prostředí a je zároveň jedinou bariérou mezi vnějším a vnitřním prostředím buňky. 18) Protoplasty jsou totipotentní buňky, které mohou za předpokladu vhodných chemických a fyzikálních stimulů regenerovat novou buněčnou stěnu. Díky vzniku buněčné stěny jsou následně schopny mitotického dělení, vzniku dceřiných buněk a za příhodných podmínek v tkáňové kultuře i regenerace celé nové rostliny. 10) 14) Zvýšený zájem o protoplasty byl zaznamenán díky značným pokrokům v genomice, proteomice a metabolice. Z důvodu velmi unikátní využitelnosti pro širokou škálu 30

experimentálních procedur se staly předmětem zájmu mnoha vědců. 10) V současné době jsou známy spolehlivé metody pro izolaci a kultivaci protoplastů z široké škály rostlin, jednoděložných i dvouděložných. Schopnost protoplastů a buněk odvozených z protoplastů vyjádřit svou totipotenci a vyvinout se ve fertilní rostlinu ovlivňuje několik parametrů. Mezi ně patří zejména: zdrojová tkáň, kultivační medium a vlivy okolního prostředí. Nové přístupy snažící se o maximalizaci efektivity systémů, při nichž je z protoplastu následně získávána fertilní rostlina, zahrnují již dobře známé a využívané techniky u buněk mikrobiálních a živočišných. Jedná se například o techniky jako je elektrostimulace, vystavení protoplastů povrchově aktivním látkám a nosičům dýchacích plynů, zejména pak perfluorochemikáliím a hemoglobinu. I přes 50 let intenzivního celosvětového výzkumu však zůstávají rostlinné druhy, u nichž se izolace a následná kultivace nedaří. 10) 5.4.2 Využití Protoplasty jsou využitelné při genetické manipulaci rostlin, somatické hybridizaci, při šlechtění rostlin. Skrze jejich fúzi je umožněna úplná či částečná kombinaci jaderného a cytoplazmatického genomu, což umožňuje obejít bariéry přirozeně se vyskytující sexuální inkompatibility na mezidruhové a mezirodové úrovni. Je možné získat asymetrické hybridy a rostliny heterozygotní v extrajaderných genech. 10) 15) Příjem izolované DNA do protoplastů poskytuje základ pro tranzientní (přechodnou) a stabilní jadernou transformaci, pro transformaci organel a následné vytvoření transplastomických rostlin. 10) Z protoplastu mohou být také izolovány jednotlivé organely, což umožňuje zkoumat vnitrobuněčný transport metabolitů mezi jednotlivými vnitřními částmi rostlinné buňky. 19) Izolované protoplasty jsou využívány i v mnoha rozličných studiích zahrnujících funkci membrán, buněčné struktury, syntézu farmaceutických produktů, toxikologické hodnocení, studium transportních dějů a expresi genů. 10) 15) V roce 2001 byla provedena studie na pohance Fagopyrum esculentum Moench. Pohanka je rostlina akumulující ve svém těle hliník. Tato studie měla objasnit mechanismus detoxikace hliníku. Pomocí protoplastů a vakuol izolovaných z listů pohanky pěstovaných hydroponicky v roztoku hliníku, bylo zkoumáno, kde je hliník kumulován. Studie pomocí 13 Al NMR prokázala vysokou přítomnost hliníku 31

v protoplastu (více než 80 % celkového hliníku obsaženého v listech) a to v podobě hliníko-oxalátového komplexu (v poměru 1:3) lokalizovaného ve vakuole. Předpokládá se tedy, že detoxikace hliníků probíhá pomocí tvorby komplexu s oxalátem a separací do vakuol. (31) 5.4.3 Izolace protoplastů Izolace protoplastů může být uskutečněna mechanicky nebo enzymaticky. 5.4.3.1 Mechanická izolace Pro tento typ izolace mohou být využity buňky zásobních pletiv rostlin. Tyto buňky bývají zpravidla hodně vakuolizovány. K izolaci jsou vhodné např. šupiny cibule, pletivo řepy, pletivo ředkvičky. 18) Vůbec první mechanickou izolaci provedl v roce 1892 Klercker z tkáně jednoděložné rostliny čeledi Hydrocharitaceae Stratiotes aloides L. Jednalo se o mikrochirurgické provedení mechanické izolace. 16) 17) 33) Nejprve byla provedena v osmotickém roztoku plazmolýza pletiva, následoval mikrořez ostrou čepelí mezi buněčnou stěnou a protoplastem, čímž došlo k uvolnění nepoškozeného protoplastu. 18) 20) 21) Metoda mechanické izolace však měla několik nevýhod. Jednak poskytovala velmi malý výnos a pak bylo její použití omezené pouze na ty typy pletiv, které obsahovaly vakuolizované buňky. Těmito omezeními se stala metoda ve větším měřítku prakticky nevyužitelnou a věda čekala na objev metody jiné. 16) 18) Zlomovou událostí byl objev enzymů trávících buněčnou stěnu. Jednalo se o pektinázu, hemicelulázu a celulázu izolovanou z hub. 16) Mechanická metoda však může být užitečná v případě, že se u enzymatické metody vyskytnou nežádoucí účinky spojné s lytickými enzymy degradujícími buněčnou stěnu. Díky těmto nežádoucím účinkům může docházet např. k poškození protoplastu, snížení jeho životaschopnosti. V tomto případě je vhodnější využít metodu mechanickou. 18) 32

5.4.3.2 Enzymatická izolace 5.4.3.2.1 Historie První enzymatickou izolaci protoplastů z vyšších rostlin provedl v roce 1960 Cocking. 32) K degradaci buněčné stěny využil E. C. Cocking celulázu izolovanou z houby Myrothecium verrucaria. Protoplasty izoloval z kořenové čepičky rostliny rajčete Lycopersicon esculentum Mill. aplikací extraktu hydrolytického enzymu celulázy. 16) 18) Z důvodu vysoké výtěžnosti se metoda enzymatické izolace stala brzy metodou pro izolaci protoplastů preferovanou. Za předpokladu zachování příslušných podmínek poskytuje chemická metoda u řady rostlinných druhů možnost následné kultivace a regenerace buněčné stěny či podmínky pro provedení genetické manipulace. 18) Po objevu enzymatické izolace, byly realizovány další izolace protoplastů pomocí různých enzymatických přípravků a to z široké škály rostlinných druhů. Od první chemické izolace uplynulo téměř deset let, než byly enzymatické přípravky dostupné komerčně. Rozdíl mezi jednotlivými komerčními přípravky je především v jejich čistotě. Prvně byl využit komerční enzymatický přípravek v roce 1968. Výzkumný tým započal výzkum zaměřený na izolaci protoplastů z mezofylu tabákových listů. Po testování řady komerčně dostupných přípravků lytických enzymů a s tím souvisejícího testování podmínek dostatečné izolace protoplastů se současným zachování jejich životaschopnosti, vyvinul tento tým metodu izolace protoplastů z mezofylu tabákových listů. Metoda umožnila izolaci protoplastů v množství dostačujícím pro biochemické experimenty. Jednalo se o významný výzkum, neboť to byla vůbec první izolace protoplastů z rostliny tabáku. Navíc se mezofyl listů ukázal jako velice dobrý zdroj protoplastů. Nejen dobře dostupný, ale i s vysokou výtěžností. Metoda izolace protoplastů se sestává z dvoukrokového působení enzymů. V prvním kroku jsou listy tabáku macerovány v pektináze a dochází k uvolnění buněk palisádového a houbového parenchymu. K takto izolovaným buňkám je v dalším kroku přidána celuláza. 12) Zprvu se jednalo o neaseptickou izolační metodu, z důvodu dlouhodobějšího zachování kultury izolovaných protoplastů však byla v roce 1970 popsána metoda aseptická. 35) 33