MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2011 LENKA KRUTILOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Detekce polymorfismů prionového genu asociovaného se scrapií u ovcí pomocí molekulárně-genetických metod Bakalářská práce Vedoucí práce: Vypracoval: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Lenka Krutilová

Brno 2011 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci na téma Detekce polymorfismů prionového genu asociovaného se scrapií u ovcí pomocí molekulárně-genetických metod vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. diplomanta. dne. podpis

Abstrakt Bakalářská práce je zaměřena na shrnutí nejnovějších poznatků o moţnostech detekce polymorfních variant prionového genu asociovaných se spongiformní encefalopatií u ovcí pomocí molekulárně-genetických metod. První část je zaměřena na popis onemocnění transmisivních spongiformních encefalopatií u lidí. Druhá část popisuje tato onemocnění u zvířat. V práci jsou zmíněny i preventivní opatření v České republice a Evropské unii, která mají sníţit riziko šíření těchto nebezpečných nemocí. Čtvrtá část shrnuje nejnovější poznatky ve studiu spongiformní encefalopatie u ovcí, zejména vyuţitím molekulárně-genetických metod, jejímţ cílem je detekce genotypů prionového genu asociovaného s tímto onemocněním. Klíčová slova: TSE, BSE, prion, CJD, genetika Abstract The thesis is aimed to summarise the latest knowledge about the possibilities of detecting polymorphic variants of the prion gene associated with spongiform encephalopathy in sheep by molecular genetic methods. The first part is focused on the description of the disease transmissible spongiform encephalopathies in humans. The second part describes the diseases in animals. In the work there are also mentioned preventive measures in the Czech Republic and in the European Union, which should reduce the risk of the spread of these dangerous diseases. The fourth part summarises the latest findings in the study of spongiform encephalopathy in sheep using especially molecular genetic techniques. Its aim is to detect the prion gene genotypes associated with this disease. Keywords: TSE, BSE, prion, CJD, genetics

Obsah ÚVOD... 7 1 TSE... 8 1.1 TSE člověka... 9 1.1.1 CJD... 9 1.1.2 Nová varianta CJD (vcjd)... 10 1.1.3 Kuru... 12 1.1.4 Gerstmann Straussler Scheinker syndrom (GSS)... 14 1.1.5 Fatální familiární insomnie (FFI)... 15 1.2 TSE člověka... 15 1.2.1 Scrapie... 15 1.2.2 CWD... 16 1.2.3 BSE... 18 1.2.4 Důleţitá data o BSE... 18 2 BSE... 19 2.1 Co je BSE?... 20 2.2 Příčina vzniku BSE... 20 2.2.1 Odkud se vzaly priony?... 21 2.2.2 Příznaky BSE... 23 2.2.3 Fáze nemoci... 23 2.3 Pozitivní případy v ČR... 23 2.4 Opatření v České republice... 25 2.5 Opatření v Evropské unii... 26 2.6 Testování BSE... 26 3 SCRAPIE... 27 3.1 Co je scrapie?... 27 3.2 Příčiny vzniku scrapie... 28 3.3 Testování scrapie... 28

3.4 Opatření v České republice... 28 3.5 Opatření v Evropské unii... 30 4 GENETICKÉ TESTOVÁNÍ BSE A SCRAPIE... 30 ZÁVĚR... 43 PŘEHLED POUŢITÉ LITERATURY... 44 SEZNAM ZKRATEK... 46 SEZNAM OBRÁZKŮ... 48 SEZNAM TABULEK... 49

ÚVOD V dnešní době mají transmisivní spongiformní encefalopatie (TSE), mezi které patří nejznámější nemoc BSE a scrapie, velký vliv na spotřebitele a konzumenty hovězího i skopového masa. V dřívějších dobách, kdy ještě nebyla problematika těchto nemocí tak medializovaná, vědělo o této chorobě jen pár zasvěcených odborníků. Po rozsáhlé medializaci, zejména v devadesátých letech minulého století, klesla v celé Evropě spotřeba hovězího masa. Všichni dostali strach, ţe se nakazí. Přitom jsme v České republice měli daleko přísnější podmínky na výrobu masokostní moučky neţ ve Velké Británii. U nás se vyráběla za tlaku 3 bary (300kPa) a 130 C, po dobu nejméně 20 - ti minut (kvůli zničení tehdy hojného antraxu sněti slezinné), které zlikvidovalo i tehdy neznámé priony. Jinde v Evropě stačila teplota okolo 100 C. Byly zakázány i tzv. domácí zabijačky skotu, a to proto, ţe některé tkáně (slezina, mícha aj.) patří mezi rizikové a musí se likvidovat jako rizikový materiál. Také by mohlo dojít k potřísnění tkání třeba mozkomíšním mokem, nebo míchou, takţe by se riziko přenosu znásobilo. Začal platit i zákaz krmení býloţravců masokostní moučkou. Podle zpráv z února letošního roku zvaţují poslanci Evropského parlamentu o zrušení zákazu krmení prasat a drůbeţe tímto krmivem. A právě moje bakalářská práce je zaměřena na tuto problematiku.

1 TSE TSE transmisivní spongiformní encefalopatie (přenosné houbovitě vyhlíţející onemocnění mozku), jsou onemocnění člověka i zvířat, vzájemně přenosné z jednoho druhu na jiný druh (například ze skotu na člověka nebo z ovcí na skot). Mezi nejznámější TSE patří BSE, scrapie, a u lidí Creutzfeldt Jakobova choroba (CJD), a taktéţ její nová varianta (vcjd). Tyto nemoci způsobuje tzv. prion (PrpSc). Prion vzniká v těle ţivočicha z tzv. prionového proteinu (PrpC), který je součástí mnoha bílkovin v těle, například neuronů. Všichni savci mají tedy v těle prionový protein. Tato bílkovina plní důleţitou úlohu při udrţení běhu našich vnitřních hodin. Prionový protein se tedy podílí na tom, abychom se ráno probudili a večer si šli opět lehnout. 1 V případě onemocnění změní prionový protein svou prostorovou konfiguraci (lidově řečeno zašmodrchá se ). Jeho velmi nepříjemnou vlastností je, ţe působí jako matrice, podle které se změní prostorová konfigurace dalších prionových proteinů. Prionů díky tomu neustále přibývá, hromadí se v nervové tkáni nemocného zvířete a poškozují ji. Nervové buňky hynou, mizí a na jejich místě vznikají díry a ty dodávají postiţeným částem mozku typický houbovitý nebo ementálový vzhled. 2 Mezi další onemocnění patří kuru, Gerstmann- Straussler Scheinken syndrome a fatální familiární insomnie (FFI) u lidí, chronic wasting syndrome (CWS) u jelenů. Existuje ale i přenosná encefalopatie norků (mink encefalopathy) a encefalopatie koček. 1 PETR, Jaroslav. Nemoc šílených krav hrozí?!. 1. vydání. Praha: Ivo Ţelezný, nakladatelství a vydavatelství, spol. s.r.o., 2001, s. 10. ISBN 80-237-3671-X. 2 PETR, Jaroslav. Nemoc šílených krav hrozí?!. 1. vydání. Praha: Ivo Ţelezný, nakladatelství a vydavatelství, spol. s.r.o., 2001, s. 12. ISBN 80-237-3671-X. 8

Obrázek č. 1: Vlevo zdravá bílkovina, vpravo "zašmodrchaný" prion. Databáze online [cit. 2011-04-13]. Dostupné na: <http://www.rozhlas.cz/leonardo/clovek/_zprava/766615> Obrázek č. 2: Mozková tkáň napadená BSE. Databáze online [cit. 2011-03-12]. Dostupné na: <http://www.rozhlas.cz/leonardo/clovek/_zprava/766615> 1.1 TSE člověka Mezi TSE člověka patří kuru, GSS, FFI, CJD a vcjd. Všechny tyto choroby jsou smrtelné. 1.1.1 CJD Po první světové válce si německý neurolog Alfons Maria Jakob (1884-1931) všiml podivného onemocnění u starších osob. Pacienty postihl rychlý nástup demence 9

spolu s dalšími příznaky jako je záškub svalů, křeče a jiné poruchy pohybu. Při vyšetření mozku pod mikroskopem viděl mikroskopické dírky, které dávaly mozku vzhled houby. Právě tato pozorování se stala základem pro odborné označení nemoci jako spongiformní encefalopatie. 3 Své výsledky uveřejnil v odborné literatuře v roce 1921. Ve stejné době se v lékařských publikacích objevil popis podobného onemocnění od německého neurologa Hanse Jakoba Creutzfeldta (1885 1964). Jak Jakob, tak i Creutzfeldt popsali nezávisle na sobě 6 případů. Podle jejich objevů dostala choroba název Creutzfeldt Jakobova. Tato nemoc postihuje lidi ve věku okolo 55 let. Charakteristickým znakem jsou počáteční výpadky paměti, k nimţ se postupem času přidruţují i další symptomy: změny nálady, nezájem o okolní dění, pokles pracovní aktivity, poruchy řeči, vidění, ztráta stability. Onemocnění končí vţdy smrtí zhruba po půl roce od objevení se prvních příznaků. Četnost onemocnění je jeden aţ dva případy na 1 000 000 obyvatel. Jedná se tedy o velice vzácnou chorobu. Cest přenosu CJD je několik. Nejčastější z nich je tzv. sporadická forma, kdy se prionový protein samovolně pozmění na škodlivý prion. Další cestou přenosu jsou lékařské zákroky nebo léčení některých chorob, jako je například léčba poruchy růstu (zaznamenáno 75 případů), transplantace tvrdé pleny mozkové od mrtvých pacientů (registrováno 25 případů), nebo transplantace oční rohovky od pacienta nakaţeného klasickou CJD. Tato forma se označuje jako iatrogenní. 1.1.2 Nová varianta CJD (vcjd) První obětí této choroby se stal v roce 1995 Stephen Churchill z Velké Británie. Kdyţ zemřel, bylo mu 20 let. Při podrobnějším vyšetření se zjistilo, ţe jeho onemocnění se liší od klasické CJD. Ta postihuje vzácně i lidi, kteří nejsou starší 40 - ti let. Tito nemocní však tvoří jen 5% případů. 4 V březnu roku 1996 byl ve Velké Británii hlášen 3 PETR, Jaroslav. Nemoc šílených krav hrozí?!. 1. vydání. Praha: Ivo Ţelezný, nakladatelství a vydavatelství, spol. s.r.o., 2001, s. 32. ISBN 80-237-3671-X. 4 PETR, Jaroslav. Nemoc šílených krav hrozí?!. 1. vydání. Praha: Ivo Ţelezný, nakladatelství a vydavatelství, spol. s.r.o., 2001, s. 34. ISBN 80-237-3671-X. 10

výskyt deseti případů nové klinicko - patologické varianty CJD (vcjd). 5 Shoda s epidemií BSE svědčila o moţnosti vztahu mezi oběma onemocněními. Následně byly shromáţděny důkazy, které tuto hypotézu podporují: 1. makakům, kterým byl do mozku naočkován materiál z mozku skotu uhynulého na BSE byly pozorovány neuropatologické nálezy, které byly podobné nálezům lidí s vcjd 2. bylo prokázáno, ţe transgenní myši (myši, které mají pouze humánní gen prionové bílkoviny) jsou vůči BSE vnímavé 3. charakteristiky biologického kmene agens vcjd (definované podle přenosových charakteristik u inbreedních kmenů myší) a molekulárního kmene (definovaného podle typu prionové bílkoviny) jsou velmi podobné těm, které jsou pozorovány u zvířat, která se nakazila BSE ať uţ byla infikována experimentálně, nebo se nakazila přirozenou cestou - liší se však od charakteristik, které byly zjištěny u sporadických pří padů CJD). 6 Protoţe panují dohady o délce inkubační doby, a také neznáme velikost lidské populace Velké Británie, která byla vystavena BSE a je vůči ní vnímavá, není moţné odhadnout, jaký počet lidí bude v budoucnosti vystaven vcjd. 7 Moţné budoucí následky onemocnění CJD v lidské populaci byly proto projednávány na mezinárodní konferenci WHO v květnu roku 1996. Tam bylo také navrţeno, aby byl ustanoven celosvětový dohled nad touto chorobou. Hlavním cílem WHO je zjištění výskytu případů vcjd. Dosaţení tohoto cíle je moţné nejlépe dosáhnout sledováním všech forem CJD, a to z těchto důvodů: 1. klinické příznaky vcjd se někdy nemusí lišit od příznaků jiných forem CJD. 5 POLANECKÝ, Vladimír, MUDr., 2000: Metodický pokyn pro surveillanci, diagnózu a terapii transmisivních spongiformních encefalopatií (TSE) a Creutzfeldt - Jakobovy nemoci (CJN). Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://hygpraha.cz/files/tse.pdf> 6 POLANECKÝ, Vladimír, MUDr., 2000: Metodický pokyn pro surveillanci, diagnózu a terapii transmisivních spongiformních encefalopatií (TSE) a Creutzfeldt - Jakobovy nemoci (CJN). Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://hygpraha.cz/files/tse.pdf > 7 POLANECKÝ, Vladimír, MUDr., 2000: Metodický pokyn pro surveillanci, diagnózu a terapii transmisivních spongiformních encefalopatií (TSE) a Creutzfeldt - Jakobovy nemoci (CJN). Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://hygpraha.cz/files/tse.pdf> 11

2. zkušenostmi, které se získávají při identifikaci případů CJD by měly zvýšit schopnosti detekovat případy vcjd. 8 Nová varianta má odlišné příznaky od klasické CJD. Jsou to například usazeniny fluoru v mozku, rozdíl v EEG. A hlavně pomalý průběh nemoci. Tabulka č. 1: Počty v CJD ve Velké Británii. rok sporadická CJD vcjd 1995 35 3 1996 49 10 1997 59 10 1998 63 18 1999 61 15 2000 48 28 2001 52 20 Databáze online [cit. 2011-03-23]. Dostupné na: <http://www.svscr.cz/index.php?art=929> 1.1.3 Kuru Sestupovali jsme podél potoka k vesnici Amusi. Kdyţ jsme procházeli kolem jednoho stavení, všiml jsem si malé holčičky, která seděla u ohně. Silně se třásla a trhala hlavou ze strany na stranu. Řekli mi, ţe je to oběť zlého kouzla. Bude se prý takhle třást ještě několik týdnů, nebude schopna se najíst a nakonec umře, cituje ve své knize Jaroslav Petr slova australského úředníka J. R. MacArthura, který pomáhal 8 POLANECKÝ, Vladimír, MUDr., 2000: Metodický pokyn pro surveillanci, diagnózu a terapii transmisivních spongiformních encefalopatií (TSE) a Creutzfeldt - Jakobovy nemoci (CJN). Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://hygpraha.cz/files/tse.pdf> 12

v Nové Guinei s budováním státní správy. 9 Na území kmene Fore naráţel i na jiné lidi, které postihla tato neobvyklá nemoc. Nejprve se třásli, potom ochrnuli a zemřeli. V kmeni měli pro tuto nemoc název kuru, coţ v jejich jazyce znamená třas a smrtelné uřknutí (Foreové věřili, ţe je kuru důsledek černé magie). Lékař Vincent Zigas, pod jehoţ zdravotní péči spadal i kmen Fore, na základě svých výzkumů zjistil, ţe se kuru vyskytuje jen v tomto kmeni. Zkoušel různé léčebné postupy od polykání vitamínů, antibiotik, ale nic nezabíralo. Takţe usoudil, ţe příčinou onemocnění je hysterie (lidé uvěřili zásahu černé magie a příznaky si vsugerovali). Obrázek č. 3: Příslušníci kmene Fore postižení chorobou kuru. Databáze online [cit. 2011-02-22]. Dostupné na: <http://www.osel.cz/popisek.php?popisek=11227&img=1232872113.jpg> Co nemoc způsobuje, rozluštil aţ v roce 1957 potomek slovenských přistěhovalců Carleton Gajdusek. Náhoda ho přivedla na myšlenku, ţe je kuru spojeno s kanibalismem, který byl v kmeni velmi hojný. Kdyţ odjel s výsledky do laboratoře v Melbourne, opět mu pomohla náhoda v podobě veterináře Williama Hadlowa, který se zabýval scrapií. Ten pod mikroskopem porovnával vzorky ovcí se scrapií a lidí s kuru, a zarazila ho nápadná shoda vzorků. Navrhl tedy Gajdusekovi, ať naočkuje vzorek pokusným zvířatům. Gajdusek si vybral šimpanze. Teprve za dva roky se u šimpanzů projevily příznaky kuru. Gajdusek pojmenoval původce způsobující kuru jako pomalý virus, protoţe nástup choroby od projevení se prvních příznaků byl velmi 9 PETR, Jaroslav. Nemoc šílených krav hrozí?!. 1. vydání. Praha: Ivo Ţelezný, nakladatelství a vydavatelství, spol. s.r.o., 2001, s. 56. ISBN 80-237-3671-X. 13

pomalý. Tato teorie byla, jak se později ukázalo, mylná, ale i přesto dostal v roce 1976 Gajdusek Nobelovu cenu za objev infekční povahy prionového oněmocnění kuru. Obrázek č. 4: Daniel Carleton Gajdusek. Databáze online [cit. 2011-02-26]. Dostupné na: <http://www.wellesley.edu/chemistry/chem101/aspirin/prions.html> Obrázek č. 5: Mapa Papui Nové Guinei, ve které se vyskytlo kuru. Databáze online [cit. 2011-03-13]. Dostupné na: <http://www.osel.cz/index.php?clanek=125>, prezentace v ppt. 1.1.4 Gerstmann Straussler Scheinker syndrom (GSS) Nemoc byla popsána v roce 1936 třemi německými lékaři, po kterých dostala i své jméno. Projevuje se demencí a ztrátou pohyblivosti. Postupuje velmi pomalu. Je vyvolána poškozením genu pro prionový protein hned na několika místech. Zašmodrchaný prionový protein poškozuje především mozeček, tedy část mozku, řídícího kromě jiného i pohyb. 10 10 PETR, Jaroslav. Nemoc šílených krav hrozí?!. 1. vydání. Praha: Ivo Ţelezný, nakladatelství a vydavatelství, spol. s.r.o., 2001, s. 67. ISBN 80-237-3671-X. 14

1.1.5 Fatální familiární insomnie (FFI) Popsána v roce 1886. Je vyvolána poškozením genu pro prionový protein stejně jako GSS. Poškozený prionový protein se hromadí v thalamu, který se podílí na různých řídících funkcích. Postiţení lidé neztrácí své duševní schopnosti, ale trpí pohybovými a hormonálními poruchami a mají narušený spánek. 1.2 TSE zvířat 1.2.1 Scrapie Česky klusavka. První zmínka o scrapii je z roku 1732 z Francie. Postihuje ovce, méně kozy. Scrapie (z angličtiny scrape škrábat se). Inkubační doba je 2 5 let. Mezi příznaky patří: na počátku plachost, hubnutí, vypadávání a vykusování vlny, později se přidávají poruchy koordinace pohybu, obrna a ochrnutí končetin. Oproti BSE, kde ve svalovině ani v mléce nebyly prokázány priony, jsou u klusavky infekční všechny orgány i tkáně. U březích ovcí se v důsledku vertikálního přenosu prionů tyto bílkoviny šíří navíc do plodových vod a obalů. Proto se narodí jiţ infikované jehně a ostatní ovce se mohou nakazit pozřením infikované placenty. 11 Opatření jsou podobná jako u BSE likvidace rizikových orgánů mozek, mícha, střevo, slezina, mandle. V České republice se prokázala scrapie v lednu roku 2008 v Libereckém kraji. Nebyl dosud popsán případ, ţe by klusavka byla přenosná na člověka. 12 11 COJECO, 2000: Scrapie. Encyklopedie online [cit. 2011-03-31]. Dostupné na: <http://www.cojeco.cz/index.php?id_desc=84998&s_lang=2&detail=1&title=scrapie> 12 COJECO, 2000: Scrapie. Encyklopedie online [cit. 2011-03-31]. Dostupné na: <http://www.cojeco.cz/index.php?id_desc=84998&s_lang=2&detail=1&title=scrapie> 15

Obrázek č. 6: Obrázek ovce stiţené scrapií. Databáze online [cit. 2011-04-18]. Dostupné na: < http://www.avma.org/onlnews/javma/may02/s050102g.asp> 1.2.2 CWD CWD Chronic wasting disease (někdy se uvádí i CWS chronic wasting syndrome). Jedná se o prionovou chorobu jelenovité zvěře (chronické chřadnutí jelenovitých). Toto onemocnění bylo prvně popsáno v roce 1967 u jelence ušatého (Odocoileus hemionus) v USA, a to konkrétně ve státě Colorado. 13 Vnímavé druhy jsou: jelenec ušatý (Odocoileus hemionus), jelenec běloocasý (Odocoileus virginianus), los aljašský (Alces alces shirasi) a jelen lesní (Cervus elaphus). 14 CWD není přenosná na člověka a má jako jiné prionové choroby fatální průběh. Mezi příznaky patří ztráta plachosti, poruchy pohybu a koordinace pohybu, zvýšený příjem vody, a zvýšená salivace. Úhyn nastává 2-3 měsíce po propuknutí onemocnění. SVS ČR vydala směrnici na odběr vzorků jelena lesního a jelence běloocasého, jako vnímavých druhů na CWD. Monitoring byl zaměřen zejména na uhynulá, utracená, klinicky nemocná zvířata, zvířata poraţena při autonehodách a zdravá poraţená nebo zastřelená zvířata starší 18 měsíců věku. Z těchto zvířat byla jako vzorek pro vyšetření odebírána prodlouţená mícha (obex), a následně byly tyto vzorky vyšetřeny pomocí rychlých imunologických testů (Rapid test) ve státních veterinárních ústavech. Celkově bylo v České republice vyšetřeno 733 zvířat z volně ţijící populace a také z farmově 13 Státní veterinární správa České republiky, 2010. BSE (bovinní spongiformní encefalopatie) - neboli nemoc šílených krav. Databáze online [cit. 2011-03-15]. Dostupné na: <http://www.svscr.cz/index.php?art=929> 14 Státní veterinární správa České republiky, 2010. BSE (bovinní spongiformní encefalopatie) - neboli nemoc šílených krav. Databáze online [cit. 2011-03-15]. Dostupné na: <http://www.svscr.cz/index.php?art=929> 16

chovaných stád. U ţádného z nich nebyl zjištěn pozitivní výsledek. Obdobný výsledek monitoringu byl zaznamenán i v ostatních členských státech Evropské unie, které se tohoto monitoringu zúčastnily. Bylo vyšetřeno několik tisíc vzorků prodlouţené míchy jelena lesního, jelence běloocasého nebo losa (ve Skandinávii) a nebyl zaznamenán ani jeden pozitivní případ na onemocnění CWD, a proto lze konstatovat, ţe se v Evropě toto onemocnění zatím nevyskytuje. 15 Obrázek č. 7: Rozšíření CWD v severní Americe. Databáze online [cit. 2011-04-18]. Dostupné na: < http://www.avma.org/onlnews/javma/may02/s050102g.asp> 15 Státní veterinární správa České republiky, 2010. BSE (bovinní spongiformní encefalopatie) - neboli nemoc šílených krav. Databáze online [cit. 2011-03-15]. Dostupné na: <http://www.svscr.cz/index.php?art=929> 17

Tabulka č. 2: Přehled o počtu vyšetřených zvířat na CWD v České republice. rok jelen lesní (Cervus elaphus) a jelenec běloocasý (Odocoileus virginianus) farmový chov volně ţijící pozitivní případ CWD 2007 23 579 0 2008 37 81 0 2009 9 4 0 Celkem 69 664 0 Databáze online [cit. 2011-04-09]. Dostupné na: <http://www.svscr.cz/index.php?art=929> 1.2.3 BSE Tato choroba bude rozsáhleji popsána v další kapitole. Zde uvádím jen důleţitá data týkající se BSE. 1.2.4 Důleţitá data o BSE V roce 1982 Stanley Prusiner izoloval prion, a o tři roky později byly zaznamenány první případy BSE ve Velké Británii. V roce 1986 byla poprvé popsána BSE. Článek vyšel v britském veterinárním časopise Veterinary Record, ve kterém byla poprvé uveřejněna zkratka BSE (bovinní spongiformní encefalopatie). V témţe roce bylo diagnostikováno dalších 15 případů z různých částí Anglie. V roce 1988 bylo zaznamenáno dalších 2184 kusů nakaţených BSE. V dalších letech nemocných zvířat rychle přibývalo. Růst kulminoval v roce 1992. Údaje o počtu zjištěných případů BSE během období 1992-2000 potvrzují, ţe v celé Evropské unii a Švýcarsku dochází od roku 1996 k postupnému ubývání případů. V roce 2000 se počet nových případů sníţil oproti roku 1999 o 821 (tj. o 31 %) na 1 830. 18

Během tohoto roku bylo potvrzeno 182 488 případů, z toho 179 441 (98,3 %) ve Velké Británii. V tomto roce tedy klesl počet nově zjištěných případů BSE v této zemi o 42,5 %. Do roku 2003 bylo v Británii přes 170 000 případů BSE u skotu ve více neţ 34 000 zemědělských podnicích. Od tohoto data se počet případů BSE sniţuje. Obrázek č. 8 : Počet potvrzených případů BSE u dobytka ve Velké Británii. Databáze online [cit. 2011-02-26]. Dostupné na: <http://www.vesmir.cz/clanek/variantacreutzfeldovy-jakobovy-nemoci-jak-se-to-mohlo-stat> 2 BSE Bovinní spongiformní encefalopatie. Do češtiny bychom toto onemocnění mohli přeloţit jako houbovitě vyhlíţející onemocnění mozku. 19

Obrázek č. 9: Porovnání zdravé mozkové tkáně pod mikroskopem ve srovnání s tkání postiţenou kuru, klasickou formou CJD a scrapií. Databáze online [cit. 2011-02-26]. Dostupné na: <http://learn.genetics.utah.edu/content/begin/dna/prions/kuru.html> 2.1 Co je BSE? BSE je nervové onemocnění skotu, které způsobuje prion (název prion byl odvozen z anglického protein infectious dotvořeno přesmyčkou). Původně to měl být proin, jelikoţ se jedná o sloţeninu obou slov, ale slovo proin se Stanleymu Prusinerovi nelíbilo, prion zněl mnohem lépe. 2.2 Příčina vzniku BSE S největší pravděpodobností se hovězí dobytek nakazil pomocí masokostní moučky vyrobené z ovcí, které uhynuly na scrapii. Tato teorie je ze všech nejpravděpodobnější, a je také vědecky podloţená. Protoţe se odvětví lékařství a genetiky neustále zdokonaluje a uvádí se nové a nové postupy, není vyloučeno, ţe se s postupem času dočkáme jiné teorie, která bude ta správná. To ovšem neznamená, ţe je tato teorie špatná, můţe být jen jakýmsi klíčem k dalšímu poznání. Teorií ať uţ více či méně pravdivých je ale větší mnoţství, některé jsou uţ opravdu tak bizarní, ţe si myslím, ţe je lidé vymysleli proto, aby byli zajímaví a mluvilo se o nich. 20

2.2.1 Odkud se vzaly priony? Na tuto otázku existuje mnoho teorií, vědecky podloţených i bizarních. Jediné, na čem se vědci shodují, je, ţe se priony dostaly do těla skotu po krmení masokostní moučkou z těl ovcí, které uhynuly na scrapii. Masokostní moučka se zkrmovala skotu mnohem dříve, neţ se objevila BSE, a ţádné zvíře se nenakazilo. Přenos způsobila pravděpodobně ekonomická krize v 70. letech minulého století, kdy se šetřilo všude, tudíţ i ve výrobě této krmné směsi. V této době se sníţila teplota výroby, a to mohlo způsobit, ţe priony, které byly do té doby bezpečně likvidovány (i kdyţ se o nich samozřejmě nevědělo), přeţily a způsobily BSE. Další názor je takový, ţe se priony sice dostaly ke skotu pomocí masokostní moučky, ale nebyly to ovčí priony, nýbrţ priony skotu. Zastánci této teorie předpokládají, ţe se mohly priony vytvořit v těle skotu spontánně mutací (to by bylo moţné), a ţe tyto krávy, kdyţ uhynuly, poslouţily výrobě masokostní moučky, priony odolaly a nakazily se tak další krávy. Zastánci této teorie ale nevěří, ţe se BSE rozšířila kvůli tomu, ţe byl změněn technologický postup ve výrobě této krmné směsi. Zastávají názor, ţe priony přeţijí téměř vše, a ţe i před krizí byly ovčí priony v masokostní moučce přítomny, ale nedělo se nic, protoţe se skot nemohl ovčími priony nakazit. Tato teorie se zamlouvala mnohým představitelům tehdejší britské vlády. Antilopí teorie: Tým vědců z Nového Zélandu vedený Rogerem Morrisem je přesvědčen, ţe zdroj prionů je potřeba hledat někde jinde, a to aţ v Africe. Morris podrobil údaje o šíření BSE v Británii analýze pomocí nejnovějších počítačových modelů. Pokaţdé mu vycházela jako nejpravděpodobnější zdroj prionů divoká zvířata a nikoli ovce nakaţené scrapií a krávy stiţené mutací. 16 Jako ideální kandidáti mu vyšly antilopy, které byly do Británie dovezeny v 70. letech a měly prionovou chorobu. Kdyţ tyto antilopy uhynuly, nikdo se nad tím nepozastavil. Předpokládalo se, ţe se jen neadaptovaly na evropské klima, a moţná proto se po příčině úhynu důkladně nepátralo. Pak se z části jejich těl vyrobila masokostní moučka, která byla dodána skotu, a ten se poté nakazil BSE. 16 PETR, Jaroslav. Nemoc šílených krav hrozí?!. 1. vydání. Praha: Ivo Ţelezný, nakladatelství a vydavatelství, spol. s.r.o., 2001, s. 18. ISBN 80-237-3671-X. 21

Existují ale i mnohem bizarnější teorie. Některé z nich dokonce odmítají, ţe by BSE způsobovaly priony. Zde uvádím některé z nich: Orgánofosfátová teorie: Podle anglického farmáře Marka Purdeyho způsobili BSE výrobci pesticidů. Podle něj se pesticidy dostaly do míchy skotu díky střečkům, kteří kladli svá vajíčka na jejich hřbet. Také tvrdil, ţe se s podáváním pesticidů dostalo do zvířete velké mnoţství manganu, a tím bylo narušeno vnitřní prostředí organismu. U zdravých zvířat se prionový protein váţe na ionty mědi, u nemocných se naváţe na mangan a tím se naruší jeho klasické prostorové uspořádání. Někteří zastánci tvrdí, ţe za vším stojí výrobci pesticidů, kteří se snaţí ututlat svoji vinu. Tato teorie se však zdá přitaţená za vlasy, protoţe proč by státy vynakládaly tolik prostředků na boj s BSE a zároveň kryly tyto velkovýrobce? Další teorie mluví o BSE jako o autoimunitním onemocnění, kdy imunitní systém nerozezná rozdíl mezi vlastní somatickou buňkou a cizím agens, a tím zničí vlastní tkáně. Tato teorie by byla i moţná, jenţe je tu otázka, co by donutilo imunitní systém k tomu, aby začal ničit sám sebe? Byl by to nějaký podnět zvenčí (třeba záření), nebo by to byl stres či nemoc, co by zapůsobilo jako spouštěč? 17 Řepková teorie: Tato teorie je poněkud rozdvojená, a zní takto: z řepky po vylisování oleje zůstanou výlisky, které se zkrmují. Tyto výlisky obsahují velké mnoţství selenu, který postihuje nervové buňky. BSE by mohla být tedy způsobena otravou selenem. Druhá část teorie zní, ţe skotu neškodí tolik zvýšení hladiny selenu, jako jeho následný pokles, kdyţ se přestane krmit řepkovými krmivy. Skot by tedy trpěl abstinenčními příznaky, jelikoţ by byl zvyklý na vysoké dávky selenu. Dalšími bizarními teoriemi jsou například mimozemský původ prionů, fononová teorie, nebo zahlcení organismu bílkovinou. 18 17 PETR, Jaroslav. Nemoc šílených krav hrozí?!. 1. vydání. Praha: Ivo Ţelezný, nakladatelství a vydavatelství, spol. s.r.o., 2001, s. 19-20. ISBN 80-237-3671-X. 18 PETR, Jaroslav. Nemoc šílených krav hrozí?!. 1. vydání. Praha: Ivo Ţelezný, nakladatelství a vydavatelství, spol. s.r.o., 2001, s. 22. ISBN 80-237-3671-X. 22

Můj osobní názor na vznik různých teorií je, ţe se většina lidí snaţí přiţivit na kauze BSE a tím si uţít svých 15 minut slávy. Teorie sice můţe stát na reálných základech, ale její rozvinutí je uţ většinou přitaţené za vlasy. 2.2.2 Příznaky BSE má dlouhou inkubační dobu 3-6 let, délka je 2 6 týdnů. Onemocnění vţdy končí smrtí. Začátky onemocnění nejsou výrazné, projevuje se neklid zvířete, podráţdění, lekavost, abnormální chování záchvaty zuřivosti, napadání jiných zvířat, pocity strachu. 2.2.3 Fáze nemoci Nemoc probíhá ve dvou fázích: 19 1. fáze tzv. prodromální stádium- priony jsou v těle nakaţeného zvířete, ale ještě se nestihly namnoţit. Zvíře normálně ţere, ale i tak hubne, zhoršuje se laktace. Později se začínají projevovat nervové poruchy a odchylky v chování. 2. fáze klinicko manifestační stádium trvá asi půl roku. U zvířete uţ se projevuje postiţení centrální nervové soustavy, straní se skupiny, trpí zvýšenou lekavostí, dráţdivostí a zuřivostí. Období klidu a projevů nemoci se můţe střídat. Dále jsou patrné psychomotorické projevy zvíře stojí nakřivo, má rozkročený postoj a kymácivou a strnulou chůzi. Další příznaky jsou nepřirozené zvuky, a skřípání zubů. Později dojde k paralýze a zvíře umírá. 2.3 Pozitivní případy v ČR První případ byl diagnostikován v roce 2001 v malé vísce jménem Dušejov, která se nachází na Jihlavsku. Byl udělán i kontrolní test, který pozitivní výsledek potvrdil. Aby byl výsledek průkazný, odeslaly se materiály do německého Tübingenu. Ve zdejších 19 MILUCHOVÁ, Martina, et. al., 2007: Molekulový základ priónov, výskyt prionóz u ľudí a zvierat a ich klinická charakteristika a diagnostika. Databáze online [cit. 2011-03-20]. Dostupné na: <http://www.cvzv.sk/slju/07_2/miluchova.pdf> 23

laboratořích rovněţ prokázali tuto nákazu. Kvůli BSE bylo v Dušejově poraţeno 134 kusů krav, které byly následně testovány. Všechny výsledky byly negativní, BSE měla jen kráva, která byla utracena nejdříve. Utrácí se tzv. kohorta vrstevnic, to znamená, ţe krávy, které se narodily ve stejném období jako kráva nemocná, se dohledají (mohou být totiţ i v jiném zemědělském podniku) a utratí. Tyto krávy jsou o rok starší nebo mladší neţ postiţený kus. Jelikoţ existuje povinnost chovatele kaţdý nově narozený kus evidovat, není dohledání tak sloţité. Do roku 2011 bylo v České republice prokázáno 30 případů BSE, testováno bylo 1 666 854 kusů skotu. Testovaných kusů bylo velké mnoţství, přičemţ bylo zjištěno jen 30 pozitivních případů. Takţe šance, ţe zrovna vaše kráva bude mít BSE je 1: 55 000. Tabulka č. 3: Přehled o počtu vyšetřených zvířat na TSE v České republice rok skot pozitivní případy BSE ovce pozitivní případy TSE u ovcí kozy pozitivní případy TSE u koz 2001 114 146 2 2002 175 435 2 1 155 16 102 0 2003 210 456 4 2 970 12 274 0 2004 200 873 7 1 063 9 86 0 2005 170 857 8 447 1 216 0 2006 174 470 3 1 097 0 113 0 2007 160 420 2 2 839 1 163 0 2008 157 270 0 994 16 328 0 2009 156 472 2 582 0 172 0 2010 146 455 0 726 0 150 0 Celkem 1 666 854 30 11 873 55 1 604 0 24

Databáze online [cit. 2011-04-09]. Dostupné na: <http://www.vesmir.cz/clanek/varianta-creutzfeldovy-jakobovy-nemoci-jak-se-tomohlo-stat> Obrázek č. 10: Mapa pozitivních nálezů BSE v České republice. Databáze online [cit. 2011-03-26]. Dostupné na: <http://www.svscr.cz/files/bse/mapapozitivninalezybse.pdf> 2.4 Opatření v České republice Monitorování BSE začalo v roce 1991, kdy byla zaloţena Národní referenční laboratoř pro TSE. Vyšetřovala se ale jen zvířata, která měla příznaky nervového onemocnění. Vyšetření bylo prováděno histologicky. Na konci roku 2000 bylo zahájeno vyšetření zdravých kusů. V České republice se testuje metodou Western Blot. Vyšetření provádějí SVÚ Jihlava a Praha, později k nim přibyl ještě SVÚ Olomouc. Na BSE se vyšetřuje skot starší 30 měsíců při normální poráţce. Při nucené poráţce se věk skotu sniţuje na 24 měsíců. Dále se musí vyšetřit všechna zvířata poraţená mimo jatka, uhynulá a utracená zvířata, zvířata podezřelá z nákazy BSE a zvířata, která byla utracena v důsledku nákazy BSE v chovu. Všechna tato zvířata musí mít minimálně 24 měsíců. Navíc je stále platný zákaz pouţívání masokostní moučky pro krmení 25

přeţvýkavců. A na jatkách se odstraňuje tzv. specifický rizikový materiál (SRM), coţ jsou mandle, lebka, mícha přeţvýkavců starší 12 měsíců, dále ileum (kyčelník) skotu staršího 12 měsíců, a slezina ovcí a koz. Toto nařízení platí od 1. října 2000. 2.5 Opatření v Evropské unii Evropská unie pouţívá obdobná opatření jako Česká republika. Ve všech členských státech EU odstraňují jatky a asanační ústavy tento specifický rizikový materiál: lebku (včetně mozku a očí), tonzily, míchu a ileum (kyčelník) skotu staršího 12 měsíců, lebku (včetně mozku a očí), tonzily a míchu ovcí a koz starších 12 měsíců, a slezinu ovcí a koz všech věkových kategorií. 2.6 Testování BSE Testování se v ČR i EU provádí metodou Western Blot od firmy Prionics Check. Tato metoda je zaloţena na detekci určitého proteinu ve směsi různých proteinů. Pojmenování metody vzniklo jako analogie k metodě Southern Blot, která byla vyvinuta k detekci DNA. Později byla upravena k detekci RNA a pojmenována jako Northern Blot. Analogický postup pro přenos proteinů byl proto nazván Western Blot. 20 Princip a postup metody Western Blot: 21 1. Elektroforéza předchází vlastnímu western blotu, nejčastěji jde o SDS - PAGE elektroforézu. Vzorkem můţe být směs proteinů, nebo můţe jít o vzorek tkáně, který musíme napřed zhomogenizovat, neţ jej naneseme na gel. Tyto vzorky se pak označují jako lyzáty (vznikly lýzou buněk a přitom se uvolnily proteiny). 20 WIKIPEDIE, 2011: Western blot. Encyklopedie online [cit. 2011-04-11]. Dostupné na: <http://cs.wikipedia.org/wiki/western_blot> 21 Western blot. Databáze online [cit. 2011-03-23]. Dostupné na: <http://www.drobkysveta.estranky.cz/clanky/chemie/western-blot.html> 26

Obrázek č. 11: Princip elektroforézy. Databáze online [cit. 2011-03-17]. Dostupné na: <http://klouda.webpark.cz/mam.htm> 2. Blotování proteiny se z gelu musí přenést na membránu, která je nejčastěji celulózová. Přístroj je řešen jako systém anoda katody. Na anodu se poloţí papír, který se namočí do pufru, na něj se dá membrána, gel a poté znova namočený papír. Následně se dá připravený vzorek do přístroje reagovat. 3. Reakce proteinu s protilátkou membrána se nechá inkubovat s látkou, která zamezí navázání proteinu na membránu. Poté se přidá látka, která s proteinem specificky reaguje. Necháme je spolu inkubovat a přidáme sekundární protilátku, která je označena. 4. Vyvolání blotu a výsledek peroxidasa je pouţita ve spojení s chemiluminiscenční látkou. Luminiscence je v místech, kde se primární protilátka navázala na hledaný protein. Jako kaţdá metoda má i tato své klady a zápory. Kladem je jednoduchá identifikace proteinu. Záporem je mít primární protilátku, na kterou se protein naváţe. I pořizovací cena přístroje není zrovna nízká, takţe blotování je záleţitostí větších firem nebo univerzit. 3 SCRAPIE Scrapie patří stejně jako BSE mezi transmisivní spongiformní encefalopatie. Byla poprvé pozorována ve Velké Británii u ovcí v roce 1732. Scrapie u koz byla diagnostikována aţ ve 40. letech minulého století. 3.1 Co je scrapie? 27

Je to chronické, smrtelně probíhající onemocnění ovcí a koz, které způsobují priony, jeţ změní svoji prostorovou konfiguraci (lidově řečeno zašmodrchají se ). České pojmenování klusavka vzniklo podle jednoho z příznaků ovce při klusu vysoko zvedají nohy. Scrapie se vyskytuje zejména u ovcí ve věku 2-5 let. Mezi příznaky patří úporné drbání a škrábání se (ovce má na některých místech vykousanou vlnu), následují změny chování otupělost, agresivita, nervozita. Jsou patrné i změny postoje, třes hlavy, špatná koordinace pohybu, klopýtání, ochablost pánevních končetin, neschopnost stát. Později zvíře výrazně hubne a uhyne. Léčba v současné době neexistuje. Diagnostika se provádí stejně jako u BSE posmrtným vyšetřením. U klusavky jsou na rozdíl od BSE infekční všechny tkáně. Dokonce je prokázán i vertikální přenos z bahnice na jehně, takţe se další ovce mohou nakazit, seţerou li infikovanou placentu. Geneticky vnímavá k tomuto onemocnění jsou zejména plemena Suffolk a Hampshire. Proto se u těchto plemen vyuţívá tzv. genotypizace, kterou se stanoví genotyp prionového proteinu a vnímaví jedinci se vyřadí z chovu. 3.2 Příčiny vzniku scrapie Pravděpodobnou příčinou je mutace ovčího prionového proteinu. Po úhynu ovce bylo její tělo dáno do kafilérie a zpracováno na masokostní moučku, přičemţ nemusely být priony zcela zničeny a dál infikovaly jiné ovce, kterým se masokostní moučka zkrmovala. 3.3 Testování scrapie Testování probíhá stejně jako u BSE metodou Western Blot. Začátkem 60. let minulého století byl proveden první laboratorní přenos na myši to umoţnilo detailnější studium TSE. 22 22 BELAY, G. Přehled TSE u zvířat. In Tansmisivní spongiformní encefalopatie (TSE) prionové choroby člověka a zvířat. Sborník ze semináře pořádaného ústavem mikrobiologie a imunologie FVL VFU Brno, mikrobiologickým ústavem LF MU a FN U svaté Anny v Brně. Brno: Noviko, a.s., 2001, Část 3. Přehled TSE u zvířat. s. 18. 28

3.4 Opatření v České republice Specifický rizikový materiál (SRM) u ovcí je: lebka (včetně mozku a očí), mícha a mandle zvířat starších 12 měsíců, a slezina a kyčelník (ileum) zvířat všech věkových kategorií. Na základě vyhlášky č. 286/1999, je jiţ od 1. 1. 2000 odstraňován specifický rizikový materiál z potravinového řetězce. SRM se odstraňuje na jatkách a k úplné likvidaci dochází v kafilériích. Jiţ od 60. let minulého století platí v ČR přísné parametry na zpracování těl uhynulých zvířat na masokostní moučku. Tyto parametry byly 130-140 C, při tlaku 3 bary po dobu 3 minut. Bylo to kvůli nákaze snětí slezinnou (antrax). O prionech se tehdy samozřejmě nevědělo. Dne 30. 9. 1996 rozhodla Ústřední nákazová komise o sjednocení parametrů v souladu s nařízením Evropské unie, a od tohoto data jsou parametry nastaveny takto: teplota 133 C, tlak 3 bary, doba trvání 20 minut. Od roku 1991 je v ČR zákaz krmení přeţvýkavců masokostní moučkou. Toto nařízení bylo později rozšířeno na úplný zákaz krmení masokostní moučky všem přeţvýkavcům. Dále se na základě zákona o krmivech č. 91/1996, ve znění pozdějších předpisů uskutečňuje kontrola mícháren a výroben, aby nedošlo ke kontaminaci krmiv. 29

Tabulka č 4: Přehled o počtu vyšetřených zvířat na TSE v České republice rok skot pozitivní případy BSE ovce pozitivní případy TSE u ovcí kozy pozitivní případy TSE u koz 2001 114 146 2 2002 175 435 2 1 155 16 102 0 2003 210 456 4 2 970 12 274 0 2004 200 873 7 1 063 9 86 0 2005 170 857 8 447 1 216 0 2006 174 470 3 1 097 0 113 0 2007 160 420 2 2 839 1 163 0 2008 157 270 0 994 16 328 0 2009 156 472 2 582 0 172 0 2010 146 455 0 726 0 150 0 Celkem 1 666 854 30 11 873 55 1 604 0 Databáze online [cit. 2011-02-15]. Dostupné na: <http://www.svscr.cz/files/bse/mesicne/mapavysetrenibse.pdf> 3.5 Opatření v Evropské unii 30

Výrazněji se neliší od opatření v ČR. Patří tam také odstraňování SRM a zákaz zkrmování masokostní moučky. V Evropské unii platí stejné podmínky při zpracování masokostní moučky jako v České republice. 4 GENETICKÉ TESTOVÁNÍ BSE A SCRAPIE DNA a genetické testy jsou základními nástroji pro vymýcení klusavky. Genetická predispozice pro ovčí scrapii je zaloţena na malých rozdílech v peptidové sekvenci pro prionový protein. 23 Prionový protein je infekční, kdyţ se přemění jeho běţné membránové proteiny na infekční patologický konformační izomer, nazývaný PrPSc, 24 který má jinou třírozměrnou strukturu (3D). Tato vlastnost má z molekulárního hlediska zásadní význam pro rozpoznání TSE. Všechny TSE jsou infekční a mohou být přeneseny především z potravin (Creutzfeldt Jakobova choroba), mohou vzniknout i dědičnou mutací v PrPC (10 15%), nebo z neznámých důvodů (cca 85%). U některých by se mohlo jednat o nově zjištěnou mutaci. 25 Zatím sice nebyla pozorována, ale i u zvířat by mohlo dojít, stejně jako je tomu u lidí, ke vzniku nové sporadické formy onemocnění. Proto je literatura se sporadickým výskytem podrobněji studována, i kdyţ se zatím tento výskyt objevil jen u lidí. Sledování TSE se provádí pomocí mezinárodní metody nazvané Imunoblot, ve stavu post mortem. Bohuţel neexistuje ţádná metoda, která by umoţňovala vyšetření u ţivých zvířat. 26 23 HEATON, P. Michael, 2010: Ovinelreference materials and assays for prion genetic testing. Databáze online: [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2876147/pdf/1746-6148-6-23.pdf> 24 ATKINSON, H. Paul, 2005: Bovine spongiform encephalopathy (BSE): Its context in New Zealand and new tests. Databáze online: : [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://pdfserve.informaworld.com/709449 919964398.pdf> 25 ATKINSON, H. Paul, 2005: Bovine spongiform encephalopathy (BSE): Its context in New Zealand and new tests. Databáze online: : [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://pdfserve.informaworld.com/709449 919964398.pdf> 26 ATKINSON, H. Paul, 2005: Bovine spongiform encephalopathy (BSE): Its context in New Zealand and new tests. Databáze online: : [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://pdfserve.informaworld.com/709449 919964398.pdf> 31

Gen způsobující náchylnost k experimentální scrapii se nachází na chromozomu 2. Dvě alely PRNP (PRNPa a PRNPb) kódují odlišné PRPS, které se liší u aminokyselin 108 (leucin a fenylalanin) a 189 (threonin a valin). 27 Inkubační doba je závislá na izolovaném prionu a kmeni, který je naočkován. S některými izoláty, jako je kmen Rocky Mountain Laboratories (RML), je PRNb alela kodominantní s prodlouţenou inkubační dobou u klusavky, zatímco alela A22 má u myší delší inkubační dobu. Obrázek č. 12: Šíření kmenů scrapie je závislé na sekvenci aminokyselin. Databáze online [cit. 2011-03-17]. Dostupné na: <http://www.sciencedirect.com/science?_ob=articleurl&_udi=b6td0-40w0vks- 2P&_user=10&_coverDate=04%2F30%2F1995&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway &_origin=gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchstrid=1736887716&_reru norigin=google&_acct=c000050221&_version=1&_urlversion=0&_userid=10&md5= 3f903a153fd688d7b52cf96c82d64396&searchtype=a.> 27 WESTAWAY, David a kol., 1995: On safari with PrP: prion diseases of animals. Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://www.sciencedirect.com/science?_ob=articleurl&_udi=b6td0-40w0vks- 2P&_user=10&_coverDate=04%2F30%2F1995&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway&_origin= gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchstrid=1736887716&_rerunorigin=google&_ acct=c000050221&_version=1&_urlversion=0&_userid=10&md5=3f903a153fd688d7b52cf96c 82d64396&searchtype=a.> 32

V USA jiţ od roku 1952 pracují na úplném vymýcení klusavky. Existují na to i dva programy: Národní program vymýcení klusavky (NSEP the National Scrapie Eracation Program) a Certifikační program stád scrapie (SFCP Cand the Scrapie Certification program), které spolupracují na vymýcení klusavky z ovčích a kozích stád. 28 NSEP je povinný a zaloţený na podávání zpráv o zvířatech aţ do jejich původních stád, kde se narodila. Naopak SFCP, který byl zaloţen v roce 1992, je program dobrovolný. 29 Přírodní klusavka u ovcí a koz je známá dlouhodobě, ale o mechanismu jejího šíření se dlouho diskutovalo. Experimentální přenos scrapie ovcí na laboratorní hlodavce umoţňuje vědcům zkoumat neobvyklou povahu prionu a řešit, jakým způsobem dochází k přenosu. 30 V následné biochemické studii byla identifikována protein rezistentní proteáza o molekulové hmotnosti 27-30 kda, která byla označena jako PrP 27-30. Genetická analýza poukazuje na to, ţe je PrPSc hlavní, a moţná jediná varianta prionu. 31 Izolací 28 APHIS: Veterinary service, 2009: Scrapie Flock Certification Program USDA Scrapie Programs. Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://www.aphis.usda.gov/publications/animal_health/content/printable_version/fs_scrafcp.pdf> 29 APHIS: Veterinary service, 2009: Scrapie Flock Certification Program USDA Scrapie Programs. Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://www.aphis.usda.gov/publications/animal_health/content/printable_version/fs_scrafcp.pdf> 30 WESTAWAY, David a kol., 1995: On safari with PrP: prion diseases of animals. Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://www.sciencedirect.com/science?_ob=articleurl&_udi=b6td0-40w0vks- 2P&_user=10&_coverDate=04%2F30%2F1995&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway&_origin= gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchstrid=1736887716&_rerunorigin=google&_ acct=c000050221&_version=1&_urlversion=0&_userid=10&md5=3f903a153fd688d7b52cf96c 82d64396&searchtype=a.> 31 WESTAWAY, David a kol., 1995: On safari with PrP: prion diseases of animals. Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://www.sciencedirect.com/science?_ob=articleurl&_udi=b6td0-40w0vks- 2P&_user=10&_coverDate=04%2F30%2F1995&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway&_origin= gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchstrid=1736887716&_rerunorigin=google&_ acct=c000050221&_version=1&_urlversion=0&_userid=10&md5=3f903a153fd688d7b52cf96c 82d64396&searchtype=a.> 33

klonované DNA (cdna) bylo zjištěno, ţe PrP 27-30 je odvozen od PrPSc, a ţe oba u nakaţených i zdravých zvířat vyjadřují souvislost s glykolipidem, bílkovinou PrPC. Abnormální prionový protein je částečně odolný vůči trávení proteinázy (PrPres). 32 Všechny vzorky, které jsou hodnoceny, jsou ovlivněny tím, jak dlouho po smrti zvířete byly sesbírány. Vzhledem k hospodářské důleţitosti vznikly obavy, ţe spolehlivost testů na TSE bude horší, pokud bude horší kvalita tkáně. Silně rozloţená nervová tkáň nemůţe být vyhodnocena imunohistochemicky ani histologicky, protoţe je narušena tkáňová struktura. 33 Autolýza neovlivňuje testy, které detekují proteinázu, rezistentní patogenní izoformu proteinového genu PrPres. Je předpokládáno, ţe dlouhodobé působení tepla můţe mít větší vliv, neţ bylo původně bráno v úvahu. 34 Western Blot metoda a metoda specifických protilátek je směřována na základní globulární doménu prionového proteinu. Tři úlomky je moţné oddělit podle relativní molekulové hmotnosti odpovídající diglykosylové, monoglykosylové a neglykosylové PrPres. U ovcí experimentálně infikovaných BSE byly nalezeny vysoké úrovně diglykosilované PrPres. Zvířata nakaţená klasickou BSE a klusavkou je nyní moţné odlišit podle různě velkých glykoforem PpPres (PrPres). (Stéphane Lezmi a kol.: Comparative Molecular Analysis of the Abnormal Prion Protein in Field Scrapie Cases and Experimental Bovine Spongiform Encephalopathy in Sheep by Use of Western Blotting and Immunohistochemical Methods, JOURNAL OF VIROLOGY, Apr. 2004, p. 3654 3662 Vol. 78, No. 7). 32 LÉZMI, Stéphane, 2004: Comparative Molecular Analysis of the Abnormal Prion Protein in Field Scrapie Cases and Experimental Bovine Spongiform Encephalopathy in Sheep by Use of Western Blotting. Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://jvi.asm.org/cgi/reprint/78/7/3654> 33 TRIANTIS, Joni a kol., 2007: BRIEF COMMUNICATIONS Effect of time and temperature on PrPCWD immunoreactivity as evidenced by Western blot. Databáze online: [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://jvdi.org/cgi/reprint/19/4/389> 34 TRIANTIS, Joni a kol., 2007: BRIEF COMMUNICATIONS Effect of time and temperature on PrPCWD immunoreactivity as evidenced by Western blot. Databáze online: [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://jvdi.org/cgi/reprint/19/4/389> 34

U některých studií byla zjištěna moţnost niţší hmotnosti u vcjd na rozdíl od jiných forem CJD. Toto bylo také zjištěno u ovcí, experimentálně nakaţených BSE, kdyţ bylo provedeno srovnání s ovcemi nakaţenými klusavkou. U imunohistochemických přístupů slouţících ke zjištění BSE bylo dosaţeno toho, ţe charakterizuje epitopy v abnormálním prionovém proteinu, také v neuronech a fagocytárních buňkách, lymforetikulárním systému a mozku. 35 Pomocí různých specifických peptidových protilátek, namířených na PK štěpení oblasti PrP, byla rozsáhlejší hydrolýza odhalena v těle makrofágů (TBMs), lymfatické tkáni a mozku ovcí experimentálně nakaţených BSE. Tyto výzkumy naznačují, ţe PrPres u zvířat, nebo lidí, kteří se nakazili BSE je více citlivé na zacházení neţ PrPres u zvířat nakaţených scrapií. Větší část N-terminální sekvence PrPres je odstraněna proteolytickou úpravou a vede ke ztrátě epitopů. 36 Definování rozdílu mezi PrPC a PrPSc mají zásadní význam pro replikaci prionů. 37 Byly vyloučeny moţnosti, ţe všechny izoformy proteinového genu jsou důsledkem proteinového sestřihu. 38 Genů, které kódují prionový protein, je nejvíce v pěti vedlejších skupinách kódujících exonů. 35 LÉZMI, Stéphane, 2004: Comparative Molecular Analysis of the Abnormal Prion Protein in Field Scrapie Cases and Experimental Bovine Spongiform Encephalopathy in Sheep by Use of Western Blotting. Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://jvi.asm.org/cgi/reprint/78/7/3654> 36 LÉZMI, Stéphane, 2004: Comparative Molecular Analysis of the Abnormal Prion Protein in Field Scrapie Cases and Experimental Bovine Spongiform Encephalopathy in Sheep by Use of Western Blotting. Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://jvi.asm.org/cgi/reprint/78/7/3654> 37 WESTAWAY, David a kol., 1995: On safari with PrP: prion diseases of animals. Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://www.sciencedirect.com/science?_ob=articleurl&_udi=b6td0-40w0vks- 2P&_user=10&_coverDate=04%2F30%2F1995&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway&_origin= gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchstrid=1736887716&_rerunorigin=google&_ acct=c000050221&_version=1&_urlversion=0&_userid=10&md5=3f903a153fd688d7b52cf96c 82d64396&searchtype=a.> 38 WESTAWAY, David a kol., 1995: On safari with PrP: prion diseases of animals. Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://www.sciencedirect.com/science?_ob=articleurl&_udi=b6td0-40w0vks- 2P&_user=10&_coverDate=04%2F30%2F1995&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway&_origin=gateway& _sort=d&_docanchor=&view=c&_searchstrid=1736887716&_rerunorigin=google&_acct=c000050221& _version=1&_urlversion=0&_userid=10&md5=3f903a153fd688d7b52cf96c82d64396&searchtype=a.> 35

Byla provedena i studie zkušebních metod, která prokazovala neexistenci rozdílů v genetické výbavě bahnic s různými genotypy PrP. Byly analyzovány genetické hodnoty zejména pro produkci mléka u alely ARR. Genotypizace byla povedena na 204 bahnicích plemena Lacaune. Bahnicím byly odebrány vzorky v horní a dolní polovině ocasu pro odhad plemenné hodnoty (EBV). 39 Populace plemene Lacaune, která byla pouţita k této studii, se nachází v severní části Navarry (Španělsko) a čítá 4000 ovcí. Tato populace je také zařazena do španělského výzkumného projektu zaměřeného na charakterizaci PrP genu u různých plemen ovcí. Většina plemen zapojených do projektu byla místní maso mléčná plemena. Lacaune je sice plemeno francouzské, ale je do této studie zahrnuto kvůli významnému zastoupení ve španělském mléčném průmyslu. V současné době je 50% plemen mléčných ovcí ve Španělsku zahraničního původu, nebo se jedná o kříţence. Zvířata, kterým byly odebrány vzorky, byla rozdělena do dvou skupin podle nejlepší plemenné hodnoty (B-EBV) a nejhorší (W- EBV). 40 Genetické programy zaloţené na návaznosti genotypu klusavky a prionového proteinu probíhají v několika zemích. 41 V Evropské unii jsou PrP genotypy určeny s odkazem na aminokyseliny na kodonu 136, 154 a 171 prionového genu. Nalezené genotypy byly rozčleněny do 5 skupin podle náchylnosti na scrapii. Toto rozdělení bylo vytvořeno pro NSP národní program pro scrapii (National Scrapie Plan). Tento systém klasifikace byl pouţit i ve Velké Británii. 42 Tyto programy jsou důleţité proto, ţe zvýhodňují výběr z nejodolnějších genotypů a mají dopady na produkci. 39 PARADA, A. a kol., 2007: Testing the equivalence of different ovine PrP genotypes for estimated breeding values. Databáze online: [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1439-0388.2007.00661.x/pdf> 40 PARADA, A. a kol., 2007: Testing the equivalence of different ovine PrP genotypes for estimated breeding values. Databáze online: [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1439-0388.2007.00661.x/pdf> 41 PARADA, A. a kol., 2007: Testing the equivalence of different ovine PrP genotypes for estimated breeding values. Databáze online: [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1439-0388.2007.00661.x/pdf> 42 PARADA, A. a kol., 2007: Testing the equivalence of different ovine PrP genotypes for estimated breeding values. Databáze online: [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1439-0388.2007.00661.x/pdf> 36