Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat DIPLOMOVÁ PRÁCE Brno 2010 Bc. Naděžda Pirošová
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat Vliv teratospermie na kvalitu embryí, jejich implantaci a následnou graviditu Vedoucí práce: Ing. Martin Hošek, Ph.D. Vypracovala: Bc. Naděžda Pirošová Brno 2010
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv teratospermie na kvalitu embryí, jejich implantaci a následnou gravidity vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Dne. Podpis diplomanta.
PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Martinu Hoškovi, Ph.D. za vedení diplomové práce, za připomínky a pomoc při jejím vypracování. Děkuji majiteli společnosti Reprofit International MUDr. Marku Koudelkovi, za poskytnutá data a vedoucímu lékaři MUDr. Štěpánu Machačovi, PhD. za pomoc a odborné rady. Velké poděkování patří také celé mé rodině (Ing. Martinu Janíčkovi za pomoc se zpracováním dat, úpravou textu a veškerou trpělivost) a blízkým přátelům za podporu během dlouhých 5-ti let studií.
ABSTRAKT Cílem diplomové práce nazvané: Vliv teratospermie na kvalitu embryí, jejich implantaci a následnou graviditu bylo vyhodnotit vliv patologické morfologie spermií (teratospermie mužů) na kvalitu embryí, na jejich uhnízdění v děloze po transferu a na následnou graviditu příjemkyň kontrolovanou 8-mý týden gravidity. Jednalo se o embrya vytvořená v laboratorních podmínkách metodou intracytoplazmatické injekce spermie (ICSI). Diplomová práce se zabývá popisem vzniku lidských pohlavních buněk (spermiogeneze a oogeneze) a charakterizací laboratorních metod asistované reprodukce. Tyto metody byly použity k získání oocytů (OPU), k odstranění kumulárních buněk vajíčka (denudace) a k jeho oplození (ICSI). Součástí práce je vyšetření čerstvého ejakulátu (SPG) a jeho zpracování metodou Swim-up bezpodmínečně nutné pro oplodnění vajíček metodou ICSI. Dále se tato práce zabývá hodnocením embryí s cílem vybrat ta, která jsou za účelem dosažení gravidity žen nejvhodnější k přenosu do dělohy (ET), případně ke kryokonzervaci. Materiálem pro předkládanou práci byly: spermie mužů, oocyty získané ovariální punkcí dárkyň a krev příjemkyň. K získání našich výsledků byly použity spermiogramy a embrya 207-mi vybraných případů vyšetřených na klinice asistované reprodukce v Brně v průběhu roku 2008 a to od 1.4. do 31.11. Do předkládané studie byli zařazeni pouze muži, u nichž jsme měli k oplození vajíčka k dispozici tzv. fresh sperm (ejakulát získaný v odběrové místnosti na klinice). Z důvodu co nejvyšší možné eliminace vlivu ženského faktoru a co největší průkaznosti pouze vlivu mužské teratospermie jsme zvolili vajíčka pocházející od dárkyň (zdravých žen jejichž průměrný věk činil: 24,16 let. Celá skupina 207-mi případů byla rozdělena dle hodnot zjištěné normospermie na skupinu kontrolní a sledovanou. Kontrolní skupina 48-mi členů je tvořena normospermiky. Sledovanou skupinu tvoří 159 teratospermiků. V obou skupinách byly použity darované oocyty. Vyšlo nám, že u parametru FR zjištěný rozdíl 1,73 % ve prospěch skupiny normospermiků, není při hladině významnosti p=0,350 statisticky významný. U parametru PR byl zjištěn rozdíl 10,7 % ve prospěch skupiny normospermiků, který při hladině významnosti =0,189 není statisticky významný. Stejně tak u parametru IR zjištěný rozdíl 4,23 % ve prospěch skupiny normospermiků není při hladině významnosti p=0,390 statisticky významný. U parametru UR zjištěný rozdíl 1,38 % ve prospěch skupiny normospermiků také není při hladině významnosti p=0,759 statisticky významný. 7
Vliv teratospermie na jednotlivé parametry hodnotící kvalitu embryí (FR a UR), implantaci (PR) a následnou graviditu (IR) tedy nebyl prokázán. Z toho vyplývá, že u teratospermiků, jsou při dodržení námi nastavených podmínek šance na otěhotnění a dosažení následné gravidity stejné jako u normospermiků. Klíčová slova: spermie, oocyt, teratospermie, kvalita embryí, implantace, gravidita. 8
ABSTRACT The objective of the presented work entitled Effect of teratospermia on the quality of embryo, emryo implantation and subsequent gravidity was to evaluate the effect of a faulty sperm morphology (male teratospermia) on the embryo quality, embedding of ovum in uterus and the following gravidity that was assessed within 8th week of pregnancy. The embryos were obtained under laboratory conditions by using a procedure of intracytoplasmic sperm injection (ICSI). This diploma work deals with description of the formation of human gamete cells and characterization laboratory techniques used for assisted reproduction. These techniques were used to obtain oocytes (OPU), to eliminate cumular cells of the ovum (denudation) and to rise the embryos (ICSI). One part of this work was to perform examination of a fresh ejaculate (SPG) and its processing by using the swim-up method that is implicitly required for in vitro fertilisation. Further the aim of this work was to evaluate the quality of embryos with the view of selecting the most suitable once for the transfer to the uterus (ET), respectively for cryoconservation, thus the most advisable for reaching gravidity. The biological materials used for this work were: male sperm, oocytes obtained by ovary tapping of female donators, further subsequently developed embryos and blood of recipient women. For the overall evaluation collection of data with spermiograms and embryos originating from 207 cases examined during the period 1.4. to 31.11. 2008 at the Clinic Reprofit International in Brno were used. In the presented study men were included for whom we had the fresh sperm (ejaculate acquired in the taking room at the clinic) available at the day of egg fertilization. In order to eliminate the influence of female factor and to demonstrate only the effect of male teratospermia, we have used only the ovules derived from the donating women (healthy women with the average age of 24,16 years). The group consisting of 207 cases was divided to a control and monitored group based on the values of evaluated normospermia. The monitored group consisted of 159 men with teratospermia. For both groups only the donated oocytes were used. Our results demonstrated that: Considering the parameter FR, the difference of 1.73% in favor of the group of men with normospermia was not statistically significant (p=0.35). Considering the parameter PR, the difference of 10.7% in favor of the group of men with normospermia was not statistically significant (p=0.189). Considering the parameter IR, the difference of 4.23% in favor of the group of men with normospermia was not statistically significant (p=0.39). Considering the parameter UR, the difference of 1.38% in favor of the group of men with normospermia was not statistically significant (p=0.759). 9
Based on our results we conclude that the effect of teratospermia on the individual parameters assessing the quality of embryos, the implantation efficiency and the successive gravidity is not significant. This implies that men with teratospermia, when following the optimal set-up conditions, have the same probability to allow and to reach successful impregnation and subsequent gravidity as men with monospermia. Key words: sperm, oocyte, teratospermie, embryo quality, implantation, gravidity 10
OBSAH 1 Úvod 12 2 Cíl práce 14 3 Literární přehled 15 3.1 Vznik a vývoj pohlavních buněk gametogeneze 15 3.2 Zrací dělení pohlavních buněk meióza 15 3.2.1 Význam meiózy 15 3.2.2 Dělení meiózy 16 3.2.2.1 První zrací (heterotypické) dělení meiózy 16 3.2.2.2 Druhé zrací (homotypické) dělení meiózy 17 3.3.1 Průběh spermatogeneze 18 3.3.2 Faktory účastnící se spermatogeneze 19 3.4 Spermie 20 3.4.1 Stavba a hlavní komponenty spermie 21 3.5 Oogeneze 25 3.5.1 Průběh oogeneze 25 4 Materiál a metodika 27 4.1 Materiál 27 4.2 Metodika 27 4.2.1 Metody k získání oocytů 27 4.2.2 Metody k získání spermií 29 4.2.3 Metody k získání embryí 34 4.2.4 Kultivace a kontrola embryí 35 4.2.4.1 Kultivace 35 4.2.4.2 Kontrola a hodnocení embryí 36 4.2.5. Metody k získání informace o implantaci (nidaci) embrya 40 4.2.6 Metoda k získání informace o následné graviditě 41 4.2.7 Metody statistického zpracování dat 42 5 Výsledky 43 6 Diskuze 52 7 Závěr 55 8 Seznam literatury 56 8.1 Soupis zdrojů obrázků 59 8.2 Soupis zdrojů tabulek 60 9 Příloha 61 11
1 ÚVOD V roce 1978 po mnoha letech úsilí lékařů na různých místech světa se konečně ve Velké Británii narodila Luisa Brownová, první dítě po mimotělním oplodnění, tedy jak se říká ze zkumavky. Lékaři při tom čerpali ze zkušeností získaných na zvířatech. Bylo ale zapotřebí nashromáždit mnoho poznatků o dozrávání vajíčka, o složení tekutin, ve kterých se může embryo ve zkumavce dále vyvíjet, a o tom, jak připravit spermie, než se podařilo úspěšně završit proces mimotělního oplodnění také u člověka. Princip mimotělního oplodnění tedy IVF (in vitro fertilizace) není složitý: vyjmeme vajíčko z vaječníku, k němu přidáme spermie a následně vzniklé embryo vrátíme tam kam patří tedy zpět do dělohy. Metody asistované reprodukce a embryo transferu (které jsou nedílnou součástí této práce) nahrazují tu část oplození, která probíhá ve vejcovodu. Jejich úspěch vyžaduje splnění podmínek, jako je získání zralých oocytů z ovárií ženy po jejich hormonální stimulaci, či oplození těchto oocytů spermiemi in vitro, kultivace embryí anebo transfer embrya do vnitřních rodidel ženy. Všeobecně jsou hlavními předpoklady početí dítěte správná tvorba kvalitních spermií a hormonů stejně jako tvorba vajíčka. Mnohé současné studie dokazují pomalou, ale setrvalou tendenci ke snižování kvality mužského ejakulátu během posledních čtyř desetiletí. Příčin je mnoho (multifaktoriální patogeneze), patří mezi ně např. vysoká zátěž cévního systému v současné vyspělé euroamerické oblasti, zvýšený výskyt a tedy i účinek umělých estrogenů (ženských pohlavních hormonů) v prostředí i v organizmu muže. Problémy s plodností mají proto hlavně lidé z tzv. průmyslově vyspělých zemí. Vědci pod vedením prof. Jiřího Rubeše z Výzkumného ústavu veterinárního lékařství v Brně provedli na skupině dobrovolníků v Praze studii, která se týkala vlivu znečištěného ovzduší na kvalitu spermií a dle které důsledkem prokázaných změn fragmentace DNA může být i snížená schopnost spermií k oplodnění. Mužský faktor samotný je za problémy s plodností, které postihují téměř každou pátou partnerskou dvojici odpovědný ve 33 % a na příčinách problémů s plodnosti páru se podílí nejméně v 53 %. Proto bývá při problémech s plodností prováděno základní andrologické vyšetření muže. Jedná se o vyšetření spermatu jehož součástí je hodnocení morfologie spermií. Dle striktních kritérií hodnocení morfologie spermií vytvořených Krugerem v roce (1986) pro účely asistované koncepce bylo zjištěno, že každá spermie vykazuje určitý stupeň morfologické odchylky, a měla by být hodnocena jako abnormální. Na základě biologicky relevantní spojitosti mezi takovýmito odchylkami a schopností fertilizace in vivo a in vitro však byla stanovena hranice normy 14 % morfologicky normálních spermií. 12
Dle Světové zdravotnické organizace (WHO) je teratospermie definována jako: MAI index = multiple anomalies index (index mnohočetných anomálií), nebo TZI index = teratozoospermia index (index teratozoospermie). Jedná se o průměrný počet defektů spermie, který je považován za index o vysoce prediktivní hodnotě na fertilitu muže. 13
2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo vyhodnotit vliv mužské teratospermie (patologické morfologie spermií) na kvalitu lidských embryí, jejich implantaci, následnou graviditu a zjistit zda existují v jednotlivých hodnotách teratospermií na daná počáteční vývojová stádia embryí průkazné rozdíly či nikoli. 14
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Vznik a vývoj pohlavních buněk gametogeneze Vývoj člověka čili ontogenezi lze rozdělit na období prenatální a postnatální. Prenatální vývoj člověka začíná spojením ženské pohlavní buňky: vajíčka (oocytu) a mužské pohlavní buňky: spermie. Nový jedinec tedy vzniká splynutím samčí a samičí pohlavní buňky za vzniku jediné buňky zvané zygota. Pohlavní buňky se vyvýjejí z tzv. primordiálních gonocytů procesem gametogeneze (gonogeneze) v pohlavních žlazách (gonádách), které jsou zároveň místem pro jejich výživu a ochranu (Laštůvka, 2004). Gametogeneze je tedy proces formování a vývoje specializovaných zárodečných buněk, nazývaných gamety. Je to pochod, který se týká chromozomů i cytoplazmy zárodečných buněk a připravuje pohlavní buňky pro fertilizaci. V jejím průběhu se snižuje počet chromozomů na polovinu a mění se tvar buňky (Vacek, 1992). Primordiální zárodečné buňky (primordinální gonocyty, prapohlavní buňky) které jsou předchůdci budoucích buněk pohlavních, se od ostatních somatických buněk odlišují již v časných stádiích embryonálního vývoje a mohou z nich vznikat jen buňky pohlavní. Jsou-li zničeny, je jedinec sterilní (Rosypal a kol., 1998). Migrují z ektodermu (třetí týden zárodečného vývoje) přes extraembryonální endoderm (pátý týden) do primordia budoucích gonád neboli do zárodečné rýhy. Z této rýhy se pak vyvíjí kortex budoucí gonády. Pokud je přítomen chromozom Y, pak se v sedmém týdnu vývoje vyvine primordium pro varlata, pokud chybí v osmém týdnu se objeví primordium pro vaječníky. Primordiální gonocyty se v gonádách stávají zdrojem pohlavních buněk, které z nich vznikají množením, růstem a zracím, tj. redukčním dělením. Vzhledem k tomu, že existují rozdíly mezi vývojem vajíčka a spermií, hovoříme zvlášť o vývoji spermií: spermatogenezi a o vývoji vajíček: oogenezi (Sládeček, 1986). I když mezi vývojem samčích a samičích pohlavních buněk, tj. mezi spermatogenezí a oogenezí, existují rozdíly, související s podstatně rozdílným konečným utvářením a úlohou gamet různého pohlaví, jejich zrací dělení probíhá v zásadě shodně (www.embryology.ch/anglais/cgametogen/spermato02.html#aubau). 3.2 Zrací dělení pohlavních buněk meióza 3.2.1 Význam meiózy Meióza (z řeckého slova pro zmenšení) byla objevena v roce 1883. Jedná se o speciální typ buněčného dělení, v jehož průběhu je naprosto přesně redukován počet chromozomů na polovinu, což je nezbytný krok při tvorbě gamet. Výchozí diploidní buňky se tak stávají buňkami haploidními, přičemž současně se charakteristickým způsobem mění cytoplazma pohlavních buněk. Redukce je nezbytná, neboť splynutím vajíčka a spermie 15
(s polovičním množstvím původního počtu chromozomů) dojde k obnovení diploidního počtu chromozomů v buňkách embya (Alberts et al., 1998). Meióza zajišťuje nejen přesný přenos genetické informace do zralých pohlavních buněk a jejich prostřednictvím do dalších pokolení, ale též genetickou variabilitu a proměnlivost těchto pokolení novými kombinacemi dědičného materiálu (Vacek, 2006). Na vytváření nových kombinací se podílejí kromě rekombinace jednotlivých úseků chromatid při překřížení (crossing-over) v pachytenním stadiu také rekombinace jednotlivých chromozomů v rámci chromozomových sad na konci prvního zracího dělení (Vacek, 1992). Meióza je modifikovanou mitózou; je mnohem komplikovanější (probíhá ve dvou po sobě následujících děleních označovaných jako meióza I. a meióza II. nebo také jako dělení heterotypické a dělení homotypické ) a trvá mnohem déle než mitóza (u lidských oocytů může trvat až 50 let) (Jelínek a Zicháček, 1998). 3.2.2 Dělení meiózy 3.2.2.1 První zrací (heterotypické) dělení meiózy (viz obr. 1) Tvoří plynulý sled událostí, který je tradičně rozdělován do: 1. Profáze, jež se dělí na pět stadií: a) leptotene b) zygotene c) pachytene d) diplotene e) diakineze a během níž jsou všechny chromozomy zreplikovány. Vznikají tak dvě sesterské chromatidy, které spolu zůstávají spojeny po celé dělení a rozcházejí se až ve druhém meiotickém dělení. Každý replikací vzniklý chromozom se páruje se svým homologem za vzniku struktury zvané bivalent, která obsahuje čtyři chromatidy (tetrády). Profáze je charakteristická reorganizací genetické informace každého chromozomu v gametě a napomáhá vzniku jedinců se zcela novým uspořádáním genů. Tento důležitý proces nazývaný crossing-over (překřížení) umožňuje rekombinaci genů maternálních a paternálních. 2. Metafáze I., která začíná vymizením jaderného obalu. Po vytvoření dělícího vřeténka zaujmou chromosomy metafázního postavení v ekvatoriální rovině s centromerami orientovanými k opačným pólům vřeténka a jsou připraveny k rozestupu. 3. Anafáze I., kdy chromosomy putují k protilehlým pólům buňky avšak nedochází k oddělení chromatid, nýbrž k oddělení homologních chromosomů dočasně spárovaných ve dvojice. Z tetrád se stávají diády. Každý z těchto chromosomů má obě chromatidy rekombinované na podkladě crossing-overu v předchozím stadiu. Jádra takto vzniklých buněk mají poloviční počet chromosomů. 4. Telofáze I., při níž se u spermatogeneze na rozdíl od oogeneze zformuje obal jádra. Po relativně krátkém období (interkinezi) nastupuje druhé zrací dělení. Interfáze v pravém slova smyslu neexistuje, neboť nedochází k reduplikaci chromatid a ke zdvojení obsahu 16
DNA (Vacek, 2006). 3.2.2.2 Druhé zrací (homotypické) dělení meiózy (viz obr. 2) obr. 1: první dělení meiózy se v podstatě neliší od mitózy. Chromosomů je v profázi druhého zracího dělení haploidní počet. Každý je složen ze dvou téměř oddělených chromatid jež jsou v místě kinetochory spojeny, takže tvarově připomínají písmeno X (Vacek, 2006). Po krátké profázi II. následuje metafáze II. v níž se chromozómy v podobě diád uspořádají do ekvatoriální roviny (Sládeček, 1986). V anafázi II. se sesterské chromatidy úplně oddělují a rozcházejí k opačným pólům buňky. Nakonec má každé telofázní jádro jedinou chromatidu ze čtyř, které tvořily původní tetrádu (Alberts et al., 1998). Výsledkem jsou buňky, jejichž jádra mají poloviční počet chromosomů a tedy poloviční obsah DNA. obr. 2: druhé dělení meiózy 17
3.3 Spermatogeneze Zjednodušeně lze tento sled událostí popsat jako kaskádu procesů na jejímž začátku stojí primitivní zárodečná buňka (spermatogonie), která dá procesy dělení a zrání vzniknout velkému množství zralých spermií. Vývoj samčích pohlavních buněk je zahájen nástupem puberty a pokračuje celý život (www.embryology.ch/anglais/cgametogen/ spermato02.html#aubau). Probíhá ve varleti. A to v zárodečném epitelu semenotvorných kanálků v nichž nejdůležitější roli hrají Sertoliho buňky. Ty mají půrnou, vyživovací a ochrannou funkci, obklopují vývojová stadia budoucích spermií a sekretují látky nezbytné pro jejich zdárný vývoj. Ten trvá přibližně 64 dní (Vacek, 1992). Mužská pohlavní žláza (testis) vzniká u embrya za přítomnosti chromozomu Y a její vývoj nastává, kromě jiných faktorů, hlavně pod vlivem testosteronu. Ten je produkován Leydigovými intersticiálními buňkami, které vycestovávají z mezenchymu zárodečné rýhy a svoji aktivitu zahajují v sedmém týdnu zárodečného vývoje. Druhá vlna aktivity těchto buněk přichází v období puberty. Vede k dozrání epitelia gonád, růstu a formování lumen v semenotvorných kanálcích, zrání a tvorbě spermatických buněk (www.embryology.ch/anglais/cgametogen/spermato 01.html#einleitung). 3.3.1 Průběh spermatogeneze Spermie se vyvíjí z diploidních primordiálních gonocytů, které vznikly v různých částech zárodku během embryonálního vývoje a přesunuly se do základů pohlavních žláz (gonád). Zrání zárodečných buněk začíná v pubertě (mezi 13. 16. rokem) a pokračuje do pozdního stáří (Moore, Persaud, 2002). Procesem mitotického dělení vznikají spermatogonie a z nich následně spermatocyty I. řádu. Spermatogonie, které dřímaly v semenotvorných kanálcích varlat od fetální periody vývoje, zvyšují v pubertě svůj počet. Po několika mitotických děleních spermatogonie rostou a podléhají procesům, které je mění v primární spermatocyty, největší ze zárodečných buněk v semenotvorných kanálcích. Z primárního spermatocytu procesem spermatogeneze vznikají 4 spermie (viz obr. 3). Navazuje první fáze meiózy při níž každý primární spermatocyt postupuje redukční dělení za vzniku dvou spermatocytů II. řádu (Vacek, 1992). Následně probíhá u těchto sekundárních spermatocytů druhé meiotické dělení a výsledné dceřiné buňky jsou, opět o polovinu menší, čtyři haploidní spermatidy. Nepohyblivé spermatidy se postupně procesem spermiogeneze (spermiohistogeneze) promění ve čtyři zralé spermie (Laštůvka, 2004). V okamžiku dovršení spermiogeneze se spermie, jež ke svému vývinu potřebují teplotu o 2-3 C nižší než je teplota tělesná, uvolňují do lumen semenotvorných kanálků (ductus epididymidis) kde dozrávají, tj. nabývají schopnosti pohybu a fertilizace (schopnost oplození). V průběhu celého života se v semenotvorných kanálcích tvoří denně okolo 100 miliónů spermií. 18
Celý průběh spermatogeneze (zahrnující i spermiogenezi) tedy vývoj od prekurzorové buňky po zralou gametu je mnohem kratší (trvá přibližně dva měsíce) než u oogeneze (http://genetika.wz.cz/gametogeneze.htm). obr. 3: průběh spermatogeneze 3.3.2 Faktory účastnící se spermatogeneze Mezi nejdůležitější faktory které jsou nezbytné pro zdárný průběh spermiogeneze patří testosteron. Androgen, který je u muže secernován z 95% ve varlatech Leydigovými buňkami a z 5% v kůře nadledvin. Jeho koncentrace je v plazmě u muže asi 15krát vyšší než u ženy a ve stáří pomalu klesá. V krvi se váže z 98% na bílkoviny (albumin a globulin) podobně jako ostatní steroidy (Silbernagl a Despopoulos, 2004). Testosteron iniciuje nástup puberty a zrání pohlavních buněk, má vliv na růst a funkci genitálií, prostaty a semenných kanálků a řídí rozvoj mužských sekundárních pohlavních znaků. Dostatečná sekrece testosteronu je u muže předpokladem pro normální potenci (schopnost oplodnění) a schopnost pohlavního styku (Vacek, 1992). Folikuly stimulující hormon (FSH) a luteinizační hormon (LH), jsou hormony adenohypofýzy. Luteinizační hormon působí na sekreci testosteronu z Leydigových buněk. FSH stimuluje v Sertoliho buňkách sekreci 19
inhibinu a indukuje v nich expresi vazebného proteinu pro androgeny, jehož přítomnost je předpokladem pro účinek testosteronu na spermatogenezi. Kromě toho indukuje FSH expresi receptorů pro LH na Leydigových buňkách (www.ucalgary.ca/uofc/eduweb/ virtualembryo/dev_biol.html). Seminální růstový faktor (SGF) je nejdůležitější z růstových faktorů vylučovaných Sertoliho buňkami. Během fetálního a postnatálního vývoje stimuluje proliferaci somatických buněk a tvorbu krevních cév ve varlatech. V dospělosti Sertoliho buňky odpovídají na svou vlastní produkci SGF tvorbou sulfátového glykoproteinu 2 (SGP- 2). SGP-2 je hlavní produkt Sertoliho buněk v dospělosti, váže se na membránu spermatozoí a předpokládá se, že je chrání před buněčnou apoptickou smrtí (www.ucalgary.ca/uofc/ eduweb/virtualembryo/dev_biol.html). 3.4 Spermie Správná morfologie spermie a přítomnost všech jejích komponent jsou důležitým a nezbytným předpokladem pro úspěšné splynutí s vajíčkem a následný vývoj zárodku. (www.embryology.ch/anglais/cgametogen/spermato05.html#spermiohistogenese). Spermie (viz obr. 4) je vysoce specializovaná pohlavní buňka skládající se z hlavičky, středního oddílu a vláknitého bičíku (Gardner et al., 2004). Hlavička obsahuje chromozomy, střední oddíl je energetickým centrem a bičík se skládá ze struktur zajišťujících pohyb spermie (Dylevský, 1990). Na celém povrchu je spermie pokryta buněčnou membránou (Vacek, 1992). V porovnání se somatickými buňkami obsahuje poloviční (haploidní) počet chromozomů (Moore, Persaud, 2002). Celkově měří spermie 64 70 µm (Řežábek, 1999), 40 50 µm z toho připadá na bičík (Vacek, 1992). Pohybuje se rychlostí 100 µm/s proti proudu a současně se šroubovitě otáčí kolem své podélné osy (Roztočil a kol., 2001). obr. 4: spermie 20
3.4.1 Stavba a hlavní komponenty spermie (viz obr. 5) obr. 5: hlavní komponenty spermie 1 Plazmatická membrána A Hlavička 2 Vnější akrozomální membrána B Krček 3 Akrozom C Střední část 4 Vnitřní akrozomální membrána D Hlavní část bičíku 5 Jádro E Koncová část bičíku 6 Proximální centriola 7 Zbytek distální centrioly 8 Vnější fibrózní vlákna 9 Mitochondrie 10 Axonema 11 Terminální disk (anulus) 12 Prstencovitá vlákna (ring fibers) 1. Cytoplazmatická membrána Pokrývá celou spermii, je acidorezistentní s vysokou schopností permeability, jež zabezpečuje látkovou výměnu spermií. Je bohatá na cystin, histidin a arginin (Gamčík, Kozumplík, 1984). Na povrchu membrány jsou vázány proteiny a glykoproteiny, které mají významnou úlohu pro oplozující schopnost spermie. Stabilizují ji nad akrozomálním váčkem a zabraňují tak předčasnému uvolnění enzymů v něm obsažených. Chrání spermie před fagocytózou buňkami ženských pohlavních cest a zabraňují shlukování spermií (aglutinaci) v ejakulátu (Vacek, 1992). 21
2. Hlavička spermie (caput) Vprocesu oplodnění má významnou funkci. Jejím úkolem je přenést dědičný materiál lokalizovaný v nukleoplazmě (Gamčík, Kozumplík, 1984). Hlavička spermie je oploštělá, 5 10 µm dlouhá (Sova, 1990), oválného tvaru při pohledu shora, hruškovitého při pohledu ze strany (Klika, 1980). Formace a organizace hlavičky spermie je složitý proces postupných morfologických a molekulárních změn v jádře a akrozomu ve spolupráci s hlavním svazkem mikrotubulů (manchette). Spolu s manchette se těchto změn účastní další dvě struktury a to akroplaxom a perinukleární théka (Toshimori a Chizuru, 2003). Hlavička spermie kompletně obklopená plazmatickou membránou je od bičíku oddělena charakteristickou zónou tzv. zadním prstencem (posterior ring) a lze ji rozdělit na akrozomální a postakrozomální oblast (Toshimori a Chizuru, 2004). Hlavní struktury a uspořádání hlavičky spermie (viz obr. 6) obr. 6: hlavní struktury hlavičky spermie Hlavička spermie obsahuje: Haploidní jádro vyplněné chromatinem obsahujícím převážně DNA. Té je ve zralých spermiích proti ostatním tělním buňkám poloviční množství. Změna obsahu DNA, stejně jako její poškození, vede k poruchám až ztrátě oplozovací schopnosti spermií. Jádro obaluje dvojvrstvá při bázi hlavičky o něco hrubší nukleární membrána. 22
Akrozóm který zabírá téměř 50% plochy hlavičky. Dle Krugerovi striktní morfologie musí tvořit 40-70 % hlavičky spermie (Gardner et al., 2004). Je to cytoplazmatický útvar čepičkovitého tvaru, který se nachází mezi buněčnou a jadernou membránou. Je složen z mukopolysacharidů, obsahuje fruktózu, manózu, galaktózu, ale i lipidy, kalium, kyselou a alkalickou fosfázu aj. (Gamčík, Kozumplík, 1984). V akrozómech spermií byla zjištěna také proteináza a další proteolytické enzymy (akrozin a katepsin v zadní části, hyaluronidázu v přední části) nezbytné k průniku přes zonu pellucidu do vajíčka. Akrozóm spermie je citlivý na osmotické změny vnějšího prostředí a nemá tak pevnou konzistenci jako ostatní části hlavičky (Toshimori a Chizuru, 2004). Akroplaxom Jedná se o komplex filament aktinu a keratinu ležící na distálním konci akrozomu, který se podílí na tvarování hlavičky, elongaci a formování akrozomu. Manchette Jest svazkem mikrotubulů, jež hraje úlohu v prodlužování hlavičky i jádra a v transportu molekul nezbytný pro kondenzaci jádra a tvorbu bičíku. Načasování jeho rozvoje je velmi precizní (objevuje se v ranné fázi spermatid). Perinukleární théka Je esenciální cytoskeletální element obsahující značné množství různých molekul podílejících se na procesech formování jádra a akrozomu a nezbytných také pro oplození jako např. oocyty aktivující faktor. Centrozom (mikrotubuly organizující centrum) a centriol Centrozom je oblast v buňce, kde dochází k tvorbě mikrotubulů a uvnitř se nachází pár malých organel zvaných centriol (Satananthan a kol, 1991). Lidská spermie má dvě centrioly (proximální a distální). Distální se podílí na tvorbě axonemy (osového vlákna) bičíku spermie během spermiogeneze (www.cellsalive.com/cells/amincell_archive.htm). Tato centra vytvářejí paprsčitou strukturu známou jako aster, které vytváří mitotické vřeténko, zodpovědného za segregaci chromozómů a rozdělení buňky (http://micro.magnet.fsu.edu/cells/centrioles/centrioles.html). Aster, v tomto případě nazývaný spermaster, se vytváří po oplození ve vajíčku díky centriolám vnesených otcem. Spermaster je naprosto esenciální strukturou nutnou pro pohyb prvojader a následné splynutí samčího a samičího genomu (Nakamura a kol, 2001). Přítomnost a správná funkčnost centriol jsou nezbytné pro normální průběh oplození a následný vývoj zárodku. Jakékoli morfologické abnormality v těchto strukturách vedou k neplodnosti, které nelze dost dobře odstranit ani použitím ICSI, neboť jsou-li centrioly v nepořádku, nemůže dojít ani k úspěšnému vývoji embrya. Boveriho klasická teorie oplození (r. 1900) říká, že neoplozená vajíčka získávají svůj centrozom ze samčích gamet. A jak se později zjistilo, platí to pro většinu druhů. Mitotické vřeténko savčích oocytů má sice centrozom a je astrální, válcovitého tvaru, složené 23
z množství mikrotubulů. Nemá však centrioly. Ty jsou neseny spermií. Postakrozomální čepička Je útvar obalující část jádra, kterou nepokrývá akrozóm. Na neporušené spermii je spojena s buněčnou membránou. Je mnohem odolnější proti vnějším vlivům než akrozóm (Gamčík, Kozumplík, 1984). Negativní ovlivnění všech výše zmiňovaných procesů a struktur může vést k výrazné změně morfologie spermatické buňky a v konečném důsledku vést k různým typům neplodnosti jako je např. teratozoospermie, při níž je deformováno jádro i akrozóm (Toshimori a Chizuru, 2004). 3. Krček (collum) Je poměrně krátký, měří jen 2 3 µm a obsahuje dva za sebou uložené ventrikuly, mezi nimiž je devět chord (příčně segmentovaných provazců) (Sova, 1990). Nachází se v zadní části hlavičky tvořené prstencem (posterior ring), v němž se jaderná dvojmembrána těsně stýká s vnější plazmatickou membránou (Sládeček, 1986). Je motorickým centrem bičíku spermie, ve kterém se chemická energie přeměňuje v kinetickou (Klika, 1980). 4. Bičík spermie (cauda) Bičík zprostředkovává transport spermie na místo oplodnění. Je nástrojem pohybu. Důležitou úlohu přitom má mitochondriální aparát (vyrábí energii ve formě ATP) a komplex axiálních vláken. Jde o místo kde se tato energie mění na energii mechanickou, tedy na pohyb spermie (Gamčík, Kozumplík, 1992). Přibližná délka je 45 µm (Gardner et al., 2004). Ve střední části se okolo bičíku hromadí četné mitochondrie, které se nazvájem dotýkají a vytvářejí mitochondriální pochvu, sloužící jako zdroj energie (Sládeček, 1986). 24
3.5 Oogeneze Proces vzniku vajíčka (oocytu). Probíhá v prenatálním období a poté pouze od puberty do menopauzy. Vývoj od prekurzorové buňky po zralou gametu činí i přes 40 let. Procesem oogeneze vzniká z primárního oocytu jediný zralý oocyt, přičemž pólová tělíska zanikají (viz obr. 7). Oocyt je haploidní samičí pohlavní buňka. obr. 7: průběh oogeneze 3.5.1 Průběh oogeneze Oogeneze probíhá částečně v období prenatálního vývoje. Vajíčka se vyvíjejí z buněk ovariální kůry (oogonií). Tyto drobné buňky s velkými jádry jsou základními buňkami při vývoji folikulu. Pocházejí z primordiálních zárodečných buněk (gonocytů) jež prodělaly sérii asi 30-ti mitóz (Nussbaum a kol., 2004). Zárodečných buněk je v každém ováriu ženy před jejím narozením přítomno přes půl milionu (Veeck, 1999). Oogonie vstupují kolem třetího měsíce prenatálního vývoje do rozmnožovací fáze a začínají se vyvíjet v primární oocyty. Ty se do období pohlavní zralosti morfologicky příliš nemění. Ani počet oocytů I. řádu (vzniklý mitotickým dělením) se už pak během života více nezvětšuje. 25
Dnes je názor o stálém počtu oocytů před porodem zpochybňován zejména pracovníky kolektivu Dr. Jonathana Tylliho (http://www.sci.muni.cz/ptacek/reprodukce2.htm). V organismu ženy je v době porodu přítomno zhruba 2,5 miliónu oocytů dosahujících profáze prvního meiotického dělení (diplotene). Většina z těchto oocytů degeneruje. Ty, které nedegenerovaly, zůstávají v tomto diktyotenní stadiu po desetiletí. Nakonec dozrává pouze kolem 400 oocytů. Jakmile dosáhne žena pohlavní zralosti, v každém ovulačním cyklu se selektuje většinou jeden dominantní folikul a v něm přítomný oocyt I. řádu vstupuje do růstové fáze. Během ní dochází k mnohonásobnému zvětšování cytoplazmy (cytoplazmatický růst) a jádra. Ocyt I. řádu se zvětšuje až 10 000 krát a na konci růstové fáze vstupuje do prvního zracího dělení. Oocyt I. řádu se rozdělí tak, že jedna buňka se stane sekundárním oocytem (vajíčko), který obsahuje většinu cytoplasmy s organelami, a druhá buňka se stává prvním pólovým tělískem (pólocyt). Z každého oocytu I. řádu tak vzniká jeden velký oocyt II. řádu a jedna malá pólová buňka. Oocyt II. řádu prodělává druhé meiotické dělení. To se však dokončí pouze po fertilizaci (Nussbaum a kol., 2004). Z oocytu II. řádu vzniká ootida a buňka pólová. Současně se může dělit i první pólová buňka, takže ootida má na svém povrchu dvě až tři malé pólové buňky, které jsou postupně vstřebávány a vzniká tak zralé vajíčko ( viz obr. 8), neboli ovum s polovičním počtem chromozomů (Dylevský, 2007). obr. 8: schéma oocytu 26
4 MATERIÁL A METODIKA Materiálem pro tuto práci byli spermie mužů, vajíčka (oocyty) dárkyň, embrya z nich vzniklá a krev příjemkyň. Morfologie spermií byla posuzována mikroskopickým vyšetřením v andrologické laboratoři. Součástí práce byly metody asistované reprodukce, pomocí nichž jsme zajistiliy oocyty a embrya. Kvalita embrií byla hodnocena každý den jejich vývoje v laboratoři embryologické. Nezbytnou podmínkou dosažení gravidity žen byl také přenos kvalitního a životashopného embrya do dělohy ženy. Proces kultivace in vitro byl ukončen 6-tý den vývoje zamražením kvalitních embryí. Zda žena otěhotněla či ne, bylo zjištěno vyšetřením hcg z krve. Na závěr (8-mý týden gravidity) bylo ultrazvukovým vyšetřením potvrzeno, či vyloučeno pokračující těhotenství. 4.1 Materiál V této práci bylo nutné zajistit oocyty a spermie, jež dali (za použití metod asistované reprodukce) vzniknout embryím na základě jejichž kvality, implantace a následné gravidity byl hodnocen vliv teratospermie. Dále bylo potřeba zajistit krev příjemkyň k zhodnocení hladiny hcg, která je ukazatelem implantace embryí. Oocyty byly získány punkcí zralých folikulů (aspirací folikulární tekutiny) po předchozí hormonální stimulaci vaječníků dárkyň. Spermie byly získány zpracováním ejakulátů mužů přicházejících v páru s příjemkyněmi oocytů (recipientkami) v den odběru vajíček. Embrya byla získána metodikou ICSI. Krev byla získána odběrem venózní krve příjemkyň 14. - 17. den po embryotransferu. 4.2 Metodika 4.2.1 Metody k získání oocytů A) Hormonální stimulace ovariální činnosti Díky provokované stimulaci vaječníků prováděné injekčním podáním gonadotropinů jsme v organismu dárkyně stimulovali současný vývoj většího počtu folikulů a tím vyzrání většího počtu oocytů tzv. superovulaci. Použité preparáty obsahují folikuly stimulující hormon (FSH) a luteinizační hormon (LH) nazývané gonadotropiny. Jedná se o hormony předního laloku hypofýzy, která řídí činnost vaječníků. Ve snaze zabránit předčasnému prasknutí folikulů (uvolnění vajíček) ještě před jejich odběrem, aplikovali se současně tzv. agonisté nebo antagonisté GnRH. Tyto hormony (analoga gonadoliberinu) tlumí funkci hypofýzy a tím brání vyplavení hormonu, odpovědného za uvolnění vajíček z folikulu. Závěrečné vlastní dozrání všech vajíček bylo zajištěno podáním lidského choriogonadotropního hormonu (hcg). 27
B) Odběr vajíček (ovum pick-up) OPU: Den před OPU proběhla v embryologické laboratoři příprava, která zahrnovala: 1) Nahřátí Petriho misek určených k vyhledávání oocytů vložením do Labotecu. 2) Ekvilibraci misek s nakapaným Fertilizačním médiem (pro OPU) a Cleavage médiem (pro použití po ICSI) umístěním do inkubátoru Minc. OPU probíhala v celkové narkóze. Pochvou byla do vaječníku zavedena tenká jehla, jejíž hrot je dobře patrný na obrazovce ultrazvuku. Pomocí ní byla do zkumavek odsáta folikulární tekutina obsahující vajíčka (viz obr. 9). Ta se rozlévala do předem připravených Petriho misek. V laminárním boxu na výhřevné plotýnce pod stereomikroskopem byly vyhledány oocyty, zjištěn jejich počet a zhodnocena kvalita. Pomocí pipety byly vyhledané oocyty přemístěny do misky ekvilibrovaného fertilizačního média (FM). obr. 9: schéma punkce oocytů C) Denudace Slouží k odstranění kumulárních buněk z oocytů. Prováděla se cca za 2 hod. po odběru oocytů (OPU) pomocí enzymu hyaluronidázy a skleněných pipet striktních průměrů. obr. 10: oocyt před denudací obr. 11: zralý oocyt po denudaci 28
Postup: Do fertilizačního roztoku s hyázou byl přenesen COC: cumulus-oocyt-complex tj. oocyt obklopený kumulárními buňkami (viz obr. 10) a pomocí pipety (200 µl) byly opakovaným promýváním uvolněny kumulární buňky. V čistém fertilizačním médiu byly oocyty dále denudovány pomocí skleněné pipety 200µm. Skleněnou pipetou150 µm z nich byly odstraněny zbytky buněk corona radiata. Na závěr se zhodnotila zralost a kvalita denudovaných oocytů: MII (zralý oocyt) (viz obr. 11): vhodný pro mikromanipulaci (ICSI) Degenerovaný oocyt: mikromanipulace se neprováděla GV (germinal vesicul): mikromanipulace se neprováděla MI (nezralý oocyt) mikromanipulace byla provedena, ale kultivovalo se odděleně od zralých oocytů. 4.2.2 Metody k získání spermií Spermie nutné k oplození lidského vajíčka (In Vitro Fertilizaci) metodou ICSI byly získány zpracováním ejakulátu metodou Swim-up. Zpracování bylo provedeno po zkapalnění ejakulátu a po předchozím vyhodnocení spermiogramu (viz tab. 1). Ten představuje základní laboratorní metodu vyšetření mužské fertility a umožňuje klasifikovat závažnost podílu mužského faktoru na neplodnosti páru (Dvořáček, 1999). V obou případech zpracování byly zkumavky s ejakulátem vždy řádně označeny příjmením a jménem partnera a příjmením a jménem partnerky, pro kterou byl ejakulát zpracován. tab. 1: parametry vyhodnocení spermiogramu dle WHO Normální hodnoty (normospermie) Abnorm. hodnoty Abnormality Objem 2-6 ml < 2 ml > 6 ml < Oligospermatismus > Hyperspermatismus ph 7,2 7,8 < 7,2 > 7,8 Zkapalnní normální Abnormální (+, ++, +++, ++++) Koncentrace 20 mil / ml < 20 mil/ml Oligospermie Celková konc. 40 mil / celkový obj < 40 mil Oligospermie Celková pohyb. > 50 % < 50 % Asthenospermie Progresivní pohyb. > 25 % < 25 % Asthenospermie Morfologie > 15 % < 15 % Teratospermie Leukocyty < 1 mil / ml > 1 mil / ml Leukocytospermie 29
A) Vyhodnocení spermiogramu (SPG) Jedná se o základní andrologické vyšetření ejekulátu. Kvalita a standardizace jeho provedení je zásadní a je řízeno WHO nomenklaturou. V této práci byli spermiogrami posuzovány dle 4-tého vydání WHO standardů. Před odběrem (vyšetřením spermatu) byla klientům doporučována 2-3 denní pohlavní abstinence. Sperma bylo zpracováno do 45 minut po odběru (Manuál a metodiky andrologie, Reprofit International, 2009). Použité pomůcky a spotřební materiál: 1) odběrová nádobka 2) injekční stříkačka + růžová jehla 3) pipeta o objemu 20-200 µl 4) špičky 5) počítací Maklerova komůrka s krycím sklíčkem 6) mikroskop Nikon Eclipse E200 Postup: Odběry byly prováděny v k tomuto určených prostorách: tzv. odběrové místnosti. Kelímek s ejakulátem byl umístěn do termoboxu B-15, kde byl ponechán 15-45 minut při teplotě 37 C ke zkapalnění. Následovalo: A) Makroskopické hodnocení vzhledu ejakulátu, objemu (injekční stříkačkou), viskozity a ph. B) Mikroskopické vyšetření bylo provedeno po odebrání 20 50 µl dobře promíchaného ejakulátu v Maklerově počítací komůrce (viz obr. 12) pod mikroskopem (objektiv 20-40x). Hodnoceny byly vybrané parametry spermiogramu (viz tab. 2). tab. 2: vybrané parametry SPG dle WHO Koncentrace spermií mil/ml Celkový pohyb % Progresivní pohyb % Normální morfologie % Leukocyty a vývojové buky spermiogenetické ady ano / ne 30
Koncentrace spermií (množství spermií na jeden mililitr) Byla hodnocena v Maklerově počítací komůrce. Ta je tvořena čtvercem, rozděleným na menší čtverečky (viz obr. 13). Kapka spermatu se kápla na podložní sklíčko komůrky, na němž je nakreslen čtverec a přikryla se krycím sklíčkem. Dle počtu spermií se spočítal počet spermií např. buď v: V 1 čtverci = 10 spermií x 10 = 100 mil / ml V 10 čtvercích = 10 spermií = 10 mil /ml Ve 100 čtvercích = 10 spermií dělíme 10 = 1 mil /ml obr. 12: Maklerova komůrka obr. 13: schéma obrazu v mikroskopu Motilita (pohyblivost) Byla hodnocena do 3-5 min, kdy spermie mají tendenci migrovat z periférie. Byl spočítán počet všech pohyblivých spermií a poté počet progresivních spermií. Vyděleno celkovým počtem spermií, násobeno 100 nám vyšla hodnota v %. Morfologie Ne všechny spermie, které jsou produkovány, jsou normálně vyvinuté. Morfologické posouzení ejakulátu je jedním ze základních kritérií spermatoanalýzy zaměřené na stanovení kvalitativních a kvantitativních rozdílů v normálně a patologicky utvářených spermiích (Věžník, 2004). Při hodnocení musí být brána v úvahu celá spermie (Věžník, 2000). Ve všech případech této práce bylo morfologickému vyšetření podrobeno sperma čerstvé. Všechny pomůcky, které přišly do styku se spermatem, byly sterilní, chemicky čisté a měly přibližně stejnou teplotu jako vyšetřované sperma. Morfologie byla hodnocena na 50-200 pohyblivých spermiích ve zředěném vzorku (podle spermiogramu tak, že byla 1-2 spermie na zorné pole). Zřeďovacím roztokem byl fyziologický roztok NaCl. Hodnotily se: normální a abnormální formy hlavičky, krčku a bičíku dle 4-tého vydání WHO standardu, které obsahuje tzv. Krugerova striktní kriteria (viz tab. 3) 31
Názvy abnormalit patologických spermiogramů: tab. 3: názvy abnormalit patologických spermiogramů Normospermie Normální ejakulát dle parametr WHO Oligospermie Koncentrace spermií nižší než 20mil/ml. Oligospermia gravis Koncentrace spermií< 5 mil/m Asthenospermie Celková motilita spermií je nižší než 50%. Progresivní motilita je nižší než 25% Teratospermie Mén než 15 % spermií s normální morfologií (T) Oligoasthenoteratospermie Kombinace všech 3 výše zmínných patologií (OAT) Oligoasthenospermie Kombinace snížené koncentrace spermií a motility (OA) Azoospermie V ejakulátu jsou pítomny pouze vývojové buky Aspermie V ejakulátu nejsou pítomny žádné spermie ani vývojové buky Nekrospermie V ejakulátu jsou pítomny pouze spermie mrtvé ( bez pohybu) 0 % pohyblivých spermií Kryptozoospermie nález spermií až po centrifugaci Aspermatismus Není žádný ejakulát Oligospermatismus Objem ejakulátu mén než 2 ml Hyperspermatismus Objem ejakulátu více než 5 ml http://www.androcare.cz/sex.html Odchylky v morfologii hlavičky: 1) zahrocená hlavička 5) 7) amorfní spermie 2) hruškovitá hlavička 8) vakuolizovaná hlavička 3) kulatá hlavička bez akrozomu 9) malý akrozóm 4) kulatá hlavička s akrozomem obr. 14: patologie hlaviček 32
Odchylky v morfologii krčku a středního oddílu: 1) ztenčelý krček, 2) ztluštělý krček, 3) normální krček, 4) ohnutý krček, 5) asymetrická inserce, 6) velká cytoplazmatická kapka (patologie je to jen pokud je větší než 1/3 hlavičky) obr. 15: patologie krčků Odchylky v morfologii bičíku: 1) spermie s krátkým bičíkem 2) spermie se zlomeným bičíkem 3) spermie se stočeným bičíkem obr. 16: patologie bičíků 33
B) Metoda Swim up (vycestování spermií) představuje proces promývání a třídění spermií. Do sterilní konické zkumavky, předem řádně označené, jsme přenesli pomocí sterilní injekční stříkačky zkapalněný ejakulát. Přidali 1-3 ml ekvilibrovaného Sperm média. Pasteurovou pipetou dobře promíchali a vložili do centrifugy na 10 minut /1,8 rpm. Odstranili supernatant pomocí Pasteurovi pipety a sediment opět promíchali Sperm médiem. Vložili do centrifugy na 10 minut / 1,4 rpm. Opět odstranili supernatant. Pelet spermií byl zakapnut Sperm médiem 20 800 µl dle spermiogramu a vložen do inkubátoru (s CO2 / 37 C) na 15-30 minut. Po vycestování spermií jsme supernatant stahli do sterilní zkumavky a v Maklerově komůrce provedli vyhodnocení vycestovaných spermií. Vzorek byl až do doby použití k ICSI uchováván v inkubátoru s CO2 při teplotě 37 C. Použité pomůcky a spotřební materiál: 1) sterilní konická zkumavka 2) sterilní injekční stříkačka 3) ekvilibrované Sperm médium 4) Pasteurova pipeta 5) centrifuga 6) inkubátor 7) sterilní zkumavka 8) Maklerova komůrka 4.2.3 Metody k získání embryí ICSI Hlavní metodou získání embryí v této práci bylo ICSI (Intra Cytoplasmatic Sperm Injection). Metoda ICSI - díky které dochází k plození lidských vajíček a představuje nejnáročnější část celého procesu fertilizace in vitro - využívá mikromanipulační systém, který mění nedokonalý mechanický pohyb rukou na jemný a přesný pohyb mikromanipulačních nástrojů pomocí hydraulických, resp. elektrických převodů. Embryolog drží na konci tenoučké pipety jediné lidské vajíčko a jehlou (sedmkrát tenčí než průměr lidského vlasu) individuálně zavede do cytoplasmy zralého (MII) oocytu jedinou spermii. Pro fixaci oocytů a pro injekci spermií se používají jednorázové, sterilní netoxické skleněné kapiláry. ICSI dává šanci mužům, kteří nemají dostatečně kvalitní sperma a představuje tak řešení problému neschopnosti počít dítě, je - li příčinou andrologický faktor (oligospermie, astenospermie, teratospermie apod.). 34
tab. 4: použité pomůcky a spotřební materiál Použité pom cky a spot ební materiál: Petriho misky plastové Falcon 4 ks Hyaluronidase Cook 0,30 ml PVP 10 % Cook 0,01 ml Holding pipeta Microtech 1 ks ICSI pipeta Microtech 1 ks Manipulaní pipeta 200, 300 um Microtech 1 ks Manipulaní pipeta 150 um Microtech 1 ks Mineral oil FertiPro, Cook 10 ml Použité p ístroje Použité přístroje Mikromanipulátor Eppendorf s vyhřívaným skleněným stolkem (TOKAI HIT), Stereomikroskop Nikon Eclipse, CO 2 inkubátor (Labotect) a Hera cell (Heraeus), Laminární box Heraeus, Minc(Cook ) inkubátor zajišťující stálé složení plynné fáze a nepřerušenou teplotu kultivačního média, digitální fotoaparát pro fotodokumentaci. Popis metody ICSI Pomocí mikromanipulační jehly pro ICSI došlo k znehybnění spermie tak, že se mikromanipulační jehlou prudce seklo kolmo na bičík spermie o dno misky. Následně byla spermie nasáta do injekční pipety (vždy bičíkem směrem dovnitř ICSI jehly), která se přesunula do kapky s oocytem. Ten byl fixován pomocí holdingové pipety tak, aby pólové tělísko bylo v pozici 6 nebo 12. Po nastavení ICSI pipety do vhodné polohy byla spermie umístěna ke konci pipety a velmi jemně injikována do oocytu tak, že se cytoplazma oocytu aspirovala až do prasknutí oolemy. Následně byla spermie injikována i s aspirovanou cytoplazmou zpět do oocytu. Fertilizovaný oocyt byl uvolněn z holdingové pipety. Takto bylo postupováno analogicky u ostatních oocytů. Po provedení ICSI byly řádně oplozené oocyty přeneseny do ekvilibrovaného rýhovacího média (Cleavage medium) ve čtyřkomůrce. V této pak byly kultivovány do dalšího dne. 4.2.4 Kultivace a kontrola embryí 4.2.4.1 Kultivace Kultivační prostředí bylo zajištěno tekutými kultivačními médii (fertilizační médium, cleavage medium, blastocyst medium) saturovanými plynnou fází (směsný plyn: CO 2 : 6 %, O 2 : 5 %, N 2 : 89 % ). Stálé složení a nepřerušenou teplotu kultivačního systému zajišťovaly speciální inkubátory, zvané Minc. Embrya byla kultivována do nejvyššího stádia, jakého lze v laboratoři dosahnout (do tzv. blastocysty). Tato tzv. prodloužená kultivace umožňuje delší sledování vývoje embryí a vybrat nejkvalitnější embrya pro transfer. Sníží se tak pravděpodobnost zavedení embryí s omezenou schopností buněčného dělení. Embrya tak mají vyšší šanci na uchycení v děložní sliznici. 35
Dle stanovených kritérií byla nejčastěji pátý den kultivace vybrána nejlepší embrya na ET (embryotransfer). V den transferu tak byla embrya rozdělena na skupinu embryí určených pro ET a na skupinu určenou pro další kultivaci. Posledním dnem kultivace byl den šestý. Déle kultivace nebyla prodlužována, neboť v tento den by embrya měla být ve stádiu blastocysty, což je hraniční vývojové stádium, které lze úspěšně kultivovat v podmínkách in vitro. Kultivace embryí byla tedy šestý den zakončena zamrazením kvalitních blastocyst. 4.2.4.2 Kontrola a hodnocení embryí Po dobu kultivace byla embrya kontrolována a hodnocena každý den v ranních hodinách. Jejich hodnocení bylo řádně zaznamenáváno do embryologických protokolů. Den druhý, tj. 48 hod po odběru a den třetí, tj. 72 hod po odběru, byla embrya hodnocena podle počtu blastomer a stupně fragmentace, granulace a vakuolizace cytoplazmy. Na základě těchto charakteristik byla jednotlivá embrya ohodnocena stupněm kvality, tzv. grade a rozdělena do skupin s nejvyšším A či nižším B a nejnižším C grade. Den čtvrtý byla embrya hodnocena dle stupně kompaktace a kavitace. Pátý a šestý den vývoje jsme u blastocyst hodnotili trofoektoderm (TE), ze kterého se vyvýjí chorin a placenta, blastocel a vnitřní buněčnou masu (ICM). Ta tvoří základ vlastního embrya. Na základě těchto charakteristik byla jednotlivá embrya také rozdělena do skupin s nejvyšším A či nižším B případně nejnižším C grade. Hodnocení embryí - Den 1 Hodnotili jsme prvojádra (PN). Za 16-18 hodin po oplození byla provedena kontrola fertilizace. Oplození bylo hodnoceno obr. 17: řádně oplozený oocyt (2PN) obr. 18: abnormálně oplozený oocyt (3PN) na základě počtu vytvořených prvojader (PN) a počtu pólových tělísek (PB) v perivitelinním prostoru (PP). Výsledky oplození v den 1 byly: 36
a) 2PN (řádně oplozený oocyt), kdy byla v cytoplasmě patrna 2 PN a v PP vyděleny 2 PB (viz obr. 17). b) 0PN (neoplozený oocyt), kdy nebyla v cytoplasmě patra PN a pouze v PP bylo 1 PB c) 1PN (aktivovaný oocyt), kdy bylo v cytoplasmě patrno pouze 1PN a v PP pouze 1 PB, nebo kdy bylo v cytoplasmě patrno pouze 1PN a v PP vydělena 2PB (pravděpodobně oplozený oocyt, po syngamii jader, což bylo ověřeno další kultivací, neboť pokud se po dalších 24 hod embryo nedělilo, pak oocyt nebyl oplozen). d) Abnormálně oplozené oocyty a degenerované oocyty (viz obr. 18). Hodnocení embryí - Den 2 Hodnotili jsme počet blastomer. Jak se preembryo vyvíjí, podstupuje rýhovací proces, v němž se buňky dělí na menší buňky (blastomery). Po dvou dnech vývoje obsahuje embryo 4 blastomery (viz obr. 19). obr. 19: 4-buněčné embryo druhý den kultivace Hodnocení embryí - Den 3 Hodnotili jsme počet blastomer. Za normální počet blastomer jsme třetí den vývoje embrya považovali 8 blastomer (viz obr. 20). Tolerovat se dá 7 i 9 buněk. Tak tomu bylo i v této práci. obr. 20: 8-mi buněčné embryo třetí den kultivace 37