Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Optimalizace metod elektroforézy proteinů pro identifikaci odrůd pšenice (Triticum aestivum L.) Metodika vypracována jako výstup projektu NAZV QF 3050: Vývoj metod objektivní identifikace odrůd zemědělských plodin Autoři: Ing. Jana Bradová, Ing. Antonín Šašek, CSc. Prosinec 2007
OPTIMALIZACE METOD ELEKTROFORÉZY PROTEINŮ PRO IDENTIFIKACI ODRŮD PŠENICE (TRITICUM AESTIVUM L.) Metodika vypracována jako výstup projektu NAZV QF 3050: Vývoj metod objektivní identifikace odrůd zemědělských plodin Ing. Jana Bradová Ing. Antonín Šašek, CSc. Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha 2007 http://www.vurv.cz Text: 2007 J. Bradová, A. Šašek Foto: 2007 J. Bradová Grafická úprava: 2007 Mgr. M. Sýkora Vydáno bez jazykové úpravy ISBN: 978-80-87011-10-2
OPTIMALIZACE METOD ELEKTROFORÉZY PROTEINŮ PRO IDENTIFIKACI ODRŮD PŠENICE Obsah: 1. Úvod. 4 2. Použité metody souborné zhodnocení. 4 3. Metodické postupy. 5 3. 1. Elektroforetická analýza gliadinů pšenice ve sloupcích škrobového gelu (SGE). 5 3. 2. Elektroforetická analýza gliadinů pšenice v polyakrylamidovém gelu v kyselém prostředí (A PAGE ISTA). 11 3. 3. Elektroforetická analýza gliadinů pšenice v polyakrylamidovém gelu s Al-laktátovým pufrem (A PAGE-Metakovsky). 14 3. 4. Elektroforetická analýza podjednotek gluteninů s vysokou molekulovou hmotností (HMW-GS) pšenice v zásaditém prostředí dodecylsulfátu sodného (SDS PAGE). 20 4. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti uvedených metod. 26 5. Katalog gliadinových a HMW- gluteninových elektroforetických spekter registrovaných odrůd jarní a ozimé pšenice zjištěných metodami SGE a SDS PAGE. 27 6. Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty. 33 7. Další doporučená literatura. 36 J. Bradová, A. Šašek VÚRV Praha
1. Úvod Odrůda je jedním z nejvýznamnějších faktorů rozvoje zemědělství, je tzv. nositelem kvality. Metody identifikace a vzájemného rozlišování odrůd významných zemědělských plodin se v posledních letech vyvíjejí v rychlém tempu. Souvisí to s obchodními aktivitami specializovaných firem a společností, kterým se u nás otevřel trh s osivem a sadbou. S obchodováním jsou vždy spojeny problémy související s právní a obchodní ochranou zboží. Ochrana práv, která se váže na určitý rostlinný genotyp resp. odrůdu, se na různých úrovních týká ochrany autorských práv jak samotného autora, či majitele odrůdy, tak i dalších, kteří s odrůdou manipulují, např. na základě licence. Význam rychlého a spolehlivého určení odrůd je podmiňován odlišností odrůd v řadě hospodářsky významných vlastností. Každá odrůda se vyznačuje specifickým souborem vlastností, které rozhodují o jejím využití. Je proto v zájmu výrobců osiva a sadby i v zájmu pěstitelů, nákupu, zpracovatelského průmyslu, vnitřního a zahraničního obchodu používat jen správně zvolené a spolehlivě určené odrůdy. U obilnin může být k tomuto účelu využita sestava zásobních a enzymatických proteinů zrna (genetické bílkovinné markery), geneticky fixovaná a nezávislá na ročníku, lokalitě a podmínkách pěstování. Elektroforéza bílkovinných genetických markerů je běžným postupem separace semenných bílkovin v prostředí škrobového či polyakrylamidového gelu. Genetická interpretace, spojená především s elektroforézou ve škrobovém gelu (SGE), umožňuje identifikovat fenotypové projevy jednotlivých bílkovinných alel, jak to respektuje inovovaná státní norma (ČSN 461085-1, ČSN 461085-2. Pšenice obecná a ječmen - Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty - Část 1: Elektroforéza bílkovin ve škrobovém gelu, resp. Část 2: Elektroforéza bílkovin v polyakrylamidovém gelu). Základním předpokladem úspěšného využití uvedených metod identifikace odrůd pšenice je vytvoření databáze etalonových elektroforetických spekter pomocí vzorků etalonů registrovaných odrůd. Takto definované etalony může poskytovat jedině Odbor odrůdového zkušebnictví ÚKZÚZ. Na základě takto vytvořených katalogů (databáze) je potom možno identifikovat i vzorek bez odrůdové deklarace, případně vzorek směsi odrůd. 2. Použité metody - souborné zhodnocení 1. Elektroforetická analýza gliadinů ve sloupcích škrobového gelu (SGE) 2. Elektroforetická analýza gliadinů v polyakrylamidovém gelu v kyselém prostředí (A PAGE - ISTA) 3. Elektroforetická analýza gliadinů v polyakrylamidovém gelu s Al-laktátovým pufrem (A PAGE-Metakovsky) 4. Elektroforetická analýza podjednotek gluteninů s vysokou molekulovou hmotností (HMW-GS) v zásaditém prostředí dodecylsulfátu sodného (SDS PAGE) Podstata metodického přístupu uvedených metod: Zmíněné elektroforetické metody vycházejí ze skutečnosti, že zásobní proteiny (gliadiny a gluteniny) zrna pšenice jsou geneticky determinovány určitými lokusy - tzn. nejsou závislé na vnějších podmínkách - ročníku, výživě, lokalitě, jsou polymorfní a mohou 4
tedy sloužit jako genetické bílkovinné markery pro identifikaci genotypů i pro stanovení jejich homogenity a homo- či heterozygotního stavu a jsou ve vazbě s některými hospodářsky důležitými znaky (odolnost ke rzi travní, mrazuvzdornost, pekařská jakost). Metody jsou na pracovišti GB ve VÚRV prováděny standardním postupem, personál laboratoře má požadovanou erudici a odbornou způsobilost. Shrnutí základních praktických postupů: Základní metodou je SGE gliadinů, kterou lze zjistit poměrně přesně sestavu gliadinových alelických bloků jednotlivých genotypů, resp. odrůd - to znamená zjistit jejich rozdílnost a šíři genetického vybavení. Touto metodou lze rovněž zjistit jejich homogenitu - jak analýzou dostatečného počtu jednotlivých zrn, tak i analýzou směsného vzorku. U nehomogenních (případně heterozygotních) materiálů lze určit počet gliadinových linií, bud' příbuzných - sesterských (některé alely shodné) nebo nepříbuzných - nesesterské (možná příměs nebo cizosprášení). Alternativou k SGE je A PAGE gliadinů dle ISTA a dle Metakovského, od nichž lze očekávat přibližně stejné výsledky, jako od SGE. Tyto metody jsou však pracovně i finančně náročnější. Metoda SDS PAGE gluteninů představuje další stupeň zjišťování polymorfismu, je vhodná k doplnění základní charakterizace výchozích materiálů a k případnému rozlišení gliadinově identických odrůd. HMW - GS jsou však mnohem méně polymorfní než gliadiny. Metoda SDS PAGE je doporučena mezinárodní organizací UPOV (Union for The Protection of New Varieties of Plants) k testování odlišnosti, homogenity a stálosti odrůd. Metoda PAGE ISTA je doporučena mezinárodní mezinárodní semenářskou organizací ISTA (International Seed Testing Assotiation) pro zkoušení osiv. 3. Metodické postupy 3. 1. Elektroforetická analýza gliadinů pšenice ve sloupcích škrobového gelu (SGE) Metoda je prováděna podle ČSN 46 1085-1 (Pšenice obecná a ječmen, Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty, část 1: elektroforéza bílkovin ve škrobovém gelu (SGE). 3.1.1. Technické vybavení Chemikálie: všechny chemikálie stupně analytical reagent (p.a.) nebo lepší - Ethanol - Methylenová zeleň - Mléčnan hlinitý - Kyselina mléčná - Škrob pro elektroforézu - Močovina - Kyselina trichloroctová (TCA) - Nigrosin rozpustný ve vodě. Přístroje: - Přístroj pro elektroforézu ve skleněných trubičkách - Zdroj stejnosměrného proudu (možnost nastavení jak konstantního proudu, tak i konstantního napětí - min. 300V, 100mA) - Laboratorní centrifuga 5
- Olejová vývěva - Analytické váhy - Laboratorní předvážky - Třepačka Vortex Sklo, laboratorní pomůcky: Skleněné trubičky o vnitřním průměru 5,5-6,0 mm a délce 120-130 mm, 250 ml zábrusová baňka s kulatým dnem, skleněný nástavec pro odvzdušnění gelu, kádinky, plynový kahan, vodní lázeň, automatická pipeta, odměrné nádoby (válce, odměrné baňky), gumová hadička o vnitřním průměru 4 mm, plastové kroužky o vnějším průměru 21 mm, plastové centrifugační kyvety 1,5 ml, injekční stříkačka s jehlou, gumový balónek s hadičkou, stojany, skleněné zkumavky, plastová střička 250 ml, laboratorní teploměr. 3.1.2.Pracovní postup Roztoky: Extrakční roztok: 65% etanol (v/v) s 0,1 g methylenové zeleně ve 100 ml. Elektrodový pufr: 1,5 g mléčnanu hlinitého a 2,5-2,8 ml kyseliny mléčné (h=1,2 g. cm -3 ) se doplní do 1000 ml destilovanou vodou - pufr má mít ph 3,1-3,2. Pufr lze uchovávat při teplotě 4-8 C nejdéle 1 týden. Gelový pufr: 0,75 g mléčnanu hlinitého a 1,5-1,7 ml kyseliny mléčné se doplní do 500 ml destilovanou vodou. Pufr lze uchovávat při teplotě 4-8 C nejdéle 1 týden. Fixační roztok: 100 g kyseliny trichloroctové se doplní vodou do 1000 ml Barvicí roztok: 0,25 g nigrosinu se rozpustí a dobře rozmíchá v 1000 ml destilované vody. Příprava gelu a gelových sloupečků Pro přípravu 25 sloupečků škrobového gelu se do 250 ml skleněné zábrusové baňky odváží 8,5 g škrobu pro elektroforézu a důkladně se smísí s 80 ml gelového pufru. Směs se během 5 minut zahřeje na vodní lázni na teplotu 72-75 C a přidá se 9,6 g močoviny, která se dokonale rozpustí. Směs se stále míchá a ochladí se pod tekoucí vodou na teplotu cca 55 C a během 15 s se zbaví vzduchových bublin pomocí olejové vývěvy. Škrobový gel teplý přibližně 50 C se poté nasáváním naplní do skleněných trubiček až ke značce ve výšce 110 mm. K nasávání a ke stabilizaci gelu v trubičce se uplatní nasazená gumová hadička o délce cca 100 mm, která se přehne a zajistí kroužkem. Trubičky naplněné gelem se po 25 ks umístí do kádinky o objemu 250 ml, na jejíž dno se předem nalije vrstva cca 10 mm gelu. Sloupce gelu se nechají v trubičkách ztuhnout při laboratorní teplotě po dobu 16-24 hodin. Extrakce proteinů Zrna pšenice se jednotlivě rozdrtí (např. kladívkem mezi listy hladkého papíru) a drť se vloží do plastové 1,5 ml centrifugační kyvety *, přidá se 0,2 ml extrakčního roztoku, kyvety se uzavřou, směs se promíchá pomocí Vortexu, ponechá se stát při laboratorní teplotě 20 minut, poté se znovu promíchá a uloží na 16 hodin do chladničky. Následně se extrakty odstředí po dobu 2 minut při 15 000 ot/min. a supernatanty se nanesou pomocí automatické pipety na povrch připravených sloupečků škrobového gelu (0,04 ml/trub.) a zasypou se škrobem pro elektroforézu tak, aby na povrchu sloupce zůstala tenká vrstvička sypkého škrobu. *) v případě směsného vzorku se do centrifugační kyvety odváží 0,05 g šrotu Elektroforéza Skleněné trubičky se škrobovým gelem a extrakty se upevní do horní nádoby elektroforetického přístroje a jeho dolní katodová část se naplní elektrodovým pufrem 6
vytemperovaným na 20 C. Tímtéž elektrodovým pufrem se opatrně převrství (např. injekční stříkačkou s jehlou) škrobem zasypané extrakty ve skleněných trubičkách, potom se elektrodovým pufrem doplní horní anodová nádoba přístroje (elektroforéza probíhá směrem od anody ke katodě: od + k -). Ze stabilizovaného zdroje se na elektrody přivede proud o stálé intenzitě 1,5 ma/trub., k čemuž se upraví potřebné napětí. Tyto podmínky se udržují po dobu 15-20 minut, kdy vstoupí vyextrahované bílkoviny do gelu. Pak se proud přeruší, trubičky s gelem se vyjmou z přístroje, zasypávací škrob se z nich odstraní proudem destilované vody ze střičky, potom se trubičky vloží zpět do elektroforetického přístroje, znovu se převrství pomocí injekční stříkačky elektrodovým pufrem, kterým se opět naplní horní nádoba přístroje a přivede se proud v dané polaritě a stálé intenzitě 1,5 ma/trub. Celková doba trvání elektroforézy se určí podle průchodu barevného markeru (methylenové zeleně) tak, že se doba průchodu markeru násobí koeficientem 1,5. Fixace, barvení, odbarvení Po ukončení elektroforézy se přeruší proud, trubičky se vyjmou z přístroje, gely se z trubiček vytěsní mírným tlakem vzduchu (např. pomocí gumového balónku s hadičkou) do připravených skleněných zkumavek s fixačním roztokem, kde se ponechají v klidu 30 minut. Fixační roztok se slije a do zkumavek se nalije barvicí roztok nigrosinu. který přes noc obarví rozdělené bílkovinné složky. Pak se barvicí roztok slije a přebytečné barvivo se z gelu odstraní vodou z vodovodu, která se během 3 hodin celkem 3x vymění. 3.1.3. Vyhodnocení experimentálních dat Identifikace alel gliadinových lokusů Gld 1-1A, Gld 2-1A, Gld 1B, Gld 1D, Gld 6A, Gld 6B a Gld 6D se provede podle katalogu gliadinových alelických bloků (Tabulka I., Obrázek 1, Obrázek 2 a-b.). Uvedená nomenklatura byla navržena dle Šaška et al. (2000). Identifikované alely u analyzovaného genotypu pšenice se potom zapíší pomocí číslic a příslušné elektroforetické spektrum pšenice tak lze vyjádřit pomocí gliadinového alelického vzorce. 3.1.4. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Úskalím metody může být nedodržení přesného pracovního postupu v jakémkoli kroku (např. příprava gelu, ph pufru, atd.), nevýhodou elektroforézy v trubičkách obecně je obtížná porovnatelnost jednotlivých elektroforeogramů ( u uvedené metody je však tato nevýhoda zeslabena genetickou interpretací výsledků). 3.1.5. Přednosti metody, možnosti rozšíření Předností metody je její relativní zdravotní nezávadnost a zvláště možnost genetické interpretace získaných výsledků, tj. jejich vyjádření ve formě gliadinového alelického vzorce. 3.1.6. Seznam literatury ČSN 461085-1. Pšenice obecná a ječmen - Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty - Část 1: Elektroforéza bílkovin ve škrobovém gelu (SGE). Šašek, A., Černý, J., Sýkorová,S., Bradová, J.: Inovované katalogy bílkovinných genetických markerů pšenice seté a ječmene. ÚZPI Praha 2000. 7
Tabulka I.: Charakteristiky gliadinových alelických bloků určených metodou SGE Označení gliadinového alelického bloku Charkteristika gliadinového alelického bloku Počet pruhů; relativní elektroforetická mobilita pruhů (REM); intenzita zbarvení pruhů (RIB) 8 Zjištění alely Predikční hodnota pekařské jakosti * GLD 1-1A 0 Saxana 1 13,5(3)-27,5(4)-60,5(5) Vlasta 0 2 27,0(3)-30,0(1)-33,5(3)-36,5(4)-39,5(1)-60,0(4) Akteur 1,5 3 27(3)-29,0(1)-31,5(2)-56,5(4) Alana 1 4 59,5(4)-77,0(2) Asta 1,5 6 23,0(3)-26,0(1)-27,5(4)-30,0(2)-32,0(3)-60,5(5) Kerubino 0,5 9 57,0(4)-78,0(3) Batis 1 10 57,0(4) Bill 0,5 12 27,0(3)-29,0(1)-31,5(2)-59,5(4) Torysa 0,5 13 27,0(3)-29,0(1)-31,5(2) Sandra B 1,5 14 23,5(3)-27,5(4) Vlada 1,5 15 60,5(5) Livia 0 GLD 2-1A 0 Alana 0 1 33,5(4) Triso 0,5 2 32,0(4) Batis 0 3 36,5(4) Barroko 0,5 GLD 1B 1 36,0(4)-45,0(1)-47,5(1)-50,5(1-)54,0(5)76,5(3)-79,5(1) Viginta 3,5 3 26,0(1)-30,0(2)-34,5(5)-34,5(3)-42,5(5)-45,0(1)-48,5(3)-62,0(2)- Livia 0 66,0(2) 4 33,5(4)-36,5(1)-41,0(1)-44,0(2)-54,0(5) Akteur 2 5 27,0(3)-31,0(4)-42,5(3)-54,0(4) Corsaire 2,5 15 27,0(4)-21,0(3)-44,0(2)-54,0(5) Košútka 1,5 GLD 1D 1 13,5(2)-17,5(4)-21,0(3)-55,0(5)-61,5(1) Akteur 1 2 17,5(4)-21,0(4)-55,0(5)-61,5(1) Hedvika 0 3 17,5(5)-21(4)-26(1)-38,0(1)-55,0(5)-62,5(2) Sakura 0,5 5 12,5(3)-16,5(3)-19,0(3)-23,5(3)-26,0(1)-38,0(1)-55,0(5)-61,5(1) Vlada 1 6 17,5(4)-21,0(4)-23,5(3)-55,0(5)-61,5(2) Barryton 0 7 12,5(3)-16,5(3)-19,0(3)-23,5(3)-55,0(5)-61,5(1) Linda 1 8 13,5(2)-17,5(4)-21(3)-23,5(3)-55,0(5)-61,5(1) Batis 0 9 13,5(2)-17,5(4)-21,0(3)-55,0(5)-61,5(4) Alana 1 12 17,5(4)-21,0(4)-55,0(5)-61,5(4) Blava 0,5 13 12,5(3)-16,5(3)-19,0(3)-23,5(3)-26,0(1)-38,0(1)-55,0(5)-61,5(4) Ilona 0,5 GLD 6A 1 76,0(1)-81,0(2)-85,0(2)-88,5(2) Barroko 0,5 2 81,0(2)-85,0(5)-88,5(2) Alana 0,5 3 70,5(1)-76,0(1)-81,0(1)-87,0(3)-91,0(4)-93,5(1)-96,0(2) Batis 1 4 70,5(1)-76,0(1)-81,0(1)-85,5(3)-91,0(4)-93,5(1)-96,0(2) Rapsodia 1 5 70,5(1)-76,0(1)-81,0(1)-87,0(0)-91,0(4)-93,5(1)-96,0(2) Akteur 0 GLD 6B 1 56,5(1)-69,0(5)-74,0(4) Akteur 1 2 66,5(3)-71,0(4) Alana 1 3 58,0(1)-66,5(3)-70,0(1)-72,0(1)-74,0(4) Clarus 0,5 4 66,5(3)-74,5(4) Athlet 0
8 66,5(3)-71,0(4)-74,5(5) Alibaba 0,5 10 66,5(3)-71,0(4)-89,0(2) Swedjet N 12 66,5(4)-73,5(4)-76,5(4) Windsor N 13 66,5(3)-71,0(3)-73,5(4)- Floret N 14 66,0(5)-69,0(5)-74,0(4) Vinjet N 16 74,0(4) Apache 0 GLD 6D 1 63,5(3)-68,5(4)-74,0(4)-82,0(3)-85,0(2)-87,5(4) Alibaba 0,5 2 63,5(2)-68,5(4)-74,0(4)-82,0(3)-85,0(2)-90,5(4) Vlada 1 4 63,5(3)-68,5(4)-72,5(3)-82,0(3)-85,0(2)-90,5(4) Barroko 0,5 5 64,5(3)-68,5(4)-72,0(3)-82,0(3)-85,0(2)-87,5(4) Akteur 0,5 6 63,5(3)-68,5(4)-72,5(3)-82(3)-85,0(2)-87,5(4) Cubus 1 8 63,5(3)-68,5(4)-74,0(4)-78,5(4)-82,0(2)-85,0(2)-87,5(4) Zuzana 0,5 9 62,5(2-0)-68,5(4)-73,5(4)-83,0(2)-86,0(2) Alana 1 19 64,0(4)-68,5(4)-74,0(4)-83,0(3)-86,5(3) Banquet 0,5 * Šašek et al., 2000 Obrázek 1.: Škála intenzity zbarvení elektroforetických pruhů (RIB) 9
Obrázek 2a-b.: Popis gliadinových alel získaných metodou SGE (počet pruhů, REM, RIB Obr.1) 10
Obrázek 3.: Příklad vyčlenění gliadinových alelických spektra bloků zón z elektroforetického Gliadinový alelický vzorec : GLD 1-1A9-2-1A2-1B4-1D8-6A3-6B8-6D6 3.2. Elektroforetická analýza gliadinů pšenice v polyakrylamidovém gelu v kyselém prostředí (A PAGE ISTA ) Metoda je prováděna podle ČSN 461085-2. Pšenice obecná a ječmen - Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty - Část 2: Elektroforéza bílkovin v polyakrylamidovém gelu (A PAGE). Jedná se o standardní referenční metodu doporučenou ISTA pro identifikaci odrůd pšenice a ječmene pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (Draper, 1987). 3.3.1.Technické vybavení Chemikálie: všechny chemikálie stupně analytical reagent (p.a.) nebo lepší - Akrylamid (AA) - Bisakrylamid (BIS) - Kyselina askorbová - Močovina - Síran železnatý - TEMED (NNN'N' - tetramethylaethylendiamin) - Persíran amonný (APS) - 2-chlorethanol - Kyselina trichloroctová (TCA) 11
- Ledová kyselina octová - Glycin - Pyronin G - Glycerol - Methanol - Coomassie Brilliant Blue R-250 Přístroje: - Přístroj pro vertikální elektroforézu, zajišťující udržování konstantní teploty gelů. Doporučená tloušťka gelu ne více než 1,5 mm. - Zdroj stejnosměrného proudu (možnost nastavení jak konstantního proudu, tak i konstantního napětí) - Chladicí termostat - Laboratorní centrifuga - Prosvětlovací panel - Analytické váhy - Laboratorní předvážky - Třepačka Vortex - Laboratorní digestoř Sklo, laboratorní pomůcky: Laboratorní sklo, skleněné desky pro přípravu gelu (gelové kazety), stativ na nalévání gelu, odměrné nádoby (válce, odměrné baňky), nádoby na fixaci a barvení gelu, plastové centrifugační kyvety 1,5 ml, injekční stříkačka s jehlou, přesná injekční stříkačka Hamilton pro nanášení vzorků, automatická pipeta, osobní ochranné pracovní prostředky - rouška, rukavice! 3.2.2.Pracovní postup Roztoky: Extrakční roztok: 25ml 2-chlorethanolu, 50mg Pyroninu - doplnit destilovanou vodou do 100ml. Tento roztok může být skladován 2 měsíce při 4 C. Elektrodový pufr: 4 ml kyseliny octové (ledové); 0,4 g glycinu- doplnit vodou do 1 000 ml (ph 3,1) Gelový pufr: 20 ml kyseliny octové (ledové); 1,0 g glycinu - doplnit vodou do 1 000 ml (ph 3,2) 1% persíran amonný: 1g do 10ml dest. vody Fixační a barvící roztok: 1. 100 g kyseliny trichloroctové doplnit dest.vodou do 1000ml 2. 5g Coomassie Brilliant Blue R-250 a 0,5g Coomassie Brilliant Blue G-250 Rozpustit ve 100ml ethanolu. Na fixaci a obarvení jednoho gelu 10ml roztoku č.2 doplnit do 200ml roztoku č.1 (lze použít 3x). 2% glycerol: 20ml glycerolu doplnit dest. vodou do 1000 ml Příprava gelu Podle návodu výrobce se sestaví čisté a suché kazety na gel. Příprava 100ml separačního gelu: 60 ml gelového pufr 10g akrylamidu 12
0,4g bisakrylamidu 6g močoviny 0,1 g kyseliny askorbové 0,005 g síranu železnatého Teplota roztoků by měla být co nejnižší (blízká 0 C). Rozmíchat a doplnit do 100 ml gelovým pufrem. Potom se přidá postupně 0,3ml TEMEDu a 0,2 ml persíranu amonného, vše se zamíchá a gelový roztok se potom pečlivě nalije do připravených kazet tak, aby se netvořily bubliny. Je třeba pracovat poměrně rychle, protože gel velmi snadno polymeruje. Vloží se "hřebeny" pro zformování jamek a nechá se polymerovat asi 2 hodiny (gel pro elektroforézu lze připravit den předem a uchovat v chladničce do druhého dne). Extrakce proteinů Jednotlivá zrna se rozmělní kladívkem (nebo jiným nástrojem) a přemístí do 1,5ml centrifugačních kyvet*). Přidá se 0,4 ml extrakčního roztoku, obsah se důkladně promíchá na Vortexu a nechá (uzavřený nebo utěsněný) přes noc stát při laboratorní teplotě. Obsah kyvet je centrifugován (15000 ot/min) po dobu 5ti minut. *) v případě směsného vzorku se do centrifugační kyvety odváží 0,05 g šrotu Elektroforéza Po zpolymerizování se hřeben vytáhne z gelu a jamky pro vzorky se promyjí elektrodovým pufrem a desky se upevní do přístroje. Do jamek v gelu se pomocí injekční stříkačky Hamilton nanese příslušné množství vzorku (10-20 µl) opatrným podvrstvením pod pufr a elektrodové nádoby se naplní vychlazeným elektrodovým pufrem. Aparatura se uzavře víkem a připojí ke zdroji proudu. Elektroforéza probíhá při konstantním napětí 500 V po dobu dvojnásobku běhu markeru Pyronin G. Je třeba pamatovat na to, že anoda (+) je v tomto systému horní elektrodou, a podle toho je třeba nastavit polaritu elektrického pole. Teplota by měla být udržována na 10 C pomocí chladicího termostatu. Fixace, barvení, odbarvení Gelové kazety se vyjmou z nádob, otevřou se a gely se vloží do plastikové nádoby obsahující 10 ml 1 % roztoku barviva ve 200 ml 10% kyseliny trichloroctové. Barvíme přes noc. Precipitované barvivo se z povrchu gelu opatrně odstraní štětečkem. Pro zvýšení kontrastu se gel promyje ve vodě. Gely je možné uchovávat v polyetylenových sáčcích při teplotě 4 C několik měsíců bez zhoršení kvality. Gely lze uchovávat i v suchém stavu. Sušení gelů Polyakrylamidové (PAA) gely získané touto metodou lze poměrně jednoduše sušit a poté skladovat v usušeném stavu. Postup sušení: Připraví se skleněná deska (rozměry desky musí být větší než velikost výsledného PAGE gelu). Dále je nutno připravit dva obdélníky z celofánu (rozměry 1. obdélníku se rovnají rozměrům skleněné desky; strany 2. obdélníku jsou cca o 2 cm delší než strany skleněné desky). Takto připravený celofán a PAA gel se ponoří do 2% roztoku glycerolu (cca 2 hodiny). Poté se 1. celofánový obdélník položí na skleněnou desku, na něj se umístí PAA gel a přikryje se 2. celofánovým obdélníkem. Okraje celofánu se přehnou pod skleněnou desku a plocha se eventuelně vyhladí plastovým válečkem (odstranění vzduchových bublin). Ponechá se sušit při laboratorní teplotě v dostatečné vzdálenosti od zdrojů tepla a světla. 13
3.2.3.Vyhodnocení experimentálních dat Identifikace odrůd se provádí porovnáním elektroforetických gliadinových spekter s elektroforetickými spektry etalonů jednotlivých odrůd. Přitom se srovnává počet jednotlivých pruhů (zón), jejich vzájemná poloha charakterizovaná relativní elektroforetickou mobilitou (REM) a relativní intenzitou zbarvení (RIB). Toto porovnání se provádí vizuálně. K vyhodnocení lze též využít počítačové denzitometrie. 3.2.4.Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Úskalím metody je rizikovost používaných chemikálií, kterou lze snížit používáním hotových komerčních roztoků akrylamidu a BIS (odpadá manipulace při navažování), tyto jsou ale nepoměrně dražší než základní chemikálie. Finančně ještě náročnější by bylo použití hotových komerčních gelů, provedení elektroforézy je pak ale podstatně standardnější. Nevýhodou metody je absence genetické interpretace elektroforetických spekter gliadinů. 3.2.5 Přednosti metody, možnosti rozšíření Standardní referenční metoda, kterou schválila organizace International Seed Testing Association (ISTA,Draper 1987). Předností metody je i možnost dlouhodobého skladování a snadné manipulace s usušenými gely. Modifikace elektroforézy v plotnách polyakrylamidového gelu umožňuje velmi dobrou porovnatelnost mezi jednotlivými drahami na jednom gelu a přesné provádění všech metodických kroků může zvýšit standardnost získaných výsledků. 3.2.6 Seznam literatury Draper,S.R: ISTA variety committee. Report ofthe working group for biochemical test for cultivar identification 1983-1986. Seed Sci. Technol., 15, 1987:431-434. ČSN 461085-2. Pšenice obecná a ječmen - Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty - Část 2: Elektroforéza bílkovin v polyakrylamidovém gelu (A PAGE) 3.3. Elektroforetická analýza gliadinů pšenice v polyakrylamidovém gelu s Allaktátovým pufrem (A PAGE-Metakovsky) Další z metod, pomocí níž lze charakterizovat pšeničné gliadiny, je elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v kyselém prostředí (A-PAGE) s použitím mléčnanu hlinitého (ph 3,1). Níže uvedený metodický postup je optimalizací metody dle Metakovského a Novoselké (1991), kteří modifikovali postup Bushuka a Zillmana (1978). 3.3.1. Technické vybavení Chemikálie: všechny chemikálie stupně analytical reagent (p.a.) nebo lepší - Akrylamid (komerční 40% roztok) - Bisakrylamid (komerční 2% roztok) - Kyselina askorbová - Mléčnan hlinitý - Síran železitý - Kyselina mléčná - Hydroxid sodný - Peroxid vodíku 14
- Kyselina trichloroctová (TCA) - Pyronin Y - Glycerol - Ethanol - Coomassie Brilliant Blue R-250 Přístroje: - Přístroj pro vertikální elektroforézu, zajišťující udržování konstantní teploty gelů. Doporučená tloušťka gelu maximálně 1,5 mm. - Zdroj stejnosměrného proudu (možnost nastavení konstantního proudu i konstantního napětí) - Chladicí termostat - Laboratorní centrifuga - Prosvětlovací panel - Analytické váhy - Laboratorní předvážky - Třepačka Vortex - Laboratorní digestoř Sklo, laboratorní pomůcky: Laboratorní sklo, skleněné desky pro přípravu gelu (gelové kazety), stativ na nalévání gelu, odměrné nádoby (válce, odměrné baňky), nádoby na fixaci a barvení gelu, plastové centrifugační kyvety 1,5 ml, injekční stříkačka s jehlou, přesná injekční stříkačka Hamilton pro nanášení vzorků,, automatická pipeta, osobní ochranné pracovní prostředky - rouška, rukavice!. 3.3.2. Pracovní postup Roztoky Extrakční roztok - 70 ml 96% ethanolu doplnit destilovanou vodou na 100ml Vzorkový pufr - 15 ml Glycerinu; 0,0125 g Pyroninu Y; doplnit dest. vodou na 25 ml Základní roztok A - 68 ml 25%ního roztoku kyseliny mléčné se zředí destilovanou vodou na 900 ml; hodnota ph se nastaví na 3,1 pomocí čerstvě připraveného 6M hydroxidu sodného (6 g NaOH ve 28 ml dest. vody.); po úpravě ph se objem doplní dest. vodou na 1 litr. Základní roztok B - 7,75 g mléčnanu hlinitého rozpustit v 50 ml 25%ní kyseliny mléčné; dest. vodou doplnit na objem 100 ml. Provozní pufr - 90 ml Základního roztoku A se smíchá s 3 ml Základního roztoku B, doplní se dest. vodou na 1 l a dobře zamíchá ( zkontrolovat, zda souhlasí ph 3,2 ) Všechny pufry uchovávat v chladničce. Extrakce proteinů Jednotlivá zrna se rozmělní kladívkem (nebo jiným nástrojem) a přemístí do 1,5ml centrifugačních kyvet*). Přidá se 125 µl extrakčního roztoku, obsah se důkladně promíchá na Vortexu a nechá (uzavřený nebo utěsněný) přes noc stát při laboratorní teplotě. Druhý den se přidá 135 µl vzorkového pufru, dobře se promíchá na Vortexu. Obsah kyvet je centrifugován po dobu 5ti minut (15000 ot/min). Na gel se nanáší 10 µl extraktu pomocí injekční stříkačky Hamilton podvrstvením pod pufr v gelových jamkách. Vzorky mohou být uloženy více dnů v chladničce, avšak nezamrazovat! *) v případě směsného vzorku se do centrifugační kyvety odváží 0,05 g šrotu 15
Příprava gelového roztoku Základní roztok 40 ml 40%ního akrylamidu 30 ml 2%ního bisakrylamidu 0,5 g mléčnanu (laktát) hlinitého 0,2 g askorbové kyseliny 3,6 ml 25%ního roztoku kyseliny mléčné (25 ml kys. mléčné 80%ní + 55 ml dest. H 2 O) 2,0 ml roztoku síranu železitého (45 mg /25 ml dest. H 2 O, vždy čerstvě připravovat). Doplnit dest. vodou na 200 ml a uchovávat v chladničce (několik týdnů) Nalévání gelu Podle návodu výrobce se sestaví čisté a suché kazety na gel. Gelový roztok, nádoby a nalévací kazety uchovávat pokud možno v chladu! Na 1 gel (např. OWL Pinguin, 14x16x0,15cm) - 36 ml základního roztoku + 68 µl 0,7% H 2 O 2 (čerstvý), krátce zamíchat a pomocí 10ml-pipety naplnit mezi desky (eventuelně nasadit hřeben již předem - gel polymeruje během několika málo minut!). Po cca 1 hodině je možno gel použít. Elektroforéza Po zpolymerizování se hřeben vytáhne z gelu a jamky pro vzorky se promyjí elektrodovým pufrem a desky se upevní do přístroje. Do jamek v gelu se pomocí injekční stříkačky Hamilton nanese příslušné množství vzorku (10µl) opatrným podvrstvením pod pufr a elektrodové nádoby se naplní vychlazeným elektrodovým pufrem. Provozní podmínky (pro 2 gely o rozměrech 14x16x0,15cm) Směr průchodu stejnosměrného proudu od anody (+) ke katodě (-). Vodní chlazení na 14 C. Provozní pufr ve spodní komoře se může použít víckrát, v horní nádobě se používá vždy čerstvý. Napětí [V] Síla proudu [ma] Výkon[W] doba průběhu [min.] 220 35 10 10 550 70 38 dvojnásobek doby dělení Doba dělení: čelo markerovací barvy se nechá dojít na konec gelu a doba dělení se prodlouží o jeden násobek trvání elektroforézy od začátku do doby, kdy barevný marker opustí gel. Fixace, barvení, odbarvení Skleněné desky s gelem se vyjmou z přístroje, gel se sejme a ponechá cca 30 minut ve fixačním roztoku (10% roztok TCA). Po této době se fixační roztok slije a gel se přelije barvicím roztokem ( 8% Coomasie R 250 w/v; 10% ethanol v/v; 8% TCA w/v) a ponechá se barvit do druhého dne. Odbarvuje se v destilované vodě dle potřeby. Sušení gelů: viz 3.2.2. 3.3.3.Vyhodnocení experimentálních dat Identifikaci alel gliadinových lokusů Gli-A1, Gli-B1, Gli-D1, Gli-A6, Gli-B6 a Gli-D6 lze provést dle katalogu gliadinových alel publikovaných Metakovským (1991), (Obrázek 4). 16
3.3.4.Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Úskalím metody je rizikovost používaných chemikálií, kterou lze snížit používáním hotových komerčních roztoků akrylamidu a BIS (odpadá manipulace při navažování), tyto jsou ale nepoměrně dražší než základní chemikálie. Finančně ještě náročnější by bylo použití hotových komerčních gelů, provedení elektroforézy je pak ale podstatně standardnější. 3.3.5 Přednosti metody, možnosti rozšíření Předností metody je možnost genetické interpretace elektroforetických gliadinových spekter, tj. jejich vyjádření ve formě gliadinového alelického vzorce, což výrazně usnadňuje práci se získanými výsledky podobně jako v případě použití škrobové gelové elektroforézy (SGE). Předností metody je i podobně jako u PAGE ISTA možnost dlouhodobého skladování a snadné manipulace s usušenými gely. Modifikace elektroforézy v plotnách polyakrylamidového gelu umožňuje velmi dobrou porovnatelnost mezi jednotlivými drahami na jednom gelu a přesné provádění všech metodických kroků může zvýšit standardnost získaných výsledků. 3.2.6 Seznam literatury Bushuk, W., Zillman, RR: Wheat cultivar identification by gliadin elektroforeograms/. Apparaturs, methods and nomenklature. Can.J. PI. ScL, 58, 1978: 505-511 Černý, J., Šašek, A.: Bílkovinné signální geny pšenice obecné. ÚZPI, Praha, 1996 Metakovsky E.V.: Gliadin allele identification in common wheat. II. Catalogue of giiadin aileles in common wheat. J. Genet. Breed., 45,1991: 325-344 Metakovsky, E.V., Novoselskaya, A.Yu.: Gliadin ailele identification in common wheat I. Methodological aspects of the analysis of gliadin patterns by one-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. J. Genet. & Breed. 45: 317-324 (1991) 17
Obrázek 4.: Katalog gliadinových alel publikovaných Metakovským (1991); Schématické znázornění gliadinových alelických bloků,, (a)- bloky kontrolované Gli-A1, (b)- Gli-B1, (c)- Gli-D1, (d)- Gli-A2, (e)- Gli-B2, (f)- Gli-D2. B: schéma gliadinového spektra odrůdy Bezostá 1. 18
19
3.4. Elektroforetická analýza podjednotek gluteninů s vysokou molekulovou hmotností (HMW-GS) pšenice v zásaditém prostředí dodecylsulfátu sodného (SDS PAGE) Metoda SDS PAGE je doporučena mezinárodní organizací UPOV (Union for The Protection of New Varieties of Plants) k testování odlišnosti, homogenity a stálosti odrůd (Guidelines for the conduct of tests for distinctness, uniformity and stability - TG/3/11 94-11-04 ) 3.4.1.Technické vybavení Chemikálie - všechny chemikálie stupně analytical reagent (p.a.) nebo lepší - Akrylamid (AA) - Bisakrylamid (BIS) - Tris(hydroxymethyl) aminomethan(tris) - Dodecylsulfát sodný (SDS) - Persíran amonný (APS) - 2-merkaptoethanol - TEMED (NNN'N' - tetramethylethylendiamin) - Kyselina trichloroctová (TCA) - Ledová kyselina octová - Glycin - Pyronin G - Glycerol - Methanol - Coomassie Brilliant Blue R-250 Přístroje: - Přístroj pro vertikální elektroforézu, zajišťující udržování konstantní teploty gelů. Doporučená tloušťka gelu ne více než 1.5 mm (např. přístroj pro elektroforézu Pinguin 14xl6 cm OWL) - Zdroj stejnosměrného proudu (možnost nastavení jak konstantního proudu, tak i konstantního napětí) - Chladicí termostat - Laboratorní stolní centrifuga - Třepačka na barvení a odbarvení gelů - Prosvětlovací panel - Analytické váhy - Laboratorní předvážky - Třepačka Vortex - Laboratorní digestoř Sklo, laboratorní pomůcky: Laboratorní sklo, skleněné desky pro přípravu gelu (gelové kazety), stativ na nalévání gelu, odměrné nádoby (válce, odměrné baňky), nádoby na fixaci a barvení gelu, plastové centrifugační kyvety 1,5 ml s perforovanými víčky, injekční stříkačka s jehlou, přesná injekční stříkačka Hamilton pro nanášení vzorků, automatická pipeta, osobní ochranné pracovní prostředky - rouška, rukavice!. 20
3.4.2. Pracovní postup Roztoky: A. Zásobní pufrový roztok na dělicí gel (0,75M TRIS HCl, ph 8,8): 91,14 g TRIS a 9,75 ml koncentrované HCl se doplní destilovanou vodou do 1000ml. Skladovat v lednici. B. Zásobní pufrový roztok na zaostřovací gel (0,25 M TRIS HCl, ph 6,8: 6,1 g Tris, 4,12 ml koncentrované HCl a špetka bromfenolové modři se doplní vodou do 200 ml. Skladovat v lednici. C. Extrakční roztok: 30 ml roztoku 1.2, 24 ml roztoku 1.5, 12 ml glycerolu,6 ml 2- merkaptoethanolu, 48 ml vody a špetka bromfenolové modři, promíchat a skladovat při laboratorní teplotě v digestoři! D. Zásobní roztok akrylamidu a bisakrylamidu (AA+BIS): 150 g AA a 4 g BIS doplnit vodou do 500 ml. Rukavice a rouška při navažování! Skladovat za lab. teploty! E. 10 % (w/v) roztok SDS : 10 g SDS doplnit dest. vodou do 100 ml. Skladovat za lab. teploty! F. 10% (w/v) roztok APS :0,5 g persíranu amonného doplnit dest. vodou do 5 ml. Připravovat vždy čerstvý!! G. Elektrodový pufr zásobní: 0,25 M Tris, 1,92 M glycin (ph 8,3): 30,3 g Tris, 144 g glycin, 10 g SDS doplnit vodou do 1 000 m Pohotovostní elektrodový pufr pro elektroforézu (roztok Gp): zásobní elektrodový pufr zředěný 10x dest. vodou ( 1:9) H. Fixační roztok: 20 % (w/v) roztok kyseliny trichloroctové(tca) - 200 g TCA doplnit dest. vodou do 1000 ml. J. Směsný roztok: 250 ml methanolu, 100 ml kyseliny octové, 650 ml dest. vody K. Barvicí roztok: 0, 05 % roztok Commassie Brilliant Blue R 250 (CBB R250) ve směsném roztoku - 0,5 g CBB R250 v 1000 ml směsného roztoku. L. 2% glycerol (v/v): 20ml glycerolu doplnit do 1000ml dest. vody. Extrakce proteinů Jednotlivá zrna se rozmělní kladívkem (nebo jiným nástrojem). Melivo se převede do 3 ml centrifugačních kyvet*). Na 1 rozmělněné zrno se použije 0,3 ml extrakčního roztoku C, po zamíchání navortexu se zrna extrahují 2 hod. za laboratorní teploty, poté jsou extrakty povařeny na vroucí vodní lázni 2 minuty a ponechány vychladnout. Kyvety jsou centrifugovány 2 min. při 15 000 ot/min. *) v případě směsného vzorku se do centrifugační kyvety odváží 0,05 g šrotu Příprava gelu Sestavit suché a čisté gelové kazety (dle typu přístroje) Každý gel se skládá z dělicího a zaostřovacího gelu Příprava 10% dělicího gelu Za pomalého míchání jsou přidávány jednotlivé složky (množství dle typu přístroje a velikosti desek) Uvedená množství - pro přístroj OWL Pinguin 14x16x 0,15cm) 42 ml (AA a BIS) roztok D 63 ml (gelový pufr 8,8) roztok A 1,26 ml (SDS) roztok E 21 ml vody 21
Polymerace se nastartuje přidáním: 75 µl TEMEDu 1,26 ml 1.1.6(APS) roztok F Gel se pečlivě nalije mezi skla tak, aby se netvořily vzduchové bublinky. Gelové kazety se naplní 30 mm pod okraj (prostor pro 30 mm vrstvu zaostřovacího gelu). Povrch gelu se převrství opatrně vodou (injekční stříkačkou), nechá se cca 30 minut polymerovat. Po skončení polymerace se voda slije, povrch gelu se osuší filtračním papírem a kazety se až po okraj naplní zaostřovacím gelem. Příprava 4,6 % zaostřovacího gelu: Za pomalého míchání jsou přidávány jednotlivé složky (množství dle typu přístroje a velikosti desek) 6 ml (AA a BIS) roztok D 20 ml 2.1.2(gelový pufr 6,8) roztok B 0,4 ml 2.1.5 (SDS) roztok E 13,2 ml vody Polymerace se nastartuje přidáním: 16 µl TEMEDu 0,4 ml 1.1.6.(APS) roztok F Gel se pečlivě nalije na spodní gel tak, aby se netvořily vzduchové bublinky, vloží se hřebeny pro tvorbu jamek. Polymerace probíhá cca 30 minut. Potom se hřebeny opatrně vyjmou a jamky v gelu se promyjí a naplní elektrodovým pufrem roztok Gp. Doporučuje se připravit si gely den předem před vlastní elektroforézou a skladovat je v chladničce. Nanášení vzorků Do každé jamky se nanáší 15µl extraktu. Elektroforéza Podmínky SDS PAGE pro HMW-GS Elektrodový pufr Roztok Gp Proud 0,2 ma/ mm 2 gelu (1gel- 14 cm šířka;1mm tloušťka = 28mA) Napětí max. 300 V Teplota 8 C Směr migrace od katody (-) k anodě (+) Doba dělení: Čelo markerovací barvy se nechá dojít na konec gelu a doba dělení se prodlouží o 1,5 násobek trvání elektroforézy od začátku do doby, kdy barevný marker opustí gel. 22
Fixace, barvení, odbarvení, sušení Fixace: Skleněné desky s gelem se vyjmou z přístroje, gel se sejme a ponechá cca 30 minut ve fixačním roztoku H. Roztok H se slije a gel se přelije roztokem J a ponechá se cca 30 minut. Barvení: Slít roztok J a přelít barvicím roztokem K. Ponechá se barvit přes noc (bez třepání). Odbarvení: Slít roztok K a přelít roztokem J, ponechat cca 30 minut. Slít roztok J (odbarvit jej aktivním uhlím a lze jej znovu použít) a nakonec přelít gely destilovanou vodou. Sušení: Viz kapitola 3.2.2. 3.4.3. Vyhodnocení experimentálních dat Vyhodnocení získaných elektroforeogramů se provádí pomocí schématického znázornění elektroforetických mobilit jednotlivých HMW-GS alel kodovaných lokusem Glu-3(Obrázek 5a-c). (Payne, Lawrence, 1983). Doporučuje se zařadit do elektroforetického běhu analyzovaným odrůdám o neznámé sestavě HMW-GS jeden či dva genotypy o známém složení HMW-GS (Obrázek 6.). Identifikace jednotlivých HMW-GS je pak snazší. Identifikované alely se potom zapíší pomocí číslic a vytvoří SDS PAGE gluteninový alelický vzorec. 3.4.4. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití: Viz kapitola 3.3. 3.4.5. Přednosti metody, možnosti rozšíření Předností metody je genetická interpretace získaných výsledků tj. jejich vyjádření ve formě gluteninového alelického vzorce - tzn. relativní nezávislost na případných metodických odchylkách v hodnotách relativní elektroforetické mobility na jednotlivých gelech. Tuto metodu lze využívat jako doplňující metodu k identifikaci pšeničných genotypů, vzhledem k mnohem nižšímu polymorfismu na rozdíl od gliadinů. Použití metody je vhodné pro případy, kdy zjistíme shodnou sestavu gliadinových lokusů u genotypů, které chceme dále rozlišit - tento další systém může, ale také vždy nemusí znamenat rozšíření polymorfismu genetických markerů. HMW-GS lze rovněž využívat k predikci pekařské jakosti genotypů pšenice (Šašek, Černý, 1996). 23
3.4.6. Seznam literatury Černý, J., Šašek, A.: Bílkovinné signální geny pšenice obecné. ÚZPI, Praha, 1996 Guidelines for the conduct of tests for distinctness, uniformity and stability. Wheat. (Aditional usefull explanation). TG/3/11, 96-10-18, (1996) Payne,P.I., Lawrence,G.J. Catalogue of alleles for the gene loci, Glu-A1, Glu-B1 and Glu-D1 which code for highmolecular weight subunits of glutenin in hexaploid wheat. Cereal.Res. Communs.,11,1983 č.1, s.29-35 Obrázek 5 a-c : Schématické znázornění elektroforetických mobilit jednotlivých zón HMW- GS alel kodovaných lokusem Glu-3( Payne, Lawrence,1983) Obrázek 5a.: Glu A1 lokus Obrázek 5b.: Glu B1 lokus 24
Obrázek 5b.: Glu D1 lokus Obrázek 6.: Označení jednotlivých HMW-GS na SDS PAGE gelu ( HMW-GS běžně se vyskytujících u českých registrovaných odrůd) HMW-GS Odrůdy: Alana (1), Ilias(2), Heroldo(3), Akteur(4), Clarus(5), Floret(6), Rapsodia(7), Swedjet(8) 25
Tabulka II.: Popis HMW-GS alel Lokus Glu-A1 Glu-B1 Glu-D1 HMW- Alela GS a 1 b 2* c null a 7 b 7+8 c 7+9 d 6+8 e 20 f 13+16 g 13+19 h 14+15 i 17+18 j 21 a 2+12 b 3+12 c 4+12 d 5+10 Pozn.: Nomenklatura dle Payne, Lawrence, (1983) 4. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti uvedených metod Časová, pracovní a kapacitní náročnost je u metod SGE, SDS PAGE a obou A PAGE metod shodná. Výsledky elektroforetických analýz 24 jednotlivých zrn (nebo směsných vzorků) mohou být k dispozici za 48 hodin. Použití metody SGE je ve srovnání s metodami elektroforézy v polyakrylamidovém gelu relativně nerizikové z hlediska bezpečnosti práce. Používání všech elektroforetických metod v polyakrylamidovém gelu je finančně náročnější (dražší a více různých chemikálií i dokonalejší přístroje) a i rizikové z hlediska bezpečnosti práce, roztoky akrylamidu a bisakrylamidu jsou látky vysoce toxické a karcinogenní. Při manipulaci s nimi musejí být dodržována přísná bezpečnostní opatření, nezbytné je používání OOPP. Odborně nejnáročnější část analýz představuje vlastní vyhodnocení výsledků - identifikace alel gliadinových resp. gluteninových lokusů, které vyžaduje vysoce erudovaného zkušeného odborníka. 26
5. Katalog gliadinových a HMW- gluteninových elektroforetických spekter registrovaných odrůd jarní a ozimé pšenice zjištěných metodami SGE a SDS PAGE Elektroforetická spektra gliadinů jsou vyjádřena v podobě sestav gliadinových alelických bloků, zjištěných na lokusech Gld 1-1A, Gld 2-1A, Gld 1B, Gld 1D, Gld 6A, Gld 6B a Gld 6D. Elektroforetická spektra HMW- gluteninů jsou vyjádřena v podobě sestav gluteninových alelických bloků, zjištěných na lokusech Glu 1A, Glu 1B, Glu 1D. Zjištěné sestavy gliadinových a gluteninových alel jednotlivých odrůd pšenice vyjádřené v podobě gliadinových (SGE) a gluteninových (SDS PAGE) alelických vzorců jsou přehledně uvedeny v Tabulkách III (jarní) a IV(ozimé). Využívání registrovaných odrůd pšenice je spojeno s jejich rychlou identifikací. Význam rychlého a spolehlivého určení odrůd je podmiňován odlišností odrůd v řadě hospodářsky významných vlastností, protože každá odrůda se vyznačuje specifickým souborem vlastností, které rozhodují o jejím využití. Předpokladem využití metody bílkovinných genetických markerů (gliadinů, případně gluteninů) pro identifikaci odrůd je jedinečnost a specifičnost elektroforetických spekter každé registrované odrůdy pšenice. Dále je nezbytná znalost případného vnitroodrůdového bílkovinného polymorfismu. V případě polymorfních odrůd je jejich genetická struktura charakterizována počtem bílkovinných linií, a je proto nutné verifikovat a identifikovat tyto odrůdy podle počtu a zastoupení jednotlivých bílkovinných linií, typických pro danou odrůdu. 27
5.1. Sestavy gliadinových (SGE) a gluteninových (SDS PAGE) alelických bloků odrůd pšenice v podobě gliadonových resp. gluteninových alelických vzorců Tabulka III: Gliadinové a gluteninové genetické markery jarních odrůd pšenice registrovaných v ČR Odrůda Gliadinové alelické bloky na lokusech Gluteninové alel. bloky na lokusech Rok linie % 1-1A 2-1A 1B 1D 6A 6B 6D linie % 1A 1B 1D registrace Amaretto A 100 9 2 4 2 2 1 1 a 100 1 7+9 5+10 2006 Aranka A 26 0 2 1 1 4 1 1 B 74 0 2 1 1 2 1 1 a 100 1 14+15 5+10 1998 Brawura A 64 3 2+3 4 1 3 1 4 B 36 3 2+3 4 1 3 1 4 a 100 1 7 5+10 2007 Bruncka A 100 0 0 4 1 3 1 6 a 100 0 7+8 2+12 2001 Corso A 84 10 0 4 8 4 3 1 B 16 17 0 4 8 4 3 1 a 100 0 7+9 5+10 2001 Granny A 100 9 2 4 12 2 1 4 a 75 1 7+9 2+12 2004 b 25 0 7+9 2+12 Leguan A 48 0 2 1 7 3 1 2 B 52 0 2 1 7 4 1 2 a 100 1 7+9 5+10 1998 Linda* A 100 0 2 1 7 4 1 2 a 100 1 7+9 5+10 1992 Mája* A 100 3 2+3 1 8 2 1 5 a 100 1 7+8 5+10 1990 Munk A 66 0 2 1 7 4 1 1 B 34 10 2 1 7 4 1 1 a 100 0 7+9 5+10 1995 A 54 0 2 1 7 2 1 1 a 75 2* 7+8 3+12 Sandra B 46 13 2 1 7 2 1 1 b 17 2* 7+9 3+12 1984 c 8 1 7+9 3+12 Saxana A 100 0 2 1 7 4 1 2 a 100 1 7+9 5+10 1990 Sirael A 63 3 2 4 9 3 1 1 B 37 3 2+3 4 9 3 1 1 a 100 1 7+9 2+12 2005 Swedjet A 100 2 0 4 1 2 10 5 a 100 0 14+15 2+12 2003 SW Kadrilj A 100 10 0 4 1 3 1 6 a 100 1 14+15 5+10 2006 SW Kronjet A 100 0 1 5 1 3 1 8 a 100 0 14+15 2+12 2005 Trappe A 100 2 3 4 2 3 2 5 a 100 0 7+9 5+10 2007 Triso A 100 3 1 1 1 3 1 4 a 100 1 7+9 5+10 2002 28
Vánek A 100 3 2+3 1 1 1 2 4 100 1 7+9 5+10 2004 Vinjett A 100 10 0 4 1 2 14 5 a 100 0 7+9 5+10 2001 Zuzana A 100 0 1 5 1 3 1 8 a 100 1 7 5+10 2003 Vysvětlivky: velká písmena - SGE gliadinová linie malá písmena - SDS PAGE gliadinová linie * registrace zrušena 2007 * bez ověření užitné hodnoty (ÚKZÚZ) Tabulka IV: Gliadinové a gluteninové genetické markery ozimých odrůd pšenice registrovaných v ČR Odrůda Gliadinové alelické bloky na lokusech Gluteninové alel. bloky na lokusech Rok linie % 1-1A 2-1A 1B 1D 6A 6B 6D linie % 1A 1B 1D registrace Acteur A 100 2 2+3 4 1 5 1 5 a 100 1 7+9 5+10 2004 Alana A 100 3 0 4 9 2 2 9 a 100 0 7+8 5+10 1997 Alka A 100 3 0 4 9 2 2 9 a 100 0 6+8 5+10 1995 Alibaba A 100 10 0 4 1 2 8 1 a 100 1 6+8 5+10 2003 Anduril A 100 10 2 4 1 2 1 1 a 100 0 7+9 2+12 2007 Apache A 100 2 2 4 2 1 16 1 a 100 0 7+9 3+12 1999 Asta A 100 4 0 4 1 2 2 19 a 64 0 6+8 5+10 b 36 0 7+9 5+10 1994 Astella A 72 2 0 1 2 1 1 4 B 28 2 0 1 2 1 1 1 a 100 0 7+9 5+10 1995 Athlet* A 100 10 2 3 8 5 4 9 a 100 0 6+8 5+10 1996 Banquet A 100 2 2 4 1 2 1 19 a 100 0 7+8 5+10 2001 Barroko A 100 4 3 4 9 1 1 4 a 100 1 7+9 5+10 2005 Barryton A 79 4 0 4 6 3 2 1 B 21 3 2 4 6 3 2 1 a 100 1 7+9 5+10 2007 Biscay A 100 4 0 4 1 2 4 1 a 100 0 6+8 2+12 2005 Batis A 100 9 2 4 8 3 2 1 a 100 1 7+9 5+10 2001 29
Bill A 100 10 0 4 1 2 2 4 a 100 0 7+9 2+12 2002 Blava* A 100 2 0 1 12 1 3 6 a 100 0 7+9 5+10 1992 Bohemia A 100 4 0 4 2 2 2 1 a 100 0 17+18 5+10 2007 Boka A 100 2 0 1 1 2 4 4 a 100 0 7+9 5+10 1995 Brea A 100 2 0 4 1 1 1 9 a 100 0 7+9 5+10 1996 Bruneta A 100 2 0 1 1 1 1 1 a 100 0 7+9 5+10 1996 Bruta A 100 2 0 4 1 1 1 1 a 100 0 6+8 5+10 1994 Buteo A 100 9 2 4 8 3 2 2 a 100 0 6+8 5+10 2006 Caphorn A 100 4 0 4 1 5 1 1 a 100 1 7+9 5+10 2004 Clarus A 100 2 3 3 1 3 2 2 a 100 0 6+8 2+12 2003 Clever A 100 2 0 4 1 2 2 1 a 100 1 6+8 2+12 2002 Complet A 100 10 0 4 9 2 8 1 a 100 1 6+8 5+10 2000 Contra A 100 4 0 4 1 3 1 1 a 100 0 6+8 2+12 1998 Corsaire A 100 2 0 5 8 2 2 1 a 100 0 6+8 4+12 1999 Cubus A 100 0 2 4 1 5 2 6 a 100 0 7+9 5+10 2004 Darwin A 100 9 0 4 1 2 8 5 a 100 0 6+8 5+10 2004 Drifter A 100 9 0 5 1 5 8 6 a 100 0 7+8 2+12 2000 Dromos A 100 9 2 4 8 4 1 6 a 100 1 7+9 2+12 2006 Ebi A 100 2 0 4 9 3 4 5 a 100 0 7+8 5+10 1997 Estika A 100 10 2 4 1 2 1 1 a 100 0 6+8 2+12 1995 Etela A 100 2 0 3 7 3 3 2 a 100 0 6+8 2+12 2006 a 84 1 17+18 5+10 Eurofit A 100 9 2 4 2 5 8 6 b 11 1 7+9 5+10 2006 c 5 1 6+8 5+10 Floret A 100 0 3 4 1 1 13 1 a 100 2* 7+8 5+10 2006 Globus A 100 2 0 4 1 2 1 1 a 100 1 6+8 2+12 2003 Hana* A 100 3 1 4 9 2 1 9 a 100 0 7+8 5+10 1985 Hedvika A 100 9 2 4 2 2 1 1 a 100 0 6+8 2+12 2004 Hermann A 100 4 0 4 2 3 1 1 a 100 0 7 2+12 2007 Heroldo A 88 9 0 4 1 5 2 4 a 100 1 7 5+10 2005 Ines** A 100 2 2 4 1 2 1 1 a 100 0 7+8 2+12 2004 Ilias A 100 9 2 4 1 2 3 6 a 100 1 20 5+10 2003 Ilona* A 96 3 0 1 13 1 1 6 B 4 12 0 1 13 1 1 6 a 100 0 7+9 5+10 1989 30
Karolinum A 67 9 0 3 1 3 1 4 B 33 9 0 4 1 3 1 4 a 100 1 17+18 5+10 2003 Kerubino A 100 6 0 4 2 3 1 4 a 100 0 7+9 2+12 2007 Košútka A 100 4 3 15 2 3 3 2 a 100 0 7+9 5+10 1981 Livia A 100 15 0 3 2 3 1 2 a 100 0 7+9 5+10 1991 Ludwig A 100 2 0 4 8 5 3 6 a 100 0 6+8 5+10 2000 Manager A 100 4 0 4 8 3 2 1 a 100 1 6+8 2+12 2007 Meritto A 58 4 0 4 1 2 1 1 B 42 4 0 4 1 2 4 1 a 100 0 6+8 2+12 2003 Mladka A 76 4 0 1 9 3 1 9 B 24 4 0 4 9 3 1 9 a 100 0 7+9 2+12 2002 Mona A 100 10 0 3 1 3 1 2 a 100 0 7+9 5+10 1994 Mulan A 100 4 0 5 1 2 2 1 a 100 1 7+8 2+12 2007 Nela A 100 2 2 4 1 3 3 1 a 100 0 7+8 5+10 1998 Niagara A 81 2 0 1 1 1 1 1 B 19 2 0 4 1 1 1 1 a 100 0 7+9 5+10 1999 Raduza A 59 10 3 4 8 3 2 1 B 41 10 3 4 1 3 2 1 a 100 1 7+9 5+10 2006 Rapsodia A 100 4 0 3 1 4 1 1 a 100 0 17+18 2+12 2003 Record A 100 4 0 4 1 5 1 6 a 100 0 7+9 2+12 1999 Regina A 100 9 2 4 1 2 1 1 a 100 0 7+9 5+10 1982 Rexia* A 100 4 3 1 9 1 1 6 a 100 1 7+9 5+10 1994 Rheia A 100 14 0 4 1 2 1 1 a 100 1 6+8 5+10 2002 Rialto A 100 9 0 3 1 3 3 6 a 100 1 17+18 5+10 1999 Ritmo* A 100 4 0 4 9 2 2 19 a 100 1 6+8 2+12 1996 Sakura A 100 9 2 4 3 2 1 9 a 100 0 7+8 5+10 2007 Samanta A 100 2 0 4 1 2 1 1 a 100 0 7+8 5+10 1993 Samara A 100 10 0 4 1 2 2 4 a 100 0 6+8 2+12 1995 Saskia A 100 2 0 4 1 1 1 9 a 100 0 7+8 5+10 1996 Semper A 100 3 3 4 1 1 1 6 a 100 0 7+9 2+12 1999 Sepstra A 87 9 0 4 1 2 2 1 B 13 9 3 4 1 2 2 1 a 100 0 7+9 2+12 1999 Sida* A 100 2 0 3 1 3 1 1 a 100 0 7+9 2+12 1993 Simila A 100 2 0 4 1 2 1 6 a 100 0 7+8 5+10 2006 31
Siria A 68 4 0 4 9 2 1 5 B 32 4 2 4 9 2 1 5 a 100 0 7+9 5+10 1994 Solara A 100 2 0 1 2 1 3 1 a 100 0 7+9 5+10 1998 Sulamit A 100 3 2+3 4 8 2 1 4 a 100 0 17+18 5+10 2000 Svitava A 100 4 0 4 1 1 2 1 a 100 0 6+8 5+10 2001 Šárka A 83 2 0 4 1 3 1 4 B 17 2 0 4 1 3 1 9 a 100 0 7+8 5+10 1997 Tower A 100 3 0 4 1 2 1 6 a 100 0 6+8 2+12 1998 Trend* A 100 9 0 4 1 2 2 1 a 100 0 7 5+10 2002 Versailles A 100 4 0 4 1 2 1 4 a 100 1 6+8 2+12 1997 Viginta* A 100 2 0 1 1 1 1 1 a 100 0 7+9 5+10 1984 Vlada A 100 14 3 1 5 2 1 2 a 100 1 7+9 5+10 1990 Vlasta A 100 1 2+3 4 1 2 3 6 a 100 1 7+8 5+10 1999 A 42 2 0 4 1 3 12 5 Winsdor B 25 2 0 3 1 3 12 5 a 100 0 6+8 2+12 2001 C 33 9 0 4 1 3 12 5 Vysvětlivky: velká písmena - SGE gliadinová linie malá písmena - SDS PAGE gliadinová linie * registrace zrušena 2007 * * bez ověření užitné hodnoty (ÚKZÚZ) 32
6. Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty Pšenice je jednou z našich nejvýznamnějších obilnin a pěstuje se ve všech výrobních podmínkách České republiky. Stále větší důraz se klade na jakost produkce, jejíž nedílnou součástí je i záruka odrůdové pravosti a odrůdové čistoty. Právě odrůda představuje významný výrobní prostředek, intenzifikující rostlinnou výrobu a současně je považována za spolehlivou záruku vytváření dědičných znaků a agronomických, nutričních a technologických vlastností. Každá odrůda se vyznačuje specifickým souborem vlastností, které rozhodují o jejím využití. Je proto v zájmu výrobců osiv, sadby, i v zájmu pěstitelů, nákupu, zpracovatelského průmyslu, vnitřního a zahraničního obchodu používat jen správně zvolené a spolehlivě určené odrůdy. K identifikaci odrůd pšenice lze využít účinně výše uvedených elektroforetických metod. Základem využívání elektroforézy genetických markerů pro identifikaci odrůd je však vytvoření vzorových elektroforetických spekter bílkovin jednotlivých odrůd - etalonů. Tato vzorová elektroforetická spektra mohou být vyjádřena rovněž v podobě alelického vzorce (souborů alelických bloků společně děděných zón, vyčleněných z elektroforetických spekter gliadinů či gluteninů (Viz 5.). Neúčelněji lze hodnotit odrůdovou pravost či odrůdovou čistotu elektroforetickou analýzou jednotlivých zrn. Hodnocení elektroforeogramů jednotlivých zrn pak vychází z celkového počtu hodnotitelných elektroforeogramů, nikoliv z celkového počtu elektroforetických analýz provedených v rámci zkoušky příslušné dávky. Hodnotitelným se rozumí elektroforeogram s jednoznačně odečitatelnými zónami (proužky), případně gliadinovými nebo gluteninovými alelickými bloky. Ke správné interpretaci výsledků identifikace je nutno si položit některé otázky, které mohou vést k vypracování nejvhodnějšího postupu, který nám umožní identifikaci odrůdy v závislosti na daných okolnostech. 1. Odpovídá vzorek deklaraci? Určit deklaraci zpravidla umožňuje vizuální porovnání spektra testovaného vzorku s etalonovým spektrem deklarované odrůdy (nejlépe analyzované společně s testovaným vzorkem). Je tudíž evidentní, zda jsou či nejsou stejné. Zjištěné rozdíly mohou být důsledkem chybné deklarace odrůdy nebo mohou svědčit o příměsi jiné odrůdy. 2. Je to ta či ona odrůda? Takto často se ptáme, pokud dojde k popletení vzorků (např. v důsledku nejasného nápisu na obalu). Tuto otázku by měla vyřešit analýza testovaného vzorku současně s originálními (etalonovými) vzorky očekávaných odrůd. 3. Jaká je to odrůda? Tato otázka nastává, jestliže výsledkem analýzy vzorku (viz bod 1) zní: odrůda neodpovídá deklaraci. Na tuto otázku je obtížné odpovědět, pokud neznáme dostatek podkladů, které by nám ozřejmily, jaká etalonová odrůda by měla být analyzována současně s testovaným vzorkem. V tomto případě je nutno provést analýzu testovaného vzorku a výsledný elektroforeogram porovnat s etalonovými elektroforeogramy odrůd, které máme soustředěny v katalogu. Testovaný vzorek může být i odrůda, která není popsaná v katalogu, pak ji lze označit jako neznámý genotyp (NG). 33