cobas 4800 HPV Test PRO Ú ELY DIAGNOSTIKY IN VITRO.

cobas 4800 HPV Test PRO Ú ELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. cobas 4800 System Sample Preparation Kit c4800 SMPL PREP 960 Tests P/N: 05235804190 240 Tests P/N: 05235782190 cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit c4800 HPV AMP/DET 960 Tests P/N: 05235910190 240 Tests P/N: 05235901190 cobas 4800 HPV Controls Kit c4800 HPV CTLS 10 Sets P/N: 05235855190 cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit c4800 LIQ CYT 960 Tests P/N: 05235839190 240 Tests P/N: 05235812190 cobas 4800 System Wash Buffer Kit c4800 WB 960 Tests P/N: 05235871190 240 Tests P/N: 05235863190 POZNÁMKA: Díky koupi tohoto produktu m že zákazník provád t amplifikaci a detekci sekvencí nukleové kyseliny pomocí polymerázové et zové reakce (PCR) a souvisejících proces s využitím diagnostiky in vitro. Tímto se neudílí žádný obecný patent ani jiná licence jakéhokoliv typu mimo toto konkrétní právo použití. Ú EL POUŽITÍ Test cobas 4800 pro detekci lidského papilloma viru (HPV) je kvalitativní test in vitro pro detekci lidského papilloma viru v pacientských vzorcích. Test využívá amplifikace cílové DNA pomocí polymerázové et zové reakce (PCR) a hybridizace nukleové kyseliny pro detekci 14 vysoce rizikových (HR) HPV typ v jedné analýze. Test specificky detekuje HPV16 a HPV18 a sou asn detekuje i ostatní vysoce rizikové typy (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68) v klinicky relevantních infek ních hladinách. Vzorky jsou omezeny na cervikální bu ky odebrané do PCR bun ného odb rového média cobas (Roche Molecular Systems, Inc.), roztoku PreservCyt Solution (Hologic Corp.) a konzerva ního roztoku SurePath TM (BD Diagnostics-TriPath). Indikace použití testu cobas 4800 HPV jsou: (a) Test cobas 4800 HPV je ur en pro skríning pacientek s cervikálními cytologickými výsledky ASC-US (atypické šupinovité bu ky neznámého významu) pro stanovení nutnosti provedení kolposkopie. (b) Test cobas 4800 HPV je ur en pro použití u pacientek s cervikálními cytologickými výsledky ASC-US pro vyhodnocení p ítomnosti nebo nep ítomnosti vysoce rizikového HPV typu 16 a 18. (c) Test cobas 4800 HPV je ur en pro použití u pacientek s cervikálními cytologickými výsledky k dodate nému skríningu p ítomnosti nebo nep ítomnosti vysoce rizikových typ HPV. (d) Test cobas 4800 HPV je ur en pro použití u pacientek s cervikálními cytologickými výsledky k dodate nému skríningu p ítomnosti nebo nep ítomnosti vysoce rizikového HPV typu 16 a 18. (e) Test cobas 4800 HPV je ur en pro použití jako primární skríningový test za ú elem identifikace žen se zvýšeným rizikem rozvoje rakoviny d ložního ípku nebo p ítomnosti vysokého stupn onemocn ní. (f) Test cobas 4800 HPV je ur en pro použití jako primární skríningový test p ítomnosti nebo nep ítomnosti HPV typu 16 a 18. Výsledky testu cobas HPV spole n s léka ským vyhodnocením anamnézy cytologie, dalších rizikových faktor a odborných zásad lze použít jako vodítko p í lé b pacientek. Ú elem testu cobas HPV není zabránit provedení kolposkopie u žen. SOUHRN A VÝKLAD TESTU Perzistující infekce lidským papilloma virem (HPV) je p í inou karcinomu ípku a p edcházející cervikální intraepiteliální neoplázie (CIN) 1 3. P ítomnost HPV byla zaznamenána u více než 99 % p ípad karcinomu ípku na celém sv t 3. HPV je malý neobalený virus s dvouvláknovou DNA, jehož genom obsahuje p ibližn 8000 nukleotid. Existuje více než 118 r zných typ HPV viru 4,5 a p ibližn 40 r zných HPV typ, které mohou infikovat sliznici lidského genitálu 6,7. Ale pouze podskupina 13 až 18 t chto typ je považována za vysoce rizikovou pro vznik karcinomu ípku a jemu p edcházejících lézí 3,8 13. Podle analýzy údaj z multicentrické studie p ípad a kontrol Mezinárodní agentury pro výzkum rakoviny (IARC), smíšený OR (pom r šancí Odds Ratio) pro šupinovité bu ky karcinomu d ložního ípku s infekcí HPV byl 158,2, když byla analýza omezena na studie provedené pomocí dob e validovaných HPV detek ních technik 12. V této studii se pom r šancí u karcinomu d ložního ípku pohyboval mezi 109 až 276 ve studiích z r zných ástí sv ta 12. P estože je perzistující infekce vysoce rizikovým (HR) virem HPV nutnou p í inou karcinomu ípku a jemu p edcházejících lézí, velmi malé procento infekcí postoupí do tohoto stavu onemocn ní. Sexuáln p enášená infekce HPV je velmi astá. Odhaduje se, že až 75 % všech žen je n kdy exponováno infekci HPV 14. Ale více než 90 % infikovaných žen vytvo í ú innou imunní odpov a po 6 až 24 m sících infekce odezní bez jakýchkoli dlouhodobých zdravotních následk 15 20. Infekce jakýmkoli typem HPV m že mít za následek cervikální intraepiteliální neoplázii (CIN), i když i ta zpravidla ustoupí, jakmile odezní infekce HPV 21. V rozvinutých zemích se screeningovými programy karcinomu ípku je od poloviny 50. let používán Pap st r jako primární nástroj pro detekci asných zm n p edcházejících karcinomu ípku. I když v t chto zemích došlo k dramatickému snížení mortality na karcinom ípku, Pap st r vyžaduje interpretaci velmi zkušeným cytopatologem a je relativn nep esným testem s vysokým po tem falešn negativních výsledk. Cytologické abnormality pozorované v Pap st ru jsou primárn zp sobeny infekcí HPV. Nicmén r zné zán tlivé a odb rové variace mohou zp sobit falešn pozitivní výsledky Pap st r. T íd ní abnormálních Pap st r zahrnuje opakované testování, kolposkopii a biopsii. Histologicky ov ená léze vysokého stupn dysplázie musí být chirurgicky odstran na pro prevenci vzniku invazivního karcinomu ípku. Oddíl s informacemi o revizi dokumentu se nachází na konci tohoto dokumentu. 05990289001-13CS 1 Doc Rev. 13.0

Kultivace papillomaviru je v podmínkách in vitro extrémn obtížná a protilátková odpov není u všech pacient infikovaných HPV prokazatelná. Testování nukleové kyseliny (DNA) pomocí PCR je neinvazivní metodou pro stanovení p ítomnosti aktivní cervikální infekce HPV virem. Zavedení testování DNA HPV zvýšilo ú innost skríningových program rakoviny d ložního ípku asn jším detekováním vysoce rizikových lézí u žen ve v ku 30 let a starších s cytologií NILM a snížením nutnosti provád t nepot ebnou kolposkopii a lé bu u pacientek ve v ku 21 a starších s cytologickým nálezem ASC-US. Krom toho byla dob e zdokumentována vynikající citlivost test HPV u st r Pap p i detekci vysokého stupn onemocn ní u skupiny podléhající skríningu 22,23. Díky své vynikající citlivostí byl test DNA HPV nabídnut a zaveden v n kterých skríningových programech jako primární skríningový test. PRINCIPY POSTUPU Test cobas 4800 HPV je založen na dvou základních postupech: (1) automatizovaná p íprava vzork pro simultánní extrakci HPV a bun né DNA; (2) PCR amplifikace 24 cílových sekvencí DNA pomocí HPV a pár komplementárních primer specifických pro -globin a detekce rozšt pených fluorescen ních HPV a -globin specifických oligonukleotidových detek ních sond v reálném ase. Soub žná extrakce, amplifikace a detekce -globinu v testu cobas 4800 HPV monitoruje celý postup testu. inidlo Master Mix pro test cobas 4800 HPV obsahuje páry primer a sondy specifické na 14 vysoce rizikových typ HPV a -globin DNA. Detekce amplifikované DNA (amplikon) probíhá b hem tepelného cyklu pomocí oligonukleotidových sond zna ených ty mi r znými fluorescen ními barvivy. Amplifikovaný signál dvanácti vysoce rizikových typ HPV (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68) je detekován pomocí stejného fluorescen ního barviva, zatímco signály HPV16, HPV18 a -globinu se detekují pomocí svých vlastních dedikovaných barviv. P íprava vzorku P íprava vzorku testu cobas 4800 HPV je automatizována díky použití za ízení cobas x 480. Cervikální vzorky odebrané do PCR bun ného odb rového média cobas, roztoku PreservCyt nebo konzerva ního roztoku SurePath TM se rozpoušt jí za denatura ních podmínek p i zvýšených teplotách a poté jsou rozšt peny za p ítomnosti chaotropického inidla. Uvoln né nukleové kyseliny HPV spolu s p idanou kontrolou DNA -globinu jsou purifikovány pomocí absorpce na magnetické sklen né ástice, promyty a nakonec separovány z t chto ástic, ímž jsou p ipraveny k PCR amplifikaci a detekci. PCR amplifikace Volba cílové sekvence Test cobas 4800 HPV využívá primery pro definování sekvence asi 200 nukleotid v rámci polymorfního regionu L1 v genomu HPV. Sm s HPV primer p ítomná ve sm si Master Mix je navržena pro amplifikaci HPV DNA z 14 vysoce rizikových typ (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68) 3,8 13,25. Fluorescen ní oligonukleotidové sondy se vážou na polymorfní regiony v sekvenci definované t mito primery. Další pár primer a sonda je namí eny na gen lidského -globinu (amplikon 330 bp), aby umožnily kontrolu procesu. Amplifikace cíle EagleZ05 DNA polymeráza 26, chemicky modifikovaná verze Thermus species Z05 DNA polymerázy 27, se využívá k horkému startu amplifikace cílové HPV a -globinové kontroly. Nejprve se reak ní sm s pro PCR zah ívá, aby se aktivovala EagleZ05 DNA polymeráza k denaturaci virové DNA a genomické DNA a expozici primerových cílových sekvencí. B hem ochlazování sm si dochází k anelaci upstream a downstream primer k sekvencím cílové DNA. EagleZ05 DNA polymeráza za p ítomnosti dvojmocných kovových iont a nadbytku dntp primer(y) prodlužuje a syntetizuje se druhý et zec DNA. Tím se uzavírá první cyklus PCR, který poskytuje dvou et zcovou DNA kopii cílového regionu genomu HPV a genu -globinu. DNA polymeráza prodlužuje primery po anelaci podél cílových vzor a poskytuje molekulu dvou et zcové DNA cílového HPV se zhruba 200 páry bází nebo molekulu DNA -globinu se 330 páry bází, které se íká amplikon. Tento proces se n kolikrát opakuje a v každém cyklu se efektivn zdvojnásobuje množství amplikonové DNA. Amplifikace probíhá pouze v oblasti genomu HPV a/nebo genu -globinu mezi p íslušným primerovým párem. Celý genom amplifikován není. Automatická detekce v reálném ase Test cobas 4800 HPV využívá v reálném ase b žící 29,30 PCR technologii. Každá oligonukleotidová sonda v reakci je ozna ena fluorescen ním barvivem, které slouží jako oznamovací, a dalším barvivem, které je tlumicí a tlumí fluorescen ní emise z barviva v intaktní sond. Jak amplifikace pokra uje, sondy komplementární k amplikonu se vážou na specifické jednovláknové DNA sekvence a jsou rozšt peny 5' až 3' nukleázovou aktivitou EagleZ05 DNA polymerázy. Jakmile je pomocí této nukleázové aktivity separováno oznamovací barvivo od tlumicího barviva, po excitaci p íslušným sv telným spektrem se emituje fluorescen ní signál o specifické vlnové délce. Tato specifická vlnová délka pro každé barvivo umož uje nezávisle zm it HPV16 amplikon, HPV18 amplikon, jiné vysoce rizikové amplikony (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68) a -globinovou kontrolu, protože sondy specifické pro tyto sekvence jsou ozna eny r znými barvivy. Selektivní amplifikace Selektivní amplifikace cílové nukleové kyseliny z klinického vzorku se dosahuje v testu cobas 4800 HPV použitím enzymu AmpErase (uracil- N-glykosylázy) a deoxyuridin-trifosfátu (dutp). Enzym AmpErase rozpozná a katalyzuje rozklad et zc DNA obsahujících deoxyuridin 28, ale nikoli DNA obsahující deoxytymidin. Deoxyuridin se v p irozené DNA nevyskytuje, je však vždy p ítomen v amplikonu díky tomu, že se jako jeden z dntp v inidle Master Mix místo thymidintrifosfátu používá deoxyuridintrifosfát; proto je deoxyuridin obsažen pouze v amplikonu. V d sledku p ítomnosti deoxyuridinu je kontaminující amplikon citlivý v i destrukci enzymem AmpErase p ed amplifikací cílové DNA. Enzym AmpErase, který je obsažen ve sm si inidla Master Mix, katalyzuje št pení DNA obsahující deoxyuridin v míst deoxyuridinového zbytku rozev ením deoxyribozového et zce v pozici C1. Když je et zec amplikonové DNA v prvním tepeln cykliza ním kroku zah íván, št pí se v poloze deoxyuridinu, ímž se DNA stává neamplifikovatelnou. P i teplotách nad 55 C, tedy b hem tepelného cyklování, je enzym AmpErase inaktivní, a proto cílový amplikon nerozkládá. Je prokázáno, že enzym AmpErase v testu cobas 4800 HPV inaktivuje minimáln 10 3 kopií deoxyuridin-obsahujícího HPV amplikonu na jednu PCR. 05990289001-13CS 2 Doc Rev. 13.0

INIDLA cobas 4800 System Sample Preparation Kit Souprava pro p ípravu vzork pro systém cobas 4800 (P/N: 05235782190) MGP (Magnetické sklen né ástice pro systém cobas 4800) Magnetické sklen né ástice 93 % Isopropanol Xi 93 % (hm.) Isopropanol c4800 SMPL PREP 240 test 10 x 4,5 ml F Dráždivý 93 % (hm.) Isopropanol Vysoce ho lavý R: 11-36-67, S: 7-16-24/25-26 EB (Elu ní pufr pro systém cobas 4800) Pufr Tris-HCl 0,09 % azid sodný cobas 4800 System Sample Preparation Kit Souprava pro p ípravu vzork pro systém cobas 4800 (P/N: 05235804190) MGP (Magnetické sklen né ástice pro systém cobas 4800) Magnetické sklen né ástice 93 % Isopropanol Xi 93 % (hm.) Isopropanol c4800 SMPL PREP 10 x 18 ml 960 test 10 x 13,5 ml F Dráždivý 93 % (hm.) Isopropanol Vysoce ho lavý R: 11-36-67, S: 7-16-24/25-26 EB (Elu ní pufr pro systém cobas 4800) Pufr Tris-HCl 0,09 % azid sodný cobas 4800 System Wash Buffer Kit Souprava promývacího pufru pro systém cobas 4800 (P/N: 05235863190) WB (Promývací pufr pro systém cobas 4800) Dihydrát citrátu sodného 0,05 % N-metylizotiazolon HCl cobas 4800 System Wash Buffer Kit Souprava promývacího pufru pro systém cobas 4800 (P/N: 05235871190) WB (Promývací pufr pro systém cobas 4800) Dihydrát citrátu sodného 0,05 % N-metylizotiazolon HCl c4800 WB c4800 WB 10 x 18 ml 240 test 10 x 55 ml 960 test 10 x 200 ml 05990289001-13CS 3 Doc Rev. 13.0

cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit Souprava pro p ípravu kapalných cytologických vzork pro systém cobas 4800 (P/N: 05235812190) PK (Proteináza K cobas 4800) Pufr Tris-HCl < 0,05 % EDTA Glycerol Chlorid vápenatý Octan vápenatý < 2 % proteináza K Xn < 2 % (hm.) proteináza K c4800 LIQ CYT 240 test 10 x 0,9 ml Zdraví škodlivý SDS (SDS inidlo pro systém cobas 4800) Pufr Tris-HCl 0,2 % SDS 0,09 % azid sodný LYS (Lytický pufr pro systém cobas 4800) Pufr Tris-HCl 37 % guanidin HCl < 5 % polydokanol Xn 37 % (hm) guanidin HCl 10 x 3 ml 10 x 10 ml Zdraví škodlivý R: 22-36/38, S: 13-26-36-46 N < 5 % (hm.) polydokanol Nebezpe ný pro životní prost edí R: 22-41-50, S: 26-39-61 cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit Souprava pro p ípravu kapalných cytologických vzork pro systém cobas 4800 (P/N: 05235839190) PK (Proteináza K cobas 4800) Pufr Tris-HCl < 0,05 % EDTA Glycerol Chlorid vápenatý Octan vápenatý < 2 % proteináza K Xn < 2 % (hm.) proteináza K c4800 LIQ CYT 960 test 20 x 1,2 ml Zdraví škodlivý SDS (SDS inidlo pro systém cobas 4800) Pufr Tris-HCl 0,2 % SDS 0,09 % azid sodný 10 x 9 ml 05990289001-13CS 4 Doc Rev. 13.0

LYS (Lytický pufr pro systém cobas 4800) Pufr Tris-HCl 37 % guanidin HCl < 5 % polydokanol Xn 37 % (hm) guanidin HCl 10 x 36 ml Zdraví škodlivý R: 22-36/38, S: 13-26-36-46 N < 5 % (hm.) polydokanol Nebezpe ný pro životní prost edí R: 22-41-50, S: 26-39-61 cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit c4800 HPV AMP/DET 240 test Souprava pro amplifikaci/detekci HPV pro systém cobas 4800 (P/N: 05235901190) HPV MMX 10 x 0,5 ml (Master Mix HPV pro cobas 4800) Tricinový pufr Octan draselný Hydroxid draselný Glycerol < 0,13 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0.01 % Upstream a downstream HPV primery < 0,01 % Upstream a downstream -globin primery < 0,01 % fluorescen ní HPV sondy < 0,01 % fluorescen ní -globin sondy < 0,10 % EagleZ05 DNA polymeráza (mikrobiální) < 0,10 % AmpErase (uracil-n-glykozyláza) enzym (mikrobiální) 0,09 % azid sodný HPV Mg/Mn 10 x 1,0 ml (Roztok HPV Mg/Mn pro cobas 4800) Octan ho e natý Octan manganatý < 0,02 % ledová kyselina octová 0,09 % azid sodný cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit c4800 HPV AMP/DET 960 test Souprava pro amplifikaci/detekci HPV pro systém cobas 4800 (P/N: 05235910190) HPV MMX 20 x 1,0 ml (Master Mix HPV pro cobas 4800) Tricinový pufr Octan draselný Hydroxid draselný Glycerol < 0,13 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0.01 % Upstream a downstream HPV primery < 0,01 % Upstream a downstream -globin primery < 0,01 % fluorescen ní HPV sondy < 0,01 % fluorescen ní -globin sondy < 0,10 % EagleZ05 DNA polymeráza (mikrobiální) < 0,10 % AmpErase (uracil-n-glykozyláza) enzym (mikrobiální) 0,09 % azid sodný HPV Mg/Mn 10 x 1,0 ml (Roztok HPV Mg/Mn pro cobas 4800) Octan ho e natý Octan manganatý < 0,02 % ledová kyselina octová 0,09 % azid sodný 05990289001-13CS 5 Doc Rev. 13.0

cobas 4800 HPV Controls Kit Kontrolní souprava HPV pro systém cobas 4800 c4800 HPV CTLS 10 sad (P/N: 05235855190) HPV (+) C 10 x 0,5 ml (Pozitivní kontrola HPV cobas 4800) Pufr Tris-HCl EDTA 0,05 % azid sodný < 0,00001 % poly ra RNA (syntetická) < 0,00001 % neinfek ní plasmid DNA (mikrobiální) obsahující HPV sekvence 16, 18, 39 < 0,00001 % neinfek ní plasmid DNA (mikrobiální) obsahující sekvence lidského -globinu ( ) C 10 x 0,5 ml (Negativní kontrola pro systém cobas 4800) Pufr Tris-HCl EDTA 0,05 % azid sodný < 0,00001 % poly ra RNA (syntetická) POZN.: Bezpe nostní ozna ení produkt vychází primárn z pokyn GHS EU. POZN.: V p ípad pot eby si p e t te p íslušnou p íru ku obsluhy. Uživatelé verze softwaru 2.1 nebo vyšší si p e tou p íru ku obsluhy pro systém cobas 4800 a uživatelskou p íru ku k testu cobas HPV. VAROVÁNÍ A BEZPE NOSTNÍ OPAT ENÍ A. PRO Ú ELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. B. Tento test je ur en pro cervikální vzorky odebrané pomocí PCR bun ného odb rového média cobas, roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM. C. Nepipetujte ústy. D. V pracovních laboratorních prostorách nejezte, nepijte a neku te. P i manipulaci se vzorky a s inidly ze soupravy noste ochranné rukavice na jedno použití, laboratorní plášt a prost edek pro ochranu o í. Po práci se vzorky a zkušebními inidly si d kladn umyjte ruce. E. Zamezte mikrobiální a DNA kontaminaci inidel. F. Nespot ebovaná inidla a odpad likvidujte v souladu s celostátními a místními p edpisy. G. Nepoužívejte po uplynutí data exspirace. H. inidla nemíchejte. I. Bezpe nostní listy pro materiály (MSDS) zašle na vyžádání Vaše místní pobo ka spole nosti Roche. J. Je nutné nosit rukavice. Aby nedošlo ke kontaminaci, musí se rukavice vym nit mezi manipulací se vzorky a manipulací s inidly pro cobas 4800. K. Manipulace se vzorky se musí ídit pravidly pro zacházení s infek ním materiálem. Musí být používány bezpe né laboratorní postupy, nap. postupy uvedené v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 31 a v dokumentu CLSI. M29-A3 32. L. LYS obsahuje guanidin-hydrochlorid. Nesmí dojít k p ímému kontaktu guanidin-hydrochloridu a chlornanu sodného (b licí prost edek) nebo jiných vysoce reaktivních inidel jako jsou kyseliny nebo zásady. Z t chto sm sí by se mohl uvol ovat škodlivý plyn. Pokud se kapalina obsahující guanidin-hydrochlorid rozlije, postižené místo vy ist te vodou s vhodným laboratorním detergentem. Jestliže dojde k rozlití potenciáln infek ních látek, vy ist te místo NEJPRVE vodou s vhodným laboratorním detergentem a potom 0,5% chlornanem sodným. M. MGP obsahuje isopropanol a je vysoce ho lavý. Uchovávejte mimo otev ený ohe a prost edí, ve kterém se mohou vytvá et jiskry. N. EB, SDS, HPV MMX, HPV Mg/Mn, ( ) C a HPV (+) C obsahují azid sodný. Ten m že reagovat s olov ným nebo m d ným potrubím a vytvá et vysoce explozivní kovové azidy. P i likvidaci roztok obsahujících azid sodný do laboratorního umyvadla propláchn te odtok velkým množstvím studené vody, abyste tak zabránili vytvá ení azid. O. P i práci s jakýmikoliv inidly používejte rukavice na jedno použití, pracovní od v a ochranné brýle. Dbejte na to, aby se tyto materiály nedostaly do styku s pokožkou, o ima nebo sliznicemi. Pokud ke styku dojde, okamžit postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody. Pokud by byla tato opat ení zanedbána, m že dojít k popáleninám. Pokud dojde k rozlití, z e te je p ed vyt ením dosucha vodou. P. Všechny položky k jednorázovému použití použijte jen jednou. Pufr znovu nepoužívejte. Q. K išt ní za ízení cobas x 480 nebo analyzátoru cobas z 480 nepoužívejte roztok chlornanu sodného (b lidlo). Dojde-li k rozlití na za ízení cobas x 480 nebo na analyzátor cobas z 480, postupujte podle pokyn v p íslušné p íru ce obsluhy pro systém cobas 4800. R. Další varování, upozorn ní a postupy pro snížení nebezpe í kontaminace za ízení cobas x 480 nebo analyzátoru cobas z 480 najdete v p íslušné p íru ce obsluhy pro systém cobas 4800. POŽADAVKY NA SKLADOVÁNÍ A MANIPULACI A. inidla nezmrazujte. B. MGP, EB, PK, SDS, LYS, HPV MMX, HPV Mg/Mn, HPV (+) C a ( ) C uchovávejte p i 2-8 C. Tato inidla jsou stabilní do uvedeného data použitelnosti. C. WB uchovávejte p i 15-25 C. inidlo je stálé do vyzna eného data expirace. 05990289001-13CS 6 Doc Rev. 13.0

DODÁVANÝ MATERIÁL A. cobas 4800 System Sample Preparation Kit c4800 SMPL PREP 240 test Souprava pro p ípravu vzork pro systém cobas 4800 (P/N: 05235782190) MGP (Magnetické sklen né ástice pro systém cobas 4800) EB (Elu ní pufr pro systém cobas 4800) B. cobas 4800 System Sample Preparation Kit c4800 SMPL PREP 960 test Souprava pro p ípravu vzork pro systém cobas 4800 (P/N: 05235804190) MGP (Magnetické sklen né ástice pro systém cobas 4800) EB (Elu ní pufr pro systém cobas 4800) C. cobas 4800 System Wash Buffer Kit c4800 WB 240 test Souprava promývacího pufru pro systém cobas 4800 (P/N: 05235863190) WB (Promývací pufr pro systém cobas 4800) D. cobas 4800 System Wash Buffer Kit c4800 WB 960 test Souprava promývacího pufru pro systém cobas 4800 (P/N: 05235871190) WB (Promývací pufr pro systém cobas 4800) E. cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit c4800 HPV AMP/DET 240 test Souprava pro amplifikaci/detekci HPV pro systém cobas 4800 (P/N: 05235901190) HPV MMX (Master Mix HPV pro cobas 4800) HPV Mg/Mn (Roztok HPV Mg/Mn pro cobas 4800) F. cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit Souprava pro amplifikaci/detekci HPV pro systém cobas 4800 c4800 HPV AMP/DET 960 test (P/N: 05235910190) HPV MMX (Master Mix HPV pro cobas 4800) HPV Mg/Mn (Roztok HPV Mg/Mn pro cobas 4800) G. cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit c4800 LIQ CYT 240 test Souprava pro p ípravu kapalných cytologických vzork pro systém cobas 4800 (P/N: 05235812190) PK (Proteináza K cobas 4800) SDS (SDS inidlo pro systém cobas 4800) LYS (Lytický pufr pro systém cobas 4800) H. cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit c4800 LIQ CYT 960 test Souprava pro p ípravu kapalných cytologických vzork pro systém cobas 4800 (P/N: 05235839190) PK (Proteináza K cobas 4800) SDS (SDS inidlo pro systém cobas 4800) LYS (Lytický pufr pro systém cobas 4800) 05990289001-13CS 7 Doc Rev. 13.0

I. cobas 4800 HPV Controls Kit c4800 HPV CTLS 10 sad Kontrolní souprava HPV pro systém cobas 4800 (P/N: 05235855190) HPV (+) C (Pozitivní kontrola HPV cobas 4800) ( ) C (Negativní kontrola pro systém cobas 4800) POT EBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOU ÁSTÍ DODÁVKY Manipulace se vzorky a inidly PCR bun né odb rové médium cobas (Roche P/N 05619637190, nepovinné) Špi ky CO-RE, 1000 µl, stojan na 96 (Roche P/N 04639642001 nebo Hamilton P/N 235905) Zásobník na inidla 50 ml (Roche P/N 05232732001) Zásobník na inidla 200 ml (Roche P/N 05232759001) Pro test HPV ASAP v2.0.1 použijte extrak ní desti ku pro systém cobas 4800 (s hlubokými jamkami) 1,6 ml (Roche P/N 05232716001) Pro test HPV ASAP v2.1 použijte extrak ní desti ku pro systém cobas 4800 (s hlubokými jamkami) 2,0 ml (Roche P/N 06884008001) Mikrotitra ní desti ka a zalepovací fólie pro systém cobas 4800 0,3 ml (Roche P/N 05232724001) Pevný odpadový pytel [Roche P/N 05530873001 (malý) nebo 04691989001 (velký)] Plastová skluzavka na odpad Hamilton STAR (Roche P/N 04639669001) Zkumavky 13 ml s kulatým dnem, (Sarstedt P/N 60.541.122) pro použití jako sekundární zkumavky na vzorky Ví ka neutrální barvy (Sarstedt P/N 65.176.026) pro uzav ení 13 ml zkumavek Sarstedt s kulatým dnem po cyklu Rukavice na jedno použití bez pudru Vybavení a software Za ízení cobas x 480 Analyzátor cobas z 480 ídicí jednotka systému cobas 4800 se softwarem systému verze 2.1 nebo vyšší AP software cobas HPV verze 2.0 nebo vyšší pro systém cobas 4800 Volitelné vybavení a materiály cobas pufr pro p ípravu vzork (Roche P/N 06526985190; pufr Tris-HCl, 0,4% SDS, 0,09% azid sodný) Pipety: možný objem pipetování 1000 µl Špi ky s aerosolovou bariérou nebo špi ky bez DNázy: možný objem 1000 µl Centrifuga s kyvnou nádobou rotoru s min. otá kami 1500 Samostatná magnetická desti ka (Roche P/N 05440777001) Vortex mixer (pro jednu zkumavku) Vortex mixer pro více zkumavek [nap. VWR P/N 58816-116] Štítky s árovým kódem odolné proti teplotám (RACO Industries; kat.. RAC-225075-9501) Teplom r 20/150 C (VWR kat.. 89095-600) nebo ekvivalentní Digitální vyh ívací blok 120V (VWR kat.. 12621-096) nebo ekvivalentní Modul pro vyh ívací blok s 12 otvory 16 mm (VWR kat.. 13259-162) nebo ekvivalentní ODB R, P EPRAVA A SKLADOVÁNÍ VZORK POZN.: Se všemi vzorky je t eba zacházet jako s infek ními. A. Odb r vzork Cervikální vzorky odebrané pomocí PCR bun ného odb rového média cobas, roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM byly validovány pro použití s testem HPV cobas 4800. P i odb ru cervikálních vzork postupujte podle pokyn výrobce. B. P eprava vzork Cervikální vzorky odebrané pomocí PCR bun ného odb rového média cobas, roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM lze p epravovat p i teplotách 2 30 C. P i p eprav vzork HPV je t eba dodržovat celostátní resp. místní p edpisy o p eprav etiologických agens 33. POZN.: Jestliže testování nep edchází p edanalytická úprava obrácení matrixových vazeb, musí být vzorky SurePath p epravovány p i teplot 2 8 C. C. Skladování vzork Cervikální vzorky odebrané do PCR bun ného odb rového média cobas a roztoku PreservCyt je možné uchovávat p i teplot 2 30 C až 6 m síc od data odebrání. V konzerva ním roztoku SurePath TM je možno vzorky cervikálních bun k uchovávat p i teplot 2 8 C po dobu až 6 m síc od data odebrání. Cervikální vzorky odebrané do konzerva ního roztoku SurePath TM je možné skladovat p i 15-30 C až 6 týdn od data odb ru za p edpokladu, že matricové vazby vzniklé díky konzerva nímu roztoku SurePath TM budou b hem zpracování p ed testováním HPV obráceny pomocí pufru pro p ípravu vzork cobas (viz ást Vzorky a výsledky stability vzork ). 05990289001-13CS 8 Doc Rev. 13.0

NÁVOD K POUŽITÍ POZN.: Všechna inidla krom HPV MMX a HPV Mg/Mn musí mít p ed vložením do za ízení cobas x 480 okolní teplotu laborato e. HPV MMX a HPV Mg/Mn je možné vzít p ímo z místa skladování o teplot 2 8 C, protože se budou vyrovnávat na teplotu v za ízení cobas x 480 do doby, než se použijí v procesu. POZN.: Vzorky v PCR bun ném odb rovém médiu cobas, roztoku PreservCyt a konzerva ním roztoku SurePath TM musí mít p ed vložením do p ístroje cobas x 480 okolní teplotu laborato e. POZN.: Viz p íslušná p íru ka obsluhy pro systém cobas 4800, kde najdete podrobné postupy. Množství pro jeden cyklus: Systém cobas 4800 je navržen tak, aby dokázal pracovat s testy HPV cobas 4800, s množstvím 1 až 94 vzorky plus kontroly (až 96 test /cyklus). Každá souprava pro p ípravu vzork pro systém cobas 4800, souprava pro p ípravu kapalných cytologických vzork pro systém cobas 4800 a souprava promývacího pufru pro systém cobas 4800 obsahuje množství inidel dostate né pro 10 cykl po 24 testech (240 test v souprav ) nebo 96 test (960 test v souprav ). Každá souprava pro amplifikaci/detekci HPV pro systém cobas 4800 HPV obsahuje množství inidel dostate né pro 10 cykl po 24 testech (240 test v souprav ) nebo 96 test (960 test v souprav ); více souprav test s 240 testy je možné použít k optimalizaci použití inidel pro 48 nebo 72 test. Souprava kontrol HPV pro systém cobas 4800 HPV obsahuje dostate né množství inidel pro celkem 10 cykl (10 sad na soupravu). Minimální množství pro jedno m ení (cyklus) v systému cobas 4800 je 1 vzorek plus kontroly. Jeden replikát negativní kontroly systému cobas 4800 [( ) C] a jeden replikát HPV pozitivní kontroly cobas 4800 [HPV (+) C] jsou nutné k provedení každého cyklu (viz oddíl Kontrola kvality ). Pracovní postup: POZN.: Pro cyklus s 24 vzorky lze použít i soupravu pro p ípravu vzork pro 960 test, a pro cykly s 24, 48 a 72 vzorky lze použít soupravu pro amplifikaci a detekci HPV pro 960 vzork, i když inidla nebudou v takovém p ípad optimáln využita. P i spušt ní testu HPV cobas 4800 si lze v softwaru cobas 4800 vybrat jeden ze dvou pracovních postup : Full workflow (Úplný pracovní postup) a Recovery Workflow (Postup p i obnovení). Úplný pracovní postup HPV: Úplný pracovní postup HPV se skládá z p ípravy vzorku na za ízení cobas x 480 a poté následuje amplifikace a detekce na analyzátoru cobas z 480. Velikost cyklu m že být ve formátu s 24 testy (1 až 22 vzork plus 2 kontroly) nebo ve formátu s 96 testy (1 až 94 vzork plus 2 kontroly). Viz oddíl Provedení úplného pracovního postupu níže a p íslušná p íru ka obsluhy pro systém cobas 4800, kde najdete podrobnosti. Postup p i obnovení HPV: Postup p i obnovení HPV se skládá z manuálního nastavení desti ky PCR s použitím eluátu ze zpracované desti ky s hlubokými jamkami následované amplifikací/detekcí na analyzátoru cobas z 480. Viz oddíl Provedení pracovního postupu Obnovení níže a p íslušná p íru ka obsluhy pro systém cobas 4800, kde najdete podrobnosti. Vzorky: Testem HPV cobas 4800 je možné vyhodnotit t i typy cervikálních vzork : a) cervikální vzorky v roztoku PreservCyt, b) cervikální vzorky v PCR bun ném odb rovém médiu cobas a c) cervikální vzorky v konzerva ním roztoku SurePath TM. Vzorky v roztoku PreservCyt a PCR bun ném odb rovém médiu cobas je možné zpracovat p ímo z jejich primární nádobek s p íslušným árovým kódem nebo z ádn árovým kódem ozna ené 13ml zkumavky Sarstedt s kulatým dnem v za ízení cobas x 480. Vzorky SurePath, které nevyžadují p edb žnou úpravu pomocí pufru pro p ípravu vzork cobas, mohou být zpracovány p ímo z jejich primárních nádobek (bez plastových vložek) s náležitým árovým kódem nebo z ádn árovým kódem ozna ené 13ml zkumavky Sarstedt s kulatým dnem v za ízení cobas x 480. Vzorky v konzerva ním roztoku SurePath v primárních nádobách s plastovými vložkami není možné zpracovat p ímo z jejich primárních nádob. Tyto vzorky v konzerva ním roztoku SurePath je nutno p enést do ádn árovým kódem ozna ené 13 ml kulaté zkumavky Sarstedt a poté zpracovat v za ízení cobas x 480. Prostudujte si p íslušnou p íru ku obsluhy pro systém cobas 4800, kde najdete p íslušné postupy správného ozna ování pomocí árového kódu a seznam p ípustných árových kód pro systém cobas 4800. POZN.: Jestliže vzorky budou uchovávány p i teplot 2 8 C a testovány do 6 m síc, není nutné žádné další zpracování vzork v konzerva ním roztoku SurePath. Pokud jsou uchovávány p i teplot 15 30 C, musí být vzorky SurePath p ed testováním HPV v systému cobas 4800 zpracovány tak, aby došlo k obrácení matrixových vazeb. POZN.: Testy HPV p ímo z primárních lahvi ek SurePath bez plastových vložek je možné provést pouze p ed provedením cytologických test. Testování vzork SurePath po provedení cytologických test bude vyžadovat p enos alespo 1 ml vzorku do 13ml kulaté zkumavky Sarstedt ádn ozna ené árovým kódem. Zpracování primárních vzork SurePath v pufru pro p ípravu vzork cobas pro obrácení matricových vazeb POZN.: Pro zkumavky používané pro obrácení matricových vazeb jsou nutné štítky odolné proti teplotám (viz ást Volitelné vybavení a materiály). POZN.: Aby nedošlo k možné k ížové kontaminaci, je doporu eno, aby kroky B, C, G a H probíhaly pod digesto í. A. Pro každý vzorek SurePath si p ipravte 13ml kulatou zkumavku Sarstedt ozna enou árovým kódem s 0,5 ml pufru pro p ípravu vzork cobas. B. P ed p enesením vzorky SurePath míchejte ví ením 10 s. P eneste 0,5 ml každého vzorku SurePath do 13ml kulaté zkumavky Sarstedt p ipravené v kroku A. P ed p esunem k další zkumavce každou zkumavku uzav ete. Pro každý vzorek vždy vym te pipetovací špi ky. C. Každou zkumavku míchejte ví ením po dobu 1 s. D. Zkumavky p eneste do vyh ívací jednotky (viz ást Volitelné vybavení a materiály). V jedné dávce je možné zpracovat až 48 zkumavek. E. Zah ívejte 20 minut p i teplot 120 C. F. Po zah átí zkumavky vložte do sb rného stojanu a nechte 10 minut zchladnout p i teplot laborato e. 05990289001-13CS 9 Doc Rev. 13.0

G. Každou zkumavku míchejte ví ením po dobu 5 s. H. Zkumavky p eneste do stojan na vzorky s 24 pozicemi cobas 4800, odstra te ví ka a testujte na HPV v systému cobas 4800. Vzorky SurePath zpracované v pufru pro p ípravu vzork cobas je možné skladovat pro další testování HPV, nap. jestliže je nutné nejd íve vyhodnotit cytologii. Postup: A. Prove te výše uvedený postup až do kroku G. B. Skladujte vzorky SurePath zpracované v pufru pro p ípravu vzork cobas p i teplot 2-30 C až 4 týdny p ed testováním HPV v systému cobas 4800. POZN.: Minimální požadovaný objem v bun ném odb rovém médiu cobas PCR a v primárních nádobách s roztokem PreservCyt 3,0 ml. Minimální požadovaný objem v primárních nádobách SurePath bez plastových vložek je 5,0 ml. P i použití 13 ml kulatých sekundárních zkumavek je minimální požadovaný objem 1,0 ml a maximální objem 10 ml. POZN.: Používejte pouze PCR bun né odb rové médium cobas, roztok PreservCyt a konzerva ní roztok SurePath TM k odb ru cervikální vzork pro test cobas 4800 HPV. Test HPV cobas 4800 nebyl validován s jinými za ízeními pro odb r výt r nebo jinými typy médií. Užívání testu HPV cobas 4800 s jinými odb rovými za ízeními nebo typy médií by mohlo vést k falešn negativním, falešn pozitivním nebo neplatným výsledk m. POZN.: P ed zpracováním vzork v za ízení cobas x 480 m že být nutné vzorky rozd lit na alikvotní podíly do árovým kódem ozna ených 13 ml kulatých zkumavek Sarstedt. K manipulaci se vzorky používejte pipetory se špi kami s aerosolovou bariérou nebo s p ímým vypuzováním. Aby nedošlo ke k ížové kontaminaci zpracovaných vzork, je nutné po zpracování vzork použít pro uzav ení t chto zkumavek další ví ka jiné barvy (neutrální, viz oddíl Pot ebný materiál, který není sou ástí dodávky). POZN.: P i p enosu vzork z primárních nádob do 13 ml kulatých sekundárních zkumavek postupujte opatrn. P ed p enosem zamíchejte primární vzorky na vortexu. Po každém vzorku vym te pipetovací špi ky. POZN.: Nezpracovávejte vzorky, které nesou známky krve nebo mají tmav hn dou barvu. V jednom cyklu m že být jakákoli kombinace vzork (PCR bun né odb rové médium cobas, roztok PreservCyt nebo konzerva ní roztok SurePath TM ) a každý vzorek lze testovat s genotypizaním testem HPV High Risk, nebo HPV High Risk Plus. Pracovní postupy Provedení úplného pracovního postupu: A. Test HPV cobas 4800 je možné použít pro 1 až 94 vzorky a jednu negativní kontrolu pro systém cobas 4800 a jednu pozitivní kontrolu HPV cobas 4800. B. Podle pokyn v p íslušné p íru ce obsluhy pro systém cobas 4800 zapn te systém a prove te údržbu. C. Kliknutím na tla ítko New run spus te nový cyklus. D. V okn Selection test zvolte typ pracovního postupu Full a poté zvolte test HPV. E. Zadejte název cyklu nebo ponechejte výchozí název cyklu a pokra ujte kliknutím na OK. F. P i vkládání vzork postupujte podle softwarového pr vodce. POZN.: Vzorky v primárních nebo sekundárních zkumavkách ozna ených árovým kódem je možné vkládat v jakémkoli po adí. POZN.: Jestliže se zpracovávají primární nádoby se vzorky v PCR bun ném odb rovém médiu cobas nebo roztoku PreservCyt nebo konzerva ním roztoku SurePath (primární nádoby SurePath bez plastových vložek), p ed vložením je zamíchejte na vortexu. Pro každý vzorek zvolte typ vzorku. Pro vzorky v roztoku PreservCyt nebo v PCR bun ném odb rovém mediu cobas zvolte PC. Pro vzorky v konzerva ním roztoku SurePath zvolte SP. G. Pro každý vzorek zvolte požadovaný výsledek. Pro zprávu o kterémkoli z níže uvedených vysoce rizikových typ HPV nebo jejich kombinaci (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) zvolte požadovaný výsledek testu HPV High Risk Panel. Pro zprávu o kterémkoli z níže uvedených vysoce rizikových typ HPV nebo jejich kombinaci (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 a pro samostatnou zprávu o vysoce rizikovém HPV genotypu 16 a o vysoce rizikovém HPV genotypu 18) zvolte požadovaný výsledek testu HPV High Risk Panel Plus Genotyping. H. P i vkládání spot ebního materiálu postupujte podle softwarového pr vodce. I. P i vkládání všech inidel postupujte podle softwarového pr vodce. POZN.: Kontroly [HPV (+) C a ( ) C] se nevkládají spolu se vzorky. Vkládají se na nosi inidel v pr b hu vkládání inidel. Dv pozice (A1 a B1) na každé extrak ní desti ce a mikrotitra ní desti ce jsou rezervovány pro kontroly HPV (+) a ( ). POZN.: Systém cobas 4800 má vnit ní hodiny, které monitorují as, po který jsou inidla umíst ná v p ístroji. Jakmile je WB naskenováno, je k dispozici 1 hodina na dokon ení vkládání a kliknutí na tla ítko Start. Na záložce Workplace se zobrazí ubíhající as. Jestliže vyprší as, po který mohou být inidla umíst ná v p ístroji, systém nedovolí spušt ní cyklu. POZN.: Aby transfer MGP prob hl správn, p ed dávkováním do zásobníku na inidla lahvi ku s MGP vortexujte nebo s ní siln zat epejte. K. Vložte inidla pro p ípravu vzork (WB, MGP, EB, SDS a LYS) do zásobník na inidla ozna ených árovým kódem pomocí metody sken-sken-nalít-umístit : Naskenujte árový kód lahvi ky s inidlem. Naskenujte árový kód zásobníku na inidla. 05990289001-13CS 10 Doc Rev. 13.0

Nalijte inidlo do zásobníku na inidla. Vložte napln ný zásobník na inidla na ur enou pozici do nosi e inidel. L. Zásobníky na inidla jsou k dispozici ve dvou velikostech: 200 ml a 50 ml. P i výb ru p íslušné velikosti zásobníku na inidla postupujte podle softwarového pr vodce. árové kódy zásobník na inidla musí sm ovat na pravou stranu nosi e. POZN.: Amplifika ní/detek ní inidla (HPV MMX a HPV Mg/Mn), kontroly [HPV (+) C a ( ) C] a PK se vkládají p ímo na nosi inidel a za ízení cobas x 480 je automaticky skenuje. POZN.: Veškerá inidla a zásobníky na inidla jsou ozna ená árovým kódem a jsou ur ena pro jedno použití. Software za ízení cobas 4800 sleduje použití inidel a zásobník na inidla a vy azuje již d íve použitá inidla nebo zásobníky na inidla. Software rovn ž ov uje, zda je v za ízení dostate né množství inidel. POZN.: Software cobas 4800 sleduje data expirace všech inidel. inidla, která p ekro í datum expirace, systém cobas 4800 nep ijme. M. Kliknutím na Start Run spus te p ípravu vzork. N. Po úsp šném dokon ení p ípravy vzorku kliknutím na ** Unload uvolníte/vyjmete nosi desti ek. ** V tomto bod lze p ed kliknutím na Unload zkontrolovat stav p ípravy vzorku. Viz p íslušná p íru ka obsluhy pro systém cobas 4800. O. Postupujte podle pokyn v p íslušné p íru ce obsluhy pro systém cobas 4800 a zalepte mikrotitra ní desti ku, p eneste desti ku do analyzátoru cobas z 480 a spus te cyklus amplifikace a detekce. POZN.: Systém cobas 4800 má vnit ní hodiny, které monitorují as po p idání p ipravených vzork do pracovního Master mixu. Amplifikaci a detekci je nutné spustit co nejd íve, ale ne pozd ji než 90 minut po dokon ení cyklu za ízení cobas x 480. Na záložce Workplace se zobrazí ubíhající as. P. Po dokon ení cyklu amplifikace a detekce vyjm te mikrotitra ní desti ku z analyzátoru cobas z 480. Q. Postupujte podle pokyn v p íslušné p íru ce obsluhy k systému cobas 4800 a zkontrolujte a p ijm te výsledky. Provedení pracovního postupu Obnovení: POZN.: Postup pro obnovení je k dispozici jako možnost obnovení v p ípad, že úplný pracovní postup nelze dokon it kv li okolnostem mimo kontrolu uživatele (nap. výpadek proudu b hem amplifikace/detekce). POZN.: Pomocí cyklu Obnovení lze amplifikovat/detekovat pouze vzorky, které byly úsp šn zpracovány na za ízení cobas x 480. Kontrola inidel a spot ebního materiálu je b hem cyklu Obnovení omezená. B hem pracovního postupu Obnovení není k dispozici sledování pozice vzorku uživatel musí zajistit, aby skute ná pozice vzorku na mikrotitra ní desti ce odpovídala pozici ur ené v souboru objednávek zpráv s rozložením desti ek pro obnovení. P i p íprav mikrotitra ních desti ek a nastavení PCR je nutné pracovat velice pe liv, aby nedošlo ke zk ížené kontaminaci. POZN.: Vzorky zpracované na za ízení cobas x 480 mají omezenou stabilitu. Amplifikaci/detekci pomocí pracovního postupu Obnovení je nutné provést do 24 h v p ípad skladování p i teplot 2 C až 30 C. A. Kliknutím na tla ítko New run spus te cyklus Obnovení. B. V okn Test Selection zvolte typ pracovního postupu Recovery a poté zvolte test HPV. C. Zadejte název cyklu nebo ponechejte výchozí název cyklu a pokra ujte kliknutím na OK. D. Zvolte cyklus k obnovení. E. Jestliže používáte test HPV ASAP v2.1, naskenujte p vodní ID DWP z úplného pracovního postupu. F. Zadejte nové ID MWP. G. Pro všechny amplifika ní/detek ní lahvi ky s inidly v souprav zadejte ID Master Mixu a kovových iont. H. P ipravte pracovní HPV Master mix pro cobas 4800: 1. Do soupravy pro 240 test p idejte 240 µl HPV Mg/Mn do jedné lahvi ky HPV MMX (0,5ml lahvi ka ze soupravy pro 240 test ). 2. Do soupravy pro 960 test p idejte 450 µl HPV Mg/Mn do každé ze dvou lahvi ek HPV MMX (1,0ml lahvi ky ze soupravy pro 960 test ). POZN.: Cyklus Obnovení musí být spušt n do 90 minut od p idání HPV Mg/Mn do HPV MMX. Systém nemonitoruje délku asu po p idání p ipravených vzork do pracovního Master Mixu v postupu Obnovení. Je na uživateli, aby zajistil, že amplifikace a detekce za ne v ur eném ase. I. Opatrným obrácením lahvi ky (lahvi ek) dob e zamíchejte pracovní master mix. K promísení pracovního master mixu nepoužívejte ví ení. J. P eneste 25 µl pracovního master mixu do p íslušných jamek na mikrotitra ní desti ce. K. Položte extrak ní desti ku opakovaného cyklu na samostatnou magnetickou desti ku. L. Manuáln p eneste 25 µl eluátu z jamek extrak ní desti ky do odpovídajících jamek na mikrotitra ní desti ce. Ujist te se, že pozice jamek jsou vzájemn zachovány (nap. eluát v jamce A1 na extrak ní desti ce je p enesen do jamky A1 na mikrotitra ní desti ce). Ujist te se, že na mikrotitra ní desti ku nebyly p eneseny magnetické sklen né ástice (MGP). M. Postupujte podle pokyn v p íslušné p íru ce obsluhy k systému cobas 4800 a zalepte mikrotitra ní desti ku. N. Centrifugujte mikrotitra ní desti ku pomocí rotoru s kyvnou nádobou alespo 5 sekund p i 1500 RCF. O. P eneste desti ku do analyzátoru cobas z 480 a spus te cyklus amplifikace a detekce. P. Po dokon ení cyklu amplifikace a detekce vyjm te mikrotitra ní desti ku z analyzátoru cobas z 480. Q. Postupujte podle pokyn v p íslušné p íru ce obsluhy k systému cobas 4800 a zkontrolujte a p ijm te výsledky. 05990289001-13CS 11 Doc Rev. 13.0

Interpretace výsledk POZN.: Veškerou validaci test a cykl provádí software cobas 4800. POZN.: Platný cyklus m že zahrnovat jak platné tak i neplatné výsledky vzork. Jestliže je m ení platné, lze výsledky vzork interpretovat zp sobem, který je uveden v tabulkách 1 a 2: Tabulka 1 Interpretace výsledk testu HPV cobas 4800 na p ítomnost HPV DNA Test HPV cobas Výsledkový protokol a interpretace 4800 Požadovaný výsledek HPV High Risk Panel : Vysoce rizikový HPV pozitivní POS HR HPV Vzorek je pozitivní na DNA jednoho typu nebo kombinace následujících vysoce rizikových typ HPV: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. Vysoce rizikový HPV negativní* NEG HR HPV Typy HPV DNA 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68 byly nedetekovatelné nebo pod nastavenou prahovou hodnotou. Vysoce rizikový HPV neplatný Výsledky pro HR HPV jsou neplatné. U vzork PreservCyt by pro získání platných výsledk m l být p vodní vzorek znovu Invalid HR HPV otestován maximáln dvakrát. Pokud jsou výsledky nadále neplatné, je nutné získat nový vzorek. U vzork SurePath by m l být otestován p vodní vzorek pokud z stává dostate ný objem. Pokud jsou výsledky nadále neplatné, je nutné získat nový vzorek. Pro tento vzorek nejsou žádné výsledky Failed P e t te si p íslušné pokyny v p íslušné p íru ce obsluhy k systému cobas 4800 a zkontrolujte p íznaky cyklu a doporu ené kroky. Pro získání platného výsledku je nutné p vodní vzorek testovat znovu. Požadovaný výsledek HPV High Risk Panel Plus Genotyping : POS Other HR HPV NEG Other HR HPV Invalid Other HR HPV POS HPV16 NEG HPV16 Invalid HPV16 POS HPV18 NEG HPV18 Invalid HPV18 Failed Jiný vysoce rizikový HPV pozitivní Vzorek je pozitivní na DNA jednoho typu nebo kombinace následujících vysoce rizikových typ HPV: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. Jiný vysoce rizikový HPV negativní* Typy HPV DNA 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68 byly nedetekovatelné nebo pod nastavenou prahovou hodnotou. Neplatný jiný vysoce rizikový HPV Výsledek Ostatní HR HPV je neplatný. U vzork PreservCyt by pro získání platných výsledk m l být p vodní vzorek znovu otestován maximáln dvakrát. Pokud jsou výsledky nadále neplatné, je nutné získat nový vzorek. U vzork SurePath by m l být otestován p vodní vzorek pokud z stává dostate ný objem. Pokud jsou výsledky nadále neplatné, je nutné získat nový vzorek HPV16 pozitivní Vzorek je pozitivní na HPV DNA typu 16. HPV16 negativní* HPV DNA typu 16 byla nedetekovatelná nebo pod nastavenou prahovou hodnotou. Neplatný HPV16 Výsledek pro HPV16 je neplatný. U vzork PreservCyt by pro získání platných výsledk m l být p vodní vzorek znovu otestován maximáln dvakrát. Pokud jsou výsledky nadále neplatné, je nutné získat nový vzorek. U vzork SurePath by m l být otestován p vodní vzorek pokud z stává dostate ný objem. Pokud jsou výsledky nadále neplatné, je nutné získat nový vzorek. HPV18 pozitivní Vzorek je pozitivní na HPV DNA typu 18. HPV18 negativní* HPV DNA typu 18 byla nedetekovatelná nebo pod nastavenou prahovou hodnotou. Neplatný HPV18 Výsledek pro HPV18 je neplatný. U vzork PreservCyt by pro získání platných výsledk m l být p vodní vzorek znovu otestován maximáln dvakrát. Pokud jsou výsledky nadále neplatné, je nutné získat nový vzorek. U vzork SurePath by m l být otestován p vodní vzorek pokud z stává dostate ný objem. Pokud jsou výsledky nadále neplatné, je nutné získat nový vzorek. Pro tento vzorek nejsou žádné výsledky P e t te si p íslušné pokyny v p íslušné p íru ce obsluhy k systému cobas 4800 a zkontrolujte p íznaky cyklu a doporu ené kroky. Pro získání platných výsledk je nutné p vodní vzorek testovat znovu. * Negativní výsledek nevylu uje p ítomnost HPV infekce, protože výsledky závisí na adekvátním odb ru vzorku, absenci inhibitor a dostate ném množství DNA k detekci. 05990289001-13CS 12 Doc Rev. 13.0

Tabulka 2 Interpretace výsledk testu HPV cobas 4800 u pacientek s cytologickými abnormalitami Výsledky NEG Other HR HPV*, NEG HPV16, NEG HPV18 POS Other HR HPV*, NEG HPV16, NEG HPV18 POS HPV16 a/nebo POS HPV18 Interpretace Velmi nízká pravd podobnost nálezu s gradingem CIN2. Zvýšená pravd podobnost, že nález s gradingem CIN2 bude p i kolposkopii detekován. Nejvyšší pravd podobnost, že nález s gradingem CIN2 bude p i kolposkopii detekován 34,35. *Jiná HR HPV DNA zahrnuje následující typy: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. POZN.: Negativní výsledky HPV nemají zabránit ženám v provedení kolposkopie. POZN.: Krom výsledk uvedených v tabulce výše jsou možné neplatné výsledky jedné nebo více kombinací. V p ípad takového výsledku, nap.: Other HR HPV NEG, HPV16 POS, HPV18 Invalid Pozitivní a negativní výsledky je nutné interpretovat podle tabulky 1. V tomto p íkladu jsou výsledky HPV 18 neplatné. Pro získání platných výsledk by p vodní vzorek m l být znovu otestován maximáln dvakrát. Pokud jsou výsledky nadále neplatné, je nutné získat nový vzorek. POZN.: Negativní výsledky znamenají, že koncentrace HPV DNA jsou nedetekovatelné nebo pod nastavenou prahovou hodnotou. POZN.: Pozitivní výsledky test znamenají p ítomnost jednoho nebo více vysoce rizikových typ, ale protože pacientky jsou asto koinfikovány nízko rizikovými typy, nevylu uje to p ítomnost nízko rizikových typ u pacientek se smíšenými infekcemi. POZN.: Výsledky tohoto testu je nutné interpretovat ve spojení s informacemi získanými na základ klinického hodnocení a anamnézy pacientky. KONTROLA KVALITY Jedna sada pozitivních a negativních kontrol testu HPV cobas 4800 je za azena do každého cyklu. U každého cyklu musí mít jak pozitivní, tak i negativní kontrola platný výsledek v softwaru cobas 4800, aby bylo možné zobrazit výsledky testu HPV cobas 4800 z daného cyklu. Pozitivní kontrola Výsledek kontroly HPV (+) musí být Valid. Pokud jsou výsledky testu kontroly HPV (+) soustavn neplatné, spojte se s místním zastoupením firmy Roche a vyžádejte si technickou pomoc. Negativní kontrola Výsledek kontroly ( ) musí být Valid. Pokud jsou výsledky testu kontroly ( ) soustavn neplatné, spojte se s místním zastoupením firmy Roche a vyžádejte si technickou pomoc. BEZPE NOSTNÍ OPAT ENÍ P I PRÁCI Jak je tomu p i každém testovacím postupu, je pro správné fungování tohoto testu zásadním požadavkem dodržovat principy správné laboratorní praxe. Vzhledem k vysoké analytické citlivosti testu je t eba dbát opatrnosti, aby mezi inidly a amplifika ními sm smi nedošlo ke kontaminaci. 05990289001-13CS 13 Doc Rev. 13.0

PROCEDURÁLNÍ OMEZENÍ 1. Test cobas 4800 HPV detekuje DNA vysoce rizikových typ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68. Tento test nedetekuje DNA nízce rizikových typ HPV (tj. 6, 11, 42, 43, 44), protože neexistuje klinická použitelnost testování nízce rizikových typ HPV 36. 2. Test cobas 4800 HPV pro detekci lidského papilloma viru typu 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68 se nedoporu uje k hodnocení p i podez ení na sexuální zneužívání. 3. Výkonnost testu cobas 4800 HPV nebyla pat i n stanovena pro jedince o kované proti HPV 37. 4. Na test m že mít vliv i prevalence infekce HPV v dané populaci. P i testování populace s nízkou prevalencí nebo osob bez rizika infekce pozitivní prediktivní hodnoty klesají. 5. Infekce HPV neindikuje cytologickou diagnózu HSIL nebo nález vysokého stupn cervikální dysplazie CIN, ani neimplikuje, že CIN2-3 nebo karcinom vznikne. U v tšiny žen infikovaných jedním nebo více vysoce rizikovými typy HPV nedojde ke vzniku CIN2-3 nebo karcinomu. 6. Negativní výsledek vysoce rizikového HPV nevylu uje možnost budoucí cytologické diagnózy HSIL nebo nálezu CIN2-3 nebo karcinomu. 7. Testujte pouze indikované typy vzork. Tento test HPV cobas 4800 byl validován pouze pro cervikální vzorky odebrané pomocí PCR bun ného odb rového média cobas, roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM. 8. Primární lahvi ky SurePath s plastovou d licí vložkou není možné p ímo zpracovat v za ízení cobas x 480. Vzorky odebrané do t chto lahvi ek je nutné p enést do sekundární 13ml zkumavky Sarstedt, aby je bylo možné vložit do za ízení cobas x 480 a zpracovat. 9. Detekce vysoce rizikového HPV závisí na tom, kolik kopií je ve vzorku p ítomno, a vliv mohou mít i metody odb ru vzorku, faktory pacienta, stádium infekce a p ítomnost interferen ních látek. 10. Amplifikace a detekce beta-globinu je sou ástí testu cobas 4800 HPV, aby bylo možné odlišit HPV negativní vzorky od t ch, které nevykazují signál HPV kv li nedostate nému množství bun k ve vzorku. Všechny HPV negativní vzorky musí mít platný signál beta-globinu s p eddefinovaným rozsahem, aby byly systémem cobas 4800 identifikovány jako platné negativní vzorky. 11. K získání spolehlivých výsledk je t eba dodržovat p íslušné postupy odb ru, transportu, skladování a zpracování vzork. Postupujte dle krok uvedených v tomto p íbalovém letáku a v p íslušné p íru ce obsluhy pro systém cobas 4800. 12. P idání enzymu AmpErase k inidlu Master Mix HPV cobas 4800 umož uje selektivní amplifikaci cílové DNA. Aby se však p edešlo kontaminaci inidel, je t eba uplat ovat zásady správné laboratorní praxe a d sledn dodržovat postupy, jenž jsou v tomto p íbalovém letáku uvedeny. 13. Tento produkt smí používat pouze personál vyškolený v technikách PCR a v používání systému cobas 4800. 14. Pouze za ízení cobas x 480 a analyzátor cobas z 480 byly validovány pro použití s tímto produktem. S tímto produktem se nesmí používat žádné jiné za ízení na p ípravu vzork nebo jiný systém PCR. 15. Vzhledem k rozdíl m mezi technologiemi se doporu uje, aby uživatelé p ed p echodem od jedné technologie k druhé provedli v jejich laborato i studie pro stanovení rozdíl mezi t mito technologiemi. 16. Rovn ž nebyly hodnoceny vlivy dalších potenciálních prom nných, jako je vaginální výtok, používání tampon, sprchování apod., a prom nných odb ru vzorku. 17. I když vzácn, mutace ve vysoce konzervovaných oblastech genomické DNA lidského papilloma viru pokryté primery a/nebo sondami testu cobas 4800 HPV mohou vést k selhání detekce DNA viru. 18. P ítomnost inhibitor PCR m že vyvolávat falešn negativní nebo neplatné výsledky. 19. Cervikální vzorky asto vykazují z eteln detekovatelné hladiny plné krve ve form r žového nebo slab hn dého zbarvení. Takové vzorky se normáln zpracují v systému cobas 4800. Jestliže koncentrace plné krve p ekro í 2 % (tmav ervené nebo hn dé zbarvení) v PCR bun ném odb rovém mediu cobas, roztoku PreservCyt nebo konzerva ním roztoku SurePath TM nebo p ekro í 4 % v konzerva ním roztoku SurePath TM s pufrem pro p ípravu vzork cobas, existuje zde pravd podobnost získání falešn negativního výsledku. Podrobnosti najdete ve výsledcích interference. 20. Použití vaginálního zvlh ova e Replens je spojeno s falešn negativními výsledky u vzork v konzerva ním roztoku SurePath TM. 21. Odstran ní ervených krvinek ze vzork PreservCyt nebo SurePath pomocí ledové kyseliny octové (GAA) nebylo s testem HPV cobas 4800 validováno. Jakékoli použití GAA s testem HPV cobas 4800 musí být testující laborato í validováno. 05990289001-13CS 14 Doc Rev. 13.0

FUNK NÍ CHARAKTERISTIKY Srovnání ú innosti s kompara ním testem HPV se zna kou CE Klinická senzitivita a specificita na stav onemocn ní ( CIN2) byla stanovena pro test cobas 4800 HPV a kompara ní HPV test se zna kou CE 38 v populaci žen ve v ku minimáln 21 let s cytologickými výsledky ASC-US stanovenými na základ rutinního skríningu cervikálního karcinomu. Všechny testy byly provedeny na cervikálních vzorcích v roztoku PreservCyt. Kolposkopii podstoupilo celkem 1578 pacientek s po áte ními cytologickými výsledky ASC-US a byly provedeny platné testy HPV a výsledky cervikální biopsie. Stav onemocn ní pacientek zjistila Úst ední patologická znalecká komise na základ vzork získaných pomocí biopsie b hem kolposkopie. Výsledky populace ASC-US jsou shrnuty v tabulce 3 a ukazují, že ú innost testu cobas 4800 HPV byla srovnatelná s kompara ním testem. Tabulka 3 Srovnání ú innosti testu cobas 4800 HPV a kompara ního testu HPV se zna kou CE p i detekci CIN2 a CIN3 v populaci ASC-US Test HPV cobas 4800 HPV test se zna kou CE Odhad 95% CI Odhad 95% CI CIN2 Senzitivita (%) 90,0 (72/80) (81,5, 94,8) 87,2 (68/78) 1 (78,0, 92,9) Specificita (%) 70,5 (1056/1498) (68,1, 72,7) 71,1 (1056/1485) 2 (68,8, 73,4) PPV (%) 14,0 (72/514) (12,8, 15,3) 13,7 (68/497) (12,4, 15,1) NPV (%) 99,2 (1056/1064) (98,6, 99,6) 99,1 (1056/1066) (98,3, 99,5) Prevalence (%) 5,1 (80/1578) (4,1, 6,3) 5,0 (78/1563) (4,0, 6,2) CIN3 Senzitivita (%) 93,5 (43/46) (82,5, 97,8) 91,3 (42/46) (79,7, 96,6) Specificita (%) 69,3 (1053/1517) (66,9, 71,5) 70,0 (1062/1517) (67,7, 72,3) PPV (%) 8,4 (43/514) (7,6, 9,2) 8,5 (42/497) (7,6, 9,4) NPV (%) 99,7 (1061/1064) (99,2, 99,9) 99,6 (1062/1066) (99,0, 99,9) Prevalence (%) 2,9 (43/1578) (2,2, 3,9) 3,0 (46/1563) (2,2, 3,9) 1 Výsledky pro dv pacientky s diagnózou CIN2 nebylo možné stanovit pomocí kompara ního testu HPV se zna kou CE kv li nedostate ného objemu v d sledku opakovaného testování. 2 Výsledky pro t ináct pacientek s diagnózou < CIN2 nebylo možné stanovit pomocí kompara ního testu HPV se zna kou CE kv li nedostate ného objemu v d sledku opakovaného testování. U žen 30 let s normální cytologií je riziko cervikálního onemocn ní ( CIN2) 7,29 násobn vyšší s High Risk pozitivním výsledkem testu cobas 4800 HPV než s negativním výsledkem testu cobas 4800 HPV. Odhady relativního rizika a jejich 95% intervaly spolehlivosti jsou uvedeny v tabulce 4. U žen ve v ku 30 let nebo starších je možné test cobas 4800 HPV použít pro stanovení p ítomnosti nebo absence genotypu HPV 16 a 18. Riziko cervikálního onemocn ní ( CIN2) je 13,71krát vyšší p i pozitivním výsledku HPV16 nebo HPV18 testu cobas 4800 HPV než u negativního výsledku a riziko je 2,51krát vyšší s pozitivním výsledkem HPV16 nebo HPV18 testu cobas 4800 HPV v porovnání s pozitivním výsledkem testu cobas 4800 HPV pro 12 dalších vysoce rizikových typ. Ve všech p ípadech dolní mez 95% intervalu spolehlivosti p ekra uje 1, což ozna uje statisticky vyšší riziko cervikálního onemocn ní v p ípad pozitivního výsledku testu HPV. Tabulka 4 Relativní riziko cervikálního onemocn ní ( CIN2 dle Úst ední patologické komise) u žen 30 let s normální cytologií* HPV výsledek Odhad relativního rizika 95% CI* (interval spolehlivosti) Poz vs. neg 7,29 (3,99, 22,11) 16+/18+ vs. neg 13,71 (7,31, 41,92) 16+/18+ vs. 12 jiných HR+ 2,51 (1,73, 3,61) Poznámka: k nulové bu ce odhadovaného po tu pacientek s onemocn ním u jakýchkoliv z 1000 bootstrap vzork byla p idána hodnota 0,5 * 95% CI je 2,5 a 97,5 percentil CI bootstrapu na základ 1000 bootstrap vzork 05990289001-13CS 15 Doc Rev. 13.0

Populace NILM ( 30 let) Hodnocení ú innosti Pro populaci NILM ( 30 let) jsou odhady pro senzitivitu a specificitu spolu s 95% CI pro pozitivní HR HPV oproti negativním HR HPV uvedeny v tabulce 5 pro neupravené výsledky. Neupravená senzitivita a specificita testu pro histologii CIN2 byla 83,2 % (109/131) s 95% CI: 75,9 % až 88,6 % a 60,4 % (2492/4127) s 95% CI: 58,9 % až 61,9%. Neupravená senzitivita a specificita testu cobas HPV pro detekci histologie CIN3 byla 90,0 % (72/80) s 95% CI: 81,5 % až 94,8 % a 60,0 % (2506/4178) s 95% CI: 58,5 % až 61,5 %. Tabulka 5 Ú innost testu cobas 4800 HPV u populace NILM ( 30 let) (neupravené odhady) Diagnóza CPR Ú innost Odhad 95% CI CIN2 Senzitivita (%) 83,2 (109/131) (75,9, 88,6) Specificita (%) 60,4 (2492/4127) (58,9, 61,9) PPV (%) 6,3 (109/1744) (5,8, 6,8) NPV (%) 99,1 (2492/2514) (98,7, 99,4) Prevalence (%) 3,1 (131/4258) (2,6, 3,6) CIN3 Senzitivita (%) 90,0 (72/80) (81,5, 94,8) Specificita (%) 60,0 (2506/4178) (58,5, 61,5) PPV (%) 4,1 (72/1744) (3,8, 4,5) NPV (%) 99,7 (2506/2514) (99,4, 99,8) Prevalence (%) 1,9 (80/4258) (1,5, 2,3) Celková populace ( 25 let) Porovnání ú innosti testování HPV oproti cytologii Klinická ú innost testu cobas HPV a cytologie na tenké vrstv - LBC (PreservCyt) byla stanovena u populace 40 901 žen ve v ku 25 let a starších, nezávisle na stavu cytologie (celková populace). V tabulce 6 jsou odhady senzitivity a specificity pro celkovou populaci ( 25 let) pro test cobas HPV oproti cytologii pro detekci CIN2 a CIN3 38. Neupravené senzitivity testu cobas HPV a cytologie pro detekci histologie CIN2 byla 88,2% (380/431) s 95% CI 84,8 90,9 a 51,5 % (222/431) s CI 46,8 56,2 %, v tomto po adí. Neupravené senzitivity testu cobas HPV a cytologie pro detekci histologie CIN3 byla 92,0 % (252/274) s 95% CI 88,1 94,6 a 53,3 % (146/274) s CI 47,4-59,1 %, v tomto po adí. Verifika ní odchylkou upravené senzitivity testu cobas HPV a cytologie pro detekci histologie CIN2 byly 90,5% (36343/40163) s CI 90,2 90,8 % a 94,1 % (37811/40163) s CI 93,9 94,4 %, v tomto po adí. Tabulka 6 Srovnání ú innosti testu cobas 4800 HPV a cytologie p i detekci CIN2 a CIN3 v celkové ( 25 let) populaci CIN2 Senzitivita Specificita PPV NPV CIN3 Senzitivita Specificita PPV NPV Cytologie Test cobas HPV % (n) 95% CI % (n) 95% CI 51,5 (222/431) 73,4 (5428/7392) 10,2 (222/2186) 96,3 (5428/5637) 53,3 (146/274) 73,0 (5509/7549) 6,7 (146/2186) 97,7 (5509/5637) (46 8 56 2) (72 4 74 4) (9,3 11,1) (95,9 96,6) (47,4 59,1) (72,0 74,0) (6,0 7,4) (97,4 98,0) 88,2 (380/431) 57,8 (4270/7392) 10,9 (380/3502) 98,8 (4270/4321) 92,0 (252/274) 56,9 (4299/7549) 7,2 (252/3502) 99,5 (4299/4321) (84,8 90,9) (56,6 58,9) (10,4 11,3) (98,5 99,1) (88,1 94,6) (55,8 58,1) (6,9 7,5) (99,2 99,7) 05990289001-13CS 16 Doc Rev. 13.0

Mez detekce Byla stanovena mez detekce (LOD) vysoce rizikových HPV genotyp HPV16, HPV18 a HPV31 pro test cobas 4800 HPV. Meze detekce byly ur eny pomocí 1) plazmid HPV31, HPV16 a HPV18 na pozadí sm si HPV negativních vzork pacient odebraných do roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM a 2) HPV pozitivních bun ných ad SiHa (HPV16) HeLa (HPV18) v roztoku PreservCyt a konzerva ním roztoku SurePath TM, které na pozadí obsahovaly HPV negativní bun nou adu (HTC-15). Plazmidy a bun né ady byly roz ed ny na níže uvedené koncentrace, nad a na o ekávané hladiny LOD. Bylo testováno minimáln 60 replikát každé hladiny plazmid nebo bun né ady jak v roztoku PreservCyt, tak v konzerva ním roztoku SurePath TM s každou ze 3 šarží inidel. Výsledky s konzerva ním roztokem SurePath jsou uvedeny se zpracováním pomocí pufru pro p ípravu vzork cobas i bez n ho. LOD je ta hladina HPV DNA ve vzorku, která vykazuje pozitivní výsledky test alespo v 95 %. Tabulky 7, 8 a 9 obsahují výsledky šarže inidel, která dávala nejkonzervativn jší (nejvyšší) LOD v analýze u roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM. Typ HPV Tabulka 7 Hladiny meze detekce HPV typ 31, 16, 18 a bun ných ad SiHa (HPV16) a HeLa (HPV18) v roztoku PreservCyt Titr (kopií nebo bun k/ml) Po et pozitivních/ testovaných vzork 95 % interval spolehlivosti % pozitivních Dolní Horní 31 600 60/60 100 % 94 % 100 % 31 300 59/61 97 % 89 % 100 % 31 150 49/60 82 % 70 % 90 % 16 1500 60/60 100 % 94 % 100 % 16 600 60/60 100 % 94 % 100 % 16 300 55/61 90 % 80 % 96 % 18 1500 60/60 100 % 94 % 100 % 18 600 60/60 100 % 94 % 100 % 18 300 42/61 69 % 56 % 80 % SiHa (HPV 16) 200 66/66 100 % 95 % 100 % SiHa (HPV 16) 100 64/65 98 % 92 % 100 % SiHa (HPV 16) 50 57/60 95 % 86 % 99 % HeLa (HPV 18) 80 60/60 100 % 94 % 100 % HeLa (HPV 18) 40 60/60 100 % 94 % 100 % HeLa (HPV 18) 20 56/60 93 % 84 % 98 % 05990289001-13CS 17 Doc Rev. 13.0

Tabulka 8 Hladiny meze detekce HPV typ 31, 16, 18 a bun ných ad SiHa (HPV16) a HeLa (HPV18) v konzerva ním roztoku SurePath TM Typ HPV Titr (kopií nebo bun k/ml) Po et pozitivních/ testovaných vzork % pozitivních 95 % interval spolehlivosti Dolní Horní 31 300 60/60 100 % 94 % 100 % 31 150 57/60 95 % 86 % 99 % 31 75 46/60 77 % 64 % 87 % 16 600 60/60 100 % 94 % 100 % 16 300 60/60 100 % 94 % 100 % 16 150 51/60 85 % 73 % 93 % 18 1,500 60/60 100 % 94 % 100 % 18 600 60/60 100 % 94 % 100 % 18 300 56/60 93 % 84 % 98 % SiHa (HPV 16) 100 59/60 98 % 91 % 100 % SiHa (HPV 16) 50 57/60 95 % 86 % 99 % SiHa (HPV 16) 25 42/60 70 % 57 % 81 % HeLa (HPV 18) 80 60/60 100 % 94 % 100 % HeLa (HPV 18) 40 60/60 100 % 94 % 100 % HeLa (HPV 18) 20 59/60 98 % 91 % 100 % Tabulka 9 Hladiny meze detekce HPV typ 31, 16, 18 a bun ných ad SiHa (HPV16) a HeLa (HPV18) v konzerva ním roztoku SurePath TM p i zpracování v pufru pro p ípravu vzork cobas Typ HPV Titr (kopií nebo bun k/ml) Po et pozitivních/ testovaných vzork % pozitivních 95% interval spolehlivosti Dolní Horní 31 600 60/60 100 % 94 % 100 % 31 300 59/59 100 % 94 % 100 % 31 150 54/60 90 % 80 % 96 % 16 600 60/60 100 % 94 % 100 % 16 300 59/60 98 % 91 % 100 % 16 150 40/60 67 % 53 % 78 % 18 1 500 60/60 100 % 94 % 100 % 18 600 60/60 100 % 94 % 100 % 18 300 55/59 93 % 84 % 98 % SiHa (HPV 16) 400 60/60 100 % 94 % 100 % SiHa (HPV 16) 200 60/60 100 % 94 % 100 % SiHa (HPV 16) 100 55/60 92 % 82 % 97 % HeLa (HPV 18) 80 60/60 100 % 94 % 100 % HeLa (HPV 18) 40 59/60 98 % 91 % 100 % HeLa (HPV 18) 20 43/60 72 % 59 % 83 % 05990289001-13CS 18 Doc Rev. 13.0

Ov ení inkluzivity Pro ov ení, zda test HPV cobas 4800 dokáže správn detekovat všechny HPV vysoce rizikové genotypy, byla stanovena mez detekce (LOD) (tabulky 10, 11 a 12) pro genotypy 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68. Sensitivita testu HPV cobas 4800 HPV na HPV genotypy 16, 18 a 31 byla stanovena ve studii meze detekce popsané výše v p íbalovém letáku. Kvantifikovaný inventá plazmid každého genotypu HPV byl roz ed n bu v roztoku PreservCyt, nebo konzerva ním roztoku SurePath TM obsahující HPV negativní bu ky HTC-15 na koncentrace pod, nad a na o ekávanou LOD. Jedna šarže inidel byla použita pro vytvo ení minimáln 48 replikát pro každou pozitivní hladinu v každém médiu. Pro testování v konzerva ním roztoku SurePath TM p i použití zpracování v pufru pro p ípravu vzork cobas (Tabulka 12) byl materiál pro pozadí p ipravený z cervikálních vzork odebraných do konzerva ního roztoku SurePath TM a testován jako 24 replikát, každý se dv ma šaržemi inidel. Pro každý typ HPV uvedená LOD byla definována jako nejnižší testovací koncentrace s 95% pozitivní mírou detekce a všemi vyššími koncentracemi, které m ly alespo 95% míru detekce. Tabulka 10 Shrnutí míry detekce u genotypu s vysokým rizikem v testu HPV cobas 4800 ve studii inkluzivity genotypu (roztok PreservCyt ) Typ HPV DNA LOD (kopií/ml) Po et pozitivních/ testovaných vzork Míra detekce 95 % interval spolehlivosti Dolní Horní 33 190 46/48 96 % 86 % 99 % 35 480 48/48 100 % 93 % 100 % 39 80 48/48 100 % 93 % 100 % 45 190 46/48 96 % 86 % 99 % 51 100 46/48 96 % 86 % 99 % 52 2400 48/48 100 % 93 % 100 % 56 1400 48/48 100 % 93 % 100 % 58 480 47/48 98 % 89 % 100 % 59 190 46/48 96 % 86 % 99 % 66 640 48/48 100 % 93 % 100 % 68 450 48/48 100 % 93 % 100 % Typ HPV DNA Tabulka 11 Shrnutí míry detekce u genotypu s vysokým rizikem v testu HPV cobas 4800 ve studii inkluzivity genotypu (konzerva ní roztok SurePath TM ) LOD (kopií/ml) Po et pozitivních/ testovaných vzork Míra detekce 95 % interval spolehlivosti Dolní Horní 33 480 47/49 96 % 93 % 100 % 35 1400 48/48 100 % 93 % 100 % 39 190 53/53 100 % 93 % 100 % 45 480 49/49 100 % 93 % 100 % 51 100 47/48 98 % 89 % 100 % 52 7200 51/51 100 % 93 % 100 % 56 1400 50/50 100 % 93 % 100 % 58 1400 49/49 100 % 93 % 100 % 59 480 46/48 96 % 86 % 99 % 66 640 47/48 98 % 89 % 100 % 68 1100 48/48 100 % 93 % 100 % 05990289001-13CS 19 Doc Rev. 13.0

Tabulka 12 Shrnutí míry detekce u genotypu s vysokým rizikem v testu HPV cobas 4800 HPV ve studii inkluzivity genotypu HPV (konzerva ní roztok SurePath TM p i zpracování v pufru pro p ípravu vzork cobas ) Typ HPV DNA LOD (kopií/ml) Po et pozitivních/ testovaných vzork Míra detekce 95% interval spolehlivosti Dolní Horní 33 300 48/48 100 % 93 % 100 % 35 600 47/48 100 % 89 % 100 % 39 150 48/48 100 % 93 % 100 % 45 300 48/48 100 % 93 % 100 % 51 600 46/48 96 % 86 % 99 % 52 4800 48/48 100 % 93 % 100 % 56 1200 46/48 96 % 86 % 99 % 58 600 48/48 100 % 93 % 100 % 59 600 48/48 100 % 93 % 100 % 66 1200 48/48 100 % 93 % 100 % 68 300 48/48 100 % 93 % 100 % P esnost Vlastní p esnost na míst byla stanovena pomocí položek panelu p ipravených pro studii meze detekce popsané v tomto p íbalovém letáku. Pro analýzu p esnosti byly použity hladiny na a nad mezí detekce. Panely byly p ipraveny p idáním plazmid HPV31, HPV16 a HPV18 na pozadí sm si HPV negativních vzork pacient odebraných do roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM. Pozitivní míry detekce položek panelu (v roztoku PreservCyt a konzerva ním roztoku SurePath TM ) na a nad LOD jsou uvedeny v tabulce 13 a 14. U všech hladin plazmid na panelu byla míra detekce nad 95 %. Byla analyzována variace hodnoty Ct testu a byly vypo ítány náhodné faktory zp sobené šarží inidel, systémy, rozdíly mezi testy a v rámci testu. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 15 pro roztok PreservCyt a v tabulce 16 pro konzerva ní roztok SurePath TM. Tabulka 17 ukazuje Ct hodnotu SD a %CV složek variace v roztoku PreservCyt. Tabulka 18 ukazuje Ct hodnotu SD a %CV složek variace v konzerva ním roztoku SurePath TM. Cíl HPV 31 HPV 16 HPV 18 Cíl HPV 31 HPV 16 HPV 18 Tabulka 13 Shrnutí míry detekce studie p esnosti HPV cobas 4800 HPV na nebo nad LOD (v roztoku PreservCyt ) Hladina panelu Koncentrace (kopií nebo bun k/ml) Po et test Po et poz. 95 % CI pro míru detekce Míra detekce Dolní Horní > LOD 600 186 186 100 % 98 % 100 % = LOD 300 187 184 98 % 95 % 100 % > LOD 1500 186 186 100 % 98 % 100 % = LOD 600 186 186 100 % 98 % 100 % > LOD 1500 186 186 100 % 98 % 100 % = LOD 600 186 186 100 % 98 % 100 % Tabulka 14 Shrnutí míry detekce studie p esnosti HPV cobas 4800 HPV na nebo nad LOD (v konzerva ním roztoku SurePath TM ) Hladina panelu Koncentrace (kopií nebo bun k/ml) Po et test Po et poz. 95 % CI pro míru detekce Míra detekce Dolní Horní > LOD 300 180 180 100 % 98 % 100 % = LOD 150 180 175 97 % 94 % 99 % > LOD 600 180 180 100 % 98 % 100 % = LOD 300 180 180 100 % 98 % 100 % > LOD 1500 180 180 100 % 98 % 100 % = LOD 600 180 180 100 % 98 % 100 % 05990289001-13CS 20 Doc Rev. 13.0

Cíl HPV 16 HPV 18 HPV 31 Cíl HPV 16 HPV 18 HPV 31 Cíl HPV 16 HPV 18 HPV 31 Tabulka 15 Analýza hodnoty Ct složek variace studie p esnosti HPV cobas 4800 na hladinách panelu p ipravených v roztoku PreservCyt Hladina panelu N Pr m rná hodnota ohybu > LOD 186 36,3 = LOD 186 37,5 > LOD 186 36,6 = LOD 186 37,8 > LOD 186 36,5 = LOD 187 37,6 Složky variace/procentuální p ísp vek Šarže inidel Systém Cyklus Náhodn Celkem 0,038 0 0,111 0,079 0,228 17 % 0 % 49 % 35 % 100 % 0,025 0 0,042 0,161 0,228 11 % 0 % 18 % 71 % 100 % 0,043 0 0,149 0,067 0,259 16 % 0 % 58 % 26 % 100 % 0,027 0 0,050 0,184 0,261 10 % 0 % 19 % 71 % 100 % 0,003 0,002 0,105 0,187 0,297 1 % 1 % 35 % 63 % 100 % 0,020 0 0,157 0,489 0,666 3 % 0 % 24 % 73 % 100 % Tabulka 16 Analýza hodnoty Ct složek variace studie p esnosti HPV cobas 4800 na hladinách panelu p ipravených v konzerva ním roztoku SurePath TM Hladina panelu N Pr m rná hodnota ohybu > LOD 180 37,2 = LOD 180 38,2 > LOD 180 36,3 = LOD 180 37,7 > LOD 180 37,2 = LOD 180 38,1 Hladina panelu Složky variace/procentuální p ísp vek Šarže inidel Systém Cyklus Náhodn Celkem 0,014 0 0,039 0,157 0,209 7 % 0 % 18 % 75 % 100 % 0 0 0,090 0,316 0,405 0 % 0 % 22 % 78 % 100 % 0,011 0 0,119 0,073 0,204 5 % 0 % 58 % 36 % 100 % 0 0 0,148 0,219 0,366 0 % 0 % 40 % 60 % 100 % 0 0 0,099 0,393 0,493 0 % 0 % 20 % 80 % 100 % 0,026 0,015 0,038 0,684 0,764 3 % 2 % 5 % 90 % 100 % Tabulka 17 Analýza hodnoty Ct SD a %CV studie p esnosti HPV cobas 4800 na hladinách panelu p ipravených v roztoku PreservCyt N Pr m rná hodnota ohybu > LOD 186 36,3 = LOD 186 37,5 > LOD 186 36,6 = LOD 186 37,8 > LOD 186 36,5 = LOD 187 37,6 Složky SD/ %CV Šarže inidel Systém Cyklus Náhodn Celkem 0,19 0 0,33 0,28 0,48 0,50 % 0,00 % 0,90 % 0,80 % 1,30 % 0,16 0 0,20 0,40 0,48 0,40 % 0,00 % 0,50 % 1,10 % 1,30 % 0,21 0 0,39 0,26 0,51 0,60 % 0,00 % 1,10 % 0,70 % 1,40 % 0,16 0 0,22 0,43 0,51 0,40 % 0,00 % 0,60 % 1,10 % 1,30 % 0,05 0,05 0,32 0,43 0,54 0,10 % 0,10 % 0,90 % 1,20 % 1,50 % 0,14 0 0,40 0,70 0,82 0,40 % 0,00 % 1,10 % 1,90 % 2,20 % 05990289001-13CS 21 Doc Rev. 13.0

Cíl HPV 16 HPV 18 HPV 31 Tabulka 18 Analýza hodnoty Ct SD a %CV studie p esnosti HPV cobas 4800 na hladinách panelu p ipravených v konzerva ním roztoku SurePath TM Hladina panelu N Pr m rná hodnota ohybu > LOD 180 37,2 = LOD 180 38,2 > LOD 180 36,3 = LOD 180 37,7 > LOD 180 37,2 = LOD 180 38,1 Složky SD/ %CV Šarže inidel Systém Cyklus Náhodn Celkem 0,12 0 0,20 0,40 0,46 0,30 % 0,00 % 0,50 % 1,10 % 1,20 % 0 0 0,30 0,56 0,64 0,00 % 0,00 % 0,80 % 1,50 % 1,70 % 0,11 0 0,34 0,27 0,45 0,30 % 0,00 % 1,00 % 0,70 % 1,20 % 0 0 0,38 0,47 0,61 0,00 % 0,00 % 1,00 % 1,20 % 1,60 % 0 0,02 0,32 0,63 0,70 0,00 % 0,10 % 0,80 % 1,70 % 1,90 % 0,16 0,12 0,20 0,83 0,87 0,40 % 0,30 % 0,50 % 2,20 % 2,30 % Analytická specificita Byl testován panel baktérií, plísní a vir, v etn t ch, které se b žn vyskytují v ženském urogenitálním traktu, dále n kolika typ lidských papilloma vir s nízkým a neur itým rizikem pomocí testu HPV cobas 4800 pro stanovení analytické specificity. Tyto organizmy uvedené v tabulce 19 byly p idány ve vysokých koncentracích ( 1 x 10 3 jednotek/reakce) do HPV negativního pozadí vzorku v roztoku PreservCyt a do HPV negativního vzorku v roztoku PreservCyt s p idaným plasmidem DNA HPV31, HPV16 a HPV18 v množství 3krát p ekra ujícím LOD. Organizmy ozna ené hv zdi kou byly rovn ž testovány na pozadí vzorku v konzerva ním roztoku SurePath TM za stejných podmínek. Organizmy ozna ené dv mi hv zdi kami byly testovány pouze na pozadí vzorku v konzerva ním roztoku SurePath TM. Veškeré testování na pozadí vzorku SurePath bylo provedeno pomocí zpracování v pufru pro p ípravu vzork cobas. Výsledky ukazují, že žádný z t chto organizm neinterferoval s detekcí plazmidu DNA HPV 31, HPV 16 a HPV 18, ani nevytvo il falešn negativní výsledek v HPV negativním vzorku. Tabulka 19 Mikroorganizmy testované na analytickou specificitu Achromobacter xerosis Haemophilus ducreyi Streptococcus agalactiae* Acinetobacter calcaceticus Virus hepatitidy B (HBV) Streptococcus anginosus Acinetobacter lwoffi Virus Herpes simplex 1* Streptococcus faecalis** Acinetobacter sp. genospecies 3 Virus Herpes simplex 2* Streptococcus pyogenes* Actinomyces isrealii Virus selhání lidské imunity (HIV-1) Streptococcus sanguis Adenovirus* Kingella kingae SV40 Aerococcus viridans Klebsiella pneumoniae ss ozaenae* Treponema pallidum Alcaligenes faecalis Lactobacillus acidophilus* Trichomonas vaginalis* Bacillus thuringiensis Lactobacillus crisptus Ureaplasma urealyticum Bacteroides caccae** Lactobacillus delbrueckii s. lactis Veillonella parvula Bacteroides fragilis Lactobacillus jensenii Vibrio parahaemolyticus Bacteroides ureolyticus Lactobacillus vaginalis Weissella paramesenteroides Bifidobacterium longum Lactococcus lactis cremoris Yersinia enterocolitica Bifidobacterium adolescentis* Legionella pneumophila HPV 6* Bifidobacterium brevi Micrococcus luteus HPV 11* Campylobacter jejuni Mobiluncus curtisii s. curtisii HPV 26* Candida albicans* Moraxella osloensis HPV 30** Chlamydia trachomatis* Morganella morganii HPV 34** Chromobacter violaceum Mycobacterium avium HPV 40 Citrobacter braakii Mycobacterium smegmatis HPV 42 Clostridium adolescentis Mycoplasma genitalium HPV 53** Clostridium beijerinckii** Mycoplasma hominis HPV 54 Clostridium perfringens Neisseria gonorrhoeae* HPV 55B Corynebacterium genitalium** Neisseria meningitidis Séroskupina A HPV 61 Corynebacterium glutamicum Pasteurella multocida HPV 62 05990289001-13CS 22 Doc Rev. 13.0

Cytomegalovirus* Pediococcus acidilactici HPV 64 Eikenella corrodens Peptostreptococcus anaerobius* HPV 67* Enterobacter aerogenes** Propionibacterium acnes HPV 69* Enterobacter cloacae Proteus mirabilis* HPV 70* Enterococcus faecalis Proteus vulgaris HPV 71 Enterococcus faecium* Providencia stuartii HPV 72 Virus Epstein-Barrové* Pseudomonas aeruginosa HPV 73* Erysipelothrix rhusiopathiae Pseudomonas fluorescens** HPV 81 Escherichia coli* Ruminococcus productus HPV 82* Ewingella americana Salmonella minnesota HPV 83 Fusobacterium nucleatum Serratia marcescens HPV 84 Fusobacterium varium** Staphylococcus aureus* HPV 85** Gemella morbillorum Staphylococcus epidermidis* HPV 89 (CP6108) Gardnerella vaginalis Staphylococcus saprophyticus * Testováno na pozadí vzork PreservCyt a SurePath ** Testováno pouze na pozadí vzork SurePath Interferen ní látky HPV pozitivní a HPV negativní cervikální vzorky stejn jako upravené vzorky byly použity k vyhodnocení ú ink endogenních a exogenních interferen ních látek, které mohou být potenciáln p ítomné v cervikálních vzorcích. Testovací materiály použité v t chto studiích jsou popsány v tabulce 20. Koncentrace testovaných endogenních a exogenních látek p edstavují podmínky, které mohou objevit p i odb ru vzork. Jako potenciální endogenní interferen ní látky nalézané cervikálních vzorcích byly testovány plná krev, mononukleární bu ky periferní krve (PBMC) a cervikální hlen. Hladiny každé testované potenciáln interferen ní látky a zjišt ní výkonu jsou uvedeny v tabulce 21. Nebyla zjišt na žádná interference u PBMC nebo cervikálního hlenu ve všech hladinách. Plná krev nevykázala žádnou interferenci, pokud byla p ítomná ve vizuáln zjistitelných množstvích do 2 % v PCR bun ném odb rovém mediu cobas, roztoku PreservCyt a konzerva ním roztoku SurePath TM. Plná krev nevykázala žádnou interferenci, pokud byla p ítomná ve vizuáln zjistitelných množstvích do 4 % v konzerva ním roztoku SurePath TM s pufrem pro p ípravu vzork cobas. Tabulka 20 Popis vzork pro testování interference Typ vzorku Popis HPV pozitivní cervikální vzorky HPV negativní cervikální vzorky Upravené HPV pozitivní cervikální vzorky Sm si 3x LOD roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM Na alikvotní podíly bylo rozd leno 10 jednotlivých HPV pozitivních vzork v roztoku PreservCyt a testováno s endogenními interferen ními látkami a bez nich Na alikvotní podíly bylo rozd leno 10 jednotlivých HPV negativních vzork v roztoku PreservCyt a testováno s endogenními interferen ními látkami a bez nich HPV pozitivní (kanál 1) vzorky v roztoku PreservCyt byly roz ed ny HPV negativním vzorkem na koncentraci p ibližn 3x LOD. Poté byly p idány plazmidy HPV typu 16 (kanál 2) a 18 (kanál 3) v koncentraci p ibližn 3x LOD. Plazmidy HPV typu 31, 16 a 18 byly každý roz ed ny na 3x LOD ve sm sích negativního vzorku a roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM. Vzorky SurePath byly testovány jak zpracované v pufru pro p ípravu vzork cobas, tak i nezpracované. 05990289001-13CS 23 Doc Rev. 13.0

Testovaná interferen ní látka Tabulka 21 Výsledky testování interference s endogenními interferen ními látkami Testované koncentrace PreservCyt Pozorovaná interference SurePath SurePath zpracované s pufrem pro p ípravu vzork cobas Plná krev 1 %, 1,5 %, 2 %, 3 %, 4 %, 6 %, 8 % obj. Nad 2 % Nad 2 % Nad 4 % PBMC 10 4, 10 5, 10 6 bun k/ml Žádná Žádná Žádná Cervikální hlen Hlen získaný p i standardním cervikálním isticím postupu Žádná Žádná Žádná Jako potenciáln interferen ní látky bylo testováno celkem 18 voln prodejných prost edk pro ženskou hygienu a antikoncep ních prost edk. Typy potenciáln interferen ních prost edk a zjišt ní výkonu v roztoku PreservCyt a konzerva ním roztoku SurePath TM ve sm sích 3x LOD jsou uvedeny v tabulce 22. Tabulka 22 Výsledky testování interference s exogenními interferen ními látkami Popis interferen ní látky Pozorovaná interference Antikoncep ní gely, p ny Žádná Vaginální lubrikanty *Ano Výplach d lohy Žádná Protiplís ové krémy obsahující 1% klotrimazol, fenazopyridin hydrochlorid, 1% hydrokortizon, 2% mikonazol nitrát, Žádná 6,5% tiokonazol mast, 20% benzokain * Replens (topický gel proti vysoušení) vykázal negativní výsledky ve sm si konzerva ního roztoku SurePath TM 3 x LOD. Tato interference byla zjišt na rovn ž tehdy, když vzorky SurePath byly zpracovány pufrem na p ípravu vzork cobas. Porovnatelnost základní látky Celkem bylo vyšet eno 1752 pacientek, kterým byly odebrány cervikální vzorky do roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM. Každý pár cervikálních vzork byl vyhodnocen testem HPV cobas 4800 tak, aby bylo dosaženo shody výsledk. Vzorky SurePath byly testovány zpracované v pufru pro p ípravu vzork cobas. V tabulce 23 vzorky s pozitivními výsledky v jakémkoli ze t í HPV detek ních kanál byly považovány za pozitivní; vzorky s negativními výsledky ve všech t ech HPV detek ních kanálech byly považovány za negativní. Shoda mezi pozitivními vzorky v konzerva ním roztoku SurePath TM a vzorky v roztoku PreservCyt byla 96,4%; shoda mezi negativními vzorky byla 95,1% a celková shoda byla 95,4%. Tabulka 23 Shrnutí výsledk testu HPV cobas 4800 pro spoluodebrané vzorky pomocí roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM pomocí výsledku testu HPV High Risk Panel Páry cervikálních vzork N = 1752 Konzerva ní roztok SurePath TM (10 ml) Roztok PreservCyt (20 ml) Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní 407 65 472 Negativní 15 1265 1280 Celkem 422 1330 1752 Shoda pozitivních = 407/422 = 96,4 % (95 % CI 94,2 %, 98,0 %) Shoda negativních = 1265/1330 = 95,1 % (95 % CI 93,8 %, 96,2 %) Celková shoda = 1672/1752 = 95,4 % (95 % CI 94,3 %, 96,4 %) 05990289001-13CS 24 Doc Rev. 13.0

Výsledky studie t chto 1752 pacientek byly rovn ž analyzovány pomocí kombinace výsledk ze všech t í HPV detek ních kanál. V této analýze (tabulka 24) byly výsledky každého kanálu 1 3 zkombinovány. Shoda mezi pozitivními vzorky v konzerva ním roztoku SurePath TM a vzorky v roztoku PreservCyt byla 96,9 %; shoda mezi negativními vzorky byla 98,0 % a celková shoda byla 97,9 %. Tabulka 24 Shrnutí výsledk testu HPV cobas 4800 pro spoluodebrané vzorky pomocí roztoku PreservCyt a konzerva ního roztoku SurePath TM pomocí výsledku testu HPV High Risk Panel Plus Genotyping Páry cervikálních vzork N = 5256 Konzerva ní roztok SurePath TM (10 ml) Roztok PreservCyt (20 ml) Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní 492 94 586 Negativní 16 4654 4670 Celkem 508 4748 5256 Shoda pozitivních = 492/508 = 96,9 % (95 % CI 94,9 %, 98,2 %) Shoda negativních = 4654/4748 = 98,0 % (95 % CI 97,6 %, 98,4 %) Celková shoda = 5146/5256 = 97,9 % (95 % CI 97,5 %, 98,3 %) Stabilita vzork SurePath pro 6 týdn p i teplot 2-30 C p i zpracování pufrem cobas T i sm si vzork SurePath negativních na HPV byly nast íknuty vzorky SurePath pozitivními na HPV typu 51 a vznikly tak pozitivní, vysoce pozitivní a nízko pozitivní sm si vzork. Nízko pozitivní sm s byla p i testu ve dni 0 v mezi detekce (LOD) p ed zpracováním pufrem pro p ípravu vzork cobas. Tyto sm si byly uchovávány p i 32 C a testovány v intervalech až do doby uplynutí 6 týdn. Sm si byly zpracovány tak, aby došlo k obrácení matrixových vazeb a poté byly v daných intervalech testovány pomocí testu HPV cobas 4800. Pr m rné Ct všech t í sm sí bylo po celou dobu 6 týdn uchovávání pod klinickou hrani ní hodnotou pro HPV typ 51 (40,0 pro kanál 1) (viz tabulka 25). Tabulka 25 Výsledky stability vzork SurePath po dobu 6 týdn p i zpracování pomocí pufru pro p ípravu vzork cobas Sm si SurePath Pr m rné hodnoty Ct* Den 0 Týden 1 Týden 3 Týden 4 Týden 6 Vysoce pozitivní 28,7 30,1 30,3 30,6 31,1 Pozitivní 32,9 33,5 34,1 33,9 34,6 Nízce pozitivní (~LOD) 36,9 37,9 38,0 38,8 38,7 *P i nízko pozitivních testováních testováno jako 40 replikát ; p i pozitivních testováních testováno jako 30 replikát ; p i vysoce pozitivních testováních testováno jako 20 replikát 05990289001-13CS 25 Doc Rev. 13.0

LITERATURA 1. Burd, Eileen M. 2003. Human Papillomavirus and Cervical Cancer. Clinical Microbiology Reviews. 16:1-17. 2. zur Hausen, H. 2002. Papillomaviruses and Cancer: From Basic Studies to Clinical Application. Nat Rev Cancer. 2(5):342-50. 3. Walboomers, Jan M.M., Jacobs, Marcel V., Manos, M.M., et al. 1999. Human Papillomavirus is a Necessary Cause of Invasive Cervical Cancer Worldwide. Journal of Pathology. 189:12-19. 4. Bernard HU. Review: The clinical importance of the nomenclature, evolution and taxonomy of human papillomaviruses. J Clin Virol. 2005; 32S, S1-6. 5. Molijn A, Kleter B, Quint W, van Doorn, L. Review: Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections. J Clin Virol. 2005; 32S:S43-51. 6. zur Hausen H. Roots and perspectives of contemporary papillomavirus research. J Cancer Res Clin Oncol. 1996; 122:3-13. 7. de Villiers EM, Fauguet C, Broker TR, Bernard HU, zur Hausen H. Classification of papillomaviruses. Virology. 2004; 324:17-27. 8. Franco EL, Rohan TE, Villa LL. Epidemiologic evidence and human papillomavirus infection as a necessary cause of cervical cancer. J Natl Cancer Inst. 1999; 91:506-511. 9. Lorincz AT, Reid R, Jenson AB, et al. Human papillomavirus infection of the cervix: relative risk associations of 15 common anogenital types. Obstet Gynecol. 1992; 79:328-37. 10. Bosch, F.X., Manos, M.M., Munoz, N., et al. 1995. International Biological Study on Cervical Cancer (IBSCC) Study Group. Prevalence of Human Papillomavirus in Cervical Cancer: a Worldwide Perspective. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 87, No. 11:796-802. 11. Bosch, F.X., A. Lorincz, N. Muñoz, C.J.L.M. Meijer, K.V. Shah (2002) The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer J Clin Path 55:244-265. 12. Muñoz N, F.X. Bosch, S. de Sanjosé, R. Herrero, X. Castellsagué, K.V. Shah, P.J.F. Snijders, and Chris J.L.M. Meijer, for the International Agency for Research on Cancer Multicenter Cervical Cancer Study Group. (2003) Epidemiologic Classification of Human Papillomavirus Types Associated with Cervical Cancer N Engl J Med 348(6):518-527. 13. Clifford GM, Smith JS, Plummer M, Muñoz N, Franceschi S. Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a metaanalysis. Br J Cancer. 2003; 88:63-73. 14. Koutsky, L. 1997. Epidemiology of genital human papillomavirus infection. American Journal of Medicine. 102(5A):3-8. 15. Winer RL, Kiviat NB, Hughes JP, et al. Development and duration of human papillomavirus lesions, after initial infection. J Infect Dis. 2005;191:731-738. 16. Moscicki, A, Schiffman M, Kjaer S, Villa L. Updating the natural history of HPV and anogenital cancer. Vaccine 2006; 24(S3); 42-51. 17. Moscicki AB, Ellenberg JH, Farhat S, Xu J. Persistence of human papillomavirus infection in HIV-infected and uninfected adolescent girls: risk factors and differences, by phylogenetic type. J Infect Dis. 2004 Jul 1;190(1):37-45. 18. Palmer Castle PE, Schiffman M, Herrero R, Hildesheim A, Rodriguez AC, Bratti MC, Sherman ME, Wacholder S, Tarone R, Burk RD. A prospective study of age trends in cervical human papillomavirus acquisition and persistence in Guanacaste, Costa Rica. J Infect Dis. 2005 Jun 1;191(11):1808-16. 19. Zielinski GD, Snijders PJF, Rozendaal l, et al. High-risk HPV testing in women with borderline and mild dyskaryosis; long term follow-up data and clinical relevance. J Pathol 2001;195:300-306. 20. Holowaty P, Miller AB, Rohan T, To T. Natural history of dysplasia of the uterine cervix, J Natl Cancer Inst 1999; 91:252-58. 21. Nobbenhuis MA, Helmerhorst TJ, van den Brule AJ, Rozendaal L, Voorhorst FJ, Bezemer PD, Verheijen RH, Meijer CJ. Cytological regression and clearance of high-risk human papillomavirus in women with an abnormal cervical smear. Lancet. 2001;358(9295):1782-1783. 22. Cuzick J, Clavel C, Petry KU, et al. Overview of the European and North American studies on HPV testing in primary cervical cancer screening. Int J Cancer 2006;119:1095-1101. 23. Whitlock EP, Vesco KK, Eder M, Lin JS, Senger CA, Burda BU. Liquid-based cytology and human papillomavirus testing to screen for cervical cancer: a systematic review for the U.S. Preventive Services Task Force. Ann Intern Med 2011;155:687,697, W214-5. 24. Myers, T.W. and Gelfand, D.H. 1991. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry. 30:7661-7666. 25. Davies, P., Kornegay, J., Iftner, T. 2001. Current methods of testing for human papillomavirus. Best Practice and Research Clinical Obstetrics and Gynaecology. Vol. 15, No. 5:677-700. 26. Birch, D.E., et al. 1996. The use of a thermally activated DNA polymerase PCR gives improved specificity, sensitivity and product yield without additives or extra process steps. Nature. Vol 381, No 6581:445-446. 27. Meng, Q., et al. 2001. Automated Multiplex Assay System for Simultaneous Detection of Hepatitis B Virus DNA, Hepatitis C Virus RNA, and Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA. J Clin Microbiol. Vol 39, No 8:2937-2945. 05990289001-13CS 26 Doc Rev. 13.0

28. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93:125-128. 29. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Bio/Technology 10:413-417. 30. Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K., and Williams, P.M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Research 6:986-994. 31. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 32. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Villanova, PA:CLSI, 2005. 33. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 48 th Edition. 2007. 34. Wheeler, C.M., Hunt, W.C., Joste, N.E., Key, C.R., Quint, W.G.V. and Castle, P.E. 2009. Human Papillomavirus Genotype Distributions: Implications for Vaccination and Cancer Screening in the United States. J Natl Cancer Inst. 101:475-487. 35. Khan, M.J., Castle, P.E., Lorincz, A.T., Wacholder, S., Sherman, M., Scott, D.R., Rush, B.B., Glass, A.G. and Schiffman, M. 2005. The Elevated 10-Year Risk of Cervical Precancer and Cancer in Women With Human Papillomavirus (HPV) Type 16 and 18 and the Possible Utility of Type-Specific HPV Testing in Clinical Practice. J Natl Cancer Inst. 97:1072-1079. 36. Wright TC, Jr., Massad LS, Dunton CJ, Spitzer M, Wilkinson EJ, and Solomon D. 2007. 2006 Consensus Guidelines for the Management of Women with Abnormal Cervical Cancer Screening Tests, Am J Obstet Gynecol 197 (4); 346-355. 37. Saslow D, Runowicz CD, Solomon D, Moscicki A-B, Smith RA, Eyre HJ, Cohen C. 2002, American Cancer Society Guideline for the Early Detection of Cervical Neoplasia and Cancer. CA Can Jour Clin 53: 342-362. 38. Stoler MH, Wright TC Jr, Sharma A, Apple R, Gutekunst K, Wright TL; ATHENA(Addressing THE Need for Advanced HPV Diagnostics) HPV Study Group. High-risk human papillomavirus testing in women with ASC-US cytology: results from the ATHENA HPV study. Am J Clin Pathol. 2011 Mar;135(3):468-475. 05990289001-13CS 27 Doc Rev. 13.0

Informace o revizi dokumentu Doc Rev. 12.0 08/2015 Doc Rev. 13.0 06/2016 Aktualizace v ÁSTI B: nyní zahrnuje informace o extrak ní desti ce (s hlubokými jamkami) 2,0 ml v ásti POT EBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOU ÁSTÍ DODÁVKY. Do ásti Provedení pracovního postupu Obnovení byl p idán krok ohledn skenování ID DWP v p ípad použití testu HPV ASAP v2.1. Aktualizovány popisy stránky s harmonizovanými symboly na konci p íbalového letáku. Máte-li jakékoli dotazy, kontaktujte zástupce spole nosti Roche. ásti ODB R, P EPRAVA A SKLADOVÁNÍ VZORK, NÁVOD K POUŽITÍ a FUNK NÍ CHARAKTERISTIKY byly dopln ny o nové pokyny pro uchovávání a manipulaci vzork SurePath. ást A byla odstran na pro ú ely podpory povinného upgradu na verzi softwaru 2.2. Máte-li jakékoli dotazy, kontaktujte zástupce spole nosti Roche. 05990289001-13CS 28 Doc Rev. 13.0

Roche Molecular Systems, Inc. 1080 US Highway 202 South Branchburg, NJ 08876 USA Distributed by Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 2, Avenue du Vercors 6343 Rotkreuz, Switzerland 38240 Meylan, France Roche Diagnostics GmbH Distributore in Italia: Sandhofer Strasse 116 Roche Diagnostics S.p.A. 68305 Mannheim, Germany Viale G. B. Stucchi 110 20052 Monza, Milano, Italy Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, 171-173 Distribuidor em Portugal: E-08174 Sant Cugat del Vallès Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Barcelona, Spain Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier Roche Diagnostica Brasil Ltda. H7V 4A2 Laval, Québec, Canada Av. Engenheiro Billings, 1729 (For Technical Assistance call: Jaguaré, Building 10 Pour toute assistance technique, 05321-010 São Paulo, SP Brazil appeler le: 1-877-273-3433) Obchodní zna ky a patenty Viz http://www.roche-diagnostics.us/patents 2016 Roche Molecular Systems, Inc. 06/2016 (05641225001-15ENGL) Doc Rev. 13.0 05990289001-13 05990289001-13CS 29 Doc Rev. 13.0

V ozna ování diagnostických produkt spole nosti Roche PCR se nyní požívají následující symboly. Pomocný software Diagnostický zdravotnický prost edek in vitro Zplnomocn ný zástupce pro evropské spole enství Výrobce íslo šarže Uchovávejte v temnu Biologická rizika Obsah vysta í pro <n> test Katalogové íslo Omezení teploty t te návod k použití Defini ní soubor testu Obsah soupravy Datum expirace Distribuce Globální íslo obchodní položky Tento výrobek odpovídá požadavk m Evropské sm rnice 98/79/ES o diagnostických zdravotnických prost edcích in vitro. Technická podpora pro zákazníky v USA 1-800-526-1247 05990289001-13CS 30 Doc Rev. 13.0