Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/28.0088
Hybridizační metody v diagnostice Mgr. Gabriela Kořínková, Ph.D. Laboratoř molekulární patologie LF UP a Ústav klinické a molekulární patologie FN Olomouc
Obsah přednášky Teoretický úvod Principy metod využívajících hybridizaci Příklady využití těchto metod v praxi
Základní struktura DNA spojení (vazba) 2 navzájem komplementárních jednořetězcových molekul DNA vodíkovými vazbami, vzniká dvouřetězcová molekula DNA - dvoušroubovice DNA A-T a C-G RNA A-U a C-G
Pojem hybridizace Za vyšší teploty (specifická pro konkrétní složení DNA teplota tání Tm) probíhá denaturace DNA, zanikají vodíkové vazby ve dvoušroubovici a vznikají jednořetězcové DNA molekuly Při postupném ochlazování dochází k renaturaci DNA, tzn. znovuobnovení dvoušroubovice Hybridizace = proces spojování navzájem komplementárních jednořetězcových molekul DNA za vzniku hybridních dvouřetězcových molekul DNA podmínkou je úplná nebo částečná komplementarita bází nukleových kyselin
Pojem hybridizace DNA - A DNA - B Denaturace, zvýšená teplota Kombinování řetězců DNA Stupeň hybridizace Snižování teploty, renaturace Kompletní hybridizace Částečná hybridizace Nulová hybridizace
Využití hybridizace v diagnostice Detekce přítomnosti hledané DNA (RNA) ve vzorku (např. detekce DNA Mycobacteria tuberculosis), vyšetření genové exprese Detekce změn v DNA sekvenci (genetické mutace, strukturní a početní změny chromozomů) dsdna ssdna (doublestranded) dvouřetězcová DNA (singlestranded) jednořetězcová DNA
DNA (RNA) sonda Uměle připravená jednořetězcová DNA nebo RNA o délce 15-2000 bází (syntéza, klonování do bakteriálních vektorů) Označení sondy na jejím konci nebo po celé délce - radioaktivní - chemické - fluorescenční
Podmínky hybridizace Optimální teplota hybridizace Délka molekul DNA (RNA) použitých k hybridizaci, jejich koncentrace v reakční směsi Stupeň komplementarity bází Koncentrace solí a ph v reakční směsi, atd. přísné x méně přísné podmínky (potlačení nespecifických vazeb) Hybridizace A. s NK přenesenými na membrány B. s NK přímo v původních preparátech buněk a tkání - in vitro hybridizace C. s NK (nukleovou kyselinou) v roztoku
Hybridizace na membránách Testovaná NK je před hybridizací přenesena na membránu (nitrocelulóza, nylon) 1. Tečková hybridizace - přenáší se NK obsažená v roztoku
Hybridizace na membránách 2. Hybridizace kolonií a plak - přenáší se NK bezprostředně uvolněná z bakteriálních kolonií nebo plak bakteriofágů vyrostlých na živých médiích (agar) - mikrobiologie
Hybridizace na membránách membrána řetězce NK radioaktivně značená sonda navázaná sonda kolonie nebo plaky vyrostlé na plotně lýza buněk nebo fágů, denaturace NK v alkalickém prostředí hledaná genetická sekvence mem brán a odpovídající kolonie autoradiografie
Hybridizace na membránách 3. Southernův přenos (DNA) - štěpení DNA restriktázou na fragmenty - jejich rozdělení podle molekulární hmotnosti (velikosti) gelovou elektroforézou v el. poli (polyakrylamidový nebo agarózový gel) - přenos DNA z gelu na membránu (kapilární, elektroforetický nebo vakuový přenos) - hybridizace Nothernův přenos (RNA)
Hybridizace na membránách Southernův přenos restriktáza DNA gelová elektroforéza membrána sonda hybridizace autoradiografie
Hybridizace na membránách - DNA molekuly putují při gelové elektroforéze ke kladně nabité elektrodě DNA marker, určení velikosti DNA
Hybridizace na membránách - Získáme informaci nejen o přítomnosti, ale i o velikosti NK, která hybridizovala Southernův přenos ukázka autoradiogramu
In vitro hybridizace detekce sekvence DNA přímo v buňkách cytologických nebo histologických preparátů detekce přítomnosti sekvence DNA, její přesná lokalizace, možná kvantifikace signálu dnes převážně fluorescenční značení sond FISH - fluorescenční in situ hybridizace (základní metoda cytogenetiky) vizualizace pod fluorescenčním mikroskopem možnost použití několika sond vedle sebe
In vitro hybridizace
In vitro hybridizace Metoda FISH Chromozomy V jádře Testovaný preparát FISH sonda Fluorescenční signál Hybridizující FISH sonda
Příklad FISH vyšetření v naší laboratoři Prediktivní diagnostika u onkolog. pacientů Vyšetření onkogenu HER2 (transmembránový buněčný receptor) u pacientek s karcinomem prsu v případě zmnožení receptorů (pozitivita u 10-34% pacientů), pacientka dostává cílenou léčbu monoklonální protilátka Herceptin, výsledkem je inhibice růstu nádorových buněk http://www.breastcancer.org/treatment/targeted_therapies/herceptin/how_works
Příklad FISH vyšetření v naší laboratoři
Příklad FISH vyšetření v naší laboratoři - zelená sonda pro centromerickou oblast chromozomu - červená sonda pro gen HER2 Amplifikace HER2 genu
Příklad FISH vyšetření v naší laboratoři centr omer a gen HER2 centromera
Příklad FISH vyšetření v naší laboratoři Vyšetření onkogenu HER2 - v současné době se ve světě testuje a validuje možnost detekce HER2 pomocí RNA in situ hybridizace (detekce mrna HER2) - podmínkou je výborná kvalita vyšetřovaného materiálu, relativně nová metoda IHC x amplifikace DNA x m RNA
In vitro hybridizace Modifikováním FISH metody vznikly nové metodiky umožňující analyzovat celý genom v jednom hybridizačním pokusu Lze snadno hledat změny v počtu chromozomů, genů a DNA sekvencí (vrozené chromozomově podmíněné syndromy, nádorové buňky) - CGH metoda (komparativní genomická hybridizace) - SKY metoda (spektrální karyotypování)
In vitro hybridizace CGH (komparativní genomová hybridizace) - umožňuje detekovat relativní počet kopií jednotlivých sekvencí DNA mezi testovaným a tzv. normálním genomem - lze tak zjistit zmnožení DNA (amplifikace) nebo naopak ztrátu sekvencí (deleci), podmínkou je, aby byly tyto klonální změny zastoupeny alespoň v 50 % testovaných buněk
In vitro hybridizace Princip CGH metody testovaná DNA fluorescein rhodamid normální DNA metafázové chromozomy hybridizace oranžová-balancovaná DNA červená-ztráta DNA zelená-zisk DNA
Příklad CGH typizace In vitro hybridizace
In vitro hybridizace SKY metoda (spektrální karyotypování) - barevné rozlišení jednotlivých chromozomů založené na současné hybridizaci chromozomů (mitóza) s 24 celochromozomovými sondami značenými v různých kombinacích několika fluorescenčními barvami - screnningová metoda, identifikace komplexních chromozomových abnormalit, zejména translokací
In vitro hybridizace Příklad SKY karyotypizace
Hybridizace v roztoku PCR reakce polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) - zmnožování (amplifikace) vybrané sekvence dvouřetězcové DNA (stačí 1 molekula DNA) - sekvence DNA je vymezena tzv. primery (umělé nukleotidy 18-30 bází) - používá se speciální termostabilní Taq polymeráza základní 3. kroky reakce, obvykle cca 30 cyklů 1. denaturace dsdna (94 C) 2. nasedání (hybridizace) primerů (30-65 C) 3. syntéza DNA (65-75 C)
Hybridizace v roztoku PCR reakce denaturace nasedání primerů syntéza DNA (Taq polymeráza, volné nukleotidy) namnožený úsek DNA
PCR reakce Hybridizace v roztoku cílový úsek Exponenciální amplifikace
Hybridizace v roztoku PCR reakce - zařízení hybridizér
PCR reakce Hybridizace v roztoku - detekce amplikonu gelovou elektroforézou, stanovením sekvence DNA nebo pomocí hybridizace se značenou sondou (Southernův přenos nebo real time PCR reakce) ko
Hybridizace v roztoku Real time PCR reakce (reakce PCR sledovaná v reálném čase) fluorescenční sonda nasedající na postupně přibývající amplikon možnost kvantifikace počtu hledané DNA sekvence ve vzorku
Hybridizace v roztoku PCR metoda má mnoho modifikací - In situ PCR reakce reakce probíhá přímo v buňkách preparátů, fluorescenční vizualizace amplikonu - Reverzní PCR reakce (RT-PCR) určená k amplifikaci molekul RNA; vyizolovaná RNA se nejprve přepíše za pomocí enzymu reverzní transkriptázy do cdna (copy DNA), pak probíhá standartní PCR reakce
Hybridizace v roztoku Využití PCR reakce - identifikace bakteriálních a virových patogenů (v naší laboratoři je zavedena metoda detekce mykobakterií tuberkolózy v DNA vyizolované z parafinových bločků neživé bakterie) - detekce mutací - určení typu nádorů (B nebo T lymfom) - detekce přítomnosti nádorových buněk ve vzorcích krve, kostní dřeně nebo v sentinelových uzlinách (hledají se typické znaky epiteliální tkáně na pozadí neepiteliální tkáně) minimální reziduální choroba
Shrnutí Hybridizační metody mají dnes už nezastupitelnou úlohu v získávání poznatků o vyšetřovaném materiálu pacienta Vždy je nutná kooperace lékař molekulární biolog Výhody vysoká citlivost a specifita Nevýhody dostatečně kvalitní materiál, speciální vybavení, časová náročnost, cena
Děkuju za pozornost