POČÍTÁNÍ BUNĚK Potřeba spočítat množství buněk vzniká při řešení mnoha biologických otázek. Mnohé z nich mívají rovněž klinický význam (zejména v hematologii je zjišťování počtů krvinek každodenním rutinním vyšetřením). Podle účelu a charakteru buněk mohou být ke spočítání množství buněk použity různé metody. Buňky bývají počítány přímo nebo nepřímo. Nepřímo bývají počítány měřením charakteristik, které na počtu buněk závisejí. Jsou-li vzata v úvahu specifická omezení, která jsou s takovýmto přístupem spojena, může být podobné měření počtu buněk v analyzovaném vzorku nejenom pro daný účel dostatečně přesné, ale mnohdy i mnohem levnější a rychlejší. O počtu buněk svědčí jejich hmotnost, kterou lze zjistit vážením. Množství buněk může být měřeno jako zákal suspenze v kolorimetru (nefelometricky, např. u bakteriální suspenze) nebo jako podíl objemu všech buněk ve vzorku (např. hematokrit pro červené krvinky). Na množství buněk lze usuzovat také dle intenzity metabolické činnosti buněk (např. u mikrobiálních kultur) nebo podle množství některé složky buněk (např. množství hemoglobinu v červených krvinkách). Někdy se podobným způsobem naměřené hodnoty přepočítávají podle kalibrační křivky na počet buněk (např. při nefelometrickém stanovení), jindy se naměřené hodnoty nepřepočítávají (např. hematokrit, který se udává jako poměrné číslo). V mikrobiologii je běžnou metodou zjištění počtu buněk ve vzorku též metoda kultivační. Ta spočívá ve vhodném naředění analyzovaného vzorku, následné kultivaci suspenze na vhodné půdě a spočítání množství narostlých kolonií. Buňky lze počítat v různě upravených preparátech pod mikroskopem, nebo elektronicky v suspenzi. Pod mikroskopem lze použít počítací komůrky a suspenzi buněk (např. mikrobiální kultury nebo vzorek krve) umístit do ní, nebo trvalý preparát (např. hematologický, histologický). Trvalý preparát pro počítání buněk lze někdy zhotovit ze známého objemu suspenze (např. 10 µl), který rozetřeme na definovanou plochu (např. 1 cm 2 ) a po vysušení, fixaci a barvení buňky spočteme. K elektronickému počítání buněk se používají speciální počítače, jejichž principem je to, že supenze buněk (v elektrolytu) o přesném objemu je nasávána úzkým otvorem (do elektricky nevodivé trubice) mezi dvěma elektrodami a přístroj registruje průchod každé buňky jako jeden impuls. Nejrozšířenější jsou v tomto směru počítače krvinek. Část mřížky Bürkerovy komůrky. Výška prostoru, v němž jsou buňky nad mřížkou počítány, je 0,1 µm
Následující cvičení obsahují návod k počítání erytrocytů a leukocytů v Bürkerově komůrce, což je aplikace z laboratorní biologie. Stejným postupem lze spočítat řasy, kvasinky a jiné jednobuněčné organismy (např. dírkonošce, mřížovce, bachořce), přičemž do Bürkerovy komůrky kápneme přímo vodnou suspenzi kultury a tyto organismy můžeme často počítat přímo nebarvené. Počítání erytrocytů Normální počet erytrocytů dosahuje v krvi dospělého člověka u mužů 4,3-5,3 10 12 /l, u žen 3,8-4,7 10 12 /l. Při některých patologických stavech dochází ke zvýšení počtu erytrocytů (polyglobulie, polycytémie) nebo naopak k jejich snížení (obvykle anémie). Na počtu erytrocytů a tím i obsahu hemoglobinu závisí schopnost krve přenášet kyslík. V Hayemově roztoku (0,5 g HgCl2, 1 g NaCl, 5 g Na2SO4, destilovaná voda 200 ml) se erytrocyty zvýrazní a ostatní elementy rozruší, takže neztěžují počítání. Roztoku se nemá připravit velké množství do zásoby, ale jen tolik, kolik je potřeba na 14 dní. Ve starším roztoku m že nastat slepování až shlukování erytrocyt a to ztěžuje počítání. Hayemův roztok obsahuje prudký jed, chlorid rtuťnatý, takže je nutno s ním pracovat velmi opatrně. Nesmí se pipetovat nasáváním ústy, ale vždy pomocí dávkovače nebo nasávacího násadce pro pipety. Pomůcky: Bürkerova komůrka, banička, dávkovač nastavený na 4,0 ml, pipety pro odběr 20 µl krve, Hayemův (čti ejemův) roztok, mikroskop, měkký hadřík na očištění komůrky. Postup: 1) Do zkumavky se nejprve napipetuje dávkovačem 4,0 ml ředicího roztoku. 2) Potom se do pipety nasaje přesně 20 µl krve a přidá se k ředicímu roztoku ve zkumavce (tj. ředění 200x). 3) Pipeta s krví se několikrát propláchne, aby se všechna krev dostala do zkumavky a aby se dokonale promíchala s ředicím roztokem. 4) Zkumavka se zředěnou krví se uzavře gumovou zátkou a dokonale se promíchá, aby z erytrocytů vznikla rovnoměrná suspenze. Tou pak kapátkem nebo Pasteurovou pipetou naplníme počítací Bürkerovu komůrku. 5) Komůrka se naplní zředěnou krví tak, aby se dokonale a rovnoměrně přikrylo celé počítací pole. Obvodové kanálky se mají naplnit tak, aby tekutina z jedné polovice nepřetékala do druhé. Po správném naplnění počítacího prostoru necháme komůrku ležet, aby se náplav erytrocytů ustálil. 6) Erytrocyty počítáme s objektivem zvětšujícím 20x. Erytrocyty je třeba v Bürkerově komůrce spočítat ve 20 obdélnících napříč komůrkou. Počítáme červené krvinky uvnitř každého obdélníku a krvinky, které se dotýkají (zevnitř i zvenčí) levé a horní strany. Červené krvinky, které se dotýkají pravé a dolní strany (vně i zevnitř), nepočítáme. Napočítané erytrocyty postupně zaznamenáváme do protokolu nebo na tlačítkovém čítači. Hodnocení: Vzhledem k ředění a objemu komůrky ve 20 obdélnících získáme konečný výsledek tak, že součet erytrocytů z těchto 20 obdélníků vydělíme 100, čímž vyjde hodnota v 10 12 /l. Výsledky:
POČÍTÁNÍ ERYTROCYTŮ Obdélník 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 VÝSLEDEK: Závěr: Hodnocení a podpis vyučujícího:... Datum a podpis studenta:...
Počítání leukocytů Počítání leukocytů je jedním z důležitých ukazatelů obranyschopnosti organismu a současně ukazatelem funkčního stavu aktivní kostní dřeně. Zvýšený počet vyzrálých leukocytů signalizuje zvýšenou dřeňovou nebo lymfatickou aktivitu, snížení naopak. leukocytů se pohybuje u dospělého člověka mezi 4,0 až 10,5 10 9 /l. Vyšší hodnoty se označují jako leukocytóza, nižší jako leukopenie. Leukocyty se mohou počítat podobně jako erytrocyty, při počítání v komůrce se jako ředicí roztok používá Türkův roztok (1 ml kyseliny octové, 1 ml jednoprocentního roztoku gentiánové violeti, 100 ml destilované vody). Ledová kyselina octová tohoto roztoku rozruší erytrocyty a trombocyty, neporuší však leukocyty. Genciánová violeť obarví jádra leukocytů, takže leukocyty jsou potom v zorném poli mikroskopu výrazné a dají se poměrně snadno počítat. Pomůcky: Bürkerova komůrka, zkumavky, pipeta 20 µl, Türkův roztok, mikroskop, měkký hadřík na očištění komůrky. Postup: 1) Nejdříve se do zkumavky napipetuje 400 µl Türkova roztoku, přidá se 20 µl krve (tj. ředění 20x). 2) Pipetu, kterou jsme přidali krev, několikrát ve zkumavce propláchneme ředícím roztokem. 3) Zkumavku uzavřeme gumovou zátkou a dokonale promícháme, aby vznikla stejnoměrná suspenze leukocytů. 4) Kapátkem nebo Pasteurovou pipetou potom přeneseme kapku suspenze leukocytů v Türkově roztoku do počítacího prostoru Bürkerovy komůrky. Napuštění má být přiměřené. Při napouštění dbáme, aby se nevytvořily vzduchové bublinky pod krycím sklíčkem v prostoru nad počítací mřížkou. 5) Když se náplav v počítacím prostoru ustálil, přikročíme k vlastnímu počítání s objektivem zvětšujícím 20x v 50 středně velkých (nebo v 80 malých) čtvercích počítací mřížky (viz obr.). 6) Počítáme bílé krvinky uvnitř každého čtverce a krvinky, které se dotýkají (zevnitř i zvenčí) levé a horní strany. Bílé krvinky, které se dotýkají pravé a dolní strany (vně i zevnitř), nepočítáme. Hodnocení: Vzhledem k objemu nad 50 čtverečky komůrky a použitému ředění obdržíme výslednou koncentraci leukocytů v krvi tak, že součet leukocytů vydělíme deseti a výslednou hodnotu vyjádříme s násobkem 10 9 /l. Výsledky:
POČÍTÁNÍ LEUKOCYTŮ Čtverec 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Čtverec 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Čtverec 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 VÝSLEDEK: Závěr: Hodnocení a podpis vyučujícího:... Datum a podpis studenta:...