KDE MŮŽE POMOCI MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE GASTROENTEROLOGIE
A) GENETICKY PODMÍNĚNÁ ONEMOCNĚNÍ Celiakální sprue Celiakální sprue je hereditární autoimunitní onemocnění dětí a dospělých s celosvětovým výskytem způsobené celoživotní nesnášenlivosti lepku (glutenu). Celiakie je velmi častá autoimunitní choroba s prevalenci 0,5 2 % ve vyspělých zemích. Odhad prevalence v ČR je 1:200 1:250, tj. 40 000 50 000 nemocných, ale v současné době je diagnostikováno a dispenzarizováno jen 10 15 % celiaků. Onemocnění má genetický podklad a je podmíněno přítomnosti specifických glykoproteinů HLA systému II. třídy na povrchu imunokompetentních buněk. Asi u 95 % pacientů se vyskytují molekuly HLA-DQ2 a u 5 10 % pacientů HLA-DQ8. Po úpravě transglutaminázou se na tyto molekuly vážou metabolity lepku (gliadin), které ve sliznici tenkého střeva spouštějí imunitní reakci namířenou proti buňkám vlastního organismu. Přítomnost těchto molekul ovšem znamená pouze možnost onemocnět celiakií, onemocnění se rozvíjí až za přispění dalších známých i neznámých faktorů. Choroba není projevem defektního genu, ale vzniká spíše jako důsledek sdruženého efektu zcela funkčních variant genových produktů. HLA-DQ2 nebo HLA-DQ8 pozitivita se vyskytuje u 20 25% zdravé bělošské populace. Nepřítomnost HLA-DQ2 nebo HLA-DQ8 vylučuje celiakii z 99%. 2
Hereditární fruktózová intolerance Hereditární fruktózová intolerance je autozomálně recesivní onemocnění projevující se neschopností metabolizovat fruktózu a podobné cukry (sacharóza, sorbitol). Onemocnění je způsobeno deficiencí enzymu aldolázy B. Incidence tohoto onemocnění není přesně známá, ale uvádí se v rozmezí 1/12000 1/58000. Gen pro aldolázu B je lokalizován na 9 chromosomu. V tomto genu bylo popsáno více než tři desítky mutací. Z toho však tři mutace (A149P, A174D a N334K) jsou v evropské populaci velmi časté a představují přibližně více než 85% všech HFI mutantních alel. Laktózová intolerance Laktózová intolerance je nejčastější forma disacharidázové deficience a jedná se o neschopnost trávit laktózu, která je hlavním cukrem obsaženým v mléce. Odhaduje se, že 7-20% bělošské populace trpí intolerancí laktózy. Intolerance se projevuje v jakémkoli věku a muži i ženy jsou postiženi stejně. Enzym laktáza - phlorizin hydroláza je kódován genem LCT, který je lokalizován na chromosomu 2q21. Exprese genu LCT je regulována a tato regulace zahrnuje transkripční a posttranskripční kontrolu. Transkripční regulace se ukazuje jako nejdůležitější faktor, který ovlivňuje hladinu enzymu laktázy phlorizin hydrolázy. Se sníženou aktivitou enzymu jsou asociovány jednonukleotidové polymorfismy C/T-13910 a G/A-22018, které jsou ve vzdálenosti 14 a 22 kb před genem LCT a které snižují transkripci genu LCT a tímto tak ovlivňují a vlastně snižují hladinu enzymu. Hemochromatóza Hereditární hemochromatóza (HH) je dědičná autosomálně recesivní porucha metabolismu železa, projevující se střádáním přebytečného železa v orgánech a tkáních s jejich následným poškozením. HH patří mezi nejčastější hereditární onemocnění v evropské populaci a její frekvence se udává mezi 1:400 až 1:200 jedinců. V současnosti je známých 5 forem HH, z nichž nejčastější je HH typ 1, která je asociována s mutacemi v genu HFE. U 80 85 % nemocných s klinicky diagnostikovanou HH lze nalézt mutaci C282Y (845G>A), tuto mutaci v heterozygotní podobě má 8-10 % obyvatel západní, severní a střední Evropy a v podobě homozygotní činí její prevalence asi 1 : 30 400 a jedná se tak o jednu z nejčastějších geneticky přenášených chorob vůbec. Další nejčastější je mutace H63D (187C>G), která se nachází asi u 40 % nemocných s hemochromatózou, kteří nemají mutaci C282Y. Ještě méně častá je mutace S65C (193A>T), která se nachází asi u 8 % případů bez jiné prokazatelné mutace; onemocnění zde mívá mírnou podobu. 15 20 % nemocných s klinicky jasnou hemochromatózou nemá homozygotní mutaci C282Y. V těchto případech se může jednat o heterozygoty či složené heterozygoty (nosiči mutace C282Y a H63D), o jinou genetickou odchylku s podobným fenotypem či o dosud nerozpoznané sekundární nahromadění železa (hemosiderózu). Tito složení heterozygoti tvoří asi 1 % populace, z nich má 22 % normální koncentraci ferritinu, u 40 % lze prokázat nadbytek železa bez klinických příznaků a 30 % splňuje klinická kritéria pro hemochromatózu. Naopak asi 5 % nemocných s fenotypem hemochromatźy nemá žádnou známou genetickou poruchu. Penetrace genu není vysoká, téměř u 50 % homozygotů C282Y nedochází k progresivní akumulaci železa a nesplňují tedy klinická kritéria hemochromatózy, přestože u nich lze prokázat zvýšenou saturaci transferrinu. 3
4
Wilsonova choroba Wilsonova choroba je autozomálně recesivní onemocnění, které je charakteristické akumulací mědi v organismu (především v játrech a mozku). Výskyt choroby je celosvětový, vyšší incidence je mezi židy a Araby. Výskyt poruchy je cca 1:30 000, výskyt heterozygotních nosičů genu je 1/90 obyvatel. Wilsonova choroba je nejčastějším geneticky podmíněným poškozením jater u dětí. Tato porucha je podmíněna na molekulární úrovni mutacemi v genu ATP7B. V tomto genu bylo popsáno více než 215 mutací. Vliv jednotlivých mutací na průběh onemocnění je rozdílný a je dán polohou mutace v genu. Základní vyšetření zahrnuje kauzální mutaci H1069Q, která je nejčastěji se vyskytující mutací ve střední Evropě. Frekvence této mutace u nemocných se pohybuje 30 65%. Dalšími vyšetřovanými mutacemi rozšířenými ve střední Evropě jsou T737R, R778G, W779X, T977M, A1018V, T1033S, G1111D, D1271N, 3402delC, 1340del4, 1518_1522del5, 3140delA, 3794_3803del10, jejichž výskyt u nemocných WD v České republice nepřesahuje 5%. Metodou sekvenování jsme schopni vyloučit všechny bodové mutace, menší delece, duplikace a inzerce ve vyšetřovaných exonech 3, 8, 13, 14, 15, 18 a 19. Významný je přínos genetické diagnostiky Wilsonovy choroby u sourozenců a v asymptomatické fázi onemocnění. Crohnova choroba Crohnova choroba je nespecifické zánětlivé onemocnění trávicího traktu. Příčina Crohnovy choroby není dosud přesně známa. Sklon k onemocnění je ovlivněn geneticky a nemoc může být v náchylné osobě vyvolána vlivy okolního prostředí (dietní chyby, kouření, stres). Rovněž se uvádí, že na rozvoji onemocnění se uplatňují faktory imunologické a infekční (vše je předmětem intenzivního výzkumu). V nedávné době bylo identifikováno několik chromosomových oblastí, které vykazují možnou spojitost s náchylností ke vzniku Crohnovy choroby (např. na chromosomu 5p13.1, 6p21). Jedním z významných genů, jehož mutace jsou asociovány se zvýšenou pravděpodobností rozvoje Crohnovy choroby, patří gen NOD2/CARD15, který se nachází na chromosomu 16q12. Protein kódovaný tímto genem hraje důležitou roli v imunitní odpovědi na bakteriální infekci. Mutace v tomto genu mají za následek změnu funkce proteinu, které vedou ve svém důsledku ke ztrátě kontroly organismu na bakteriální infekci. Tři mutace v NOD2/CARD15 genu (R702W, G908R, 1007fs) představují přibližně až 82 % mutací u pacientů s Crohnovou chorobou. Uvádí se, že relativní riziko rozvoje CD je 2 4x vyšší u nosičů jedné mutace (heterozygoti) a až 17x vyšší u nosičů dvou mutací (homozygoti, složení heterozygoti). Uvádí se, že mutace v NOD2/CARD15 genu se vyskytují přibližně u 7-20 % zdravé populace a 30 50 % pacientů s CD. Gilbertův syndrom Gilbertův syndrom (GS) je geneticky podmíněné banální onemocnění, ale jeho vysoká frekvence v populaci v rámci diferenciálně diagnostického uvažování často prodlužuje stanovení správné diagnózy. Jedná se o autozomálně recesivní onemocnění s 15 % frekvencí v populaci ČR. GS je charakterizované mírnou chronickou nekonjugovanou hyperbilirubinémií (17-100 mol/l) (Tab. 1) bez přítomnosti jaterního onemocnění či zjevné hemolýzy. Etiologií GS je snížená aktivita uridindifosfát glukuronosyltransferázy 1A1, katalyzující glukuronidaci nekonjugovaného bilirubinu. Nejčastější kauzální mutací je inzerce TA sekvence v promotoru UGT 1A1 genu. Promotor 5
nemutovaného genu obsahuje 6 TA sekvenci na obou alelách UGT 1A1 (genotyp 6TA/6TA). Postižení jedinci s GS mají genotyp 7TA/7TA (7 TA na obou alelách genu) nebo zřídka genotyp 7TA/8TA. Přenašeči mají genotyp 6TA/7TA (heterozygoti). U GS pacientů genotyp 7TA/7TA se vyskytuje v 99 %. Zbylí pacienti (s výskytem méně než 1%) jsou tzv. compound (složení) heterozygoti, kteří na jedné alele UGT 1A1 genu nesou inzerci TA sekvence a na druhé jinou mutaci (genotyp: 7TA/jiná mutace)*. Doporučujeme proto v prvním kroku indikovat analýzu TA inzerce a v případě výsledku 6TA/7TA žádat rozšířenou molekulárně genetickou analýzu celého UGT 1A1 genu metodou přímého sekvenování. Je třeba dodat, že při léčbě irinotecanem u onkologických pacientů s genotypem 7TA/7TA se může vyskytnout toxické reakce na terapii (diarrhea, leukopenie, neutropenie atd). Crigler-Najjar syndrom I, II Crigler-Najjar syndrom (CNS) je velmi vzácná porucha metabolismu bilirubinu s incidencí 1:1 000 000. Jedná se o dědičnou nehemolytickou žloutenku vedoucí ke kernikteru. Jsou rozlišovány dvě formy: CNS typ I s dědičností autozomálně recesivní (AR) a CNS typ II s dědičností autozomálně dominantní (AD) (Tab. 1). CNS typ I je charakterizován hladinou celkového bilirubinu kolem 345 μmol/l (310-755 μmol/l). Neléčené formy onemocnění mají fatální konec v 1. 2. roku života. U CNS II se hladina bilirubinu většinou pohybuje pod 345 μmol/l a afekce je mnohdy detekována v pozdějším věku. Kernikterus je méně častý. Etiologickou příčinou obou syndromů jsou mutace v UGT 1A1 genu. Na rozdíl od Gilbertova syndromu se tyto mutace nacházejí v kódující oblasti genu. Tab. 1: Celkový bilirubin v séru (mg/dl) Typ I 18 45 (obvykle > 20) Crigler-Najjar syndrom Typ II 6 25 (obvykle < 20) Gilbertův syndrom Typicky 4 mg /dl bez hladovění nebo hemolýzy Pravidelné jaterní testy Normální Normální Normální Odpověď na fenobarbital Obvyklý Snížení bilirubinu o > 25% Snížení bilirubinu na normál Kernicterus Žádný Vzácný Žádný Jaterní histologie Normální Normální Obvykle normální; u některých zvýšení pigmentu lipofuscin Barva žluči Světlá nebo bezbarvá Pigmentovaná Normální tmavé barvy Frakce bilirubinu ve žluči Aktivita bilirubin UDP- -glucuronosyl-transferázy Dědičnost (všechny autosomální) > 90% nekonjugovaný Obvykle chybí; zbytky u některých pacientů Největší podíl (průměr: 57%) monokonjugáty Výrazně snížená: 0 10% normální hodnoty Hlavně dikonjugáty, ale monokonjugáty zvýšené (průměr 23 %) Redukovaná: typicky 10 33% normální hodnoty recesivní Dominantní Recesivní 6
B) NÁDOROVÁ ONEMOCNĚNÍ 1) Hereditární nádorová onemocnění Tento typ vyšetření může indikovat pouze klinický genetik (odbornost 208). Pokud máte u pacienta podezření na jakýkoliv typ hereditárního nádorového onemocnění obraťte se na nejbližšího klinického genetika. Klinický genetik v zařízení Agel a.s.: MUDr. Kateřina Kyselová (tel.: 556 416 142, 602 632 736) > Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC, Lynchův syndrom) gen MLH1, MSH2 a MSH6 > Familiární adenomatózní polypóza (FAP) gen APC a MYH (MUTYH) > Syndrom Li-Fraumeni gen TP53 > Hereditární difúzní karcinom žaludku gen CDH1 > Hereditární syndrom prsu a/nebo ovarií gen BRCA1 a BRCA2 > Peutz-Jeghersův syndrom gen STK11 > Cowden syndrom gen PTEN > Juvenilní polypóza gen SMAD4 a BMPR1A > Tuberósní sklerósa gen TSC1 a TSC2 > Li-Fraumeni syndrom gen TP53 > Hereditární pankreatitida gen PRSS1, PRSS2, SPINK1 a CFTR Laboratoře AGEL a.s. a CGB laboratoř a.s. spolupracují na multicentrické mezinárodní studii CANCER OF THE PANCREAS SCREENING-CAPS, která probíhá v 10 státech na území 4 kontinentů. Cílem této studie je detekce časných, tj. kurabilních neoplázií pankreatu. Vyhledávána jsou T1N0M0 R0 (negativní hranice resekce) adenokarcinomy, high-grade dysplastické PanIN leze (PanIN3) a intraduktální papilární mucinosní neoplázie (IPMN). Koordinátorem této studie je MUDr. Martin Kliment, Vítkovická Nemocnice a.s., Ostrava. > a jiné 7
2) Sporadická nádorová onemocnění Detekce mutací v genu K-ras Onkogen K-ras patří do rodiny ras (of retrovirus-associated DNA sequences) původně izolovaných z Harvey (H-ras), Kirsten (K-ras, Ki-ras, rask) myšího sarkoma virů. K-ras je lokalizován na 12p chromozómu v oblasti 12p12.1 K-ras kóduje transdukční monomerní G-protein (označen jako p21k-ras nebo K-ras protein), který hraje významnou roli při přenosu signálu z receptoru přes cytosol do jádra buňky. Molekula p21 sestává z jednoho polypeptidu a vyznačuje se GTPázovou aktivitou. Protein je aktivní v případě, že se na něj váže GTP, a je inaktivní, když váže GDP. V normálních fyziologických podmínkách se jedná o cyklický proces, který je indukován signálem zprostředkovaným GRB2 proteinem. Na zprostředkovaný extracelulární popud se z p21k-ras uvolní GDP a dojde k navázání GTP. Takto vzniklá konformační změna proteinu vyvolá interakci s daným efektorem a dovolí transmisi signálu. V zápětí dojde k hydrolýze GTP na GDP a anorganický fosfátu a k návratu proteinu do inaktivního stavu. Somatické mutace v K-ras blokují hydrolýzu GTP na GDP nebo způsobují konformační změny v kódovaném proteinu, a tak vyvolávají permanentní stimulaci jeho efektorů, která vede ke změnám v regulaci buněčného cyklu. Nejčastěji byly nalezeny mutace k kodonech 12, 13 a 61 s různým zastoupením v nádorech: pankreatu (80 90 %), CRC (kolem 40 %), plic (25 60 %), prostaty (do 25 %), kůže (do 25 %), štítné žlázy (do 60 %), jater (10 25 %), vaječníku (do 50%), endometria (10 40 %), ledvin (do 50 %), hlavy a krku (asi 10 %), prsu (asi 10 %), mozku (do 15), močového měchýře (asi 5 %) seminomu (10 45 %). Detekce mutací má velký význam při upřesnění nejednoznačných výsledků histologických vyšetření, při subtypizaci nádoru a při léčbě anti-egfr preparáty. Předpokladem aplikace těchto léků je K-ras negativita v nádorech. Detekce mutací v genu BRAF Gen BRAF je lokalizovaný na chromozomu 7 v oblasti 7q34. Je humánním homologem ptačí c-rmil protoonkogenu. Kóduje cytoplazmatický protein BRAF (B-raf), který patří do skupiny serin/threonin proteinových kináz Raf (Rapidly Accelerated Fibrosarcoma) spolu s dalšími proteiny ARAF (A-Raf) a CRAF (C-Raf) a hraje důležitou roli v regulaci signální kaskády MAPK/ ERK. Substituce c.1796t>a (Val600Glu) v exonu 15, kódujcí kinázovou doménu BRAF, je téměř jedinou aktivační mutací v mnoha nádorech. Tato somatická mutace zvyšuje aktivitu BRAF a způsobuje jeho nezávislost na stimulaci ras. V publikacích se uvádí, že je přítomná u cca 7 % maligních nádorů, zejména v maligním melanomu (40 až 60 %), papilárním karcinomu štítné žlázy (29 až 69 %), kolorektálním karcinomu (5 až 10 %), GIST (až 13%), v karcinomech žlučníku a žlučových cest (asi 20 %), v nádorech ze zárodečných buněk,ale i v benigních melanocytárních névách a dalších. Detekce mutací má velký význam při upřesnění nejednoznačných výsledků histologických vyšetření, při subtypizaci nádoru a při léčbě. Detekce mutací u gastrointestinálních stromálních tumorů Gastrointestinální stromální tumor (GIST) je nejčastějším mezenchymálním nádorem trávicího traktu. Nejčastěji postihuje žaludek (65 %), tenké střevo (25 %), tlusté střevo a konečník (5 10 %), vzácně se vyskytuje také v jícnu. Incidence GIST v České republice je kolem 300 případů ročně. 8
Původ nádoru je přisuzován kmenovým buňkám, které se diferencují směrem k intersticiálním Cajalovým buňkám ovlivňujícím peristaltiku. a) genu c-kit Více než 80 % GISTu je způsobeno mutací v genu c-kit akumulovaných v hotspot exonech 8, 11, 13 a 17. Gen c-kit je lokalizován na dlouhém raménku 4. chromozomu a kóduje tyrozinkinázový receptor (RTK) pro růstový faktor SCF. Mutace v genu c-kit u GISTu způsobují nepřiměřenou aktivaci TK domény nezávislou na vazbě SCF, což vede ke zvýšené buněčné proliferaci a genomové instabilitě. U GISTu je terapie zaměřena na biologickou léčbu pomocí protein kinázového inhibitoru imatinib mesylátu (STI 571, Glivec). Detekce mutací v c-kitu slouží jako prediktivní faktor terapeutické odpovědi. Vysokou citlivost na léčbu vykazují nádory s mutací v exonu 11, naopak primárně rezistentní jsou nádory bez mutace či nádory s mutací v exonu 18. b) genu PDGFRA Dalším z klíčových dějů v onkogenezi GIST se považují aktivační mutace genu PDGFRA. Studie potvrdily přítomnost mutací PDGFRA v cca 30 60 % KIT-imunonegativních a/ 9
nebo KIT,,wild type tumorů splňujících histologická kritéria GIST. Gen PDGFRA (platelet derived growth factor receptor α) je lokalizován na dlouhém raménku 4. chromozomu. Kóduje alfa podjednotku receptoru tyrozin kinázy PDGF, která náleží do podskupiny III protein tyrozin kinázové rodiny. Nejvíce mutací je lokalizováno v exonech 12, 14 a 18 PDGFRA genu. Nejčastější mutací je substituce D842V v exonu 18 (asi 60 %) spojená s rezistencí na terapii imatinib mesylátem (Glivec). V některých studiích byla prokázána spojitost s predominantní žaludeční lokalizací, epiteloidní morfologií PDGFRA mutovaných GISTů. Rovněž byla popsána u přibližně asi 7 % pacientů bez mutace KIT a PDGFRA (tzv. wt GIST) přítomnost mutace V600E v BRAF genu. Molekulárně genetické vyšetření genu PDGFRA má význam nejen diferenciálně diagnostický, ale i prediktivní. Test Septin9 (pouze pro samoplátce) Jednoduchý krevní test pro časnou detekci kolorektálního karcinomu. Kolorektální karcinomy dokonce i v nejranějších stádiích uvolňují DNA do krve. Test Septin9 umožňuje snadno a spolehlivě detekovat biologický marker msept9 ve vzorku krve. Na základě výsledků řady nezávislých klinických studií indikuje pozitivní výsledek testu zvýšenou pravděpodobnost přítomnosti kolorektálního karcinomu. Test Septin 9 byl uveden na evropský trh v říjnu 2009 a má specifitu 99 % a senzitivitu od 52 % 100 % v závislosti na stádiu onemocnění. Tento test je krevní test, který lze provést jako první krok při časné detekci 10
kolorektálního karcinomu. Pokud je ve vzorku detekován tento marker, existuje u pacienta zvýšená pravděpodobnost výskytu kolorektálního karcinomu. V takovém případě by měl pacient podstoupit kolonoskopii pro potvrzení diagnózy nebo pro zahájení léčby. Test nenahrazuje kolonoskopii. MATERIÁL PRO VYŠETŘENÍ A) Geneticky podmíněná onemocnění: > 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!!!) > vyizolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru > zkumavky musí být označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta) > přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením B) Sporadická nádorová onemocnění: > 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!!!) > izolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru > parafinový bloček, sklíčko, nativní tkáň: na základě písemné žádosti lékaře si tento materiál laboratoř vyžádá na příslušné patologii (o jakou patologii se jedná musí být uvedeno na žádance) > aspirát z pankreatické cysty ve sterilní zkumavce s písemnou žádostí lékaře a s informovaným souhlasem pacienta (odběr provádí MUDr. Kliment, MUDr. Urban, Centrum péče o zažívací trakt, Vítkovická nemocnice a.s.) > zkumavky musí být označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta) > přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením 11
KONTAKTY LABORATOŘE AGEL A.S. Laboratoř lékařské genetiky úsek molekulární biologie Revoluční 2214/35 741 01 Nový Jičín Tel.: 556 416 230-234 e-mail: lmb@lab-agel.cz www.lab-agel.cz CGB LABORATOŘ A.S. Molekulární genetika Kořenského 6 703 00 Ostrava Vítkovice Tel.: 595 700 995-996 www.pathology.cz