Analýza DNA
Co zjišťujeme u DNA Genetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů), chromosomové aberace (numerické, strukturální) Polymorfismy konkrétní mutace, které se vyskytují v populaci s frekvencí vyšší než % Podobnost DNA mezi druhy Vlastnosti - koncentraci, čistotu, chemické vazby s proteiny, funkci ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC
DNA Izolace Detekce DNA Specifické analýzy DNA struktury Hlavní metody pro práci s DNA: PCR sekvenace RFLP DNA hybridizace - blotting
Biologický materiál pro izolaci DNA Teoreticky z jakéhokoliv dostupného biologického materiálu (s jádrem)
Izolace DNA Specifické postupy pro získání molekul DNA v takové čistotě a koncentraci, aby mohly být dále analyzovány běžně dostupnými molekulárně biologickými metodami
Mutace v sekvencích ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATACTCCC Normální sekvence Jednobodová záměna (SNP) Inzerce TT Delece GA (7. a 8. odzadu)
PCR polymerase chain reaction Nobelova cena za její objev v roce 984 Obdoba DNA replikace, která se odehrává v buňkách Amplifikace (zmnožení) vybraných úseků DNA U oblasti, kterou se snažíme amplifikovat musíme znát sekvenci koncových částí 3 Cyklické střídání teplotních kroků Denaturace dvoušroubovice se oddělí na jednotlivá vlákna (teplota; chemická činidla) Annealing (anýlink) navázání primerů ke koncové oblasti vybraného úseku (oligonukleotidy jednovláknové řetězce; cca 20bp ) Elongace prodloužení primeru vkládáním jednotlivých dntp (A,G,C,T) na základě komplementarity k templátové DNA 3 5 5 3 primer
Princip PCR Teplotní denaturace Annealing primerů Elongace Teplotní denaturace Annealing primerů Elongace
PRINCIP METODY PCR 5 3 5 3 5 3 ( MOLEKULA) DENATURACE. CYKLUS 3 5 3 5 PRIMERY 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 Taq POLYMERÁZA (2 MOLEKULY) DENATURACE PRIMERY 2. CYKLUS Taq POLYMERÁZA (4 MOLEKULY) 3. CYKLUS DENATURACE PRIMERY Taq POLYMERÁZA (8 MOLEKUL) 4. CYKLUS (6 MOLEKUL) 5. CYKLUS (32 MOLEKUL)
PCR V reakci: templát (DNA), Taqpolymerasa (teplotně stabilní), primery, dntp (jednotlivé dideoxynukleotidy) a vhodný pufr Z jednoho cílového úseku DNA (určený primery) vznikne po cyklu denaturace, annealingu a elongace vždy dvojnásobek DNA fragmentů (velikost fragmentu je dána primery) Možno vyjádřit matematicky 2 n kde n je počet cyklů Kolik bude DNA fragmentů po 8 PCR cyklech? 2 8 = 256
Elektroforéza Metoda, která slouží k rozdělení DNA fragmentů o nestejné délce DNA má celkově slabě negativní náboj a v elektrickém poli putuje ke kladné elektrodě Rychlost putování je závislá na její celkové délce Gel (agaróza, polyakrylamid) je ponořen do vhodného pufru mezi elektrody V gelu u záporné elektrody jsou jamky pro vzorky DNA Stejnosměrný elektrický proud Vizualizace fragmentů se provádí např. ethidiumbromidem (interkalačního činidla), které svítí v UV světle
Sekvenace - Sangerova metoda Zjištění konkrétní sekvence vybraného úseku DNA řetězce Fragmenty DNA (řetězce) - rozlišení ve své délce i o jeden nukleotid Sangerova metoda - chemicky modifikované dntp (deoxyribonukleosidtrifosfáty) na ddntp (dideoxyribonukleosidtrifosfáty) ddntp postrádají 3'-OH skupinu; za ddntp si při elongaci už nemůže přisednout žádný dntp - dojde k terminaci elongace PCR reakce: a) zkoumaný fragment DNA; pufr, DNA-polymerasa a mix normálních dntp b) radioaktivně značený primer pro jedno vlákno DNA, c) sekvenace se odehrává ve 4 reakčních směsích (ddatp; ddttp; ddctp; ddgtp - odlišně fluorescenčně značeny); Elektroforetická detekce fragmentů v gelu
3' 5' Analyzovaná DNA (jednovláknová) 5' * 3' Značený primer DNA-polymerasa, primer, nukleotidy - rozdělení do čtyř zkumavek. Přidány jednotlivé ddntp: ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp PCR syntéza komplementárního vlákna (značeno barevně pro jednotlivé ddntp) ve směru 5' 3' * A * C G * * T * A * C * G * T * A * C * G * T Elektroforéza A C G T - + Výsledná sekvence na syntetizovaném vlákně: 5'- C T A G T A G G T C C A - 3' Sekvence analyzované DNA (komplementarita párování basí): 3'- G A T C A T C C A G G T - 5'
Sekvenace - Sanger AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGCATGGCAACTGCAGATCGATGCAAGTGCCGATC TTCAGGCTAGCAATCGAAGGCTTAACGTACCGTTGACGTCTAGCTACGTTCACGGCTAG začne probíhat sekvenační PCR s mixem dntp a fluoresčenčně značenými ddntp AAGTCCGATCGTTAGCTTC AAGTCCGATCGTTAGCTTCC AAGTCCGATCGTTAGCTTCCG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAAT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGC Nejkratší fragment ve schématu bude svítit červenou barvou a nejdelší také červenou Speciální elektroforéza s laserovou detekcí fluorescenčně barvených ddntp
Restrikční endonukleázy - restriktázy Enzymy, které štípou dvouvláknovou molekulu DNA uvnitř řetězce a to vždy v konkrétní pozici, charakteristické pro danou restriktázu (restrikční místo) Např. Eco R restriktáza izolovaná z Escherichia coli, která specificky štípe v sekvenci G^AATTC AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAGAATTCCAGTCGAA TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAAGGTCAGCTT AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAG TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAA AATTCCAGTCGAA GGTCAGCTT
Identifikace restrikčních míst Na uvedeném vlákně najděte restrikční místa pro nabídnuté enzymy restrikční místo Alu I Sau 3AI Msp I AG / CT / GTAC C / CGG 5 G.G.G.C.G.T.A.C.A.T.A.G.C.T.A.A.T.G.G.C.A.A.G.C.T.A.T.G.G.T. 3
RFLP restriction fragment length polymorphism Charakteristické fragmenty pro každého jedince po naštípání celkové DNA restriktázami Jednotlivé cílové sekvence vybraných restriktáz mohou být mutovány, nebo v rámci jiných delecí/inzercí posunuty (variabilita restrikčních míst) Každý člověk má proto charakterictické rozložení restrikčních míst pro určitou restriktázu (restrikční mapy) Mendelovská dědičnost délky restrikčních fragmentů EcoRI štípání fragmentů 2 jedinců AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC Na elektroforéze bude mít druhý jedinec delší fragment
RFLP restriction fragment length polymorphism Variabilita RFLP Vzorek DNA 2 a 5 má typickou délku fragmentu Vzorek DNA a 3 má navíc jedno nové restrikční místo (v jiné oblasti) Vzorek DNA 4 je variantou vzorku 3, kdy vzniklo další restrikční místo Nová restrikční místa vznikají např. záměnou nukleotidů
Southern - blotting Jméno po objeviteli Southernovi; umožňuje z velkého množství fragmentů (např. po štěpení celkové DNA restrikčními endonukleázami) specificky detekovat DNA fragment V doslovném překladu pijákování tzn. nasátí PCR produktů z elektroforetického gelu na membránu (nylonovou) a jejich následná analýza Hybridizace = spojení dvou jednovláknových DNA podle pravidla komplementarity Gel se denaturuje v chemickém činidlu denaturuje se i dvouvláknová DNA; na membránu jsou blottována jen jednořetězcová vlákna - v uspořádání, v jakém byla na elektroforetickém gelu Hybridizace s radioaktivně značenou próbou membrána je ponořena do roztoku s jednovláknovým radioaktivně značeným řetězcem DNA Na základě komplementarity basí dojde k hybridizaci Nenavázaná próba je odmyta V případě úspěšné hybridizace svítí na membráně fragment tvořený jedním vláknem DNA a jedním vláknem próby
Southern - blotting
Southern blot hybridizace sondy DNA Sonda Zahřátí (denaturace) Ochlazení (renaturace)
Fenylketonurie - PAH gen Fenylketonurie Defekt genu pro fenylalaninhydroxylasu (PAH) AR onemocnění PAH 3 exonů Mnoho mutací (více než 400 známých v roce 2000) Oblast mutace (delece) Mutace - např. delece v 2. exonu; detekce systémem restrikční endonukleasy (viz obrázek) Rodiče Při negativním výsledku vyšetření jednoho exonu vyšetření mutací v dalších exonech Děti Děti
RFLP metoda Autosomálně recesivní onemocnění (např. cystická fibróza, fenylketonurie) Vyšetření je informativní Druhá dcera má genotyp Aa
RFLP prenatální vyšetření Fenylketonurie - AR A) B) Vyšetření je informativní Plod heterozygot - zdravý
RFLP metoda Polycystická choroba ledvin - AD Vyšetření je informativní Prenatální diagnostika - genotyp aa
RFLP metoda GR onemocnění hemofilie (obdobné pro barvoslepost)? Dcera zdravá Genotyp X + X h Přenašečka
I 2 II 2 3 2 A a aa AA A a Jsou jedinci II/2 a II/3 heterozygoti pro mutovanou alelu sledovaného AR onemocnění? (vazba úplná)
I 2 II 2 3 2 a A aa AA A a a A Jsou jedinci II/2 a II/3 heterozygoti pro mutovanou alelu sledovaného AR onemocnění? (vazba úplná) II/2 ne II/3 ano
I 2 II 2 3 2 Aa a a Aa Jsou jedinci II/2 a II/3 heterozygoti pro mutovanou alelu sledovaného AR onemocnění? (vazba úplná) II/2 AA nebo Aa II/3 AA nebo Aa Vyšetření je neúspěšné (neinformativní z hlediska určení heterozygocie jedinců II/2 a II/3).
I X + Y 2 X + X h II 2 X h Y X + Y 2 3 X + X + X + X h X + X h X h Je dcera II/3 přenašečkou (heterozygot) pro mutovanou alelu sledovaného GR onemocnění? (vazba úplná) II/3 ano
I 2 II 2 3 2 X + X h X + X + X + X h X + Je dcera II/3 přenašečkou (heterozygot) pro mutovanou alelu sledovaného GR onemocnění? (vazba úplná) II/3 ne
Polycystická choroba ledvin (AD, p = 5cM) I Aa aa 2 II 2 3 4 A B C D a) Riziko postižení pro II/3 i II/4 je 50%. 32
Polycystická choroba ledvin (AD, p = 5cM) I Aa aa 2 II 2 3 4 A B C D A a A a a a a a a) Riziko postižení pro II/3 i II/4 je 50%. b) Riziko postižení pro II/3 je 95%. b) Riziko postižení pro II/4 je 5%. 33
Polycystická choroba ledvin (AD, p = 5cM) I 2 II III A B C D 2 3 4 aa Aa Aa aa 2 5 a) Riziko postižení pro III/ 34 i III/2 je 50%.
Polycystická choroba ledvin (AD, p = 5cM) I 2 II III A B C D 2 3 4 aa Aa Aa aa 2 5 b) Riziko postižení pro III/ je 95%. b) Riziko postižení pro III/2 je 5%. 35
Polymorfismy lidské DNA - vazebná analýza v přímé a nepřímé diagnostice Mikrosatelity (syn. krátké tandemové repetice) STR short tandem repeats, SSR simple sequence repeats TAGCCATCGGTACACACACACACACACAGTGCTTCAGTAGC TAGCCATCGGTACACACACACACAGTGCTTCAGTAGCGTAG Pokud se detekovatelný polymorfismus nachází dostatečně blízko lokusu, ve kterém se vyskytuje kauzální mutace pro sledovanou chorobu, bude možné jej využít i bez znalosti molekulární podstaty daného onemocnění: vazba polymorfismu s mutovanou alelou V závislosti na frekvenci crossing-overu bude současně s mutací předáván z rodičů na potomky kosegregace markeru s mutovanou alelou
Chromosomové mutace Aneuploidie Downův syndrom (3x 2. chromosom)
Nondisjunkce u Downova syndromu Tři rodokmeny rodin s dětmi postiženými Downovým syndromem (prostá trisomie). Výsledek analýzy DNA tetranukleotidového polymorfismu na chromozómu 2 - je znázorněn pod rodokmeny. Od kterého z rodičů zdědilo dítě třetí kopii chromozómu 2? V kterém meiotickém dělení došlo k nondisjunkci?
Nondisjunkce u Downova syndromu? Meióza I u otce nebo u matky
Nondisjunkce u Downova syndromu? Meióza I u otce nebo u matky Meióza I u matky
Nondisjunkce u Downova syndromu? Meióza I u otce nebo u matky Meióza I u matky Meióza II u matky
Přímá DNA diagnostika Huntingtonovy chorey 42 2 3 4......................................... n CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG primer (CAG)n primer 203 bp 203 bp + 3n
Přímá DNA diagnostika Huntingtonovy chorey I 2 43 II 2 3 4 III 2 3 353 329 expanze expanze 263 248 42 20 50 42 5 20 20 50 42 20 5 5 20 5 20 5 5 5 - + +
Polymorfismy lidské DNA využívané v přímé a nepřímé diagnostice Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms SNP) SNP C / A TAGCCATCGGTA N GTACTCAATGATCAGCT G C T A
Polymorfismy lidské DNA využívané ve vazebné analýze, přímé a nepřímé diagnostice Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms SNP) V 99.9% sekvence DNA se lidé od sebe vzájemně neliší. Ze zbývajícího 0.% rozdílu tvoří SNP přes 80%. Projekt lidského genomu nyní pokračuje mj. ve formě identifikace miliónů SNP, které jsou shromažďovány ve veřejně přístupných databázích. Možnost typizace mnoha set tisíc SNP v jednom vzorku pomocí DNA čipů by měla usnadnit identifikaci alel, zodpovědných za řadu onemocnění.
DNA čipy - microarrays Moderní metoda analýzy DNA v několika lokusech současně Genové čipy obsahují velké množství sond, které hybridizují s různými oblastmi genomu Využití nanotechnologií manipulace se vzorky probíhá převážně roboticky a vyhodnocení je softwarové Klony DNA Testovaný vzorek Referenční vzorek PCR amplifikace purifikace Reverzní transkripce Fluorescenční barvivo Hybridizace na mikrodestičce Počítačová analýza
Genetický čip DNA čip -.5 x.5 cm křemíková nosná destička s mřížkou (v plastové kazetě) Uměle syntetizované krátké jednovláknové řetězce DNA o známé sekvenci nukleotidů (oligonukleotidové próby); až několik milionů Analyzovaný vzorek jednořetězcové DNA označené fluorescenčním barvivem Snímání skenerem, počítačová analýza Testování aktivity genů (intenzita záření jednotlivých prób po hybridizaci) Využití: genetika, farmakologie, imunologie, mikrobiologie (genové profily virů a bakterií)