doc. Ing. Richard rabal, CSc. NMR laboratoř, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, číslo dveří 42 telefon 220 443 805, e-mail hrabalr@vscht.cz)
15. říjen 2015 základy NMR spektroskopie přístrojové vybavení návštěva laboratoře 22. říjen 2015 technologie využití NMR spektroskopie pro řešení prostorové struktury proteinů praktické příklady
lavní protagonisté Felix Bloch Kurt Wüthrich Oleg Jardetsky Edward M. Purcell Richard Ernst
Kurt Wüthrich Nobel Price Winner in Chemistry 2002 G. Wagner, K. Wüthrich. 1982. Sequential resonance assignments in protein 1 nuclear magnetic resonance spectra. Basic pancreatic trypsin inhibitor. J. Mol. Biol. 155, 347-366.
Co lze pomocí NMR spektroskopie studovat na biomolekulách? identifikace substrátu (kovalentní struktura) prostorové uspořádání (vyšší typ struktury, sekundární, terciární..) dynamické vlastnosti (celé molekuly nebo jen vybrané části) schopnosti vzájemné interakce, event. interakce s jinými substráty struktura komplexů, dynamika a rovnováha vynikající metoda pro návrh nových typů léčiv (SAR)
Úvodní poznámky NMR spektroskopie využívá magnetických vlastností jader atomů. Absorpční (emisní) spektroskopie, podobně jako IČ nebo UV. Detekuje absorbci radiofrekvenčního záření jádry atomů v molekule. Aktivní jsou pouze jádra se spinovým kvantovým číslem (I) 0. Tato jádra mohou absorbovat RF záření. Sudé hmotové číslo & sudé atomové číslo I = 0 ( 12 C, 16 O) Sudé hmotové číslo & liché atomové číslo I = celočíselný ( 14 N, 2, 10 B) Liché hmotové číslo I = polovinový ( 1, 13 C, 15 N, 31 P) Spinové stavy jádra jsou kvantovány. m = I, (I - 1), (I - 2),, -I m je magnetické kvantové číslo.
Pro 1, 13 C, 15 N, 19 F, 31 P (nejběžnější měřená jádra) platí: I = 1/2 m = 1/2, -1/2 To znamená, že tato jádra mohou zaujmout pouze dva stavy (energetické hladiny). Další důležitou vlastností částic s nábojem je tzv. magnetický moment (m), který může být vyjádřen m = g I h / 2p Je to vektorová veličina, která má velikost a směr (nukleární magnet) h je Planckova konstanta g je gyromagnetický poměr (konstanta), která je závislá na povaze jádra. Různá jádra mají různý magnetický moment.
Vliv externího magnetického pole B o (jádra I = 1/2) V základním stavu nejsou jaderné spiny uspořádané a neexistuje mezi nimi žádný energetický rozdíl. Jsou tzv. degenerované: B o = 0 Vlivem silného externího magnetického pole dojde však k jejich uspořádání buď v souhlasném nebo opačném směru s ohledem na směr magnetického pole: B o Vždy existuje malý přebytek jader uspořádaných souhlasně se směrem externího magnetického pole než nesouhlasném.
Energie a populace spinových stavů Vlivem externího magnetického pole dojde k vytvoření dvou hladin, mezi kterými je rozdíl v energii. Tyto hladiny jsou obsazeny souhlasně a nesouhlasně orientovanými jadernými spiny: b B o = 0 B o > 0 a DE = h n Rozdíl v populaci jednotlivých stavů je dán rozdílem v jejich energiích a řídí se Boltzmanovým rozdělením: N a / N b = e DE / kt DE pro 1 při 400 Mz (B o = 9.5 T) je 3.8 x 10-5 Kcal / mol N a / N b = 1.000064 Rozdíl v populacích je velmi malý ve srovnání s ostatními spektroskopickými metodami.
Zvyšující se rozdíl v populacích obou spinových stavů a a b pro jádro 1 v závislosti na externím magnetickém poli. Je-li stav b obsazen 10 6 spinů, stav a obsahuje10 6 +přebytek. b B o = 0 2,35 T 100 Mz 9,40 T 400 Mz 21,14 T 900 Mz B o 16 spinů a 64 spinů 135 spinů
Energie a citlivost Energie (jednoho spinu) je přímo úměrná magnetickému momentu jádra a velikosti externího magnetického pole: E = - m. B o E (up) = g h B o / 4p --- E (down) = - g h B o / 4p DE = g h B o / 2p Energetický rozdíl mezi oběma stavy určuje intenzitu signálu, tj. citlivost měřeného jádra), Větší magnety (vyšší B o ) způsobují vyšší citlivost NMR přístrojů. Jádra s větší gyromagnetickou konstantou g absorbují více energie a jsou tudíž citlivější. Výsledná citlivost je úměrná m a N a - N b, a magnetickému toku v RF cívce, což opět závisí na g, konkrétně g 3. g 13 C = 6,728 rad / G g 1 = 26,753 rad / G 1 je ~ 64x citlivější než 13 C jen z důvodu konstanty g Přidáme-li k tomu nižší přirozené zastoupení 13 C, citlivost tohoto jádra se sníží dokonce o faktor 6400 vzhledem k 1.
Energie a frekvence Energie je též přímo úměrná frekvenci elektromagnetického záření DE = h n DE = g h B o / 2p n = g B o / 2p Pro jádro 1 je tato frekvence při využití komerčně dostupných magnetů (2,35 23,49 T) v rozsahu 100-1000 Mz. g-rays x-rays UV VIS IR m-wave radio (NMR) 10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 10 0 10 2 wavelength (cm)
Precesní pohyb jader Každé jádro má tzv. moment hybnosti I, který je vlastností všech (nejen magneticky aktivních jader). Jádro si lze potom představit rotující kolem vlastní z osy. l Má-li jádro nenulový magnetický moment (I 0) dostaneme rotující atomový magnet. Interakcí s externím polem B o vzniká kroutící moment. Bez ohledu na původní orientaci vektoru m, tento má vždy snahu orientovat se podle externího pole B o. m B o nebo... m B o m
Precesní pohyb jader (pokračování) Precesní pohyb je výslednicí interakce síly, která se snaží přimět vektor m k souhlasné nebo nesouhlasné orientaci s vektorem B o, a síly udržující jej v rotaci: w o m B o Vektor magnetického momentu vykonává precesní pohyb okolo osy z (směru externího magnetického pole). Frekvence tohoto pohybu se nazývá Larmorova frekvence a značí se w: w o = 2pn w o = - g B o (radiany) Tento jev lze přirovnat k pohybu osy otáčejícího se setrvačníku pod vlivem gravitace. Frekvence tohoto precesního pohybu je přímo úměrná rozdílu energií dvou spinových stavů, což lze odvodit na základě kvantové mechaniky.
Makroskopická magnetizace Nyní je možné zavést pojem makroskopická magnetizace M o, který je přímo úměrný rozdílu populací (N a - N b ), kdy byly příspěvky jednotlivých vektorů m zprůměrovány: z z x M o x y B o y B o Každý vektor m může být rozložen na složku v ose z a v rovině <xy>. Distribuce komponent v rovině <xy> je náhodná, takže se zprůměrují a navzájem vyruší. Velikost makroskopické magnetizace je potom dána rozdílem populací spinových stavů a a b (N a N b ). Mezi m and M o je podstatný rozdíl. Zatímco m je kvantován (může se vyskytovat ve dvou stavech a a b ), M o odráží stav celé populace spinů a představuje kontinuum.
NMR excitace Nyní potřebujeme, aby systém absorboval energii. Zdrojem je oscilující elektromagnetické záření s frekvencí w o generované střídavým proudem : B 1 = C * cos (w o t) z b z M o x M o x B o B 1 B 1 y i Vysílač (y) Je-li frekvence RF pole B 1 a precesního pohybu magnetizace M o stejná, je dosaženo tzv. rezonanční podmínky a systém absorbuje energii. Vzájemnou interakcí RF pole B 1 a magnetizace M o dojde k jejímu překlopení kolem tohoto pole B 1 o úhel b, který odpovídá velikosti dodané energie a době jejího působení. y i
Návrat magnetizace M o zpět do rovnováhy (detekce signálu) Při absenci excitujícího magnetického pole B 1 se M xy bude snažit přejít zpět na M o (do výchozího rovnovážného stavu) obnovením původní distribuce populací N a / N b. Tento jev se nazývá relaxace. z z M xy x rovnováha... M o x w o y y Oscilace vektoru M xy vytváří fluktující magnetické pole, které generuje elektrický proud v přijímací cívce: z M xy w o y Přijímací cívka (-x) x NMR signál
Průběh signálu v přijímací cívce (-x): x x x y y y I I = C * cos (w o t) t x x x y y y
Laboratorní a rotující soustava souřadnic Systém koordinát doposud používaný se nazývá laboratorní soustava souřadná. Jedná se o fixní systém, ve kterém jaderné spiny rotují rychlostí w o, což znesnadňuje jakoukoliv další analýzu. Řešením je souřadná soustava, která sama rotuje rychlostí w o, tzv. rotující soustava souřadná. Z fyzikálního pohledu odstraníme takto vliv frekvence generované externím magnetickým polem B o. z z M xy x M xy x w o y y B o Laboratorní soustava Rotující soustava V rotujícím systému souřadnic se vektor M xy nepohybuje za podmínky, že jsme v rezonanci (w pole B 1 je přesně frekvence jádra w o ). Jsme-li mimo rezonanci, pohyb vektoru je stále pomalý ve srovnání s rychlostí rotace w o.
Free Induction Decay (FID) Nyní analyzujme signál, který se objeví v přijímací cívce po sklopení vektoru makroskopické magnetizace do roviny <xy> (p / 2 puls). Po aplikaci RF pulsu se vzorek postupně dostane do rovnováhy, t.j. obnoví se původní obsazení energetických hladin a vektor makroskopické magnetizace se dostane zpět do osy z, okolo níž vykonává precesní pohyb. M xy w o w = w o čas t w w - w o <> 0 M xy čas t V rotující soustavě souřadnic w - w o. Relaxace M o v rovině <xy> je exponenciální. V příjímací cívce detekujeme zanikající cosinový signál.
FID (pokračování) V reálném vzorku je mnoho spinových systémů, jejichž frekvence jsou odlišné od frekvence B 1 (carrier frequency). Protože jsme efektivně excitovali všechny tyto spiny, dostaneme kombinaci signálů a různé frekvenci Free Induction Decay (FID): I = f(t) Po zpracování Fourierovou transformací dostaneme: I = f(n)
Základní NMR parametry Chemický posun Interakční konstanta Intenzita signálu Počet signálů ve spektru Relaxační vlastnosti jádra (NOE) N 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5
Chemický posun Jestliže má každý druh jádra svoji charakteristickou frekvenci, proč je NMR spektroskopie tak užitečná? Vlivem tzv. chemického okolí dochází ke změnám magnetického pole, které působí na každé jádro stejného typu. ovoříme o tzv. efektivním magnetickém poli B eff, které je tvořeno hlavním magnetickým polem B o a lokálním magnetickým polem B loc. B eff = B o - B loc --- B eff = B o ( 1 - s ) s je tzv. konstanta magnetického stínění. O C 2 C 3 vyšší pole frekvence w o velikost stínění s nižší pole
NMR škála (d, ppm) Každý signál ve spektru je charakterizován svou pozicí vyjádřenou ve frekvenčních jednotkách. Problémem je však skutečnost, že B loc je mnohem menší než B o (rozsah tisíce z oproti milionům z) a také závislost na velikosti B o. Proto používáme relativní stupnici (odstranění velké frekvence generované externím magnetickým polem) a vztahujeme posun každého signálu k signálu referenčnímu (standardu). w - w ref d = x 10 6 ppm (parts per million) w ref Potom je pozice signálu stejná pracujeme-li se 100 Mz (2.35 T) nebo 900 Mz (21,14 T) magnetem. C 3 3 C S i C 3 C 3 Př. Tetramethylsilan (TMS) je standardem jak pro 1, tak pro 13 C spektroskopii. Je dobře rozpustný, inertní a poskytuje vždy jeden signál.
Příklady rozsahů chemických posunů v ppm 1 ~ 15 ppm: Kyseliny Aldehydy Aromatické Amidy Olefiny Alkoholy, a Alifatické ppm 15 10 7 5 2 0 TMS 13 C ~ 220 ppm: C=O v ketonech Aromatika, konjugované alkeny Olefiny Alifatické C 3 C 2, C 210 C=O v kyselinách, aldehydech, esterech 150 100 80 50 Uhlíky v sousedství alkoholů, ketonů 0 TMS ppm
Indukční efekt. Izolovaný atom 1 má kulově symetrický orbital 1s. (1s) Nyní přidáme -C 3, čímž získáme methan. Elektronový oblak 1 (kteréhokoliv ze 4 ekvivalentních atomů) se deformuje vlivem elektronegativnějšího atomu uhlíku (přitahuje elektrony 1s). (1s) C (sp 3 ) Tímto způsobem se sníží elektronová hustota okolo jader 1, dojde k jejich odstínění a posunu k vyšším hodnotám magnetického pole (ppm). Nahradíme-li jeden z vodíků halogenem, pozorujeme, že čím je příslušný halogen elektronegativnější, tím dochází k většímu odstínění ostatních jader 1. s (F) < s (Cl) < s (Br) < s (I) Jinými slovy, s rostoucí elektronegativitou připojeného atomu (skupiny atomů), klesá stínící konstanta s.
Mezomerní efekt N 2 v anilinu vykazuje +M efekt dojde k většímu stínění aromatických protonů, než v případě benzenu (7.24 ppm). N 2 skupina dodává elektrony do aromatického systému a ten jich obsahuje více než benzen. N 6.55 6.70 7.08 Z rezonančních struktur je vidět větší elektronová hustota v polohách ortho a para. Protony v těchto polohách jsou tedy více stíněny a tedy posunuty k nižším hodnotám ppm. N N N
Mezomerní efekt ( ) Na druhé straně, nitrobenzen vykazuje výrazný -M efekt. Všechny aromatické protony jsou více odstíněny a tím pádem posunuty k vyšším hodnotám ppm než benzen. Opět polohy ortho a para mají tento efekt výraznější. N O O N O O N O O N O O 7.55 8.15 7.70
Anizotropní efekt Jakákoliv chemická vazba je anizotropní, protože je orientována v prostoru. Významný jev zejména u násobných vazeb a aromatických kruhů ( π-elektrony) Jestliže takovouto vazbu (vazebné elektrony) vložíme do externího magnetického pole, bude indukovat lokální magnetické pole, které bude také anizotropní. Magnetické pole působící na jádra v okolí takovéto vazby bude též anizotropní. Lokální magnetické pole bude buď zvyšovat nebo naopak snižovat efektivní magnetické pole. Bude-li tento efekt kladný nebo záporný záleží na pozici příslušného jádra vůči takovéto vazbě. B o C C
Ring current efekt Anizotropní efekt aromatického jádra je vytvářen systémem konjugovaných dvojných vazeb. Siločáry indukovaného magnetického pole jsou kolmé k rovině aromatického kruhu. B ring B o Vodíky v rovině kruhu jsou odstíněny (posun k vyšším hodnotám ppm), zatímco vodíky nad nebo pod rovinou kruhu jsou stíněné (nižší hodnoty ppm). - + + -
Ring current efekt ( ) Toto je důvod, proč je chemický posun aromatických protonů v rozmezí 6 až 9 ppm: 7.27 7.79 7.41 Extrémním příkladem tohoto efektu je [18]anulen: -2.99 +9.28
B loc Spin-spinové interakce B loc Přímá spin-spinová interakce 1 j 1 k B o 13 C Nepřímá spin-spinová interakce J jk DD jk 2pI J I J jk 0 25z b 3 b jk ( 0,2nm) 15012z jk j jk ( ( I e )( I e ) I I ) j k jk k jk j k
Přímá spin-spinová interakce v pevných látkách b jk ( 15012z) J jk ( 0 25z) projeví se v běžném spektru ztráta rozlišení rotace pod magickým úhlem (54,7 ), 12 000 z B o rotace pod magickým úhlem (54,7 ), 870 z statické spektrum Obrázek z: Brinkman A., Dipolar Recoupling in Magic-Angle-Spinning NMR, disertace, Stockholmská univerzita 2001
Přímá spin-spinová interakce v kapalinách kapaliny z důvodu izotropního pohybu molekul zprůměrování interakce = 0 jk jk r IS < 5-6 Ǻ jk jk jk jk jk jk jk jk Spin spinová interakce se neprojeví přímo ve spektrech, nicméně její efekt lze měřit v podobě tzv. křížové relaxace, což se využívá v experimentech, které využívají tzv. nukleární Overhauserův efekt (NOESY, ROESY)
Nepřímá spin-spinová interakce Energetické hladiny jednotlivých jader jsou též ovlivňovány spinovými stavy jader v okolí. Toto je nazýváno nepřímou spin-spinou interakcí. Nepřímá interakce je to proto, že je zprostředkována vazebnými elektrony (na rozdíl od přímé dipóldipólové interakce jaderných spinů): 1 1 B o C E = J AB * I A * I B Magnetický moment jádra polarizuje vazebné elektrony, resp. jejich magnetické momenty a tato polarizace je přenášena na další jádra.
C 3 Nepřímá spin-spinová interakce Interakční konstanta (intenzita a počet čar) O O C 2 C 3 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 4.10 4.00 1.30 1.20 Každý atom 1 ve skupině C 2 vidí 4 možné stavy atomů 1 v sousední skupině C 3. Naproti tomu každý atom 1 skupiny C 3 vidí 3 možné stavy protonů C 2 skupiny. 2 protony skupiny C 2 a 3 protony skupiny C 3 jsou navzájem ekvivalentní.
Nepřímá spin-spinová interakce Interakční konstanta (intenzita a počet čar) aa ab ba bb aaa aab aba baa abb bab bba bbb C 3 C 2 Je-li jádro A v interakci s n jádry (spin ½), která jsou identická je počet čar v multipletu A roven n + 1. Signál C 2 skupiny se objeví jako kvartet (4 čáry), zatímco C 3 skupina jako triplet (3 čáry). Je-li jádro A v interakci s n jádry, která mají spin I platí pro počet čar multipletu A: m = 2 n I + 1 Vzdálenost jednotlivých čar v multipletu je rovna velikosti interakční konstanty v z. Je stejná v obou multipletech jak C 2, tak C 3 skupiny (7 z).
Interakční konstanta (pokračování) Interakční konstanta (intenzita a počet čar) Z předchozího diagramu lze též odvodit intenzity jednotlivých čar multipletu. Protože existuje stejná pravděpodobnost, že se systém nalézá v jakémkoliv stavu (stavy v řádcích jsou energeticky degenerované), poměr intenzit je 1:2:1 pro C 3 a 1:3:3:1 pro C 2 skupinu. Obecně lze intenzitu čar získat z koeficientů binomického rozvoje: 1 : n / 1 : n ( n - 1 ) / 2 : n ( n - 1 ) ( n - 2 ) / 6 :... Pro rychlou orientaci slouží tzv. Pascalův trojúhelník. 1 1 1 1 2 1 1 3 3 1 1 4 6 4 1
Kapitoly z praktické NMR spektroskopie DRX 500 Avance SPECTROSPIN 500
Schéma moderního NMR spektrometru s chlazenou měřící sondou, tzv. kryosondou Temperature 17K Temperature 4K 25 Bar Computer
istorické NMR spektrometry První komerčně dostupný CW-NMR spektrometr s rezonanční frekvencí 30 Mz (1952), Varian Inc. CW-NMR spektrometr s rezonanční frekvencí 40 Mz (1961), ÚPT Brno
600 Mz NMR spektrometr na VŠCT Praha
Řez supravodivým magnetem
Průřez supravodivým magnetem Pohled shora Měřící sonda Měřený vzorek Kapalný dusík (-196 o C) Solenoid Evakuovaný plášť Kapalné helium (-269 o C) y z x
Zhasnutí magnetu quench
Pracovní frekvence [Mz] Nárůst velikosti magnetického pole NMR spektrometrů 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 1950 1960 1970 1980 1990 2000 Rok uvedení na trh 2010 2020
900 Mz magnet firmy Oxford Instruments 900 Mz magnet firmy Bruker 900 Mz 1 NMR spektrum lysozymu
První 1 Gz NMR spektrometr Centre de RMN à Très auts Champs Lyon, France
Citlivost a rozlišení se počítají 40 Mz 1000 Mz 1 Gz NMR spectrum of 2 mm ubiquitin Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood J.G: J.Am.Chem.Soc.79, 3289 (1957). Bruker official website: http://www.bruker-biospin.com/av1000-apps.html
RIKEN Research Institute Yokohama, Japan
Schéma moderního NMR spektrometru s chlazenou měřící sondou Temperature 17K Temperature 4K 25 Bar Computer
Kryosonda Chlazená plynným e na teplotu 17 K, předzesilovače na cca 40 K
Kyvety pro kapalinovou NMR spektroskopii.
Srovnání citlivosti 500 Mz sondy TBI a 600 Mz kryosondy CTCI při měření 1 7000 620:1 6600:1 1) 500 versus 600 Mz 2) využití kryotechnologie 6000 5000 4000 3000 3) 12 let vývoje technologie NMR spektroskopie 2000 1000 0 500 TBI 600 TCI (cryo)
Sensitivity between CryoProbe (CP) TCI and Room Temperature (RT) TXI probe Sensitivity enhancement: 1.8-fold
Stabilizace magnetického pole v čase C 6 12 (bez locku) Vlivem driftu B o dochází k postupné změně polohy měřeného signálu. Řešením je systém nazývaný field lock. Jedná se o jakýsi separátní NMR spektrometr, který pracuje nejčastěji se signálem deuteria a podle velikosti změny B o a tedy polohy signálu 2 koriguje hlavní pole B o.
omogenizace magnetického pole v prostoru Nehomogenita B o vzniká vlivem nedokonalé konstrukce magnetu, okolních feromagnetických předmětů, nehomogenity vzorku Odstraňuje se malými změnami B o pomocí tzv. korekčních cívek. Tento proces se nazývá shimování. Korekční cívky jsou umístěny okolo hlavní cívky v různých směrech a lze jimi definovaně modifikovat hlavní pole.
Ukázky: a) špatně naladěný ( nashimovaný ) magnet b) dobře naladěný ( nashimovaný ) magnet