Využití NMR spektroskopie pro studium biomakromolekul RCSB PDB

Transkript

1 Využití NMR spektroskopie pro studium biomakromolekul RCSB PDB

2 Uplatnění NMR spektroskopie chemická struktura kovalentní struktura konformace, geometrie molekul dynamické procesy chemické a konformační výměny reakční kinetika dynamika molekul nebo jejich částí aplikace v biologických vědách analýza přírodních látek určení trojrozměrné struktury oligosacharidy a nukleové kyseliny omezené možnosti RCSB PDB peptidy, proteiny komplexy (NA protein, enzym substrát) dynamické studie RCSB PDB Progr. NMR

3 Specifika řešení struktury proteinů pomocí NMR měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-chemických vlastností prostředí sledování průběhu biochemických dějů vysoce selektivní odezva na úrovni atomů Čím jsme omezeni: velikost molekuly (ovlivnění rychlostí relaxace NMR signálu) do 10 kda ( 10 kg mol 1 ) [< 70 AA] lze řešit s přirozeným izotopovým zastoupením do 20 kda [< 180 AA] nutné 100% isotopové obohacení 13 C a 15 N do ~200 kda 100% isotopové obohacení 13 C, 15 N a částečné nebo úplné obohacení 2 (odstranění 1 jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13 C) větší proteiny přístupný pouze hrubý náhled na celkovou strukturu, sekundární struktura koncentrace vzorku alespoň 0,2 mm dlouhodobá stabilita vzorku několik týdnů (ideálně při pokojové teplotě)

4 NMR = jaderná magnetická resonance interakce elektromagnetického záření s atomovými jádry vzorku umístěného v silném magnetickém poli elektromagnetické záření je v oblasti radiových vln ( Mz)

5 princip NMR spektroskopie precese (Larmorova frekvence) gyromagnetická konstanta rozdíl v populacích a různé typy jader mají dostatečně odlišné frekvence absorbovaného elmg záření rozdíl malý nízká citlivost NMR makroskopická magnetizace při měření se detekuje jen jeden typ jader

6

7 princip NMR spektroskopie měření z z RF vysílač x přijímač y excitace RF vysílač x přijíma č y zpětné vyzáření, detekce NMR spektrum Fourierova transformace FID (free induction decay) intenzita = f(ω) intenzita = f(t)

8 NMR spektrometry FT NMR spektrometry s vysokým rozlišením supravodivé magnety s B 0 v rozmezí 11,6 až 23,2 T ( 1 frekvence 500 až 1000 Mz) trojresonanční (kryo)sondy s vysokou citlivostí, cívky pro vytváření definovaných gradientů magnetického pole

9 lavní NMR parametry 1. počet a intenzita signálů odráží situaci v molekule chemický posun umístění atomu v molekule ( frekvence absorbovaného záření) 3. interakční konstanty nejbližší vazebné okolí (počet atomů, geometrie) 4. relaxační vlastnosti struktura, dynamika molekuly (NOE) 1. 2.

10 Příklad 1 -NMR spektra: ethylacetát O 3 C C 2 O C C 3 1 / ppm intenzita 2 3 3

11 Jednodimensionální 1 NMR spektrum proteinu charakteristické oblasti výskytu jednotlivých typů 1 signálů aminokyselin kuřecí lysozym (129 AA, M = 14,6 kda) C 3 N peptidické aromatické N postranní α alifatické N C R 1 AA1 O C R 2 N C C O AA2 N C R 3 AA3 O C 1 spinové systémy jednotlivých aminokyselin jsou odděleny C=O skupinami 1D 1 spektrum tedy obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v daném proteinu a k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají všechna jádra: 1, 13 C a 15 N

12 Vícedimensionální NMR experimenty rozlišení informací obsažených v 1D spektrech příklad: 1-15 N SQC spektrum projekce 1 spektra projekce 15 N spektra 15 N 1

13 1-15 N SQC otisk palce proteinu ověření dobré terciární struktury proteinu, sledování lokálních strukturních změn, interakcí s jinými molekulami, nesbalený protein sbalený protein 15N (ppm) 15N (ppm) 1 (ppm) 1 (ppm)

14 Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku naměření NMR spekter přiřazení signálů atomům v molekule obecné informace o molekule (primární struktura, S S vazby,...) výpočet souboru počátečních struktur přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení výpočet souboru struktur validace struktur

15 Interpretace NMR spekter přiřazení resonancí přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule postup: 1.přiřazení hlavního řetězce ( N, N, α, C α, C O ) 2.přiřazení postranních řetězců (především 1 a 13 C) N C R 1 O C R 2 N C C O N C R 3 O C je nutné znát sekvenci aminokyselin daného proteinu

16 Přiřazení resonancí experimenty NCA a N(CO)CA 1 13 O C β 15 N C α 13 C' 1 13 C β N C γ C α 11 < C' O NCA po excitaci i N je magnetizace přenesena na N i ( 1 J N,N ) a dále současně na C i α ( 1 J N,Cα ) a C α i 1 ( 2 J N,Cα ) vývoj chemických posunů nastává pro N, N a C α každá N skupina dává dva signály o frekvencích {ω( i N ), ω(n i ), ω(c iα )} a {ω( in ), ω(n i ), ω(c α i 1 )} i 1 13 C γ i 13 C γ N(CO)CA po excitaci i N je magnetizace je přenesena na N i ( 1 J N,N ), dále na C i 1 ( 1 J N,C ) a na C i 1 α ( 1 J C,Cα ) vývoj chemických posunů nastává pro N, N a C α každá N skupina dává jeden signál o frekvenci {ω( in ), ω(n i ), ω(c α i 1 )} 1 13 O C β 15 N i C α 13 C' 1 13 C β 13 C γ N C α < 1 i C' O interakční konstanty J v z

17 Sekvenční propojení hlavního řetězce NCA a N(CO)CA 2D řezy spektry NCA a N(CO)CA v rovině C na frekvencích jednotlivých amidických N N(CO)CA NCA N(CO)CA NCA N(CO)CA NCA N(CO)CA NCA C N někdy chybí pík

18 Chemický posun chemický posun některých jader je charakteristicky závislý na sekundární struktuře klesá chemický posun δ( α ) roste přiřazení resonancí hlavního řetězce ( α, C α a C') α-helix náhodné klubko β-sheet výpočet indexů chemického posunu (CSI) odhad sekundární struktury podle lokální hustoty CSI N istogram indexu chemického posunu jader α, C α a C' sekvence proteinu C helix I helix II helix III helix IV

19 Nukleární Overhauserův efekt (NOE) přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy I a S vlivem křížové relaxace Vypovídá o blízkosti dvou atomů v prostoru bez ohledu na primární strukturu γ τ c ω r IS... gyromagnetická konstanta 1... korelační čas molekuly... Larmorova frekvence... vzdálenost interagujících jader dosah interakce do 5 6 Å NOE je hlavní zdroj informace o struktuře proteinu. Cílem je nalézt co největší počet NOE interakcí a jednoznačně je přiřadit dvojicím konkrétních vodíkových atomů v molekule. Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří charakteristické sítě NOE kontaktů.

20

21 Přiřazení resonancí a) páteř b) postranní řetězce Identifikace prvků sekundární struktury Strukturní omezení z NMR parametrů vzdálenosti z NOE kontaktů (intra- a interresiduální) dihedrální úhly z chemických posunů atomů páteře proteinu případně další omezení Výpočet trojrozměrné struktury molekulová mechanika + simulované žíhání

22 Výpočet struktury proteinu molekulová mechanika v prostoru kartézských souřadnic (Newtonovy pohybové rovnice) nebo torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice) použití všech dostupných experimentálních omezení, minimalizace celkové energie systému simulované žíhání: molekula se ohřeje na vysokou teplotu (10 3 K) a nechá se postupně chladnout. Po každém ochlazení se vypočítá nová energie systému. Cílem je překonat lokální energetická minima a najít (nejlépe) to globální. přidáme nové energetické členy pro experimentální omezení: čím bližší bude shoda vypočítané struktury s experimentálními údaji, tím nižší bude celková energie například pro NOE: energetická plocha v závislosti na dvou dihedrálních úhlech v disacharidu V případě proteinu se jedná o plochu závislou na n proměnných (n je počet optimalizovaných souřadnich/úhlů).

23 Vypočítané struktury obdržíme soubor velice podobných struktur s minimálními energiemi Nejedná se o jedinou strukturu jako v případě rentgenové krystalografie, ale o soubor struktur. NOE omezení se totiž nezadává jako fixní vzdálenost, ale jako interval vzdálenosti. Souboru NOE tedy bude vyhovovat více struktur, které by se ovšem měly lišit jen nepatrně. Větší rozptyl struktur v určité oblasti může být způsoben nedostatkem experimentálních dat nebo zvýšenou pohyblivostí dané části proteinu. struktura matrixového proteinu Masonova-Pfizerova opičího viru soubor struktur RMSD = 1,3 Å (jen helikální oblasti) vybraná reprezentativní struktura

24 Validace struktur ověření normality struktur Ramachandranův diagram páteř proteinu rotamery Pakování Program Cing

25 Interakce proteinu s ligandem Protein-protein, protein-nk, protein-malá molekula, oligomerace Interaguje specificky? Kde interaguje? Síla interakce (vhodné i pro slabší interakci) Farmaceutický průmysl Proteomické studie Metody pro měření interakce pomocí NMR Sledování změn chemických posunů Intermolekulární NOE Transferred NOESY Mapování -D chemické výměny N skupin

26 Změny chemických posunů Titrace proteinu ligandem Sledování změn chemických posunů skupin (nejčastěji N ) Interakční povrch Disociační konstanta

27 Transferred NOESY r < 5 Å NOE chemická výměna r > 5 Å Princip: informace o struktuře ligandu ve vázaném stavu je pomocí chemické výměny přenesena na ligand ve volném stavu, kde je detekována Uspořádání: malý ligand, který je viditelný NMR spektroskopií a velký substrát (M w > 40 kda) neviditelný pro NMR Podmínka vhodná kinetika systému 10-8 > K d > 10-3 M -1 Využití: - struktura ligandu - nepřímo struktura vazebného místa - způsob vazby

28 Peptid antikolagulační kaskády Inhibitor trombinu

29 Interakce fragmentu trombomodulinu s trombinem 18 aminokyselin z vazebného místa trombomodulinu NOESY spektrum fragmentu trombomodulinu za přítomnosti trombinu NOESY spektrum samotného fragmentu trombomodulinu

30 Důležité NOE interakce dalekého dosahu ligandu TM52+5C v komplexu s thrombinem

31

32 Struktura Complex komplexu between thrombin thrombinu and TM52+5C a ligandu TM52+5C

33 Studium dynamického chování molekul molekuly nejsou statické, reagují a pohybují se v různých časových škálách různě rychlé pohyby se vzájemně doplňují funkce mnoha biomolekul závisí na jejich flexibilitě regulace dějů, interakce molekul, oligomerizace vypočítaná struktura je někdy průměrem mnoha stavů charakterizace NMR dává možnost měřit molekulární procesy v různých časových škálách chemické reakce (ms s) konformační výměny (μs ms) dynamika pohybu relaxační vlastnosti 15 N a 13 C (ps ns) příklad: adenylát kinasa globální konformační výměna; zde limituje rychlost enzymatické přeměny rychlá dynamika residuí v místě ohybu červeně: residua ovlivněná konformační výměnou žlutá šipka: rychlá dynamika Wolf-Watz et al. (2004) Nat. Struct.