Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Ivo Frébort 4. Metody molekulární biologie I
Izolace DNA a RNA Specifické postupy pro baktérie, kvasinky, rostlinné a živočišné tkáně U RNA nutno zabránit kontaminaci RNasami Rozbití buněk NaOH/SDS, detergenty, sonikace, kapalný dusík Odstranění proteinů srážení fenol/chloroform, proteinasa K, centrifugace a odstranění sraženiny Zakoncentrování DNA/RNA srážení ethanolem, centrifugace a separace sraženiny Přečištění na afinitní kolonce Skladování -20/-80 o C
Elektroforetická separace DNA ethidium bromid polyakrylamidový gel agarosový gel agarosový gel elektroforéza v pulsním poli
Southern blot / Northern blot Hledání určité sekvence DNA/RNA pomocí sondy Fragmenty DNA/RNA separujeme v agarosovém gelu Převedení dsdna na ssdna - NaOH Neutralizace a přenos na membránu (nitrocelulosa, Immobilon P) Přenos pomocí kapilárních sil Inkubace se značenou oligonukleotidovou probou Značení pomocí 32 P nebo chemiluminiscenčním markerem Lokalizace hledaných fragmentů
Southern blot
Klonování Klon: soubor molekul nebo buněk, které jsou všechny identické s původní (originální) molekulou nebo buňkou Klonování genu znamená vytvořit mnoho jeho kopií (např. v populaci baktérií, kvasinek, atd.). Gen může být přesná kopie původního genu Gen může být upravenou verzí původního genu Umožňuje to technologie rekombinantní DNA
Plasmidy a klonovací vektory Plasmidy - přirozené extrachromosomální DNA Plasmidy jsou cirkulární dsdna Plasmidy mohou být štěpeny restrikčními enzymy za vzniku lepivých konců Umělé plasmidy mohou být konstruovány spojením fragmentů nové DNA s lepivými konci plasmidů Plasmidy lze modifikovat za vzniku nových genů Plasmidy použité jako klonovací vektory musí obsahovat: replikátor (počátek replikace) výběrový (selekční) marker (gen rezistentní na antibiotikum) klonovací místo (místo, kde vložení cizí DNA neporuší replikaci nebo nedeaktivuje důležité markery
Chimerické plasmidy Pojmenovány podle mytologických zvířat s částmi těl z různých tvorů Po rozštěpení plasmidu restrikčním enzymem může být vložen cizí fragment Konce plasmidového fragmentu jsou uzavřeny za tvorby "rekombinantního plasmidu" Plasmid se může replikovat ve vhodném bakteriálním hostiteli
Klonování do plasmidu
Typické klonovací plasmidy
Restrikční endonukleasy Baktérie dokážou zabránit ("restrict ) možnosti útoku cizí DNA pomocí restrikčních enzymů Restrikční enzymy Typu II a III štěpí řetězce DNA na místech specifické sekvence Tyto enzymy rozpoznávají sekvence 4, 6 nebo více bazí a štěpí je. Názvy těchto enzymů používají 3-písmenný kód (psaný kurzívou): 1. písmeno označuje rod, 2. a 3. písmeno druh organismu Např. EcoRI je první restrikční enzym nalezený v kmeni R baktérie Escherichia coli.
Restrikční štěpení a ligace DNA
Reakce DNA ligasy
Klonování pomocí linkeru
Řízené klonování Vložení cizí DNA v určitém směru pomocí dvou různých restrikčních endonukleas
Genetická transformace baktérií/kvasinek Vnesení chimerického plasmidu Tepelný šok (42 o C), LiAc Elektroporace 1,5/1,8 kv, ~5 ms
Klonování s využitím lacz genu
Modré a bílé kolonie
Knihovny DNA Sada fragmentů klonované DNA z určitého organismu Gen tvoří malou frakci DNA v dané buňce Nelze ho přímo izolovat V DNA knihovně je ale možné nalézt fragment DNA, který obsahuje hledaný gen Malá pravděpodobnost nutný velký počet klonů v knihovně Hledání 10 kbp fragmentu v lidské genomové knihovně nutno testovat 1,4 milionu klonů k dosažení 99% pravděpodobnosti nalezení správného klonu.
Genomové a cdna knihovny Chromosomal DNA
Izolace eukaryotní mrna
Příprava cdna
Příprava knihovny za využití bakteriofága λ
Vektory YAC sekvencování lidského genomu
Hybridizace kolonií Způsob hledání DNA fragmentu Připraví se dostatečný počet agarových ploten obsahujích klony hostitelského organismu z dané DNA knihovny Plotny se otisknou na nitrocelulosovou membránu Alkalizací se lyzují buňky a převede dsdna na ssdna Membrány se inkubují s probou značenou ssdna (většinou 32 P) odpovídající hledanému fragmentu DNA Proba se váže hybridizací na hledaný fragment
Hybridizace kolonií
Enzymová (dideoxy) metoda sekvenování DNA
Sekvenování DNA
Fluorescenční barviva pro sekvenování DNA
Automatický DNA sekvenátor
Odvození sekvence proteinu z DNA
Nové metody sekvenování genomu (High-throughput genome sequencing) Whole Genome Sequencing (WGS, FGS) komparativní sekvenování člověk 3 mld. bp de novo sekvenování - do 50 mil. bp mikrobiální genomy Amplicone Sequencing detekce mutací (SNP) Transcriptome Sequencing mrna/cdna, exprese genů Metagenomics studium genomů v komplexním vzorku
Full Genome Sequencing Race 2006 - Archon X Prize for Genomics - 10 mil. USD pro toho, kdo postaví přístroj, který bude schopen sekvenovat 100 lidských genomů za 10 dní s přesností 1/100 tis., pokrytím 98% a náklady do 10 tis. USD/genom Illumina, Knome, Sequenom, 454 Life Sciences, Pacific Biosciences, Complete Genomics, Intelligent Bio-Systems, Genome Corp., ION Torrent Systems, Helicos Biosciences, IBM 454 Life Sciences 50 tis. USD Knome - 39.5 tis. USD Illumina 19.5 tis. USD Pacific Biosciences, Complete Genomics 5 tis. USD?? Metodiky Sequencing by synthesis Nanopore technology DNA Transistor Fluorophore technology
Pyrosekvenování 454 Life Sciences https://www.roche-applied-science.com
Princip pyrosekvenování 1. DNA polymerasa po přidání datp, dctp, dgtp nebo dttp inkorporuje pouze komplementární nukleotid, uvolní se PPi. 2. ATP sulfurylasa s adenosin 5 -phosphosulfátem převede PPi na ATP. 3. Luciferasa s ATP - přeměna luciferinu na oxyluciferin a světelné kvantum. 4. Apyrasa degraduje nevyužité dntps a ATP.
Solexa (Illumina) princip http://www.illumina.com/ Sekvenování pomocí značeného reversibilního terminátoru 1. Inkorporace jednoho 3 -fluorescenčně značeného nukleotidu 2. Detekce značení 3. Chemická hydrolýza/odstranění značení/terminátoru
SMRT Technology (ZMW - zero-mode waveguide) www.pacificbiosciences.com -1 molekula DNA polymerasy imobilizovaná v ZMW - 5 -značené nukleotidy (na fosfátu), každý specifickým fluoroforem - laserem ozářené dno ZMW excitace fluorescence poblíž polymerasy - reakce polymerasy - 10 ms fluorescence daného nukleotidu - difuse nukleotidů 1000x rychlejší, krátké signály/šum