Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Morfologická a cytochemická diagnostika vlasatobuněčné leukémie Bakalářská práce Vedoucí práce: MUDr. Dana Mikulenková Praha 2010 Lenka Bergerová
Prohlašuji, že tato bakalářská práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. datum: podpis: 2
PODĚKOVÁNÍ: Chtěla bych poděkovat za odborné vedení a cenné podněty k práci paní Mgr. Iloně Fátorové a paní MUDr. Daně Mikulenkové za četné konzultace k práci a poskytnutí obrazových příloh. V Praze, červen 2010 3
Název práce: Morfologická a cytochemická diagnostika vlasatobuněčné leukémie (bakalářská práce) Autor: Lenka Bergerová Katedra: Univerzita Karlova v Praze - Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, studijní obor Zdravotní laborant Vedoucí práce: MUDr. Dana Mikulenková Abstrakt Vlasatobuněčná leukémie je chronické lymfoproliferativní onemocnění klonálního charakteru vycházející ze zralých B-lymfocytů. V nátěru periferní krve a kostní dřeně nacházíme typické leukemické buňky, které jsou charakteristické velikostí, morfologií jádra a cytoplazmy. Jsou větší než zdravé lymfocyty, nejčastěji mají ledvinovité jádro s jemnějším síťovitým chromatinem a cytoplazmu vybíhající v jemné výběžky po celém obvodu buňky. V krevním obraze se zpravidla setkáváme s mírnou pancytopenií. Přítomnost patologických buněk prokazujeme v nátěru periferní krve a kostní dřeně panoptickým barvením dle Pappenheima. Mezi další vyšetření napomáhající k diagnostice tohoto onemocnění patří cytochemické vyšetření kyselé fosfatázy a kyselé fosfatázy rezistentní na tartarát, vyšetření povrchových znaků průtokovou cytometrií a histologické vyšetření kostí dřeně. Vedle klasické formy vlasatobuněčné leukémie rozlišujeme ještě variantní formu vlasatobuněčné leukémie, která se od klasické formy liší přítomností leukocytózy s lymfocytózou a morfologií patologických lymfocytů. Rovněž některá další lymfoproliferativní onemocnění mohou mít při některých z vyšetření podobné hodnoty, a proto mohou být zaměnitelné s vlasatobuněčnou leukémií. Je tedy nezbytné, mít při stanovování správné diagnózy, co nejvíce informací a možností vyšetření. 4
Title: Morphology and cytochemical diagnosis of hairy cells leukemia (Bachelor thesis) Author: Lenka Bergerová Department: Charles University in Prague - Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, branch of study Medical Laboratory Technician Supervisor: MUDr. Dana Mikulenková Abstract Hairy cell leukemia is the chronic lymphoproliferative disorder of clonal character arising from mature B cells. In the peripheral blood smear and in the bone marrow smear, we find the typical leukemic cells which are characteristic by their size, morphology of cell nucleus and cytoplasm. They are bigger than healthy lymphocytes, and they have most frequently the kidney shaped nucleus with fine net-like chromatin and the cytoplasm projecting into fine salients all over the cell perimeter. In the blood count we usually find a mild pancytopenia. To demonstrate the presence of the pathological cells in the peripheral blood smear and the bone marrow smear, we use the panoptic staining method according to Pappenheim. Among other examinations contributing to the diagnostics of this disease belongcytochemical examination of acid phosphatase and acid phosphatase resistent for tartarate, immunophenotypic findings and trepan bone marrow biopsy. In addition to the typical form of hairy cell leukemia we distinguish another variant form of hairy cell leukemia which differs from the typical form by the presence of leukocytosis with lymphocytosis and by the morphology of pathological lymphocytes. Also some other lymphoproliferative disorders can have similar values during some examinations and therefore they can be interchangeable with hairy cell leukemia. Hence, it is necessary to have as much information and examination options as possible during the determination of the correct diagnosis. 5
Obsah Abstrakt... 4 Obsah... 6 Zkratky... 7 Úvod... 8 1. Vlasatobuněčná leukémie a historie... 9 1.1 Klinický obraz... 10 1.2 Krevní obraz... 11 1.3 Nátěr periferní krve... 12 1.4 Vyšetření kostní dřeně... 14 1.5 Cytochemické vyšetření... 14 1.6 Vyšetření průtokovou cytometrií... 15 1.7 Variantní forma vlasatobuněčné leukemie... 16 2. Diagnóza... 18 2.1 Příprava nátěru krve... 18 2.2 Panoptické Pappenheimovo barvení... 19 2.2.1 Barvení v barvicí vaně nebo kyvetách... 19 2.2.2 Barvení krevních nátěrů v barvicím automatu... 20 2.3 Stanovení kyselé fosfatázy... 21 2.4 Stanovení kyselé fosfatázy rezistentní na tartarát... 23 3. Diagnózy zaměnitelné s vlasatobuněčnou leukémií... 26 3. 1 Splenický lymfom s vilózními lymfocyty... 27 3.2 Prolymfocytární leukémie... 28 3.3 Lymfom z plášťových buněk... 29 3.4 Folikulární lymfom... 30 3.5 Lymfoplazmocytární lymfom... 31 Závěr... 32 Použitá literatura... 34 6
Zkratky AcP B-PLL CSF EDTA FCL HCL HCs K 3 EDTA KD LPL MCL MCV N/C PK RDW SLVL SMZL TRAP vhcl kyselá fosfatáza Prolymfocytární leukémie Colony stimulating factor, růstové faktory kyselina ethylendiamintetraoctová Folikulární lymfom Vlasatobuněčná leukémie vlasaté buňky tri-draselná sůl kyseliny etylendiamintetraoctové kostní dřeně Lymfoplazmocytární lymfom Mantle cell lymfom (lymfom z plášťových buněk) Mean cell volume, střední objem erytrocytu poměr jádra buňky k cytoplazmě periferní krev Read cell distribution width, šíře distribuce velikosti erytrocytů Splenický lymfom s vilózními lymfocyty Splenický lymfom z marginální zóny tartarát rezistentní kyselá fosfatáza variantní forma vlasatobuněčné leukémie 7
Úvod Ve většině základních hematologických laboratoří se rutinně vyšetřuje krevní obraz, sedimentace erytrocytů, provádí se koagulační vyšetření a morfologicky se hodnotí nátěry perifrní krve a kostní dřeně. Hodnoty krevního obrazu slouží lékařům jako první vodítko ke stanovení hematologického onemocnění. Dalším vyšetřením, které pomůže v hematologické diagnostice, je stanovení rozpočtu leukocytů (diferenciál) a morfologické vyšetření kostní dřeně. Z těchto vyšetření můžeme získat představu o tom, zda pacient trpí hematologickým onemocněním či nikoliv. K potvrzení diagnózy je v některých případech vhodné doplnit cytochemické vyšetření. Výhodou cytochemického vyšetření je rychlost provedení a to, že nejsou příliš drahá. Například barvení myeloperoxidázy trvá cca 30 minut a poskytne nám cennou informaci, zda se v nátěru nacházejí myeloperoxidáza pozitivní myeloidní blasty, či zda jsou přítomny Auerovy tyče. I v současné době rozmachu molekulárně biologických metod má morfologické vyšetření nezastupitelnou roli v základní diagnostice hematologických onemocnění. Toto vyšetření je snadno proveditelné, má ve většině případů značnou výpovědní hodnotu, není drahé a časově náročné. V neposlední řadě nám kompletní morfologicko-cytochemická diagnostika poskytuje možnost v laboratoři průtokové cytometrie zacílit na konkrétní onemocnění a ušetřit tak čas a finanční prostředky. V této práci bych se ráda věnovala vlasatobuněčné leukémii a diagnostice tohoto onemocnění v hematologické laboratoři. Vlastobuněčná leukémie není časté onemocnění, je ale diagnosticky zajímavé. O neobvyklých případech o vlasatobuněčné leukémie ze své mnohaleté praxe píše zejména doktor Lemež, Žák nebo Šteiner. 8
1. Vlasatobuněčná leukémie a historie Vlasatobuněčná leukémie patří mezi chronické B-lymfoproliferativní onemocnění. Jde o onemocnění klonálního charakteru vycházející z patologické lymfoidní buňky vývojové linie B-lymfocytů. Název je odvozen od patologických buněk, které jsou charakteristické svým vzhledem, zejména cytoplazmou která vybíhá v jemné výběžky po celém obvodu buňky. Patologické buňky infiltrují kostní dřeň, červenou pulpu sleziny a jsou vyplavovány do periferní krve. Vlasatobuněčná leukémie tvoří 2 % ze všech leukémií. Objevuje se zejména v 5. dekádě života a převážně u mužů. Příčina onemocnění není známa. Vyšší výskyt onemocnění byl zaznamenán u lidí pracujících s organofosfátovými insekcitidy, pesticidy, herbicidy a fungicidy. Vedle klasické formy vlasatobuněčné leukémie existuje ještě variantní forma vlasatobuněčné leukémie. I u této formy nacházíme vlasaté buňky, ale hodnoty krevního obrazu a další hodnoty jako vyšetření TRAP nebo vyšetření průtokovou cytometrií mohou být odlišné. Poprvé byla vlasatobuněčná leukémie vyčleněna a popsána jako samostatná jednotka v roce 1958 Berthou Bouronclovou, která ji pozorovala na souboru 26 pacientů s pancytopenií, splenomegalií a morfologicky typickými mononukleárními buňkami v obvodové krvi a nazvala ji leukemickou retikuloendoteliózou. Název vlasaté buňky zavedli Shreck a Donely v roce 1966 pro charakteristický vzhled leukemických buněk u tohoto onemocnění. Označení leukémie s vlasatými buňkami (Hairy cell leukemia, dále označované jako HCL) se objevuje až po roce 1970 a pochází od Ghadialliho a spol. a Flandrina a spol. U nás toto onemocnění sledovali a nezávisle na sobě popsali svá pozorování Chrobák a Wiederman v roce 1974. Původně se Borounclová domnívala, že leukemická retikuloendotelióza je způsobena proliferací retikulárních buněk. Další pozdější názor se přikláněl k tomu, že leukemické buňky pochází z monocytárně-makrofágové řady. Leukemické buňky totiž vykazují vlastnosti připisované monocytům jako je přilnavost ke sklu a k plastickým povrchům, schopnost fagocytózy, pozitivitu alfa-naftylacetát esterázy a přítomnost receptoru pro Fc fragment imunoglobulinu. Na druhé straně některé další vlastnosti typické pro monocyty tyto buňky postrádaly, např. schopnost vyvíjet se v krátkodobých kulturách v typické makrofágy, neprodukovaly granula dávající pozitivní reakci 9
na myeloperoxidázu, neprodukovaly CSF (Chrobák, 1999). Na základě imunofenotypizačních metod se prokázalo, že onemocnění vychází z B-lymfoidních buněk, které nesou na svém povrchu lehký řetězec imunoglobulinu nebo některý z izotopů těžkého řetězce - nejčastěji IgG3. Současně byla prokázána klonální přestavba genů pro tvorbu těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů, která svědčí pro původ leukemických buněk z B-lymfoidní řady (Žák, 2006). Leukemické buňky (HCs) u vlasatobuněčné leukémie tvoří klon poměrně vyzrálých B-buněk, jejichž terminální diferenciace je zbrzděna. Také povrchové znaky svědčí pro pokročilé vyzrávání (CD10neg., CD20+, FMC7+), ale ne konečnou diferenciaci. HCs nemají in vivo podmínkách sklon k diferenciaci k plazmatickým buňkám. HCs mají výraznou biologickou aktivitu. V cytoplazmě buněk nalézáme četné množství mitochondrií, ribozomů a vláken endoplazmatického retikula. Skelet membrány obsahuje F-aktin, který vede k nerovnosti membrány a tvorbě mikroklků. Výběžky a nerovnosti v buněčné membráně výrazně rozšiřují celkový povrch buňky a umožňují zvýšení adhezivních schopností. 1.1 Klinický obraz Tíže klinických projevů souvisí s aktivitou základního onemocnění. Mezi nejčastější objektivní příznaky patří splenomegalie, hepatomegalie, nitrobřišní lymfadenopatie, v klinickém obraze pak příznaky vyplývající z pancytopenie, ze zvětšení sleziny a jater. Pancytopenie je přítomna u 50-60 % nemocných. Příčinou jsou HCs, které produkují četné cytokiny, jenž tlumí krvetvorbu. Na cytopenii se dále podílí mechanický útlak kostní dřeně patologickými buňkami a také hypersplenismus. Splenomegalie se nalézá až u 90 % pacientů. Klinicky může zvětšená slezina vést k tlakům a bolestem pod levým žeberním obloukem a bývá příčinou dyspeptických potíží. Byly popsány i spontánní ruptury sleziny. Hepatomegalie bývá přítomna u 20-30 % nemocných, nebývá však klinicky významná. Lymfadenopatie nemusí být zpočátku zřetelná, ale u pacientů s pokročilým nebo dlouho trvajícím onemocněním je častá nitrobřišní lymfadenopatie. 10
1.2 Krevní obraz V hodnotách krevního obrazu je nejčastěji při vstupním vyšetření přítomna pancytopenie (leukopenie s neutropenií a relativní lymfocytózou, normo- či makrocytární anémie s anizocytózou, trombocytopenie) z důvodu zvětšené sleziny, infiltrace kostní dřeně leukemickými buňkami či snížené produkce krevních elementů v kostní dřeni. Anémie je přítomná u 80 % nemocných. Je středně těžká s průměrnou hodnotou HGB 98 g/l. MCV je u většiny pacientů při horní hranici nebo lehce zvýšený. Makrocytóza není provázena sníženou hladinou vitamínu B12 nebo kyseliny listové. Hodnota RDW je u neléčených nemocných středně až výrazně zvýšená, v nátěrech nacházíme anizocytózu. Počet retikulocytů není zvýšen. U 48 % nově diagnostikovaných HCL byla v kostní dřeni popsána různě závažná forma dyserytropoezy. Častěji se u pacientů s HCL vyskytuje autoimunitní hemolytická anémie (B-lymfocyty tvoří protilátky proti vlastním červeným krvinkám). Leukopenie se nachází přibližně u 60 % pacientů. U 10-15 % je onemocnění zachyceno v leukemické fázi, počet leukocytů většinou nepřesahuje 20 10 9 /l. (Žák, 2006). Typickým nálezem je monocytopenie a neutropenie. Trombocytopenie je přítomna u 80 % vyšetřovaných, u 30 % je hodnota krevních destiček při vstupním vyšetření pod 50 10 9 /l. S výše uvedenými hodnotami krevního obrazu souvisí i další potíže pacientů jako celková únava a slabost v důsledku anémie. Krvácivé projevy vyskytující se při trombocytopenii. Vlivem leukopenie a nedostatkem granulocytů a monocytů je snížená imunita a náchylnost k bakteriálním infekcím zejména k Mycobakteriu kansasii (5-10 %), Listerii monocytogeneses, mykotickým infekcím, Legionelle pneumonie a Toxoplasmě gondii. Porušené jsou rovněž funkce T-lymfocytů a nalézá se pokles dendritických antigen prezentujících buněk (Žák, 2006). 11
1.3 Nátěr periferní krve U většiny nemocných nacházíme v nátěru periferní krve leukemické (vlasaté) buňky. Protože nemocní s typickou formou HCL mají při vstupní diagnóze nízký počet leukocytů, je nutné prohlížet nátěr periferní krve pečlivě a hledat leukemické buňky i v okrajích a koncích nátěru. Vlasaté buňky jsou 10-18 µm velké tedy až 1,5 až 2 krát větší než lymfocyty. Jádro mají oválné, ledvinovité, oj. též monocytoidní, jetelovité či prsténčité, je mírně excentricky uložené. Chromatin jádra je ve srovnání se zralými lymfocyty jemnější a síťovitý, jádro je většinou bez jadérka. HCs mají šedomodrou, prostornou cytoplazmu bez granul, v okrajích roztřepenou či vybíhající v jemné výběžky po celém obvodu buňky. Obrázek č. 1: Vlasatá buňka - zvětšení 1000x Na obrázku uprostřed vlasatý lymfocyt. 12
Obrázek č. 2: Vlasatobuněčná leukémie zvětšení 1000x Na obrázku vidíme dva leukemické elementy, oba dva mají ledvinovité jádro, prostornou a na okrajích roztřepenou cytoplazmu, buňka vpravo nahoře je zralý lymfocyt. Obrázek č. 3: Vlasatobuněčná leukémie zvětšení 1000x Na obrázku vlasatá buňka s jetelovitým tvarem jádra. 13
Obrázek č. 4: Vlasatobuněčná leukémie zvětšení 1000x Vlasatá buňka s prstenčitým tvarem jádra, roztřepenou světle bazofilní cytoplazmou. 1.4 Vyšetření kostní dřeně Aspirace kostní dřeně (KD) bývá obtížná z důvodu fibrózy. Molekula CD44 vyskytující se na povrchu leukemické buňky se váže na hyaluronan přítomný v KD. Vazbou se stimuluje produkce fibronektinu, ze kterého se utváří retikulinová vlákna, na něž pevně adherují vlasaté buňky. Postupně se v kostní dřeni rozvíjí fibróza. Nátěry aspirátu kostní dřeně jsou proto většinou hypocelulární. Je nezbytné je pečlivě prohlížet a pátrat po leukemických buňkách, které jsou většinou přítomny ve větším množství než v periferní krvi (PK) a rozmístěny difúzně v celém nátěru. Obrázek č. 5: Hypocelulární kostní dřeň zvětšení 200x 14
1.5 Cytochemické vyšetření Leukemické buňky mají vysokou aktivitu 5-izoenzymu kyselé fosfatázy (AcP) a nejsou citlivé na levotočivou kyselinu vinnou (tartarát rezistentní kyselá fosfatáta, TRAP). Po přidání vínanu sodného proto není u HCs blokována aktivita kyselé fosfatázy, cytoplazma zůstává růžovo-červeně zbarvená. U zdravých lymfocytů a lymfocytů při lymfoproliferativních oněmocněn aktivita 5-izoenzymu kyselé fosfatázy klesá, zbarvení chybí. Stanovení 5-izoenzymu kyselé fosfatázy (AcP) a TRAP provádíme z nativních nátěrů periferní krve a kostní dřeně. Při vyšetření TRAP by se měla používat pozitivní kontrola, aby se vyloučil negativní výsledek způsobený technickou chybou. Přítomnost tartarát rezistentní kyselé fosfatázy je prokázáno u 95 % nemocných s HCL. U 3 % pacientů je TRAP negativní. Za pozitivní nález bývá považována přítomnost i dvou buněk s četnými granulemi. Slabou pozitivitu TRAP pozitivní buňky lze výjimečně pozorovat také u některých nehodgkinovských lymfomů, B-CLL, T-PLL, Waldenströmovy makroglobulinémie, Sézaryho syndromu a Gaucherovy choroby. 1.6 Vyšetření průtokovou cytometrií U leukémie z vlasatých buněk je silná exprese znaku CD20, koexprese znaků CD11c/ CD2/ CD5 a exprese CD103. Z povrchových imunoglobulinů je nejčastěji zastoupen IgM, ostatní typy (IgG, IgD, IgA ) jsou méně časté. Dalším znakem antigenní výbavy leukemických buněk je CD123, který je negativní u variantní formy HCL. Pro variantní formu vlasatobuněčné leukémie je charakteristická pozitivní exprese znaků CD103 a CD1c, negativní exprese znaků CD25 a CD23, povrchová exprese IgG. Tabulka č. 1: Imufenotypové nálezy Typická forma HCL Variantní HCL CD11 c + +/ - CD25 + Negativní CD103 + +/ - CD123 + Negativní TRAP + Negativní slg IgM IgG 15
1.7 Variantní forma vlasatobuněčné leukemie Variantní forma vlasatobuněčné leukemie je onemocnění charakterizováno splenomegalií, mírnou anémií, trombocytopenií a poměrně výraznou leukocytózou (medián leukocytů 116 10 9 /l, rozmezí 15-485 10 9 /l). V diferenciálním rozpočtu bílých krvinek nacházíme lymfocytózu, neutropenie a monocytopenie nebývají vyjádřeny. Nátěry kostní dřeně lze lépe aspirovat než u typické varianty, není zde fibróza KD. Nátěry KD jsou buněčné bohaté. Leukemické buňky mají bohatou cytoplazmu s vláknitými výběžky, okrouhlé někdy dvoulaločné jádro ve srovnání s typickou variantou HCL hrubší strukturu jaderného chromatinu a výrazný nukleolus. Nenacházíme různé tvary jader jako u klasické varianty HCL. TRAP reakce je většinou negativní. Obrázek č. 6: Variantní forma vlasatobuněčná leukémie v PK - zvětšeno 1000x Na obrázku nahoře vidíme neutrofilní segment, dále 2 vlasaté buňky, které mají hrubší jaderný chromatin, v jádře patrný nukleolus a prostornou cytoplazmu. 16
Obrázek č. 7: Variantní forma vlasatobuněčná leukémie v KD Hypercelulární nátěr kostní dřeně, zvětšeno 200x. 17
2. Diagnóza Diagnóza vlasatobuněčné leukémie se stanovuje pomocí těchto vyšetřovacích metod: Vyšetření hodnot krevního obrazu, morfologické vyšetření krevního nátěru periferní krve a kostní dřeně Cytochemické vyšetření nátěru periferní krve a kostní dřeně (AcP, TRAP) Imunofenotypizační vyšetření periferní krve a kostní dřeně (FCM) Histologické vyšetření KD včetně imunohistochemie (DBA44) 2.1 Příprava nátěru krve Ke správnému zhodnocení krevního nátěru patří i jeho příprava. Používají se nátěry ze žilní krve s antikoagulačním činidlem. Nevýhodou použití nesrážlivé žilní krve v K3EDTA je výjimečně to, že může způsobit artefakty, které pozorujeme v obarveném krevním nátěru jako např. vakuolizaci neutrofilů, lobulizaci jader lymfocytů, vznik echinocytů, ztrátu centrálního projasnění v erytrocytu pozorovaného potom jako výskyt sférocytů. Podobné změny nastávají též v případě nadbytku EDTA i při krátké expozici (Kačírková, 2007). Pro správné natření krevního nátěru je nezbytné použít čisté, nemastné, nezaprášené podložní sklíčko. Krev roztíráme čistým roztěrovým sklíčkem pod úhlem 25-30º. Nátěr nesmí být příliš dlouhý ani krátký. V krátkém nátěru nejsou buňky nakonci sklíčka vhodně rozprostřené pro mikroskopickou analýzu. Nátěr krve by měl uschnout co nejdříve a dokonale, v případě vyšší vlhkosti vzduchu je vhodné jej vysušit. Při dlouhém schnutí mohou vznikat artefakty- drobné výběžky a protruze cytoplazmy, zvláště lymfoidních buněk, jádra leukocytů se barví tmavěji, struktura jejich chromatinu je setřelá a případné nukleoly jsou hůře viditelné (Kačírková, 2007). Při krátkém schnutí krevního nátěru při barvení erytrocyty zhemolyzují. 18
2.2 Panoptické Pappenheimovo barvení 2.2.1 Barvení v barvicí vaně nebo kyvetách Panoptické barvení se také nazývá barvení May-Grünwald, Giemsa Romanowski. Každá laboratoř používá barvicí protokoly podle svých zkušeností. Barva May- Grünwald barví červené krvinky a jádra buněk a barva Giemsa Romanowski dobarvuje cytoplazmu bílých krvinek. Při barvení je také důležité správné ph. Je-li příliš nízké, barví se špatně bazofilní komponenty - leukocyty jsou příliš světlé a granula eozinofilů se barví svítivě červeně. Je-li ph příliš vysoké, nátěr se přebarví a vzniká falešné pozitivní polychromázie v erytrocytech, neutrofilní granulocyty mají výraznou granulaci připomínající toxickou granulaci. Před vlastním barvením je důležité nechat krevní nátěry dostatečně zaschnout. Pro barvení na barvicím stolku se nám v naší laboratoři osvědčilo používat barvy od firmy Penta, fixovat krevní nátěry pomocí metylalkoholu, naředěné barvy dát na půl hodiny před vlastním barvením do lednice vychladit. Toto barvení používáme jak k barvení krevních nátěrů, tak k barvení nátěrů kostních dření. Přístroje a pomocná zařízení: odměrný válec kádinky skleněná tyčinka barvicí pult Pracovní roztoky: Methylalkohol (firma Penta) May-Grünwald (firma Penta) ředěný destilovanou vodou 1:1 Giemsa Romanowski (firma Penta) ředěný destilovanou vodou 1:15 (př. 10 ml Giemsa Romanowski + 150 ml destilované vody) 19
Pracovní postup: 1. fixace metylalkoholem 5 minut 2. barvení barvou May-Grünwald 5 minut 3. oplach vodou z vodovodního kohoutku (pro naše barvení má optimální ph) 4. barvení barvou Giemsa Romanowski 25 minut 5. oplach vodou z vodovodního kohoutku 2.2.2 Barvení krevních nátěrů v barvicím automatu Barvicí a nátěrový automat SP 1000i od firmy SYSMEX s.r.o. v naší laboratoři umožňuje sklíčka s krevním nátěrem nejen barvit, ale také natírat. Výhodou používání barvicího automatu je standardizace krevních nátěrů a následná standardizace jejich barvení. Je možné nastavit, jak velký objem krevní kapky se má při určitých hodnotách hematokritu natírat, jakou rychlostí a pod jakým úhlem má roztěrové sklíčko krevní nátěr roztírat. Pracovní roztoky: Methylalkohol (firma Penta) May-Grünwald (firma Diagnostica) Cellpack (firma Sysmex) Giemsa Romanowski (firma Diagnostica) Fosfátový pufr ph 7 (firma Diagnostica) Pracovní postup barvení nastavený v barvicím automatu 1. fixace barvou May-Grünwald 40 sekund 2. sušení 1 minuta 3. barvení koncentrovanou barvou May-Grünwald 5 minut 4. barvení barvou May-Grünwald ředěnou chemikálií Cellpack 1 minuta (ředění přednastavitelné v barvicím automatu) 5. barvení barvou Giemsa Romanowski 5 minut 6. oplach destilovanou vodou a usušení sklíčka 1 minuta 20
2.3 Stanovení kyselé fosfatázy Stanovení KF a TRAP provádíme z nátěru periferní nebo kostní dřeně. Pro nátěry z periferní krve jsou vhodné nátěry bez použití antikoagulačního činidla, tzv. nativní nátěry. Přístroje a pomocná zařízení: analytické váhy ph-metr termostat barvicí pult automatické pipety Chemikálie: pararosalinin (firma SIGMA) tlumivý roztok octanový ph 5,6 (laboratorní chemikálie, firma Kulich) octan sodný dihydrát (p. a., reagencie pro analýzu, chemickou výrobu, firma Kulich) dusitan sodný (pro farmaceutické účely, firma Kulich) hydroxid sodný (pro analytickou chemii, Penta) naftol AS-BI fosfátu (1-naphtyl phosphate monosodium salt monohydrate, firma SIGMA) dimethylformamid (p. a., reagencie pro analýzu, MERCK) Leucognost (reagencie pro analýzu, MERCK) Mayerův hematoxylin (firma Kulich) Poznámka: všechny chemikálie použité k barvení mají CERTIFICATE OF ANALYSIS 21
Pracovní roztoky: Leucognost Octanový pufr: 2,05 g octanu sodného do 250 ml destilované vody 1N NaOH: 4 g NaOH do 100 ml destilované vody 4% dusitan sodný: 1 g dusitanu sodného do 25 ml destilované vody (pro toto barvení nesmí být naředěný roztok starší jak 1 týden) Pararosalinin: 400 mg pararosalininu + 8 ml destilované vody + 2 ml 37% HCl Barvicí roztok: a) 20 ml octanového pufru b) 6 mg naftol AS-BI fosfátu rozpustit v 0,25 ml dimethylformamidu c) 0,35 ml 4% dusitanu sodného + 0,35 ml pararosalininu nechat 1 až 2 minuty stát (směs je nutné připravovat vždy čerstvou) Smíchat složky a) + c), změřit ph pomocí ph metru a upravit ho na ph 5,0 (1 N NaOH), nakonec přidat složku b). pracovní postup: 1. fixace -fixačním činidlem (Leukognost) 45 sekund 2. oplach pod tekoucí vodou a usušení při pokojové teplotě 3. barvicí roztok přefiltrovat přes skládaný filtr na nátěry položené v krabičce 4. inkubace nátěru ve vhodné krabičce v termostatu při 37 C 2 hodiny 5. oplach pod tekoucí vodou a usušení při pokojové teplotě 6. dobarvení přefiltrovaným Mayerovým hematoxylinem v kyvetě 10 minut 7. oplach pod tekoucí vodou v kyvetě 10 minut 8. usušení 9. označení preparátů 22
Obrázek č. 8: Barvení na přítomnost kyselé fosfatázy - aspirát kostní dřeně, zvětšení 1000x Leukemické elementy jsou buňky s růžovou cytoplazmou. Růžové zbarvení je způsobeno přítomností enzymu kyselé fosfatázy, který se po cytochemickém barvení zviditelní, čím intenzivnější je zbarvení, tím více enzymu se v buňce nachází. 2.4 Stanovení kyselé fosfatázy rezistentní na tartarát Chemikálie: viz stanovení kyselé fosfatázy kyselina vinná (Penta) Pracovní roztoky: Leucognost Octanový pufr: 2,05 g octanu sodného do 250 ml destilované vody 1N NaOH: 4 g NaOH do 100 ml destilované vody 4% dusitan sodný: 1 g dusitanu sodného do 25 ml destilované vody Pararosalinin: 400 mg pararosalininu + 8 ml destilované vody + 2 ml 37% HCl 23
Barvicí roztok: a) 20 ml octanového pufru b) 6 mg naftol AS-BI fosfátu rozpustit v 0,25 ml dimethylformamidu c) 0,35 ml 4% dusitanu sodného + 0,35 ml pararosalininu nechat 1 až 2 minuty stát (směs je nutné připravovat vždy čerstvou) Smíchat složky a) + c), změřit ph a upravit ho na ph 5,0 (1 N NaOH), nakonec přidat složku b). Z této směsi vzít 5 ml a přidat k 42 mg navážené kyseliny vinné, upravit ph 5,01 (1N NaOH). pracovní postup: 1. fixace - fixačním činidlem (Leucognost) 45 sekund 2. oplach pod tekoucí vodou a usušení při pokojové teplotě 3. barvicí roztok přefiltrovat přes skládaný filtr na nátěry položené v krabičce 4. inkubace nátěru v krabičce v termostatu při 37 C 2 hodiny 5. oplach pod tekoucí vodou a usušení při pokojové teplotě 6. dobarvení přefiltrovaným Mayerovým hematoxylinem v kyvetě 10 minut 7. oplach pod tekoucí vodou v kyvetě 10 minut 8. usušení 9. označení preparátů Vždy zpracováváme pozitivní kontrolu na TRAP, používáme krevní nátěr pacienta, který má TRAP pozitivní vlasatobuněčnou leukemii, abychom zjistili, zda je reakce metodicky správná. 24
Obrázek č. 9: Barvení na přítomnost TRAP - aspirát kostní dřeně, zvětšení 1000x Šipky ukazují na vlasaté buňky, které nejsou citlivé na kyselinu vinnou, mají růžovou cytoplasmu, zatímco buňky citlivé na kyselinu vinnou ztrácí zbarvení cytoplazmy. 25
3. Diagnózy zaměnitelné s vlasatobuněčnou leukémií Mezi diagnózy zaměnitelné s HCL patří: Prolymfocytární leukémie (B-PLL) Splenický lymfom z marginální zóny (SMZL) (Splenický lymfom s vilózními lymfocyty SLVL) Lymfom z plášťových buněk, mantle cell lymfom (MCL) Folikulární lymfom (FCL) Lymfoplazmocytární lymfom (LPL) Tabulka č. 2: Stanovení využívané k diferenciální diagnostice HCL (Žák, 2006) leukocytóza ( 10 9 /l) HCL vhcl PL SLVL MCL vzácně ano, > 100 ano, 100-500 ano, jen mírně různě lymfadenopatie vzácně > 80 % 25 % 25 % 5 % splenomegalie > 80 % > 90 % > 90 % > 90 % > 15-20 % monocytopenie ano ne ne ne ne cytoplazmatické výběžky ano ano ne ano * TRAP ++ -/+ -/+ -/+ -/+ DBA44 ++ + - +/- - ++ silná pozitivita, + pozitivní, +/- velmi slabě pozitivní, -/+ pozitivita jen v ojedinělých případech, - není pozitivita, * cytoplazma vybíhající v pupence 26
3. 1 Splenický lymfom s vilózními lymfocyty U splenického lymfomu s vilózními lymfocyty (SLVL) nebývá přítomna leukopenie a monocytopenie. Leukemické buňky mají výběžky umístěné na dvou protilehlých pólech. Jaderný chromatin je hrubší konzistence než u HCs. Nádorové buňky jsou TRAP negativní. Obrázek č. 10: Splenický lymfom z B-buněk marginální zóny nátěr periferní krve, zvětšení 1000x Vilózní lymfocyty, cytoplazma na protilehlých pólech buňky vybíhá v drobné vlásky, jaderný chromatin je hrubší než u HCs. 27
3.2 Prolymfocytární leukémie Prolymfocytární leukémie je charakterizována výraznou splenomegalií a leukocytózou. Prolymfocyty jsou středně velké lymfoidní buňky ve velikosti přibližně dvojnásobku malého lymfocytu, s chromatinem méně kondenzovaným než u lymfocytu, objemnější cytoplasmou a nápadným jadérkem. Leukemické buňky mohou být slabě TRAP pozitivní. Obrázek č. 11: Prolymfocytární leukémie nátěr periferní krve, zvětšení 1000x Prolymfocyty jsou středně velké lymfoidní buňky ve velikosti přibližně dvojnásobku malého lymfocytu, s chromatinem méně kondenzovaným než u zralého lymfocytu, mají objemnější cytoplazmou, a nápadné, centrálně uložené jadérko. 28
3.3 Lymfom z plášťových buněk U lymfomu z plášťových buněk jsou pozorovány leukemické buňky s vysokým poměrem N/C, světlou cytoplazmou, s jemným jaderným nehomogenním chromatinem a jádrem se zářezy. Obrázek č. 12: Lymfom z plášťových buněk nátěr periferní krve, zvětšení 1000x Na obrázku jsou leukemické buňky s nepravidelným tvarem jádra, vysokým poměrem N/C, světlou cytoplazmou, a s jemným jaderným nehomogenním chromatinem. Úzkými šipkami jsou označené buňky se zářezem v jádře. Bílou plnou šipkou je označena buňka s cytoplazmou, která tvoří pupence. 29
3.4 Folikulární lymfom U folikulárního lymfomu bývá mírná leukocytóza, nacházíme atypické lymfoidní buňky, které jsou menší než lymfocyty, jsou s vysokým poměrem N/C. Jádro má hluboký zářez a mohou mít tak charakter kávového zrna. Obrázek č. 13: Folikulární lymfom nátěr periferní krve, zvětšení 1000x Leukemické buňky jsou menší elementy s extrémně vysokým poměrem N/C, někdy s rozštěpeným jádrem. Typické je jádro, které má tvar kávového zrnka. 30
3.5 Lymfoplazmocytární lymfom U lymfoplazmocytárního lymfomu bývá v periferní krvi lymfocytóza, nacházíme zde atypické lymfocyty, plazmocyty a plazmocytoidní lymfocyty, dále je zřetelné roleaux. Plazmocytoidní lymfocyty jsou buňky s excentricky uloženým jádrem, hrubším jaderným chromatinem a objemnou bazofilní cytoplasmou. U tohoto onemocnění se též nachází anémie a fibróza kostní dřeně. V důsledku fibrózy KD se nemusí plazmocytoidní buňky nacházet v KD. Obrázek č. 14: Lymfoplazmocytární lymfom nátěr periferní krve, zvětšení 1000x Buňky s bazofilní prostornou cytoplazmou, naznačenými nukleoly a hrubším jaderným chromatinem. 31
Závěr Tato práce poskytuje celkový přehled diagnostiky onemocnění vlasatobuněčné leukémie včetně vlastních zkušeností s hodnocením. U tohoto onemocnění je častým příznakem pancytopenie, proto může být jeho diagnostika obtížná či může být považováno za jiné onemocnění např. dřeňový útlum, a následně chybně léčeno. Dalším důvodem proč může být stanovení HC obtížné, je malý počet leukemických buněk v PK a v KD, proto je nutné, aby se diagnostika opírala o více kritérií jako je základní vyšetření krevního obrazu, cytochemické vyšetření kyselé fosfatázy a kyselé fosfatázy rezistentní na tartarát, vyšetření povrchových znaků průtokovou cytometrií a histologické vyšetření kostí dřeně. V této práci jsem se chtěla věnovat podrobněji zejména morfologické a cytochemické diagnostice tohoto onemocnění. V obou případech je nutné připravit správný nátěr k následovanému barvení. Každá laboratoř používá vlastní barvicí protokoly dle svých zkušeností. Základní barvicí protokol naší laboratoře pro barvení panoptické barvení dle Pappenheima, který používáme barvímeli ručně v barvicí vaně, je časově delší, ale poskytuje dobře nabarvené nátěry, a to i nátěry s leukocytózou. Dnes se v laboratořích používají nátěrové a barvicí automaty, které celý proces značně usnadňují a urychlují. Automaty provádí standardizované nátěry, vychází z hematokritu pacienta a dle této hodnoty je nastavena délka, úhel a rychlost roztírání. Cytochemické barvení neprovádí všechny hematologické laboratoře, ale určitě toto vyšetření poskytuje cenné vodítko při stanovení diagnózy vlasatobuněčné leukémie. Na obrázcích jsem chtěla ukázat jednotlivé morfologické typy vlasatých buněk jako například buňky s oválným, prstenčitým, jetelovitým nebo ledvinovitým tvarem jádra. Zde bych chtěla zmínit, že zejména buňky s prstenčitým jádrem byly do nedávna považovány za buňky vycházející z granularní řady. V devadesátých letech minulého století se zjistilo, že tyto buňky mohou být B-lymfoidního původu a vyskytovat se u vlasatobuněčné leukémie. Morfologicky odlišné vlasaté buňky nacházíme u variantní formy vlasatobuněčné leukémie. 32
Další část své práce jsem věnovala diagnózám zaměnitelnými s vlasatobuněčnou leukémií, což jsou obecně další lymfoproliferace. Na dalších obrázcích jsou vidět typické leukemické buňky těchto lymfoproliferativních onemocnění. Morfologické a cytochemická vyšetření jsou dle mého názoru zajímavé, ve své práci jsem se snažila svoje zkušenosti s touto problematikou předat všem, kteří se chtějí o těchto vyšetřeních a jejich významu při stanovení diagnózy vlasatobuněčné leukémie, něco dozvědět. 33
Použitá literatura Dědič, Karel: Vlasatobuněčná leukémie. Československá patologie a Soudní lékařství, Vydáno: Praha, 2002, č. 2, s. 69-74, ISSN1210-7875 Chrobák, Ladislav: Leukémie s vlasatými buňkami. 1. Vydání: Praha, nakladatelství Galén, 1999, 104 s., ISBN80-7262-019-3 Kačírková, Petra, Campr, Vít a spol: Hematologický atlas krve a kostní dřeně. 1. vydání: Praha, Grada Publishing, a.s., 2007, 285 s., ISBN978-80-247-1853-8 Lemež, Peter: Diagnosticky obtížný případ hairy cell leukemie s prstenčitými jádry. Sborník lékařství, Vydáno: Praha, 1991, č. 1/2, s. 33-35, ISSN0036-5327 Lemež, Peter: Výskyt buněk s prstenčitými jádry u leukémie s vlasatými buňkami. Vnitřní Lékařství, Vydáno: Praha, 1991, č. 3, s. 275-278, ISSN0042-773X Marinov, Iuri: Průtoková cytometrie v klinické hematologii. 2. vydání: Praha, Triton, 148 s., ISBN978-80-7387-143-7 Šteiner, Ivo: Vlasatobuněčná leukémie s infekčními komplikacemi. Lékařské zprávy Lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové, Vydáno: Praha, 1992, č. 7/8, s. 235-243, ISSN0457-4206 Zdeněk, Adam, Vorlíček, Jiří et al.: Hematologie pro praktické lékaře. 1. vydání: Praha, Galén, 2007, 313 s., ISBN978-80-7262-435-9 Žák, Pavel: Vlasatobuněčná leukémie a přínos 2-chlorodeoxyadenosinu v léčbě. 1. vydání: Hradec Králové, nakladatelství Nucleus HK, 2006, 110 s., ISBN80-87009-03-7 34