Optická mikroskopie. Petra Grznárová Jan Lipov Jindřiška Angelini - přednáší

Optická mikroskopie Petra Grznárová Jan Lipov Jindřiška Angelini - přednáší

Organizace přednášky Historické konsekvence Úvod do optické mikroskopie Fluorescence a speciální techniky fluorescenční mikroskopie Analýza obrazu

Od Nimrudského skla k nanoskopu Cca 3000 p.k. - Nejstarší nález opracovaného skleněného artefaktupravděpodobně zápalného skla Nimrudské sklo 423 p.k. Aristophanes využití skla na zapalování ohně 2.st. p.k. Claudius Ptolemaeus refrakce a reflexe

Zač. letopočtu - Seneca mladší a Plinius starší zvětšovací efekt skleněné koule naplněné vodou 940-1000 - Abu Saʿd al-ʿalaʾ ibn Sahl ekvivalent k Snellovu zákonu zákon odrazu refrakce 965 1040 - Abū ʿAlī al-ḥasan ibn al-ḥasan ibn al-haytham Alhacen/Ptolemaeus druhý Kniha Optiky 7 svazků - obraz vzniká vniknutím záření do oka, popis záření pomocí jednoduché optické geometrie, záření je forma světla a barev 973-1048 - Abū Rayḥān al-bīrūnī rychlost světla je vyšší než rychlost zvuku 11 st. - Abu 'Abd Allah Muhammad ibn Ma'udh refrakce světla na zemské atmosféře 1571-1630 Johannes Kepler - Astronomiae Pars Optica atmosférická refrakce při zatmění Slunce a Měsíce

www.history-of-the-microscope.org 1590 Hans a Zacharias Jansen dvě čočky v tubě, první složený mikroskop 1609 Galileo Galilei zkombinoval konvexní a konkávní čočku Sférická aberace čočky Objektiv Okulár světelné paprsky na okraji čočky se lámou víc, než poblíž optické osy planokonvexní vs. bikonvexní (asférické) čočky https://www.youtube.com/watch?v=jsxpxtcenri 10.20-12.10 min, první nedokonalé krůčky v mé hlavní badatelské činnosti!

1580-1626 - Willebrord Snel van Royen Snellův zákon zákon refrakce, zformuloval i zákon odrazu 1643-1727 - Isaac Newton rozložení a opětovné složení světla na skleněném hranolu, světlo je složené z částic nebo vln 1665 Robert Hook Micrographia ohromující přesnost a detailnost znázornění pozorovaných objektů, každý objekt zkoumal různými čočkami, pravděpodobně jako první použil výraz cell/buňka při popisu struktury korku REFRAKCE Index lomu = n

Držák se vzorkem Okulár Nádoba s vodou Olejová lampa Zaostřovací šroub Objektiv http://www.nlm.nih.gov/exhibition/hooke/hookesbooks.html

1674 - Antoni van Leeuwenhoek Sestrojil několik stovek mikroskopů Dosáhl zvětšení přes 200x Jako první popsal některé druhy řas Pozoroval živé spermie živočichů, krystaly, krevní buňky a mikroorganismy Zaostřovací šroub Čočka Spirogyra sp. Hlavní šroub http://www.ucmp.berkeley.edu/history/leeuwenhoek.html Držák vzorku

1703-1771 - Chester Moore Hall sestrojil první achromatický teleskop 1826 - Joseph Jackson Lister sestrojil achromatickou čočku spojením konvexní a konkávní čočky, popsal sestrojení achromatických a aplanatických objektivů První achromatický mikroskop 1826 http://www.fotoroman.cz/

1846 Carl Zeiss otvírá továrnu na výrobu mikroskopů v Jeně 1873 Carl Zeiss a Ernst Abbe formulují tzv. Abbeho zákon vztah mezi vlnovou délkou a maximálním rozlišením mikroskopu Definice NA Jedná se o bezrozměrné číslo, které je číselným měřítkem pro schopnost mikroskopické optiky zachycovat informace, obsažené v pozorovaném objektu Olejová imerze max. rozlišení světelných mikroskopů 0,2 μm NA = n. sin α n.index lomu prostředí (mezi objektivem a preparátem) α.úhel mezi středním a okrajovým paprskem světla vstupujícího do objektivu

1903 - Richard Adolf Zsigmondy patentoval ultramikroskop (Nobelova cena za chemii 1925), využití Tyndallova jevu http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-001/hesla/ultramikroskop.html

1904 August Köhler vyvinul metodu rovnoměrné iluminace vzorku Köhlerovo zobrazení, UV záření v mikroskopii 1932 - Frits Zernike fázový kontrast v mikroskopii (Nobelova cena za fyziku 1953) Aaron Klug krystalografický elektronový mikroskop (Nobelova cena za chemii 1982) 1938 - Ernst Ruska, Gerd Binnig a Heinrich Rohrer transmisní elektronový mikroskop a řádkovací tunelový mikroskop (Nobelova cena za fyziku 1986) 1957 Marvin Minsky patentoval první konfokální mikroskop 2006 - Eric Betzig, Stefan W. Hell a William E. Moerner superresoluční fluorescenční mikroskop (Nobelova cena za chemii 2014)

Úvod do optické mikroskopie Světelná (optická) mikroskopie využívá viditelné části spektra (zvětšení cca 2000x) Elektronová mikroskopie využívá proud elektronů (zvětšení cca 1 000 000x) http://www.lbl.gov/microworlds/alstool/emspec/emspec2.html

Základní ingredience v optické mikroskopii: 1. světlo Světlo Albert Einstein dualita světla vlnění spojitého elektromagnetického pole a zároveň proud fotonů (fotoelektrický efekt) Základní pojmy popisující světlo jako vlnu: Frekvence (f) udává počet kmitů za jednotku času, udává barvu Vlnová délka (λ) vzd.mezi 2 odpovídajícími si body sinusoidy (λ=c/f) Amplituda (A) udává nejvyšší odchylku sinusoidy od nulové hodnoty, na její hodnotě závisí intenzita světla Fáze (F) popisuje, v jaké části vlny se vlnění nachází v daném časovém okamžiku Pro optickou mikroskopii postačuje GO Vlnový charakter světla fázový kontrast, kvantový&vlnový elektronová mikroskopie Kotrba et al. Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006 https://www.youtube.com/watch?v=r18gi8lskfm

Vlastnosti světla Christiaan Huygens (1629-1695) Světlo je mj. také vlnění a šíří se prostorem ve vlnoplochách, v homogenním prostředí všemi směry a konstantní rychlostí en.wikibooks.org Každý bod vlnoplochy je zdrojem dalšího vlnění Sbíhavé - rozbíhavé http://www.ibiology.org/ibioeducation/taking-courses/ibiology-microsco py-short-course/resolution-in-microscopy.html

Difrakce - (ohyb) je jev, u kterého se vlnění dostává do oblasti geometrického stínu. Tento proces lze sledovat, když prochází světlo štěrbinou, jejíž šířka je srovnatelná s vlnovou délkou světla. Za štěrbinou se na stínítku objeví difrakční neboli ohybové obrazce, tj. světlé a tmavé proužky různé šířky Interference skládání různých části 2 nebo více vlnění, která dorazila do téhož místa. Monochromatické světlo tmavé a světlé proužky, bíle světlo duhovost. www.instructables.com

Geometrická optika vyžaduje fantazii :) Zásadní abstrakcí GO je pojem paprsek nekoněčne tenký kužel světla (přímka), podél které se pohybuje světelná energie. V izotropním prostředí se šíři přímočaře, při střetu s rozhraním dvou prostředí rozdílnych indexů lomu: Paprsek dopadající a odražený leží v rovině Uhel odrazu se rovná úhlu dopadu Při přechodu z prostředí opticky ředšího do pr.opticky hustšího se láme ke kolmici, v opačném případě od kolmice Platný princip záměnnosti chodu paprsků Snell-Descartův zákon: n1 x sin α=n2 x sin β Úhel dopadu α, úhel lomu β n= c/v, kde c je rychlost světla ve vakuu, v je rychlost světla v médiu Relativní index lomu poměr indexu lomu média k indexu lomu jiného média Absolutní index lomu poměr indexu lomu média k indexu lomu vakua (n=1) http://cs.wikipedia.org/wiki/snell%c5%afv_z%c3%a1kon Kotrba et al. Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006

Základní definicie a pojmy Absorpce - pohlcení a zeslabení záření při jeho šíření určitým prostředím; pohlcená energie může být opět vyzářena nebo přeměněna na kinetickou energii Odraz a lom - změna směru paprsku procházejícího z prostředí o jedné optické hustotě do prostředí o jiné optické hustotě Disperze separace jednotlivých barevných složek bílého světla např. na trojbokém hranolu. Barva světla daná jeho λ. Bíle světlo variace hodnot n pro jednotlivé frekvence. Nejkratší λ = nejvyšší frekvence i hodnota n. hyperphysics.phy-astr.gsu.edu

Refrakce lom světla v důsledku změny optické hustoty prostředí Polarizace - výchylky probíhají pouze v určitém směru a ne chaoticky v různých směrech www.microscopyu.com

Typy zdrojů světla v mikroskopii: První mikroskopy světlo svíčky, slunce Moderní zdroje wolframové lampy, wolfram-halogenová žárovka Pro fluorescenční mikroskopii rtuťová výbojka, xenonová výbojka, LED, laser Light-emitted diode http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/noncoherentsources.html

Ingredience č.2: čočka Optická čočka - optická soustava dvou centrovaných ploch Optická osa čočky přímka procházející středy křivosti kulových ploch čoček a je kolmá na jejich rovinné plochy Ohnisko (F) bod, v kterém se protínají světelné paprsky (rovnoběžné s osou čočky před dopadem na čočku) po průchodu čočkou Ohnisko předmětové na straně optické soustavy, kde je předmět Ohnisko obrazové na druhé straně, kde vzniká obraz Ohnisková vzdálenost (f) vzd. ohniska od optického středu čočky (O)

Pro čočku spojnou platí: paprsek rovnoběžný s optickou osou po průchodu optickou soustavou probíhá obrazovým ohniskem F paprsek procházející středem optické soustavy (O) po průchodu optickou soustavou probíhá stejným směrem a neláme se paprsek procházející předmětovým ohniskem F po průchodu optickou soustavou probíhá rovnoběžně s osou optické soustavy 2 možnosti umístění předmětu vzhledem k optické soustavě: předmět se nalézá mezi ohniskem a dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností vzniká obraz převrácený, zvětšený a skutečný (objektiv) předmět se nalézá mezi optickou soustavou a ohniskem vzniká obraz vzpřímený, zvětšený a zdánlivý (okulár, lupa) Kotrba et al. Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006 Tutoriál 1: http://www.olympusmicro.com/primer/java/l enses/magnify/index.html

Schéma znázornění vzniku obrazu ve složeném mikroskopu Kotrba et al. Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006 Skutečný obraz poznáme podle toho, že se v něm skutečně paprsky protínají! Takový obraz lze zachytit na stínítko, zaznamenat na fotografický film Vytváří-li optická soustava rozbíhavý svazek paprsků, není možné zachytit obraz daného bodu na stínítko a skutečný obraz nevzniká. lze ale pozorovat okem, protože oční čočka mění rozbíhavý svazek na sbíhavý. pak pozorujeme v průsečíku, který vznikne zpětným prodloužením rozbíhavých paprsků. V tomto případě vzniká zdánlivý (neskutečný) obraz. Neskutečný obraz není možné zachytit na stínítko, nelze jej zaznamenat na fotografický film. V daném bodě se paprsky neprotínají, nesoustřeďuje se v něm světelná energie. Díváme-li se na vzorek okulárem, reálný obraz je zobrazen až na naší sítnici, my to ale vnímáme jako virtuální obrázek ve vzdálenosti cca 25 cm před naším okem.

Objektiv srdce mikroskopu Objektiv soustava čoček, zásadní část mikroskopu nejblíž k objektu Hlavní charakteristiky: zvětšení, numerická apertura (NA) Long working distance - http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/objectives.html

Numerická apertura NA = n x sinθ kde n je index lomu prostředí mezi čelní čočkou objektivu a preparátem a θ je polovina otvorového úhlu objektivu. Ovlivňuje rozlišovací schopnost soustavy Rozlišení soustavy lze spočítat dle Abbeho zákona: λ d x,y = = 400 = 143 nm 2 x (n x sinθ) 2 x 1.40 d z = 2 x λ = 800 = 408 nm n x sinθ 2 1.40 2 Pro nejkratší λ a NA 1,4: - Limitní rozlišení laterální v x,y - Limitní rozlišení axiální v z Tutoriál 2: http://www.olympusmicro.com/primer/java/nuapert ure/index.html

Rozdíly ve velikosti otvorového úhlu u různých NA Objektivy s větší NA sbírají větší část světelných vln, obraz má větší jas při stejném zvětšení. Se zvyšující se NA se snižuje hloubka ostrosti. http://www.ibiology.org/ibioeducation/taking-courses/ibiology-microsco py-short-course/resolution-in-microscopy.html

Rayleighovo kritérium dva body je možné rozlišit právě tehdy, když centrální maximum (Airyho disk) prvního difrakčního obrazce spadá do prvního minima difrakčního obrazce druhého bodu. Jinak také vzdálenost mezi body musí minimálně odpovídat šířce píku v polovině maxima jeho intenzity. Rozlišovací mez (schopnost) soustavy je nejmenší lineární vzdálenost 2 bodů R = 0,61 x λ/na http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/phyopt/raylei.html http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/resolution.html www.boundless.com

Francon et al., 1961 Čím vyšší NA, tím menší hodnota Rayleighova kriteria a lepší rozlišení objektivu nízká střední hodnota numerické apertury při stejném zvětšení vysoká Hodnota Rk = 0,61.λ / NA, což je upravený vztah pro Abbeho difrakční limit - d = λ / 2n.sinθ NA numerická apertura λ vlnová délka světla sinθ - polovina otvorového úhlu objektivu n index lomu prostředí https://www.youtube.com/watch?v=n2asdncmymo

Point spread function - PSF Bodová rozptylová funkce popisuje strukturu, do kt.se vykreslí signál z jednoho bodu vzorku Airy disk v x,y průměr disku determinován NA, z měření se dá určit rozlišení 3D struktura v axiální ose www.olympusmicro.com zeiss-campus.magnet.fsu.edu

Point Spread Function = rozptylová funkce v praxi Skutečná velikost bodu a jeho zobrazení Body s velikostí pod limitem rozlišení budou mít podobnou PSF Rozptylová funkce je matematická funkce, která opisuje optickou vadu jako cestu teoretického bodového zdroje světla (nebo jiného vlnění) přes přístroj. Obvykle takový bodový zdroj přispívá do konečného obrazu malou rozmazanou ploškou. K získání původního, reálného obrazu se používají různé dekonvoluční algoritmy, které jsou spolehlivé jen do velikosti difrakčního limitu. https://www.youtube.com/watch?v=n2asdncmymo

Optické vady objektivů Vada sférická paprsky rovnoběžné s opt. osou se lámou různě podle vzdálenosti od osy, vzniká více ohnisek Místo ostrých bodů tzv. rozptylové kruhy Potlačení je možné Sestavy čoček různých tlouštěk Zamezení přístupu světla na vnější okraj čočky vhodnou clonou Asférické čočky objektivy s vysokou korekcí sférické aberace jsou často designovány pro určité podmínky, např. tloušťku krycího skla, na některých suchých objektivech lze upravit korekčním kroužkem Tutoriál 3: http://www.olympusmicro.com/primer/java/aberrations/spherical/ http://www.olympusmicro.com/primer/java/aberrations/spherical/ http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/objectives.html

Vada chromatická Tutoriál 4 : http://www.olympusmicro.com/primer/java/aberrations/chromatic/index.html Jednotlivé složky polychromatického světla (jednotlivé λ) se lámou na sférické čočce pod různými úhly, každá má jiné ohnisko Nejblíž čočce je ohnisko nejkratší λ projevuje se jako vada polohy - obrazy pro jednotlivé barvy se vytvářejí v jiných místech barevná vada velikosti - různá velikost obrazů předmětu vytvořených barvami různých vlnových délek) výsledkem je nejasný obraz s barevnými okraji (halo) tyto vady jsou u objektivů korigovány achromáty - korekce pro žlutou a zelenou část spektra (lidské oko je pro ně nejcitlivější) apochromáty - korekce na téměř celé spektrum viditelného světla http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/aberrations.html en.wikipedia.org www.globalspec.com

Vada vyklenutí zorného pole paprsky dopadající na čočku šikmo mají jiné ohnisko než paprsky rovnoběžné rovinný objekt ležící v rovině kolmé na optickou osu je pak zobrazen nikoli v rovině, ale jako plášť kulového vrchlíku korigované objektivy se označují předponou plan- další řada vad koma, astigmatismus http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/fieldcurvature.html http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/objectives.html

http://www.olympusmicro.com/primer/photomicrography/errors.html www.olympusmicro.com http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/fieldcurvature.html

Světelnost objektivu- intenzita osvětlení zorného pole, úměrná čtverci NA; Hloubka ostrosti část prostoru, vymezené 2 rovinami, kolmými na osu optického přístroje, s rostoucí NA klesá HO, Užitečné zvětšení celkové zvětšení opt. soustavy správně využívající rozlišovací schopnost objektivu, 500x-1000x NA Prázdné zvětšení když je obraz větší ale nezobrazí se více detailů

Shrnutí - objektiv otvorový úhel numerická apertura rozlišení světelnost hloubka ostrosti užitečné zvětšení optické vady Intensita světla se zvyšuje se čtvercem NA

Konstrukce mikroskopu Další optické komponenty: Okulár Kondenzor

Okulár Dále zvětšuje obraz vzniklý objektivem Nejlepších výsledků je dosaženo při použití okulárů, které jsou vhodné vzhledem k typu objektivu a jeho korekci (korekce na objektivu nebo na okuláru). 2 základní typy okulárů: positivní - clona je pod čočkami - Ramsdenův okulár - taky dvě planokonvexní čočky, ale polní čočka je zakřiveným povrchem směrem k oční čočce - vhodný okulár pro vkládání optických mřížek negativní - clona je mezi oční a polní čočkou - nejjednodušší design je tzv. Huygensův okulár pro použití s achromatickými objektivy zvětšení 5x-40x residual lateral chromatic aberration correction http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/oculars.html

Kondenzor Tvořen soustavou čoček Funkce koncentrováni světla ze světelného zdroje do kuželu, který osvětluje vzorek s uniformní intenzitou v celém zorném poli. Zásadní správné nastavení optimalizace intensity a úhlu dopadu světelného kužele do objektivu (změna objektivu = přizpůsobení kondenzoru) aperturní clona, přídavní čočky při příliš široce otevřené cloně kondenzoru rozptýlené světlo generované lomem šikmých světelných paprsků na vzorku může způsobit oslnění a snížit celkový kontrast při příliš zavřené cloně kondenzoru je osvitový kužel nedostatečný pro dosažení adekvátního rozlišení, navíc dochází k distorzi obrazu kvůli difrakci na vzorku Tutoriál 5 a 6: http://www.olympusmicro.com/primer/java/kohler/condenseraperture/index.html http://www.olympusmicro.com/primer/java/kohler/contrast/index.html http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/condensers.html

Kvalitní iluminace vzorku je zásadní!!!! Redukce intenzity iluminačního světla na množství optických komponent je více než 50 % a to i při nejkvalitnější úpravě všech čoček Tutoriál 7: http://www.olympusmicro.com/primer/ java/microscopy/transmitted/index.html www.microscopyu.com

Kritické osvětlení žárovka, polní clona, aperturní clona, kondenzor světlo ze zdroje prochází polní clonou, která slouží k regulaci velikosti zorného pole aperturní clona brání pronikání vnějších paprsků do objektivu - velikost apertury mění rozlišitelnost a ostrost obrazu kondenzor usměrňuje světlo na tzv. ideální rovinu ostrosti, kde je umístěna pozorovaná plocha vzorku rozžhavené vlákno žárovky se zobrazí přímo do zaostřené roviny vzorku, což způsobí nerovnoměrné osvětlení vzorku Sloužilo pro dosažení vyšší efektivity osvětlení vzorku Bylo nahrazeno Köhlerovým osvětlením http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/lightsources/lightsourcefundamentals.html

1893 August Köhler, Carl Zeiss Köhlerovo osvětlení Optimální iluminace vzorku využívající optického potenciálu mikroskopu Hlavní princip je perfektní defokusace světelného zdroje v optické rovině vzorku Výsledkem Köhlerova nastavení je rovnoměrné a maximální osvětlení průhledného preparátu, ležícího v předmětové rovině. Současně by měla být dosažena nejlepší kombinace mezi rozlišovací schopností a kontrastem.

Techniky pro zlepšení kontrastu Pozorování v zástinu (darkfield) Využívá šikmého osvětlení pro zvýšení kontrastu nebarveného průhledného vzorku, jehož index lomu je podobný okolí (např. vodě) světlo nultého řádu (přímo procházející, nerozptýlené) je blokováno neprůhledným členem v kondenzoru světlo procházející vzorkem šikmo ze všech stran je částečně ohnuto, rozptýleno a odraženo do objektivu vzniká jasný obraz na černém pozadí, který ale není negativem zobrazení ve světlém poli Tutoriál 8: http://www.olympusmicro.com/primer/java/darkfield/cardioid/index.html http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/darkfield.html

Krystaly snehu darkfiel iluminace www.microscopy-uk.org.uk

Polarizované světlo Sluneční světlo a skoro všechny umělé zdroje osvětlení generují světelné vlny, jejichž vektor elektrického pole vibruje ve všech rovinách kolmých na směr postupu. Pokud se filtrací odstraní všechny roviny krom jediné, mluvíme o světle polarizovaném. Herapatit (polaroid). křížová polarizace použití dvou polarizérů s navzájem kolmými štěrbinami první tzv. polarizér a druhý tzv. analyzér Polarizér mezi zdrojem iluminace a vzorkem, analyzér mezi objektivem a okulárem. Před vložením vzorku zkřížit P a A - tma Po vložení vzorku rotace vektoru polarizovaného světla na vzorku tak, že prochází analyzátorem http://www.olympusmicro.com/primer/lightandcolor/polarization.html Tutoriál 9: http://www.olympusmicro.com/primer/java/polarizedlight/filters/index.html

Krytal bíleho cukru v polarizovaném světle microscopetalk.wordpress.com

Fázový kontrast Objekty amplitudové absorbují část světla, mění amplitudu, viditelné mají kontrast Objekty fázové posunuje fáze světelného pole, nerozlišitelné pro lidské oko, objekty průhledné, ale s různým indexem lomu FK proměňuje fázové změny vlnění na změny intenzity světla Obraz objektu v obrazovém ohnisku objektivu interferenci vlnění přímého (prochází vzorkem beze změny) a difrakčního posunutého v důsledku jiného indexu lomu vzorku Světlo přímé a difrakční lze oddělit fázovou deskou posunuje fáze přímého světla (zrychlí pozitivní kontrast, zpomalí negativní kontrast), výsledný rozdíl 1/2λ Důsledkem interference obou typů vlnění kontrastní obraz Ernst Zernike http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/phasecontrast/phase.html

HeLa buňky www.microscopyu.com

Diferenciální interferenční kontrast DIC = Nomarského interferenční kontrast = Nomarski dává obdobný obraz jako fázový kontrast, ale bez difrakčních halo základní princip je rozdělení polarizovaného světelného zdroje pomocí hranolu na dva paprsky, každý zvlášť prochází vzorkem a druhým hranolem jsou oba opět spojeny před zobrazením Wollastonův hranol rozdělí náhodně polarizované či nepolarizované světlo na dva ortogonálně polarizované paprsky http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dicoverview.html

Dva ortogonálně polarizované paprsky procházejí rovnoběžně vzorkem ve vzdálenosti cca 0,2μm od sebe, vytvoří se dva obrazy (od každého z paprsků) lehce posunuté od sebe, které ale neinterferují, protože jsou odlišně polarizovány Jsou-li dvě oblasti průchodu paprsků odlišně v indexu lomu nebo tloušťce, dojde ke zpoždění jednoho z paprsků (změně fáze) po složení dvou paprsků na druhém hranolu dojde k interferenci paprsků www.micro.magnet.fsu.edu

Krystaly pozorované pomocí DIC konfokálním mikroskopem Zeiss 880, obj. 63x

Luminiscence Fotoluminiscence emise záření, které nastává spontánně při přechodu molekuly z excitovaného stavu do základního A) fosforescence Chemiluminiscence podmíněná chemickou reakcí (např. reakce peroxidu vodíku a luminolu) Emise přetrvává až do řádu vteřin od ukončení excitace http://chemiluminiscence.xf.cz/clanky.php?id=7 http://www.lightshop.cz/t/svitici-tycinky-zakladni-informace.htm http://silikonovenaramky.cz/archives/1100

B) Fluorescence - princip Polovina 19.st. Sir Goerge G. Stokes pozoroval emisi záření u kazivce po ozáření UV, popsal rozdíl λ absorbovaného a emitovaného záření Zavedl pojem fluorescence Primární fluorescence (autofluorescence) Přirozená fluorescence materiálu Sekundární fluorescence studovaný materiál je označen fluoreskující značkou http://en.wikipedia.org/wiki/fluoresc ence#mediaviewer/file:fluorescent_ minerals_hg.jpg http://www.olympusmicro.com/primer/lightandcolor/fluorointroduction.html https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/~timrozek/ibioseminar

Jablonski diagram energií Před excitaci je molekula v tzv. základním stavu Po absorpci fotonu excitačního záření (kratší λ) elektron uveden do excitačního stavu (vyšší energická hladina) na dobu 10-15 sekundy (femtosek.) Ztráta části vibrační energie elektronu do prostředí a pokles elektronu do nižší energetické hladiny Relaxace elektronu do základního stavu vyzáření energie delší λ než u excitačního záření Tutoriál 10 http://www.olympusmicro.com/primer/java/jabl onski/lightandcolor/index.html

Fluorochrom molekuly schopny projít elektronovými tranzicemi Fluorofor fluorochrom konjugován k jiné molekule kovalentními vazbami nebo adsorpcí Fluorofory můžou projít několika cykly Ex/Em než dojde k jejich destrukci interval mezi absorpcí excitačního světla a emisí je extrémně krátký (<1/1000000 s) Fluorofory přírodní, syntetické, rekombinantní Charakteristika fluoroforů: Extinkční koeficient Kvantový výtěžek Životnost http://www.olympusmicro.com/primer/lightandcolor/fluorointroduction.html

Extinkční koeficient - resp. molární extinkční koeficient - míra schopnosti fluoroforu absorbovat světlo, získá se měřením absorbance při referenční vlnové délce (charakteristické pro absorbující molekulu) pro jednomolární koncentraci Kvantový výtěžek - míra efektivity fluorescenční emise vzhledem k ostatním způsobům relaxace bývá vyjádřen jako poměr počtu emitovaných fotonů ku počtu fotonů absorbovaných (de facto pravděpodobnost, že daný excitovaný fluorochrom vyzáří foton; nabývá typicky hodnot 0-1). Pro většinu aplikací upřednostňujeme fluorofory s vysokým kvantovým výtěžkem, ten je ovšem dramaticky závislý i na vnějším prostředí (viskozita solventu, iontová síla, ph, hydrofobicita) Životnost fluoroforu - průměrný čas, po který zůstává molekula v excitovaném stavu, než emituje foton obvykle používané fluorescentní sloučeniny mají životnost 0,5-20 nanosekund blednutí dělíme na vybělení (bleaching) a zhasínání (quenching) vybělení nevratný rozklad fluorescentních molekul v důsledku vysoké intenzity světla v přítomnosti molekulárního kyslíku (trvalá ztráta schopnosti fluoreskovat v důsledku fotonem indukovaného poškození). závisí na konkrétním fluoroforu a jeho okolí, kolik cyklů excitace-emise dokáže prodělat než je vybělen - některé fluorofory několik, jiné tisíce i miliony cyklů fotovybělení se dá zabránit omezením expozice fluoroforů iluminační energii, tím se ovšem snižuje signál fluorescence deoxygenací roztoku fluoroforu, což je ovšem problematické např. u živých buněk. Iluminace se proto omezuje na co nejmenší použitelný čas a tato technika se kombinuje s komerčně dostupnými reagenciemi, snižujícími vybělení

26jul12z1 Fluorescence přírodní a fluorescenční barviva Imunodetekční přístupy imunohistochemické barvení - přímá metoda - nepřímá metoda primární protilátka (polyklonální, monoklonální), sekundární protilátka konjugovaná s fluorochromem: FITC (fluorescein isothiokyanát), TRITC (tetramethylrhodamin), DAPI, Cy3, Cy5, Alexa XXX... Aequorea victoria - je možné značit pouze fixované preparáty, nelze sledovat dynamiku Kořen Arabidopsis thaliana značený monoklonální protilátkou proti tubulinu α, sekundární protilátka konjugována s FITC http://en.wikipedia.org/wiki/fluorescence#mediaviewer/file:fluorescent_minerals_hg.jpg http://stephenslab.wordpress.com/2012/12/19/art-competition-entries-2012/ http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n8/full/nmeth0806-647.html http://www.olympusmicro.com/primer/lightandcolor/fluorointroduction.html http://www.photobiology.info/zimmer.html

http://www.olympusconfocal.com/a pplications/fpcolorpalette.html GFP a spol. - renesance live imagingu Green fluorescent protein zelený fluorescenční protein 29,6 kda, 11 beta-listů uvniř chráněný chromofor vzniký cyklizací Ser65, Tyr66, Gly67 Původní protein excitační maximum 395 a 475 nm, emise při 509 nm. Různými úpravami chromoforového jádra byly získány barevné variace a také běžně používané GFP - 488/509 nm http://www.tsienlab.ucsd.edu/

RFP red fluorescent protein (DsRed) Pochází z korálů a mořských hub rodu Discosoma sp. - poměrně odolný proti změnám ph - chemickými úpravami chromoforu byla připravena celá škála proteinů různých barev 3feb12z10 Mikrotubuly v buňkách listu Arabidopsis thaliana, transientní transformace MT markerem - RFP-MBD

Fluorescenční mikroskop Zdroj iluminace Excitační/emisní filtry Dichromatické/dichroicke zrcadlo Detektory

Zdroj iluminace ve fluorescenční mikroskopii množství fotonů, které dorazí do oka nebo na detektor je při fluorescenční mikroskopii zpravidla velmi malé - kvantový výtěžek většiny fluorochromů je malý pro dostatečné množství emisního světla nutno používat velmi silné zdroje excitace obvykle obloukové lampy (výbojky), nejčastější jsou rtuťové lampy od 50 do 200 wattů a nebo xenonové výbojky 75-150 wattů laser http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/fluorosources.html

Laser Light Amplification by the Stimulated Emision of Radiation http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/noncoherentsources.html Souvislý paprsek o jedné vlnové délce (Ar laser více λ), koherentní Na bázi krystalu, diody, plynu druh použitého materiálu určuje λ Princip vysoká aktivační energieionizace plynu-koncentrováni iontů pomocí magnetického pole Pevnolátkové lasery atomy krystalu excitovány, emitovány fotony reflektovány zrcadly, stimulují tvorbu nových fotonů v krystalu, puls fotonů opouští tubus přes aperturu Tutoriál 11 a 12: http://www.olympusmicro.com/primer/java/lasers/simplelaser/index.html http://www.olympusmicro.com/primer/java/lasers/argonionlaser/index.html

Excitační/Emisní filtry Čím větší Strokes shift, tím lehčí separace Ex/Em signálů Dialektrická vrstva určuje, kt. λ budou odraženy a kt. projdou filtrem a budou multiplikovány Správná volba kombinace fluoroforů je zásadní (crosstalk) http://www.olympusconfocal.com/theory/bleedthrough.html http://www.olympusmicro.com/primer/lightandcolor/filtersintro.html

Dichromatické = dichroické zrcadlo Odráží světlo kratší než určitá vlnová délka a propouští světlo delší než určitá vlnová délka nebo odráží pouze rozmezí vlnových délek a vše okolo propouští. Pomáhá excitačnímu a emisnímu filtru odstranit nežádoucí světlo >>> tmavé pozadí jas fluorescence vyzářené je 1000x až 1000000x nižší, než iluminace. Cílem je tedy zachytit toto slabé světlo a oddělit ho od excitačního, což zvládnou právě dichromatické děliče svazku např. vzorek s fluoroforem, excitovaným v zelené oblasti (550 nm) a fluoreskujícím červeně (620-660 nm) výkonný zdroj poskytuje široké spektrum excitačních vlnových délek, světlo narazí nejprve na filtr, který propustí vybranou vlnovou délku pro excitaci (EF). V našem případě 510-560 nm (opět s nějakou účinností, takže v prošlém světle budou i jiné vlnové délky). excitační světlo dále narazí na dichromatické zrcadlo (DM) a je odraženo do objektivu, aby vytvořilo osvětlení vzorku dichromatické zrcadlo je umístěno do světelné cesty pod úhlem 45 a je vyrobeno tak, aby selektivně odráželo pouze určité vlnové délky (zde 490-565 nm), zatímco kratší i delší vlnové délky propouští http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/anatomy/fluoromicroanatomy.html

Detektory Photomultiplier tube zobrazovací zařízení rozhoduje o tom, jak malou fluorescenci jsme ještě schopni zachytit, případně jak rychlé procesy jsme schopni zaznamenat, elektronické senzory lze popsat mnoha proměnnými: spektrální sensitivita kvantový výtěžek prostorové rozlišení stejnoměrnost poměr signál/šum dynamický rozsah rychlost odezvy PMT - photomultiplier tube (fotonásobič), GaAsP APD - avalanche photodiode (lavinová fotodioda) CCD - charge-coupled device (zařízení s vázanými náboji) CMOS - complementary-metal-oxide semiconductor detector (doplňující se kov-oxid-polovodič) Dokonalý detektor neexistuje, záleží na tom, co potřebujeme nejvíce www.globalspec.com micro.magnet.fsu.edu elchem.kaist.ac.kr

Epifluorescenční versus konfokální mikroskopie Skutečné mikroskopické objekty jsou trojrozměrné, čímž se míní, že mají konečnou tloušťku. Teoretické rozlišovací schopnosti mikroskopu lze plně využít jen v případě vzorků o tloušťce menší, než je hloubka ostrosti objektivu, která závisí na jeho numerické apertuře (Z min = 0,25 nλ/na 2 ). Při zkoumání silných vzorků, například tkáňových řezů nebo velkých buněk, je kvalita zobrazení, a tím i praktická rozlišovací schopnost mikroskopu, nepříznivě ovlivňována překrýváním obrazu roviny, do níž je mikroskop právě zaostřen, s neostrými obrazy rovin ležících nad ní a pod ní. Rušivého zamlžení obrazu zářením z mimoohniskových rovin se lze do značné míry zbavit pomocí konfokální mikroskopie. (časopis Vesmír) http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/livecellimaging/techniques.html http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/confocalintro.html

Princip konfokálního zobrazení konfokální mikroskop - vyšší rozlišovací schopnost a kontrast detekováno pouze světlo z ohniskové roviny - 1957 Marvin Minsky - použití bodové iluminace "pinhole" - malý otvor v opticky konjugované rovině před detektorem, eliminující signál odjinud než z ohniskové roviny => rozlišení hlavně ve směru tloušťky vzorku je o hodně lepší lze používat tzv. optické řezy s následnou 3D rekonstrukcí na druhou stranu opět snížení intensity signálu, vyžaduje dlouhé exposice 2 základní typy skenovací konfokální mikroskop - velmi vysoké rozlišení, ale extrémně pomalé konfokální mikroskop s rotujícím diskem - nižší rozlišení, ale velmi rychlé - pro dynamické jevy v živých soustavách http://www.tcd.ie/physics/photonics/research/plasmon.php

Camera obscura Princip konfokálního zobrazení http://www.ibiology.org/ibioeducation/taking-courses/ibiology-microscopy-short-course/resolution-in-microscopy.html

Skenovací konfokální mikroskop List Arabidopsis thaliana GFP značený membránový protein, RFP značené mikrotubuly a kolokalizace, Obj. 63x, Zeiss 880 Tutoriál 13, http://www.olympusmicro.com/primer/java/confocalsimulator/index.html

Konfokální mikroskop využívající rotující disky 1884 Paul Nipkow - Nipkowův disk Objevil televizní skenovací zařízení Světelné intenzity malých částí obrazu/objektu postupně analyzovány a přenášeny Rychle se otáčející disk umístěný mezi objekt a fotocitlivý selenový element Čtverečkové otvory po obvodu disku uspořádané v Archimedově spirále Signál z objektu přechází v daném momentu čtverečkem v opt. dráze na selenový element Druhý disk otáčí se synchronizovaně s prvním signál ze zdroje ovládaného elementem přechází čtverečkovým otvorem a vykreslí bod na projekční obrazovku Ohromná redukce signálu signál se snímá jen jedním malým otvorem v čase www.britannica.com chrismyth.hubpages.com

1967 - David Egger a Mojmír Petráň vylepšili koncepci Nipkowova disku pro multi-bodovou iluminaci spojenou s detekcí v konfokálním módu Štěrbiny uspořádaný v klastru Archimedových spirál V 1 okamžiku je iluminováno přibližně 1000 štěrbin Transmise až stokrát vyšší než u Nipkowova disku Nejrozšířenější řešení od firmy Yokogawa 12 fr. v jedné kompletní otáčce disku 5000 ot/min 10 000 ot./min Soustava 2 disků jeden s čočkami a jeden s prázdnými štěrbinami, perfektně synchronizovány http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/spinningdisk/introduction.html

Schéma skenování u skenovacího konfokálu a u iluminace na báze rotujících disků Tutoriál 14 http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/spinningdisk/yokogawa/indexflash.html

SDCM snímek GFP značená aktinová vlákna mch značené mikrotubuly v pokožkových buňkách listu Arabidopsis thaliana

Embryo chobotnice http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/confocal-microscopes/lsm-700-laser-scanning-microscopy.html

Různé druhy liposomů http://ohscience.tumblr.com/post/12746455006/giant-liposomes-of-pulmonary-surfactant-40x

Cortiho orgán, hlemýžď http://scienceblogs.com/retrospectacle/2007/11/14/confocal-image-of-cochlea-wins/

Vybrané speciální techniky ve fluorescenční mikroskopii Fotokonverze/fotoaktivace FRAP/FLIP - fluorescence recovery after photobleaching TIRFM - total internal reflection microscopy FRET - Förster (fluorescence) resonance energy transfer

FRAP Fluorescence recovery after photobleaching obnova fluorescence po vybělení fluoroforů ve vybělené oblasti FLIP Fluorescence loss in photobleaching ztráta fluorescence po vybělení fluoroforů v nevybělené oblasti http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/opticalhighlighters.html PA Photoactivation vznik fluorescence po aktivaci světlem

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/fluorescentproteins/pagfpchroma/indexflash.html jcs.biologists.org Princip fotoaktivace a použité fluorochromy

TIRFM total internal reflection microscopy mikroskopie využívající totálního odrazu ( dosáhne tzv. kritického úhlu) excitačního paprsku od rozhraní dvou prostředí o různých n http://www.tirf-labs.com/technologies.html A jeho modifikace: VAEM variable-angle epifluorescence microscopy, paprsek osvětluje vzorek v podkritickém úhlu, tzn. nevzniká evanescentní vlna (Sebastian Y. Bednarek and Catherine A. Konopka, Wisconsin University)

lightmicroscopy.ucdenver.edu

FRET - Förster (Fluorescence) resonance energy transfer transfer energie mezi dvěma chromofory, efektivita přenosu je nepřímo úměrná šesté mocnině vzdálenosti mezi donorem a akceptorem (reálná hranice je 10 nm) umožňuje studovat interakci mezi dvěma různými molekulami (proteiny). molekuly označeny odlišnými fluorochromy, emisní spektrum jednoho se překrývá s excitačním spektrem druhého při interakci molekul se jejich fluorochromy dostanou velice blízko, energie excitovaného světla se může přenést z jednoho fluorochromu na druhý při osvícení komplexu excitačním světlem prvního fluorochromu vidíme emisní světlo odpovídající druhému fluorochromu zeiss-campus.magnet.fsu.edu cam.facilities.northwestern.edu

www.olympusamerica.com Tutoriál 15: http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/spectralimaging/fretbiosensors/indexflash.html

Analýza obrazu Získání obrazu reálného světa Snímání a digitalizace obrazu Předzpracování obrazu Transformace (jas, kontrast, barva), filtrace Vyčlenění objektů zájmu Segmentace (prahování, detekce) Popis objektů (analýza) Měření, vyhodnocení dat Klasifikace Interpretace výsledků

Sampling = vzorkování Sampling promyslet již při snímání obrazu (upravit podle rozlišení mikroskopu), protože není cesty zpět, nelze opravit dodatečně!! Proces převedení analogového obrazu na digitální, složený z px (picture element) ev. vx Sampling density: popisuje podmínky, za kterých je snímán obraz. Příklad: obr. 256x256 px pokryje 100x100um např. = 256/100 = 2,56 px na 1 um = 100/256 = 0,391um = 391 nm na 1 px. Ideální sampling = snímání v takovém rozlišení (sampling density), abychom získali všechny dostupné informace (oversampling/undersampling) Ideální vzorkování se počítá na základě Nyquistova teoremu: vzorkovací frekvence se volí dvakrát větší plus ještě malá rezerva než je maximální požadovaná přenášená frekvence Obvyklá rozlišení mikroskopů: 512x512, 1024x1024 4096x4096 px

Harry Nyquist použil svůj teorem pro akustickou energii lidské ucho vnímá fekvence do 20 khz CD přehrávače mají proto frekvenci 44,1 khz... https://svi.nl/nyquistrate http://www.hi.helsinki.fi/amu/amu%20cf_tut/opt_scanres.htm

749x749 px Undersampling 75x75 px

Software pro zpracování mikroskopických obrázků Image J NIS Elements ZEN lite Imaris Huygens Předzpracování obrazu odstín, sytost barvy, jas, kontrast - většinou pouze vylepšení optické kvality obrazu, před analýzou se nedoporučuje příliš zasahovat odstranění šumu (SNR = Signal to Noise Ratio čím nižší, tím větší poškození obr.) Existuje mnoho algoritmů pro odstranění šumu

Dekonvoluce rekonstrukce obrazu Algoritmus používaný ke zpětnému odstranění vad vzniklých při průchodu světla optickou dráhou mikroskopu Dekonvoluce v praxi je to různě přesný odhad reálného obrazu za použití různých algoritmů. Přesný (relativně) obraz získáme pouze tím, že odvodíme PSF pro daný vzorek při současném snímání kalibračních objektů K popisu deformace, která při průchodu mikroskopem vzniká se používá PSF point spread function bodová rozptylová funkce: matematická funkce, která opisuje optickou vadu jako cestu teoretického bodového zdroje světla (nebo jiného vlnění) přes přístroj. Konvoluce proces tvorby obrazu v mikroskopu g (deformovaný obraz objektu) = h (PSF) x f (reálný obraz objektu) Dekonvoluční programy využívají (nepřesnou - teoretickou) PSF odvozenou na základě parametrů mikroskopu za ideálních podmínek (NA,refrakční index, λ )

10dec15z14HIR1yfpCot (Huygens) PŘED Dekonvoluce PO

Segmentace >> prahování Segmentace obrazu rozdělí obraz na logické celky s podobnými vlastnostmi. Základní segmentační metodou je prahování (tresholding). Na stupnici jasu pixelů (0-255) se určí práh px s těmito intenzitami se nahradí bílými px s těmito intenzitami se nahradí černými Histogram intenzit všech px v obrázku Vznikne binární obraz. 0 255

Analýza plochy částic Label Area Mean StdDev Min Max MinThr MaxThr 1 C2-14H1yr 20449.000 130.143 127.473 0 255 0 255

Jak obrázky ukládat? Rastrové formáty obraz je mřížka pixelů tzn. při geometrické transformaci může dojít k převzorkování a tím i ztrátě informací PNG, TIFF, GIF, JPG, BMP, XCF (GIMP2), MBD a LSM (specifické formáty mikroskopů). Vektorové formáty obraz je geometrický popis objektů tzn., že při geometrické transformaci se mění pouze geometrické parametry objektů a objekty lze zobrazit v jakémkoliv měřítku.svg (Inkscape), CDR (CorelDRAW), PPT (PowerPoint) Součástí obrazového souboru jsou doplňující informace o obrazových datech - metadata

Děkuji za pozornost Jindřiška Angelini budova B, 2. patro, 232d, 207 Tel.č. 220444341 jinmat@centrum.cz