Řasový test ekotoxicity na mikrotitračních destičkách 1 Účel Řasové testy toxicity slouží k testování možných toxických účinků látek a vzorků na vodní producenty. Zelené řasy patří do skupiny necévnatých rostlin hojně se vyskytujících v našich vodách a představujících důležitý článek potravního řetězce. Test umožňuje sledovat nejen inhibiční (toxické) účinky látek, ale také stimulační efekty, tzv. úživnost. Díky rychlému nárůstu řas je možné kromě akutního působení pozorovat i chronické účinky testovaných látek. Řasový mikrobiotest je miniaturizovanou formou klasického řasového biotestu. Na místo Erlenmayerových baněk se pro kultivaci řasové suspenze používají mikrotitrační destičky. Tím je výrazně snížena spotřeba kultivačních médií, ale především je omezeno potřebné množství testovaného vzorků, jež často bývá limitující pro provedení testu. 2 Charakteristika testu Test spočívá v měření nárůstu koncentrace biomasy řas v jednotlivých testovaných koncentracích toxického vzorku ve srovnání s kontrolou tvořenou řasovým živným médiem. Řasy jsou kultivovány za stálých světelných i teplotních podmínek. Dle doby expozice lze test uspořádat jako akutní (cca 72 hodin), semichronický (cca 96 hodin) či chronický (více než 96 hodin). V případě provádění testu na mikrotitračních destičkách je koncentrace biomasy stanovována s pomocí UV/VIS spektrometrie. Existují dva možné přístupy k měření, přičemž oba mají své výhody i nevýhody. Buď se měří absorbance při vlnové délce 671 nm odpovídající množství chlorofylu, nebo se měří zákal při 750 nm. Metoda stanovení chlorofylu má výhodu v tom, že není zatížena nepřesností v důsledku přítomnosti bakterií a nerozpuštěných částic, jež se mohou vyskytnout u nesterilních vzorků z životního prostředí. Metoda stanovení zákalu je naopak někdy upřednostňována na základě předpokladu, že se koncentrace chlorofylu v buňce vlivem fyziologických pochodů přirozeně mění. Zákal tedy přesněji popisuje množství buněk v suspenzi. Je však nutné brát v úvahu, že jednotlivé buňky se liší velikostí a tím se i mění hodnota zákalu (absorbance při 750 nm). Zákal lze také konvertovat na sušinu, která lépe vypovídá o celkovém objemu řas v roztoku, protože v sobě nezahrnuje rozdíly ve velikosti buněk. Pro různé druhy řas a různé podmínky kultivace je třeba sestrojit samostatnou konverzní křivku. Na základě konverzní křivky se naměřená absorbance převede na koncentraci buněk v roztoku a vyhodnotí se inhibice růstu biomasy řas. 1
3 Materiál 3.1 Testovací Organismus Desmodesmus subspicatus 3.2 Vzorek Čistá chemická látka ZnSO4.7H2O 3.3 Přístroje a pomůcky Termoluminostat (kultivační komora zajišťující stálé osvětlení a konstantní teplotu), laminární flow-box (zařízení pro práci ve sterilním prostředí), mikroskop + počítací komůrka Cyrrus, mikrotitrační destička (96 jamek), automatické pipety, odměrné baňky, kádinky, UV/VIS spektrofotometr 3.4 Živné médium Tabulka 1 Složení média pro kultivaci sladkovodních řas (makroprvky) chemikálie Koncentrace [mg/l] NaNO 3 467 Ca(NO 3) 2 4H 2O 59 K 2HPO 4 31 MgSO 4 7H 2O 25 Na 2CO 3 21 FeCl 3 1 koncentrace [ml/l] Gaffronův roztok 0,08 Tabulka 2 Gaffronův roztok (mikroprvky) Chemikálie Koncentrace [mg/l] H3BO3 3100 MnSO4.4H2O 2230 Na2VO4.2H2O 33 (NH4)6Mo7O24.4H2O 88 KBr 119 KI 83 ZnSO4.7H2O 287 Cd(NO3)2. 4H2O 154 Co(NO3)2. H2O 146 CuSO4.5H2O 125 NiSO4.(NH4)2SO4.6H2O 198 Cr(NO3)3.7H2O 37 V2O4(SO4)3.16H2O 35 Al2(SO4)3. K2SO4.24H2O 474 2
4 Obsah práce 1. den laboratorní práce účel a podstata testu kultivace řas podmínky kultivace práce s mikroskopem sterilizace pomůcek autoklávování určení koncentrace zásobní kultury řas výpočet dávkování toxikantu, řasového média a inokula příprava testovaných koncentrací toxikantu dávkováni inokula řas začátek expozice 2. den laboratorní práce určení koncentrace řasové suspenze v exponovaných kulturách zpracování výsledků a závěrečného protokolu 5 Pracovní postup Obecné zásady: Práce se zásobní kulturou řas 1 by měla probíhat sterilně s pomocí vysterilizovaného náčiní ve sterilním prostředí tak, aby nedošlo ke kontaminaci kultury řasovými buňkami z okolí. 1. den laboratorní práce 1. Vysterilizujte potřebné laboratorní náčiní a roztoky v autoklávu po dobu 20 minut. (kultivační médium, pipetové špičky, ) připraveno asistentem. 2. Určete v mikroskopu koncentraci buněk v zásobní kultuře řas 2. 3. V tomto kroku je třeba připravit testovací roztoky obsahující určitou koncentraci řasových buněk a zároveň určitou koncentraci toxikantu. Tyto roztoky se připravují ze zásobního roztoku kontaminantu, kultivačního média (ředící voda) a suspenze řas (koncentrace je stanovena v bodě 2). Zvažte způsob ředění roztoků tak aby bylo: a. dosaženo koncentrační řady kontaminantu. K dispozici budete mít: pipety, odměrné baňky o objemu 10 ml a kádinky o objemech 5 a 25 ml. 1 Zásobní kultury řas se pěstují v zábrusových baňkách za stálé aerace. Přiváděný vzduch je nejprve čištěn na bakteriálním filtru od řas či bakterií volně poletujících v okolním prostředí, poté je veden přímo do řasové suspenze. Přívodem vzduchu je kultuře dodáván dostatek CO2 nutný pro její růst. 2 Koncentrace se stanovuje v počítací komůrce Cyrus II. Spočívá v nanesení vrstvy roztoku zásobní kultury řas o konstantní mocnosti (0,05 mm) na sklíčko s rastrem (čtvercová pole o ploše 0,04 mm 2 uspořádaná v řadách a sloupcích jako na čtverečkovaném papíře). Pod mikroskopem je spočítán počet buněk na několika čtvercových polích a s pomocí známé plochy pole a známé mocnosti vrstvy je počet převeden na koncentraci. 3
b. v každém roztoku dosaženo stejné koncentrace inokula řas a to 160 000 buněk na mililitr (b/ml) 4. Do jamek mikrotitrační destičky nadávkujte připravené roztoky v objemech 0,25 ml do jedné jamky. Každá koncentrace bude nadávkována v šesti opakováních. 5. Připravte koncentrační řadu toxikantu bez inokula řas a rovněž dávkujte na mikrotitrační destičku. Řadu kontaminantu nadávkujte jen ve dvou opakováních. 6. Destičku opatřete víčkem a umístěte do termoluminostatu s podmínkami 27 ± 2 C, 6 000-10 000 lux. 2. den laboratorní práce 1. Po akutní době expozice (cca 72 hodin) vyjměte destičky z termoluminostatu a změřte s pomocí spektrofotometru absorbanci při vlnových délkách 671 nm a 750 nm v každé z použitých jamek. 2. S pomocí dodané křivky konverze převeďte koncentraci absorbance na koncentraci buněk. 3. Vypočtěte růstové rychlosti pro jednotlivé koncentrace toxikantu a kontroly dle vztahu č. 1. kde je: µ specifická růstová rychlost [h -1 ] (1) kde je t tl t0 xl x0 čas [h] doba konce testu doba počátku testu hustota (koncentrace) buněk na konci testu [b/ml] hustota (koncentrace) buněk na počátku testu [b/ml] 4. Vypočítejte inhibici růstové rychlosti pro každou koncentraci a každé paralelní opakování toxikantu dle vztahu č. 2. Kde je: Iµi inhibice specifické růstové rychlosti pro koncentraci i [%] (2) 4
µi specifická růstová rychlost pro zkoušenou koncentraci i [h -1 ] µc průměrná specifická růstová rychlost v kontrole [h -1 ] 5. S pomocí asistenta vypočítejte ve vhodném programu pro statistické zpracování dat indexy toxicity. 6 Použité literatura ČSN EN ISO 8692. Jakost vod Zkouška inhibice růstu sladkovodních zelených řas. 5