Řasový test toxicity

Transkript

1 Laboraorní návod č. Úsav hemie ohrany prosředí, VŠCHT v Praze Řasový es oxiiy. Účel Řasové esy oxiiy slouží k esování možnýh oxikýh účinků láek a vzorků na vodní produeny. Zelené řasy paří do skupiny neévnaýh roslin hojně se vyskyujííh v naših vodáh a předsavujííh důležiý článek poravního řeěze. Tes umožňuje sledova nejen inhibiční (oxiké) účinky láek, ale aké simulační efeky, zv. úživnos. Díky ryhlému nárůsu řas je možné kromě akuního působení pozorova i hroniké účinky esovanýh láek.. Charakerisika esu Tes spočívá v měření nárůsu konenrae biomasy řas v jednolivýh esovanýh konenraíh oxikého vzorku ve srovnání s konrolou vořenou řasovým živným médiem. Řasy jsou kulivovány za sálýh svěelnýh i eploníh podmínek. Dle doby expozie lze es uspořáda jako akuní (a 7 hodin), semihroniký (a 96 hodin) či hroniký (víe než 96 hodin). Zásobní kulury řas se pěsují v zábrusovýh baňkáh za sálé aerae. Přiváděný vzduh je nejprve čišěn na bakeriálním filru od řas či bakerií volně poleujííh v okolním prosředí, poé je veden přímo do řasové suspenze. Přívodem vzduhu je kuluře dodáván dosaek CO nuný pro její růs. 3. Maeriál a meodika 3. Tesovaí organizmus Desmodesmus subspiaus (dříve Senedesmus subspiaus) 3. Živné médium a vzorek Tesovaný vzorek - rozok neznámé láky Živné médium - řasové médium pro kulivai řas se skládá z deionizované vody a do ní nadávkovanýh předepsanýh konenraí určiýh solí (viz Tab. I, Tab. I) 3.3 Přísroje a pomůky Termoluminosa (kulivační komora zajišťujíí sálé osvělení a konsanní eplou) Laminární flow-box (zařízení pro prái ve serilním prosředí) Mikroskop s počíaí komůrkou Cyrrus ulivační Erlenmayerovy baňky Buničinové záky uomaiké pipey Orbiální řepačka

2 Laboraorní návod č. Úsav hemie ohrany prosředí, VŠCHT v Praze Tab. I ulivační médium Chemikálie onenrae [mg/l] NaNO3 467 Ca(NO3) 4HO 59 HPO4 3 MgSO4 7HO 5 NaCO3 FeCl3 konenrae [ml/l] Gaffronův,8 rozok Tab. II Rozok sopovýh prvků podle Gaffrona Chemikálie onenrae [mg/l] H3BO3 3 MnSO4 4HO 3 NaVO4 HO 33 (NH4)6Mo7O4 4HO 88 Br 9 I 83 ZnSO4 7HO 87 Cd(NO3) 4HO 54 Co(NO3) HO 46 CuSO4 5HO 5 NiSO4 (NH4)SO4 6HO 98 Cr(NO3)3 7HO 37 VO4(SO4)3 6HO 35 l(so4)3 SO4 4HO 474

3 Laboraorní návod č. Úsav hemie ohrany prosředí, VŠCHT v Praze 4. Obsah práe. den laboraorní práe Účel a podsaa esu ulivae řas, podmínky kulivae Práe s mikroskopem Serilizae pomůek, auoklávování Určení konenrae zásobní kulury řas Výpoče dávkování oxikanu, řasového média a inokula Příprava esovanýh konenraí oxikanu Dávkováni inokula řas Začáek expozie. den laboraorní práe 5. Úkol Určení konenrae řasové suspenze v exponovanýh kuluráh Zpraování výsledků Sanove experimenálně oxiké účinky rozoku neznámé láky na řasovou kuluru. Určee křivky konenrae-odpověď pro následujíí odezvy esu: Inhibie růsové ryhlosi řas (inerval - 7 hodin) Inhibie nárůsu biomasy (plohy pod růsovou křivkou (inerval - 7 hodin). Vypočíeje indexy oxiiy pro jednolivé odezvy esu. 6. Praovní posup. den laboraorní práe Vyserilizuje pořebné laboraorní náčiní v auoklávu po dobu minu. Následujíí laboraorní náčiní je řeba vyserilizova: 5 ml Erlenmayerovy baňky, kulivační médium, pipeové špičky, buničinové záky. Ukázka práe s mikroskopem, počíaí komůrky. Určee v mikroskopu konenrai buněk v zásobní kuluře řas. Pozorováním v mikroskopu se určí poče buněk ve čveríh. Ze známého objemu jednoho čvere se přepoče získaný průměrný údaj o poču buněk ve čveríh na konenrai řas v ml. Vypočěe množsví inokula řas, keré je řeba dávkova do esované konenrae oxikanu o objemu 5 ml ak, aby počáeční konenrae řas v baňkáh byla 8 ks/ml. Vypočěe, jaká množsví oxikanu a ředíího media budou řeba pro přípravu esované konenrační řady. Objem ředíího média zmenšee o objem inokula řas. 3

4 Laboraorní návod č. Úsav hemie ohrany prosředí, VŠCHT v Praze Do kulivačníh baněk nadávkuje určené objemy ředíího média a oxikanu pro všehny esované konenrae a pro konrolu (pouze živné medium). Na závěr přideje sejné objemy řasového inokula. Baňky uzavřee serilními zákami z buničiny. Umísěe kulivační baňky do ermoluminosau s podmínkami 7 ± C, 6 lux - lux.. den laboraorní práe Po akuní době expozie (a 7 hodin) odebere kapákem po důkladném prořepání kulivační baňky vzorek řasové kulury a v mikroskopu určee konenrai řasové suspense. Sesroje graf růsovýh křivek po době expozie 7 hodin. Vypočěe růsové ryhlosi pro jednolivé konenrae oxikanu dle následujíího vzore. ln N 7 ln N N N7 konenrae buněk řas na začáku esu (8 ks/ml) konenrae buněk řas po době expozie 7 hodin doba expozie (7 hodin) Vypočěe inhibie (simulae) v % pro jednolivé konenrae oxikanu dle následujíího vzore. Je-li výsledná inhibie záporná, jedná se o simulai. I I růsová ryhlos v konrole růsová ryhlos konenrae inhibie růsu v % pro konenrai oxikanu Sesroje křivku konenrae odpověď pro zjišěné hodnoy inhibi. Vynese do grafu závislos inhibie na dekadikém logarimu konenrae. S použiím získanýh da inhibií vypočěe indexy oxiiy NOEC, LOEC s použiím programu GraphPad InSa. Ploha pod růsovou křivkou odpovídá elkovému nárůsu biomasy. Dle následujíího vzore určee plohy pod růsovými křivkami v jednolivýh kuluráh včeně konroly. 4

5 Laboraorní návod č. Úsav hemie ohrany prosředí, VŠCHT v Praze ( ) ( ) ( ) ( n n ) ( n n ) n ploha pod růsovou křivkou pro danou konenrai počáeční konenrae řas [ks/ml] změřená konenrae řas v čase [ks/ml] změřená konenrae řas v čase n [ks/ml] doba prvního měření od počáku esu [hod] doba n-ého měření od počáku esu [hod] Z hodno ploh pod jednolivými křivkami určee % inhibie pro jednolivé esované konenrae. I I k inhibie růsu biomasy v % pro konenrai oxikanu i průměrná ploha pod růsovou křivkou u konroly průměrná ploha pod růsovou křivkou u esované konenrae i Rozšiře původní graf konenrae odpověď pro růsové ryhlosi I o křivku konenrae odpověď pro plohy pod křivkou. S použiím získanýh da inhibií vypočěe indexy oxiiy NOEC, LOEC s použiím programu GraphPad InSa. 7. Použiá lieraura ČSN EN (5): Jakos vod. Zkouška inhibie růsu sladkovodníh řas. ČNI Praha. 5