Teoretické základy a klinická praxe Biologická léčiva Martin Fusek, Libor Vítek, Jaroslav Blahoš jr., Marián Hajdúch, Tomáš Ruml a kolektiv Martin Fusek, Libor Vítek, Jaroslav Blahoš jr., Marián Hajdúch, Tomáš Ruml a kolektiv Biologická léčiva Teoretické základy a klinická praxe
Martin Fusek, Libor Vítek, Jaroslav Blahoš, Marián Hajdúch, Tomáš Ruml a kolektiv Biologická léčiva Teoretické základy a klinická praxe Grada Publishing
Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována a šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno. prof. Ing. Martin Fusek, CSc., prof. MUDr. Libor Vítek, CSc., MBA, doc. MUDr. Jaroslav Blahoš, PhD., doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D., prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc. a kolektiv Biologická léčiva Teoretické základy a klinická praxe Kolektiv autorů: doc. MUDr. Jaroslav Blahoš, PhD., doc. Mgr. Jiří Drábek, PhD., prof. Ing. Martin Fusek, CSc., doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D., MUDr. Martin Halad, MUDr. Eva Konířová, prof. MUDr. Jan Kvasnička, DrSc., prof. MUDr. Milan Lukáš, CSc., MUDr. Věra Malinová, MUDr. Robert Pytlík, doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D., prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc., prof. MUDr. Jan Škrha, DrSc., doc. MUDr. Ivan Špička, Ph.D., MUDr. Martin Tichý, Ph.D., RNDr. Radek Trojanec, Ph.D., doc. MUDr. Petr Urbánek, CSc., prof. MUDr. Jiří Vencovský, DrSc., prof. MUDr. Libor Vítek, CSc., MBA Recenze: Prof. MUDr. Vladimír Geršl, CSc. Prof. RNDr. Václav Hořejší, CSc. Prof. MUDr. Pavel Klener, DrSc. TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE: Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s. Grada Publishing, a.s., 2012 Cover Photo allphoto, 2012 Vydala Grada Publishing, a.s. U Průhonu 22, Praha 7 jako svou 4760. publikaci Odpovědný redaktor Mgr. Luděk Neužil Obrázky překreslil dle předloh autorů MgA. Radek Krédl. Sazba a zlom MgA. Radek Krédl Fotografie a obrázky dodali autoři. Počet stran 224 + 4 strany barevné přílohy 1. vydání, Praha 2012 Vytiskla Těšínská tiskárna, a.s., Český Těšín Autoři a nakladatelství děkují společnostem Celgene s.r.o. a AstraZeneca Czech Republic s.r.o. za podporu, která umožnila vydání publikace. Názvy produktů, firem apod. použité v této knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno. Postupy a příklady v knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky. ISBN 978-80-247-3727-0 (Grada Publishing, a. s.) ISBN 978-80-7080-810-8 (Vysoká škola chemicko-technologická v Praze; vydavatelství) ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE: ISBN 978-80-247-7872-3 (pro formát PDF) ISBN 978-80-247-7873-0 (pro formát EPUB)
Obsah Obsah Seznam autorů....................................................... 9 Seznam zkratek...................................................... 10 Předmluva....................................................... 15 1 Biotechnologie a farmaceutický průmysl (M. Fusek, T. Ruml)........... 17 1.1 Vymezení pojmů biologická léčiva, biotechnologie, biosimilars, orphan drugs a základní poznámky k názvosloví biologických léčiv......... 17 1.2 Historický vývoj a postavení biologických léčiv na trhu............. 20 1.3 Specifika biologických léčiv..................................... 24 1.4 Základní přístupy vývoje a výroby biologických léčiv............... 30 1.4.1 Exprese v bakteriích...................................... 31 1.4.2 Exprese v kvasinkách..................................... 33 1.4.3 Exprese v tkáňových kulturách............................. 34 1.4.4 Transgenní rostliny....................................... 39 2 Klinické využití biologických léčiv.................................. 42 2.1 Rekombinantní hormony a jejich využití v terapii (J. Blahoš)...... 42 2.1.1 Inzulin (J. Blahoš, J. Škrha)................................. 42 2.1.2 Glukagon (J. Blahoš)...................................... 47 2.1.3 Růstový hormon (J. Blahoš)................................ 47 2.1.4 Inzulinu podobný růstový faktor 1 (J. Blahoš)................ 52 2.1.5 Natriuretický hormon (J. Blahoš)........................... 52 2.1.6 Parathormon (J. Blahoš)................................... 53 2.1.7 Kalcitonin (J. Blahoš)..................................... 54 2.1.8 Gonadotropní hormony v léčbě neplodnosti (J. Blahoš, M. Halad).. 55 2.2 Krevní deriváty a jiné přípravky ovlivňující hemostázu vyrobené biotechnologickou metodou (J. Kvasnička)....................... 58 2.2.1 Koncentráty koagulačních faktorů k zástavě krvácení......... 59 2.2.2 Trombocytopenické krvácení.............................. 61 2.2.3 Inhibitory koagulace...................................... 61 2.2.4 Antikoagulancia.......................................... 61 2.2.5 Protidestičkové léky...................................... 62 2.2.6 Fibrinolytika............................................. 63 2.3 Využití biologických léčiv v terapii cytopenií.................... 65 2.3.1 Erytropoetin (I. Špička)................................... 65 2.3.2 G-CSF, růstový faktor pro granulocytární řadu (I. Špička)...... 69 2.3.3 Romiplostim (E. Konířová)................................ 71 2.4 Enzymy pro léčbu dědičně podmíněných poruch intermediárního metabolismu (V. Malinová).................................... 73 5
Biologická léčiva 2.4.1 Gaucherova choroba rekombinantní glukocerebrosidázy agluceráza, imigluceráza, velagluceráza..................... 75 2.4.2 Mukopolysacharidózy..................................... 76 2.4.3 Pompeho choroba glykogenóza II. typu.................... 77 2.4.4 Fabryho choroba......................................... 77 2.4.5 Nežádoucí účinky ERT.................................... 78 2.4.6 Situace v České republice.................................. 78 2.5 Využití biologické léčby u imunitně podmíněných či autoimunitních onemocnění.................................. 80 2.5.1 Obecný úvod (M. Fusek).................................. 80 2.5.2 Biologická léčiva v dermatologii (M. Tichý).................. 84 2.5.2.1 Etiologie a klinické projevy psoriázy.................. 84 2.5.2.2 Systémová terapie psoriázy.......................... 85 2.5.2.3 Biologická léčba psoriázy............................ 87 2.5.3 Biologická léčiva používaná v terapii idiopatických střevních zánětů (M. Lukáš)............................... 90 2.5.3.1 Léčiva užívaná v klinické praxi....................... 90 2.5.3.2 Klinická efektivita biologické léčby................... 91 2.5.3.3 Nevyřešené otázky................................. 93 2.5.3.4 Výhody a přednosti biologické léčby.................. 96 2.5.4 Biologická léčba zánětlivých revmatických onemocnění (J. Vencovský)............................................ 98 2.5.4.1 Strategie léčby zánětlivých revmatických onemocnění... 99 2.5.4.2 Přehled biologických léků a jejich použití v revmatologii.. 99 2.6 Biologická léčiva využívaná v léčbě roztroušené sklerózy (J. Blahoš) 109 2.6.1 Terapie roztroušené sklerózy............................... 109 2.6.2 Biologická léčiva v terapii RS............................... 109 2.7 Biologická léčba v onkologii (M. Hajdúch, R. Pytlík).............. 111 2.7.1 Cytokiny v léčbě nádorových onemocnění (M. Hajdúch)....... 111 2.7.2 Protinádorové enzymy (M. Hajdúch)........................ 113 2.7.3 Obecná farmakologie protinádorových terapeutických protilátek (M. Hajdúch)............................................ 114 2.7.3.1 Historie terapeutického použití monoklonálních protilátek v onkologii........................................ 114 2.7.3.2 Funkce imunoglobulinů a mechanismy cytotoxického účinku monoklonálních protilátek................... 115 2.7.3.3 Farmakologické aspekty imunoterapie monoklonálními protilátkami v onkologii............................ 115 2.7.3.4 Chimérické, humanizované a lidské monoklonální protilátky......................................... 117 2.7.3.5 Fragmenty protilátek............................... 118 2.7.3.6 Nekonjugované protilátky........................... 118 2.7.3.7 Protilátkové konjugáty.............................. 120 6
Obsah 2.7.4 Biologická léčiva v hematoonkologii (R. Pytlík)............... 122 2.7.4.1 Rituximab........................................ 122 2.7.4.2 Altemtuzumab..................................... 126 2.7.4.3 Gemtuzumab ozogamicin........................... 128 2.7.4.4 Ibritumomab tiuxetan.............................. 129 2.7.4.5 Ofatumumab...................................... 131 2.7.5. Monoklonální protilátky v léčbě solidních nádorů (M. Hajdúch)............................................ 132 2.7.5.1 Trastuzumab...................................... 132 2.7.5.2 Cetuximab....................................... 133 2.7.5.3 Panitumumab..................................... 134 2.7.5.4 Bevacizumab...................................... 135 2.8 Význam biomarkerů pro indikaci cílené biologické léčby v onkologii (M. Hajdúch, J. Drábek, R. Trojanec).................. 137 2.8.1 Nádorové markery v onkologii............................. 138 2.8.2 Prognostické a prediktivní faktory.......................... 139 2.8.2.1 Gen EGFR a jeho význam v predikci léčebné odpovědi u nádorů plic..................................... 140 2.8.2.2 Gen HER2 jako prognostický i prediktivní marker s možností cílené léčby u nádorů prsu a žaludku....... 146 2.8.2.3. Další příklady prediktivních vyšetření v onkologii..... 148 2.9 Využití biologických léčiv v léčbě virových hepatitid (P. Urbánek).. 150 2.9.1 Interferony.............................................. 150 2.9.1.1 Konvenční interferony.............................. 150 2.9.1.2 Nežádoucí účinky konvenčního interferonu-α......... 151 2.9.1.3 Modifikované interferony........................... 153 2.9.1.4 Nežádoucí účinky pegylovaných IFN................. 155 2.9.1.5 Albumin IFN...................................... 156 2.9.2 Základy protivirové terapie................................ 157 2.9.2.1 Virová hepatitida B................................ 157 2.9.2.2 Virová hepatitida C................................ 159 3 Moderní přístupy k vakcinaci (M. Raška)............................. 163 3.1 Pasivní imunizace............................................. 163 3.2 Využití monoklonálních protilátek v terapii infekčních onemocnění... 168 3.3 Aktivní imunizace............................................ 169 3.4 Vakcíny v klinické praxi....................................... 170 3.4.1 Živé atenuované vakcíny.................................. 170 3.4.2 Inaktivované (usmrcené) vakcíny........................... 172 3.4.3 Podjednotkové vakcíny................................... 174 3.4.4 Rekombinantní proteinové vakcíny......................... 175 3.4.5 Rekombinantní viry kódující vakcinační antigen.............. 176 3.5 Klinicky používaná adjuvans................................... 176 7
Biologická léčiva 3.6 Klinicky používané nosiče a ostatní pomocné látky................ 179 3.7 Vakcíny v klinických studiích a experimentu...................... 180 3.8 Experimentální adjuvans, nosiče a pomocné látky................. 185 4 Zneužívání biologických léčiv (L. Vítek).............................. 189 4.1 Příklady hlavních biotechnologicky připravovaných dopingových látek............................................ 190 4.1.1 Anabolické steroidy a další látky s anabolickými účinky....... 190 4.1.2 Látky stimulující erytropoézu.............................. 193 4.1.3 Genový doping.......................................... 194 5 Výhledy do budoucna genová terapie a léčiva na bázi DNA (M. Fusek).. 196 5.1 Léčiva na bázi antisense oligonukleotidů....................... 197 Doslov............................................................. 199 Výrobci biologických léčiv zmíněných v textu......................... 200 Rejstřík............................................................. 206 Souhrn............................................................. 217 Summary........................................................... 219 8
Seznam autorů Seznam autorů Doc. MUDr. Jaroslav Blahoš, Ph.D. Ústav molekulární genetiky AV ČR, Praha Doc. Mgr. Jiří Drábek, Ph.D. Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP a FN, Olomouc Prof. Ing. Martin Fusek, CSc. Vysoká škola chemicko-technologická, Praha Doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D. Ústav molekulární a translační medicíny LF UP a FN, Olomouc MUDr. Martin Halad Gynekologicko-porodnické oddělení FTNsP, Praha MUDr. Eva Konířová I. interní klinika klinika hematologie 1. LF a VFN, Praha Prof. MUDr. Jan Kvasnička, DrSc. 1. interní klinika a Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN, Praha Prof. MUDr. Milan Lukáš, CSc. IBD ISCARE a Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK, Praha MUDr. Věra Malinová Klinika dětského a dorostového lékařství 1. LF UK a VFN, Praha MUDr. Robert Pytlík I. interní klinika klinika hematologie 1. LF UK a VFN, Praha Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Ústav imunologie LF UP, Olomouc Prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc. Vysoká škola chemicko-technologická, Praha Prof. MUDr. Jan Škrha, DrSc. III. interní klinika 1. LF UK a VFN, Praha Doc. MUDr. Ivan Špička, Ph.D. I. interní klinika klinika hematologie 1. LF a VFN, Praha MUDr. Martin Tichý, Ph.D. Klinika chorob kožních a pohlavních LF UP a FN, Olomouc RNDr. Radek Trojanec, Ph.D. Ústav molekulární a translační medicíny LF UP a FN, Olomouc Doc. MUDr. Petr Urbánek, CSc. Interní klinika 1. LF UK a ÚVN, Praha Prof. MUDr. Jiří Vencovský, DrSc. Revmatologický ústav a Revmatologická klinika 1. LF UK, Praha Prof. MUDr. Libor Vítek, CSc., MBA IV. interní klinika a Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN, Praha 9
Biologická léčiva Seznam zkratek ADCC ACE ACP ACR AML ANA APC APTT ARDS AS ASA ASB ASCO ATKD BAD BFU-E BHK buňky BSA BSE CD20 CDC CDR CERA CFA CFAR CFIA CFU-E CHO buňky CHOP CIN CLL CN antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (cytotoxická aktivita závislá na protilátkách) angiotensin 1 converting enzyme (angiotenzin 1 konvertující enzym) acid phosphatase (kyselá fosfatáza) American College of Rheumatology akutní myeloidní leukémie antinuclear antibody (protilátky proti buněčným jádrům) aktivovaný protein C activated partial thromboplastin time (aktivovaný parciální tromboplastinový čas) acute respiratory distress syndrome (syndrom akutní respirační tísně) ankylozující spondylitida acetyl salicylic acid (kyselina acetylsalicylová) arylsulfatáza B American Society of Clinical Oncology autologní transplantace kostní dřeně The British Association of Dermatologists burst forming unit-e (explodující/expandující kolonie tvořící jednotky erytroidních buněk) baby hamster kidney (buňky z ledviny mláděte křečka) body surface area (plocha povrchu těla) bovinní spongiformní encefalopatie povrchový antigen B-lymfocytů CD20 complement dependent cytotoxicity (komplementem zprostředkovaná cytotoxicita) complementarity determining region (oblast určující komplementaritu např. protilátky) continuous erythropoiesis receptor activator (kontinuální aktivátor receptoru pro erytropoézu) complete Freund adjuvans (kompletní Freundovo adjuvans) režim cyklofosfamid, fludarabin, alemtuzumab, rituximab Canadian Food Inspection Agency colony forming unit-e (kolonie formující jednotka erytroidních buněk) chineese hamster ovary (buňky z vaječníku čínského křečka) režim cyklofosfamid, adriamycin, vinkristin, prednison chemoterapií indukovaná neutropenie chronická lymfocytární leukémie Crohnova nemoc 10
Seznam zkratek CSF CTLA-4 CVP DAA DAS DC DEAE DHFR DIC DI-SLE DLQI DM DM DMARD DMSO DS EASL ECT EGFR ELISA EMEA (EMA) EORTC EPO ERT ESA ETVR etpo FACS FC FCM FDA FISH FluCam FN colony stimulating factor (kolonie stimulující faktor) cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (cytotoxický T-lymfocytární antigen 4) režim cyklofosfamid, vinkristin, prednison directly acting antivirals (přímo působící antivirotika) disease activity score (stupeň aktivity nemoci) dendritic cells (dendritické buňky) dietylaminoetyl dihydrofolátreduktáza disseminated intravascular coagulation (syndrom diseminované intravaskulární koagulace) drug-induced systemic lupus erythematodes (léky indukovaný systémový lupus erythematodes) dermatology life quality index (dermatologický index kvality života) diabetes mellitus dermatomyozitida disease modifying antirheumatic drugs (nemoc modifikující antirevmatika) dimetylsulfoxid dermatansulfát European Association for the Study of the Liver (Evropská společnost pro studium jater) ecarin clotting time (doba srážení po podání ecarinu) epidermal growth factor receptor (receptor pro epidermální růstový faktor) enzyme-linked immuno sorbent assay (enzymová imunoanalýza na pevné fázi) European Medicine Agency European Organisation for the Treatment and Research of Cancer erytropoetin enzyme replacement therapy (enzymová substituční terapie) erythropoesis stimulating agens (erytropoézu stimulující látky) end of treatment virological response (virologická odpověď na konci léčby) endogenní trombopoetin fluorescence-activated cell sorting (separace buněk pomocí fluorescenční průtokové cytometrie) režim fludarabin, cyklofosfamid režim fludarabin, cyklofosfamid, mitoxantron Food and Drug Administration fluorescenční in situ hybridizace režim fludarabin, alemtuzumab febrilní neutropenie 11
Biologická léčiva FOB follow on biologics FSH follicle stimulating hormone (folikuly stimulující hormon) GAG glykosaminoglykany G-CSF granulocyte colony stimulating factor (faktor stimulující granulocytární kolonie) G-CSF receptor granulocyte colony stimulating factor receptor (receptor pro faktor stimulující granulocytární kolonie) GHRH growth hormone releasing hormone (hormon uvolňují růstový hormon) GHRP growth hormone releasing peptides (peptidy uvolňující růstový hormon) GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (faktor stimulující makrofágové a granulocytární kolonie) GC-IRMS gas chromatography-isotope ratio mass spectrometry (plynová chromatografie s detekcí poměru izotopů pomocí hmotové spektrometrie) GSD II glycogen storage disease (glykogenóza typu II) HACA human anti-chimeric antibodies (lidské antichimérické protilátky) HAMA human anti-mouse antibodies (lidské protilátky proti myším protilátkám) HAV virus hepatitidy A HBV virus hepatitidy B hcg human choriogonadotropin (lidský choriový gonadotropin) HCV virus hepatitidy C HER2 human epidermal growth factor receptor 2 (receptor 2 pro lidský epidermální růstový faktor) hgh human growth hormon (lidský růstový hormon) HIF-1α či HIF-2α hypoxia inducible factor (hypoxií indukovaný transkripční faktor) HIV human imunodeficiency virus (virus lidské imunodeficience) HPH hygromycinfosfotransferáza HPLC high performace liquid chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) HPV human papiloma virus (lidský papilomavirus) HS heparansulfát IBD inflammatory bowel disease (idiopatický střevní zánět) IGF-1 a 2 inzulin-like growth factor 1 a 2 (inzulinu podobný růstový faktor) IGFBP inzulin-like growth factor binding protein (protein vážící se na IGF) IHN infectious hematopoietic necrosis (infekční nekróza krvetvorné tkáně) IFN-γ interferon gamma (a další interferony IFN-x) IL-2 interleukin 2 (a další interleukiny IL-x) IOC International Olympic Commitee (Mezinárodní olympijský výbor) IPTG isopropyl-β-d-galaktopyranozid IRMA immuno radiometric assay (imunoradiometrická analýza) 12
Seznam zkratek IRIV ITP IVF IVIG JIA LCM KLH LH LK LSD mab MDP MPL MPS MTP-PE MTX MVA NSCLC NYHA I-IV NYVAC OMPC OLT PAI-1 PASI PCI PEG PM PML PRCA prgcd PsA PSA RA r-hu RIA RS RSV immunopotentiating reconstituted influenza virus virosome imunní trombocytopenie in vitro fertilization, (mimotělní fertilizace) intravenózní imunoglobuliny juvenilní idiopatická artritida laser capture microdissection (laserová záchytná mikrodisekce) keyhole limpet hemocyanin (hemocyanin z organismu Diodora aspersa) luteinizing hormone (luteinizační hormon) levá komora lysosomal storage disease (lyzozomální střádavé onemocnění) monoklonální protilátky muramyldipeptid monophosphoryl lipid A mukopolysacharidóza muramyltripeptidfosfatidyletanolamin metotrexát modified vaccinia virus Ankara non-small-cell lung cancer (nemalobuněčný karcinom plic) New York Hearth Association (klasifikace srdečního selhaní podle newyorkské srdeční asociace) New York vaccinia virus outer membrane protein komplex (zevní membránový proteinový komplex) orthotropic liver transplantation (ortotopická jaterní transplantace) plasminogen activator inhibitor 1 (inhibitor aktivátoru plazminogenu) psoriasis area severity index (index plochy postižení a závažnosti psoriázy) perkutánní koronární intervence polyetylenglykol polymyozitida progresivní multifokální leukoencefalopatie pure red cell aplasia (čistá aplazie červené krevní řady) plant-derived recombinant glucocerebrosidase (rekombinantní glukocerebrosidáza produkovaná v rostlinách) psoriatická artritida prostatický specifický antigen revmatoidní artritida recombinant human (lidský rekombinanantní) radio immuno assay radioimunoanalýza roztroušená skleróza respirační syncytiální virus 13
Biologická léčiva SARS SIRS SiS SK SLE SRT SSc SVR TAFI TNF-α t-pa TPO TPO-R UC USDA VEGF VIP VLP WADA WNV severe acute respiratory syndrome (syndrom akutního respiračního selhání) systemic inflammatory response syndrome (syndrom systémové zánětlivé odpovědi organismu) Sjögrenův syndrom streptokináza systémový lupus erythematodes substrát redukční terapie systémová sklerodermie sustained virologic response (setrvalá virologická odpověď) thrombin activated fibrinolysis inhibitor (trombinem aktivovaný inhibitor fibrinolýzy) tumor necrosis factor α, β (tumorový nekrotický faktor) tissue plasminogen activator (tkáňový aktivátor plazminogenu) trombopoetin TPO receptor ulcerózní kolitida United States Department of Agriculture vascular endothelial growth factor (vaskulární endotelový růstový faktor) vazoaktivní intestinální peptid virus like particles (virům podobné částice) World Antidoping Agency (Světová antidopingová agentura) West Nile virus (virus západonilské horečky) 14
Předmluva Předmluva Vážení čtenáři, dostává se vám do rukou publikace zaměřená na problematiku biologické léčby. Sám pojem biologická léčba vyvolává určitý rozpor dříve nebyla biologická léčba, když se podávaly a podávají extrakty získané z rostlin či jiných přírodních materiálů? Biologickou léčbu dnes vnímáme jako léčbu ovlivňující regulační mechanismy v buňce na různých úrovních. Jsou to enzymy, hormony, regulační molekuly ovlivňující receptory či signální kaskády, monoklonální protilátky, které jsou připraveny biotechnologickým postupem s vizí v budoucnu využívat modifikované nukleové kyseliny. Tato monografie shrnuje současné poznání o biologické léčbě, její definici, biotechnologické postupy získávání účinných přípravků. Popisuje využití látek v různých oblastech medicíny podávání hormonů inzulin, PTH, krevních derivátů regulujících koagulační kaskádu či využití různých forem erytropoetinu při léčbě anémií. Další část je věnována moderním přípravkům používaných v onkologii, dermatologii, léčbě roztroušené sklerózy či vzácných onemocnění, jako je třeba Fabryho choroba. Velký význam v biologické léčbě mají monoklonální protilátky se širokým uplatněním nejen v léčbě vybraných nádorových onemocnění. Je si třeba uvědomit, že biologická léčba se významně podílí na léčbě idiopatických střevních zánětů, revmatoidní artritidy či hepatitid, ať jde o podávání interferonu či blokátorů TNF-α nebo dalších molekul. Další významnou oblastí využití biotechnologie je vakcinace chránící nejen proti infekčním chorobám, ale v současné době též proti vybraným nádorovým onemocněním. Autorům se podařilo připravit moderní knihu, která shrnuje současné poznatky z této velmi rychle rozvíjející se oblasti, kdy i kriticky hodnotí možná úskalí či rizika možného zneužití. Vždy si je třeba uvědomit, že léčba pacienta musí zahrnovat širokou paletu léčebných a diagnostických postupů včetně klasických např. chirurgická léčba přes podávání nebiologické léčby až po moderní a účinnou biologickou léčbu. Praha 19. září 2011 prof. MUDr. Tomáš Zima, DrSc., MBA 15
Biotechnologie a farmaceutický průmysl 1 1 Biotechnologie a farmaceutický průmysl Martin Fusek, Tomáš Ruml V předkládané publikaci jsme se pokusili o stručný pohled na důležitou a dynamicky se rozvíjející oblast léčiv na tzv. biologická léčiva. V textu čtenář nalezne krátkou úvodní část, která poskytne základní informace o tomto oboru z hlediska nomenklaturního, nastíní základní postupy vývoje a výroby těchto léčiv, zmíní ekonomické aspekty dané oblasti a zdůrazní molekulární, výrobní a legislativní rozdíly mezi léky nízkomolekulárními a léky připravenými biotechnologickými postupy. Druhá část je potom řazena z hlediska farmakologického a soustřeďuje se na hlavní biologická léčiva dostupná na českém, evropském či americkém trhu. V poslední části se věnujeme dalším aspektům biologických léčiv, jako například specifické diagnostice, či možnému zneužívání těchto látek. Biologická léčiva vstoupila na trh v roce 1982. Od té doby procházejí téměř exponenciálním vývojem a na rozdíl od ubývajícího počtu nových syntetických léčiv pozorujeme jejich stálý nárůst. V době vydání této knihy tvoří z hlediska prodejů biologická léčiva téměř 20 % všech prodaných léků a je předpoklad, že toto číslo se bude v následujících letech neustále zvyšovat. Na druhou stranu je třeba konstatovat, že náklady spojené s uvedením a dodáváním těchto léčiv na trh jsou vyšší než u syntetických, nízkomolekulárních léčiv. Biologická léčiva významným způsobem rozšiřují naše možnosti léčby ať již ve smyslu nových alternativ, či směrem ke zcela novým přístupům, a také při léčbě onemocnění, která jsou zatím bez kauzální terapie. Hlavní přístupy používané v oblasti, kterou anglicky psaná literatura nazývá biopharmaceuticals či biopharmacy, zahrnují širokou paletu léčebných metod, které můžeme rozdělit na přípravu specifických proteinů jejich expresí v hostitelském organismu (jako například náhrady chybějících peptidů či proteinů hormonů, enzymů krevní koagulace), stimulaci či naopak potlačení imunitního systému (využití interferonů pro léčbu virových onemocnění či imunosuprese při autoimunitních onemocněních), dále využití protilátek pro blokování funkce jiných proteinů, a to jak u autoimunitních onemocnění, tak v případě onkologických onemocnění, a v neposlední řadě nové přístupy k přípravě vakcín, dále xenotransplantace, použití uměle připravených biopolymerů, regenerativní medicínu, buněčné transplantace a genové terapeutické přístupy. 1.1 Vymezení pojmů biologická léčiva, biotechnologie, biosimilars, orphan drugs a poznámky k názvosloví biologických léčiv Biotechnologie a léčiva Biotechnologií se většinou rozumí výrobní proces, který závisí na funkci živého organismu, nebo na jeho části. Biotechnologie má velmi dlouhou historii (například v potravinářství). Rozvoj výrobních postupů, které závisí na funkci živých organismů 17
1 Biologická * léčiva nebo jejich částí se postupně rozšiřoval do mnoha oborů. Zavedením výroby antibiotik ve čtyřicátých letech 20. století se biotechnologie začala masově uplatňovat i ve farmaceutickém průmyslu. V současnosti jsou biotechnologické postupy základem celé řady farmaceutických výrob a můžeme je rozdělit na dva základní směry: (1) výroby, kde do produkčního (hostitelského) organismu není vnesena cizorodá genetická informace (výroba antibiotik, námelových alkaloidů, některých psychotropních látek /efedrin/, některých imunosupresivních látek /cyklosporin/, některých kancerostatik /doxorubicin/ aj.), (2) výroby, kdy požadovaný produkt je získán právě díky vnesené genetické informaci pro daný protein za využití genetického inženýrství (monoklonální protilátky, erytropoetin, faktory krevního srážení, gonadotropiny a další). Třetím směrem, který ale čeká na svůj rozvoj, je vnášení genetické informace přímo do buněk či tkání pacienta, tedy genové terapie. Biologická léčiva a související názvy Pojmy biologická léčiva, bioléčiva, biologika se v češtině používají zatím jako synonyma a často jsou jednotlivými autory vymezena různým způsobem. Tento stav je dán několika fakty, a to jednak určitým opožděním domácí odborné literatury a jednak nejednotností původní anglicky psané literatury. Česká odborná literatura si zatím nevytvořila jednotné názvosloví pro obor, jehož obecný název v anglické literatuře zní Biopharmacy či Biopharmaceuticals. V češtině je pojem biofarmacie vyhrazen pro jiný obor (zjednodušeně pro sledování osudu látek v organismu). Mezi tzv. biopharmaceuticals je v anglické literatuře zařazována celá paleta léčebných produktů a postupů od rekombinantně připravených proteinů až po využití kmenových buněk či od xenotransplantací až po genové terapie. V této knize se budeme soustřeďovat podrobněji na jednu část z oboru biopharmaceuticals, a to především na využití rekombinantních proteinů v humánní terapii či profylaxi. Pro proteiny, které jsou připraveny v hostitelském organismu (například Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, tkáňové kultury živočišných buněk) rekombinantními technologiemi a po izolaci a charakterizaci použity pro léčbu pacientů se v anglické literatuře vžily názvy jako biological drugs, biologicals nebo zkráceně biologics (bohužel ale například název biologics je některými autory chápan jako synonymum k biopharmacy, což jen prohlubuje názvoslovnou nejasnost). V češtině není zatím názvosloví v této oblasti kodifikováno, a proto si dovolíme používat pojem biologická léčiva pro proteinová či peptidová léčiva připravená expresí genů vnesených do hostitelského organismu. Další odlišností v oblasti biologických léčiv oproti situaci u klasických léků jsou léčiva, která jsou uvedena na trh po vypršení původní patentové ochrany tzv. biosimilars. V oblasti klasických (tzn. nízkomolekulárních, nebo také syntetických) léčiv je zaveden pro taková (ne již originální) léčiva pojem generické léčivo (generikum). Tento pojem se ve světě biologických léčiv nepoužívá a v evropském regionu je ražen název biosimilars, v americkém regionu název follow on biologics (FOB). Čeština zatím odpovídající název nemá, proto si dovolíme používat název biosimilars. Není náhodou, že se pro takové následné produkty používá název odlišný od situace u nízkomolekulárních látek. Jak vyplyne z následujících kapitol, u biologických léčiv je totiž 18
Biotechnologie a farmaceutický průmysl 1 složitější (ne-li prozatím nemožné) porovnat produkty téhož proteinu od různých výrobců z hlediska všech parametrů, které mohou ovlivnit zdraví pacienta. Řada biologických léčiv (především v oblasti léčiv dědičných metabolických poruch a řady dětských onemocnění) vstupuje na trh ve speciálním režimu schvalování a jejich obecné označení je v angličtině orphan drugs ( sirotčí léky). Pojem orphan drugs byl zaveden pro léky (jak klasické, tak biologické), které jsou určeny pro relativně malou část populace, která trpí specifickým onemocněním (například Fabryho nebo Gaucherovou chorobou). Producenti, jejichž léky spadají do povolovacího procesu v režimu orphan drugs, jsou regulačními autoritami částečně zvýhodněni. Především z logických důvodů není požadován tak veliký počet pacientů pro klinické testování, pro daný lék je prodloužena ochrana na trhu před nástupem generických léků či biosimilars, producent má daňové úlevy a podobně. Poslední poznámku této kapitoly věnujeme názvosloví konkrétních biologických léčiv. Toto názvosloví podléhá podobným pravidlům jako názvy léčiv obecně. Většinou se biologická léčiva označují obchodními názvy (většinou registrovaná značka). Tyto názvy se mohou lišit podle indikace. Například lidský růstový hormon uváděný na trh firmou Merck-Serono má obchodní názvy Saizen v indikaci dětské deficience růstového hormonu, Serostim pro léčbu kachexie u pacientů infikovaných virem HIV a Zorbtive pro léčbu syndromu krátkého střeva. Jde vždy o rekombinantní lidský růstový hormon, ale může se lišit formulací, dávkou a především indikací, pro kterou je látka povolena. Dále jsou tato léčiva označována názvem, který přijaly pro dané léčivo schvalovací orgány (FDA, EMEA) a který je odvozen od biochemického nomenklaturního názvu. Například pro produkt Pegasys, což je rekombinantní interferon-α-2a s chemickou modifikací polyetylenglykolem, používá FDA název peginterferon-α-2a. Zvláštní pravidla platí pro názvosloví monoklonálních protilátek, u kterých byla vytvořena poměrně komplikovaná nomenklatura, kdy se vedle obchodního názvu užívá systematické pojmenování. Základní principy tohoto názvosloví můžeme shrnout následovně: Pro monoklonální protilátky a jejich fragmenty je používána koncovka -mab. Označení a identifikace monoklonálních protilátek podle původu je dána písmenem před touto koncovkou, tj. o myší (-omab), a potkaní (-amab), e křeččí (-emab), i z primátů (-imab), u humánní (-umab) a xi chimérní (-ximab). Orientačně lze říci, že v názvu se objevuje i upřesnění podle typu indikace, např. bac- (bakteriální), lim- (imunitní), les- (infekční léze) a cir- (kardiovaskulární). Pro nádorová onemocnění jsou názvy specifické podle typu orgánové predilekce, např. col (kolorektální), mel (melanom), mar (prsní mléčná žláza), got (testes), gov (ovaria), pr(o) (prostata) a tu(m) (různé typy malignit). Například léčivo s obchodním názvem Campath je humanizovanou protilátkou proti receptoru CD52 a používá se pro léčení chronické lymfocytární leukémie. Jeho systematický název je alemtuzumab, kde koncovka -umab značí humanizovanou protilátku a písmena -tu- určují indikaci pro léčení maligních onemocnění. 19
1 Biologická léčiva 1.2 Historický vývoj a postavení biologických léčiv na trhu V šedesátých a sedmdesátých letech 20. století naše znalosti biologie, biochemie, molekulární biologie, genetiky a dalších oborů umožnily vznik zcela nových biotechnologických postupů, které ve velké míře závisí na cílené změně genetické informace v organismech. Využití takových biotechnologických postupů bylo zároveň podmíněno zavedením izolačních technik a technik analýzy biologických makromolekul. Proto se často uvádí, že pod pojmem moderní biotechnologie se rozumí použití buněčných a biomolekulárních procesů pro řešení problémů a pro výrobu produktů. Další definice biotechnologie, kterou můžeme nalézt, je formulována jako aplikace vědy a technologie na živé organismy nebo jejich části, výrobky a modely pro přeměnu živých i neživých materiálů za účelem vytváření znalostí, zboží a služeb. Řada léčiv byla a je získávána izolací z geneticky neupravených organismů. Mezi ně patří například antibiotika a alkaloidy, které se vyrábějí extrakcí z mikroorganismů, a nebo krevní deriváty, pro něž je výchozím materiálem lidská dárcovská krev. Mezi posledně jmenované patří mimo jiné faktory, které se účastní krevního srážení a které se používají při léčbě hemofilie. Pro pasivní imunizaci se používají izolované protilátky a od dvacátých let 20. století byl ze zvířecích zdrojů izolován inzulin pro léčbu diabetu. Takto připravené léky sehrály velmi důležitou roli v léčbě mnoha onemocnění. Nicméně jejich použití v sobě skrývá i rizika a obecně pozorujeme jejich ústup spolu s nástupem rekombinantně připravených léčiv. Hlavním nebezpečím u proteinů izolovaných z přírodních zdrojů (lidská krev, zvířecí orgány) je možný přenos infekčních chorob. Farmaceutický průmysl se po druhé světové válce dynamicky rozvíjel a zažil dvouciferné meziroční nárůsty jak v prodejích léčiv, tak v ziscích akcionářů. Tento růst byl podmíněn množstvím nově objevených originálních léčiv, zahrnujících antibiotika, psychofarmaka, antirevmatika, léky aplikované při kardiovaskulárních onemocněních či k prevenci takových chorob. Rozvoj byl dále ovlivněn příhodnou patentovou politikou a v neposlední míře i zájmem společnosti vydávat za nová léčiva značné prostředky. Vzestupný trend se zpomalil v polovině osmdesátých let a vedl k rozvoji výroby generických léčiv, tj. léčiv, kterým skončila patentová ochrana, a která generičtí výrobci nabízejí za ceny podstatně nižší než originální výrobci. Výrobci originálních léčiv pocítili pokles obratu i zisku. Do toho vstoupily stále se zvyšující náklady na vývoj nových látek především díky zpřísňující se legislativě (obr. 1.1). Výrobci reagovali zvýšením výdajů na výzkum a vývoj, přičemž množství tzv. terapeutických cílů bylo omezené a nové cílové molekuly byly objevovány jen pomalu. Zvýšená konkurence donutila velké firmy ke spojování a vzniku obřích nadnárodních společností. Vysoké náklady na výzkum a vývoj, relativně krátká patentová ochrana a s tím spojená konkurence generických výrobců a v neposlední řadě absence snadno dostupných cílů vedou v posledních letech k malému počtu nově zavedených sloučenin (NCE new chemical entities), přičemž řada z nich nepřináší očekávané zisky. 20
Biotechnologie a farmaceutický průmysl 1 náklady na vývoj léku - mil USD přepočteno na rok 2000 mil USD 1000 800 600 400 200 52 240 450 810 0 1976 1987 2000 2007 roky Obr. 1.1 Růst nákladů na vývoj nového léčiva Novým impulzem pro rozvoj farmaceutického průmyslu bylo zavedení prvních biologických léčiv na trh v osmdesátých letech 20. století. Jako první uvedly farmaceutické firmy na trh peptidy, které byly používány jako léčiva již dříve, ale byly izolovány z materiálů obvykle živočišného původu. První takové léčivo byl rekombinantní inzulin povolený k prodeji v USA v roce 1982. Následovala řada dalších léčiv jako rekombinantní lidský růstový hormon, rekombinantní vakcína proti viru hepatitidy B, interferony, erytropoetin a další. Vývoj v této oblasti ukazuje obrázek 1.2. 25 20 15 10 5 0 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 Obr. 1.2 Počty nově přihlášených biotechnologických léčiv v období 1982 2009 (data FDA): modrá řada počty nově registrovaných rekombinantních bioléčiv, šedá řada počty nově registrovaných nerekombinantních bioléčiv (vakcíny, krevní deriváty) 21
1 Biologická léčiva Při uvádění prvních bioléčiv na trh byly náklady na jejich vývoj podstatně nižší než v případě klasických syntetických léčiv. To bylo způsobeno tím, že šlo vlastně o známé látky a změnil se pouze způsob jejich výroby. Odpadla tudíž větší část preklinického výzkumu, která u syntetických léčiv zahrnuje syntézu nových látek a jejich základní biologické testování, výběr vhodných vůdčích sloučenin a jejich hlubší farmakologické a toxikologické testování, které tvoří asi 40 % celkových nákladů na vývoj nového léčiva. Zbylých 60 % jsou náklady na klinické zkoušení, a ty jsou v zásadě stejné jak pro malé organické molekuly, tak pro bioprodukty. Trend nízkých nákladů spojených se zaváděním nových biologických léčiv však skončil. Náklady na vývoj biologických léčiv a syntetických léčiv jsou nyní podobné a v budoucnosti dále porostou. To vyvolává snahu o zavedení levnějších biosimilars. Nicméně biosimilars nebudou znamenat výrazné snížení ceny oproti originálním přípravkům, protože se na ně aplikuje jiný legislativní proces než u generických léků, který stále vyžaduje určitý rozsah klinického testování, a tudíž zvyšuje cenu produktu. Výnosy ze současných biotechnologických léčiv jsou nezanedbatelné. Tabulka 1.1 uvádí prodeje 10 nejprodávanějších bioléčiv v roce 2008 a tabulka 1.2 ukazuje prodeje skupin bioléčiv. Tab. 1.1 Nejprodávanější biologická léčiva v roce 2008 název cíl/mechanismus typ látky hlavní indikace prodeje v roce 2008 (v miliardách USD) etanercept Enbrel TNF-α antagonista dimerní fúzní protein rozpustného TNF receptoru a Fc fragmentů protilátek revmatoidní artritida 6,49 infliximab Remicade epoetin α Epogen, Procrit, Eprex, Espo rituximab Rituxan/ MabThera adalimumab Humira TNF-α antagonista receptor pro erytropoetin CD20 TNF-α antagonista rekombinantní, chimérní monoklonální protilátka rekombinantní protein rekombinantní chimérní monoklonální protilátka rekombinantní, lidská, monoklonální protilátka revmatoidní 5,335 artritida, Crohnova choroba, idiopatické střevní záněty atd. anémie 5,123 non-hodgkinův lymfom revmatoidní artritida 5,099 4,521 22
Biotechnologie a farmaceutický průmysl 1 název cíl/mechanismus typ látky hlavní indikace prodeje v roce 2008 (v miliardách USD) bevacizumab Avastin trastuzumab Herceptin darbepoetin α, Aranesep, NESP pegfilgrastim Neulasta inzulin glargin Lantus VEGF HER2 erytropoetin receptor G-CSF receptor inzulin receptor rekombinantní, humanizovaná, monoklonální protilátka rekombinantní, humanizovaná, monoklonální protilátka inženýrsky modifikovaná varianta proteinu pegylovaný, rekombinantní lidský G-CSF s počátečním methioninem rekombinantní modifikovaný inzulin metastatická rakovina tlustého střeva spolu s 5-FU, 1-linie NSCLC plus karboplatina, paklitaxel HER2 pozitivní metastatická rakovina prsu 4,484 4,384 anémie 3,344 neutropenie 3,318 diabetes mellitus 1. a 2. typu 3,13 23
1 Biologická léčiva Tab. 1.2 Skupiny produktů podle jejich prodejů v roce 2008 pořadí 2008 pořadí 2007 typ produktu podle indikační oblasti prodeje 2008 (v miliardách USD) vybraná léčiva 1 2 anti-tnf protilátky revmatoidní artritida, idiopatické střevní záněty 2 1 hlavní protilátky pro léčbu onkologických onemocnění 3 4 inzulin a jeho analoga diabetes 16,36 Enbrel, Remicade, Humira, Cimzia 15,59 Rituxan/MabThera, Herceptin, Avastin, Erbitux, Vectibix 10,9 Humalog, Humulin, Lantus, Levemir, NovoRapid, Actrapid, Novolin 4 3 erytropoetin anémie 10,05 Aransep, Procrit, Eprex, Epogen, Neo-Recormon, ESPO, Dynepo, Binocrit 5 6 interferon-β roztroušená 5,35 Avonex, Rebif, Βetaferon skleróza 6 7 G-CSF neutropenie 5,18 Neulasta, Neupogen, Neutrogin 7 5 koagulační faktory hemofilie 8 10 enzymové náhrady dědičné metabolické choroby 9 8 lidský růstový hormon léčba deficience 10 9 interferon-α virová hepatitida B a C 4,94 NovoSeven, Kogenate, Helixate, Refacto, Advate, Recombinate, Benefix 2,8 Cerezyme, Fabrazyme, Aldurazyme, Myozyme, Replagal, Naglazyme, Elaprase 2,68 Geotropon, Norditropin, Humatrope, Nutropin, Saizen, Serostim, Omnitrope 2,56 Pegasys, PegIntron, Intron A 1.3 Specifika biologických léčiv Biologická léčiva jsou proteiny (peptidy), připravené tvorbou v produkčních organismech a izolované biochemickými postupy. Tato léčiva se v mnohých aspektech liší od klasických nízkomolekulárních léčiv. Základní odlišnost tkví ve velikosti molekul. Zatímco relativní molekulová hmotnost syntetických léků se pohybuje ve stovkách daltonů, u proteinů jde o desetitisíce daltonů (například protilátky 145 kda). Schematicky je tento rozdíl uveden na obrázku 1.3. Z velikosti struktury pak vyplývají další rozdíly. Proteiny jsou oproti nízkomolekulárním lékům daleko labilnější, proto je jejich produkce, analýza a adjustace do koncové lékové formy komplikovanější než u klasických léčiv. Samotný výrobní proces se liší. 24
Biotechnologie a farmaceutický průmysl 1 atorvastatin erytropoetin Obr. 1.3 Porovnání velikosti molekul erytropoetinu a atorvastatinu (také v barevné příloze) Obecně rozdělujeme výrobu biologických léčiv do dvou základních kroků zvaných upstream processing a downstream processing. V prvním kroku se vnese do kultivačního média produkční organismus a dochází k jeho růstu a množení a zároveň s tím k produkci žádaného produktu proteinu, jehož gen byl do produkčního organismu vnesen metodami genového inženýrství. Po dosažení žádaného vzrůstu nastupuje druhý krok ( downstream processing ), který je ve své podstatě souborem izolačních technik, kdy se z komplexní produkční směsi izoluje žádaný produkt. Celý tento proces probíhá za velmi mírných podmínek, aby se zabránilo i částečné denaturaci produktu. Na konci je většinou roztok účinné látky, případně jeho lyofilizát. K tomu, aby se zjistila čistota produktu, je třeba použít celé skupiny analytických metod (na rozdíl od nízkomolekulárních léčiv, kde se většinou používá jen několik základních analytických metodik) a i přes obrovský vývoj v této oblasti, je naše schopnost určit čistotu proteinů stále omezena. Především jde o možné kontaminanty pocházející z produkčního organismu a o nečistoty ve smyslu produktu s nesprávnou prostorovou (trojrozměrnou) strukturou. Takové nečistoty by mohly u pacienta po podání vyvolat nežádoucí imunitní odpověď. Mezi hlavní možné kontaminanty patří: mikroorganismy pokud se dostanou do finálního produktu, mohly by způsobit závažné infekční komplikace, včetně rozvoje septického stavu. Relativně snadno odstranitelné filtrací, virové částice nebezpečí vzniku virových infekcí. Odstranění filtrací a dalšími čistícími operacemi, 25
1 Biologická léčiva pyrogenní látky nebezpečí nárůstu tělesné teploty s těžkými následky. Tyto látky jsou velmi problematické, protože může jít i o relativně malé molekuly, DNA není přesně znám negativní vliv, předpokládá se vznik imunitní odpovědi, kontaminující proteiny hlavním nebezpečím jsou imunologické reakce a nechtěné biologické aktivity. Jak bylo uvedeno výše, hlavním rizikem proteinových nečistot je jejich antigenita, ale problémem může být také jejich biologická aktivita, která může poškodit produkt (například přítomnost proteolytických enzymů) nebo pacienta (například přítomnost růstových faktorů, hormonů, toxinů a podobně). Za nečistoty je ale třeba považovat také samotné bioléčivo, pokud je produkováno v nesprávné struktuře. Takto nesprávně připravené léčivo může být imunogenní, může snižovat specifickou aktivitu produktu (a tím zbytečně zvyšovat dávky nutné k projevu žádaných efektů), může výrazně změnit farmakokinetiku. Pro nesprávnou funkci proteinu stačí například nesprávné párování disulfidových můstků, tvorba agregátu, naštěpení proteolytickým enzymem a podobně. Během izolace se využívají chromatografické metody, jako je gelová permeační chromatografie, která odstraní agregované formy, v kombinaci s iontově výměnnými chromatografiemi, které by měly odstranit nesprávně sbalené molekuly. Uvádí se, že výsledná čistota produktu se pohybuje na hranici 98 99 %. Testování čistoty Pro test čistoty se používají následující metody: biologické/funkční testy (aktivita enzymů, aktivita hormonů apod.), elektroforéza (nativní, nedenaturující, denaturující, dvoudimenzionální, kapilární), izoelektrická fokuzace, peptidové mapování, HPLC na reverzní fázi, hmotnostní spektrometrie, aminokyselinová analýza, N-koncové sekvenování, cirkulární dichroismus, imunologické metody ELISA, western blotting a další. Biologická aktivita Každé biologické léčivo musí splňovat požadavky na svou biologickou aktivitu tak, jak je dána jeho registrací. Biologická aktivita každé šarže je udávána na základě výsledku příslušných testů jako jednotky aktivity na miligram, na daný objem, nebo na jednu dávku. Samotná bioesej se provádí stejně jako testování aktivity v běžné biochemické laboratoři s tím rozdílem, že veškeré materiály použité k danému testu musí mít certifikovanou kvantitu a kvalitu a celý postup musí odpovídat správné laboratorní praxi a musí být pečlivě zaznamenán. Při biologickém testu se porovnává účinnost produktu se standardním preparátem. Ta může být testována buď na relativně jednoduchém systému (například test enzymové aktivity) v roztoku za využití nejčastěji spektrofotometrických měření, nebo na buněčné linii (interferony, růstové faktory), ale někdy je nutné použít celý orgán, tkáň a nebo i zvířecí model. Například testování erytropoetinu se provádí na myším modelu. Čím složitější biologický systém je pro testování použit, tím více se zvyšuje počet nevýhod takového testu. Mezi hlavní patří nepřesnost 26
Biotechnologie a farmaceutický průmysl 1 (zvířecí model může podléhat i jiným vlivům než jen podané látce), časová náročnost (často tyto testy trvají dny a týdny), cena (biologické modely jsou většinou velmi drahé a cena se zvyšuje nutností použít větší, statisticky významné skupiny zvířat, aby se eliminovaly případné nepřesnosti). Formulace biologických léčiv Jak již bylo uvedeno, proteinová léčiva mohou podléhat degradačním a modifikačním reakcím, které ohrožují stabilitu jejich struktury. Funkční poškození biologických léčiv může být způsobeno mnoha vlivy: denaturací, srážením, deamidací, nesprávným párováním disulfidů, oligomerizací, agregací, kovalentním prokřížením, hydrolýzou, izomerizací, racemizací, vznikem imidů, oxidací. Změny ve struktuře biologických léčiv mohou mít za následek ztrátu účinnosti a také nebezpečí vzniku imunitních a dalších nežádoucích odpovědí u pacientů. U biologických léčiv je proto nutné použít pro zvýšení stability a pro jejich (bio)dostupnost řadu dalších přídavných látek. Většinou se používá některý z následujících přístupů: inhibice adsorpce účinné látky na buněčných membránách, konformační stabilizace, kryoprotekce, ochrana při lyofilizaci, chelatace kovů, inhibice agregace, termoprotekce, inhibice izomerizace, ochrana proti oxidaci, posílení hydrofobních vazeb, zlepšení rozpustnosti, kontrola osmolarity, kontrola ph. K tomu se používá řada látek, které shrnuje tabulka 1.3. 27
1 Biologická léčiva Tab. 1.3 Pomocné látky a jejich funkce druh pomocné látky hlavní funkce příklady podporující rozpustnost zvýšení rozpustnosti bioléčiv aminokyseliny, tenzidy (Tween) pufrovací látky úprava ph roztoku bioléčiva soli kyseliny octové, askorbové, citronové, uhličité, fosforečné látky upravující osmolaritu úprava osmolarity sacharidy a soli konzervační látky inhibice růstu mikroorganismů při opětovném otevírání vialek fenol, benzylalkohol, organické sloučeniny rtuti antioxidanty prevence oxidace kyselina askorbová, sulfity, cystein kryoprotektiva a látky chránící při lyofilizaci ochrana stability během mrazení a lyofilizace cukry: sacharóza, trehalóza, laktóza, maltóza polyoly: mannitol, inulin aminokyseliny: glycin, glutamin, histidin, threonin, arginin, lyzin polymery: polyvinylpyrolidon Pomocné látky mohou mezi sebou interagovat, a proto je třeba pečlivě volit jejich správnou kombinaci. V dalším textu se podrobněji zmíníme o hlavních zástupcích těchto pomocných látek. Pufry a látky upravující osmolaritu Stabilita proteinů je optimální v určitém rozsahu ph. Nalezení takového rozmezí je základním požadavkem správné formulace (často je z hlediska stability optimální ph v okolí izoelektrického bodu, kde je však často problémem rozpustnost). Po určení optimálních podmínek jsou zvoleny pufrovací a iontové systémy pro formulaci. K tomu se převážně používají látky zmíněné v tabulce 1.3. Je nutné věnovat pozornost výběru pufrů i vzhledem k možné lyofilizaci. Například fosfátové pufry (soustava NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 ) během lyofilizace krystalizují za různých teplot, a mohou proto způsobit významné změny v ph, a tím porušit stabilitu proteinů. Některé soli se mohou během mrazení srážet a oslabit pufrovací kapacitu. Proto při plánované lyofilizaci produktu je dávána přednost solím, jež nezpůsobují vysrážení. Látky upravující osmolaritu jsou používány především pro odstranění bolesti během injekční aplikace. Nejčastěji se používají cukry jako glukóza, rovněž pufrovací látky upravují osmolaritu roztoku. Proto se s výhodou používají takové koncentrace pufrů, které zároveň upravují osmolaritu. Látky upravující rozpustnost Některé z používaných bioléčiv jsou tak hydrofobní, že terapeuticky použitelné koncentrace ve vodných roztocích mohou být dosaženy pouze za použití tenzidů (povr- 28