Univerzita Karlova v Praze. Farmaceutická fakulta v Hradci Králové

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Průtokové metody stanovení antioxidační kapacity BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Hradec Králové, únor 2009 Jana Kunzová

Tuto bakalářskou práci jsem vypracovala samostatně na základě informací získaných ze zdrojů uvedených v seznamu pouţité literatury. Současně bych tímto chtěla poděkovat vedoucímu bakalářské práce Doc. RNDr. Miroslavu Poláškovi, CSc., za ochotu, čas a trpělivost, které významně přispěly ke vzniku této práce. Jana Kunzová 2

Obsah: 1. Úvod... 4 2. Volné radikály... 5 2.1. Co jsou volné radikály a jejich vlastnosti... 5 2.2. Vznik volných radikálů... 5 2.2.1. ROS... 6 2.2.2. RNS... 7 3. Antioxidanty... 8 3.1. Význam a jejich funkce... 8 3.1.1. Enzymové antioxidanty... 9 3.1.2. Antioxidanty neenzymové povahy (scavengery)... 10 4. Metody stanovení antioxidační kapacity (AOC)... 12 4.1. Obecný přehled metod a jejich princip... 12 4.2. Přehled analytických metod pouţitých pro stanovení AOC... 16 4.2.1 Neprůtokové metody... 16 4.2.2 Průtokové metody... 18 5. Průtokové metody instrumentace, princip... 20 5.1. FIA... 20 5.2. SIA... 22 6. Stanovení AOC v potravinách metodou SIA... 24 6.1. SIA s chemiluminiscenční detekcí... 24 6.2. SIA se spektrofotometrickou a fluorescenční detekcí... 26 6.3. SIA se spektrofotometrickou detekcí (DAD)... 28 7. Souhrn... 31 8. Seznam pouţité literatury... 32 3

1. Úvod Volné radikály jsou nezbytnou součástí lidského organismu. Jako součást imunitního systému se významně podílejí na usmrcení cizorodých organismů. Nadměrné hromadění těchto sloučenin však představuje nebezpečí pro lidské zdraví. Tyto velmi reaktivní sloučeniny mohou svým účinkem podmínit peroxidaci lipidů buněčných membrán, modifikaci a tím i změnu funkce proteinů a enzymů, mohou vyvolávat i změny na úrovni DNA. Cílem této práce je poskytnout přehled moderních analytických metod, které jsou pouţívány ke stanovení antioxidační a antiradikálové kapacity potravin a potravinových doplňků. Informace byly čerpány z literatury pocházejících z let 2002-2008. K vyhledávání odborných článků byly pouţity databáze ScienceDirect, SpringerLink a PubMed. 4

2. Volné radikály 2.1. Co jsou volné radikály a jejich vlastnosti Jako volné radikály se označují molekuly nebo atomy obsahující 1 nebo více nespárovaných valenčních elektronů. Jsou definovány také jako molekuly s lichým počtem elektronů. Tento nespárovaný elektron je příčinou vysoké nestability a reaktivity. Volné radikály snadno a ochotně reagují s molekulami ve svém okolí a jsou schopny samostatné existence. Procesem oxidace těchto okolních molekul získávají chybějící elektron a přechází tak do stabilního stavu. Reakcí však vzniká další volný radikál, dochází tak k řetězové reakci. V podstatě jde o transport elektronů podobně jako v mitochondriích při tvorbě ATP, kde konečným příjemcem elektronů je kyslík. Volné radikály vznikají běţně v buňkách během metabolismu. Jsou také součástí buněk imunitního systému a jsou nezbytné k obraně organismu proti bakteriím, virům a parazitům. Organismus udrţuje mnoţství volných radikálů na hladině, která neznamená ţádné riziko. Nebezpečí hrozí, jestliţe dochází k nadměrné tvorbě volných radikálů nebo tehdy, je-li v organismu příliš nízká hladina enzymových nebo neenzymových antioxidantů, které se významně podílejí na likvidaci volných radikálů. V takovém případě můţe dojít k rozsáhlému poškození buněčných struktur (peroxidace lipidů buněčné membrány, poškození bílkovin, DNA) a nahromadění těchto změn můţe vést aţ ke smrti buňky a poškození orgánů. Volné radikály mají tedy dvojí roli. Na jedné straně zajišťují obranu organismu a na druhé jsou jednou z příčin vzniku závaţných onemocnění. Podílí se také na procesu stárnutí [1], [2], [3]. Zvýšená tvorba volných radikálů můţe být vyvolána vlivy vnějšího prostředí, mohou to být látky, které jsou součástí potravin, vody, ovzduší jako např. smaţená jídla, nezdravé oleje, konzervační přísady do potravin, alkohol, cigaretový kouř, pesticidy, polutanty atd. K jejich tvorbě také přispívá emoční stres [4]. 2.2. Vznik volných radikálů Rozlišujeme dvě významné formy volných radikálů. Volné radikály v jejichţ centru je kyslík reaktivní formy kyslíku (reactive oxygen species = ROS) a volné 5

radikály v jejichţ centru je dusík reaktivní formy dusíku (reactive nitrogen species = RNS) [5], [6]. 2.2.1. ROS Molekula kyslíku O 2 má zvláštní elektronovou konfiguraci (ve valenční vrstvě má 2 nespárované elektrony) a je sama o sobě radikálem. Příjmem jednoho elektronu vzniká superoxid (O 2 ). Tento primární ROS vzniká buď metabolickým procesem nebo účinkem fyzikálního záření, kdy dojde k aktivaci kyslíku. Interakcí s okolními molekulami vznikají sekundární ROS, a to buď přímo nebo je reakce katalyzována enzymy nebo kovy. Většina superoxidových radikálů vzniká uvnitř mitochondrií. Během tvorby ATP dochází k úniku malého mnoţství elektronů (1-3%), které interagují s kyslíkem za vzniku superoxidového radikálu. Dalším zdrojem radikálů je komplex I, který vyvolává tvorbu superoxidového radikálu v matrix mitochondrií. Tento superoxidový radikál není detekovatelný při neporušené membráně. Komplex III vyvolává tvorbu radikálů mimo mitochondrie. Dále mezi ROS patří hydroxylový radikál ( OH), který je vysoce reaktivní a má velmi krátký poločas rozpadu cca 10-9 s. V systému in vivo je tento poločas prodlouţen díky tvorbě redoxního páru s ţelezem nebo mědí. Na reakci se podílí buď volné intracelulární ţelezo nebo enzymy obsahující Fe-S centra (1). Během stresové reakce nejdříve vzniká superoxidový radikál O 2, který působí oxidačně na Fe-S centra enzymů, usnadňuje vznik hydroxylového radikálu z peroxidu vodíku (2) a zajišťuje regeneraci Fe 2+ (3), který vstupuje do Fentonovy reakce. Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH + OH (Fentonova reakce) (1) O 2 + H 2 O 2 O 2 + OH + OH (Haber Weiss reakce) (2) Fe 3+ + O 2 Fe 2+ + O 2 (3) Fe-S centra jsou součástí tzv. iron responsive elements-binding protein (IRE-BP), jde o proteiny citlivé na přítomnost intracelulárního ţeleza, které interagují s ironresponsive elements (IREs). IRE-BP mají v buňkách bohatých na ţelezo funkci akonitázy. V savčích buňkách je účinkem oxidantů přeměněna akonitáza na aktivní 6

IRE-BP, které zvyšují hladinu intracelulárního ţeleza, sniţují syntézu feritinu a zvyšují syntézu transferinového receptoru. Dalším významným radikálem odvozeným od kyslíku je peroxylový radikál (HOO ). Jde vlastně o protonovanou formu superoxidového radikálu. Tyto peroxylové radikály zahajují peroxidaci mastných kyselin (LH) fáze iniciace (4). Účinkem volných radikálů dochází snadno k disociaci vodíku vázaného na uhlík s dvojnou vazbou (H-CH=CH-R). Vzniká tak uhlík s nespárovaným elektronem volný radikál (L.) Ve snaze získat zpět stabilní uspořádání dochází ke změně uspořádání a vznikají konjugované dieny, které velmi snadno reagují s kyslíkem za vzniku peroxylového radikálu (5) fáze propagace, který interaguje s dalšími lipidy, dochází tak k řetězové reakci (6). LH + X. L. + XH (4) L. + O 2 LOO. (5) LOO. + LH L. + LOOH (6) 2.2.2. RNS Mezi RNS se řadí radikál oxidu dusnatého NO., který obsahuje jeden nespárovaný elektron. Je syntetizován v biologických tkáních za účasti syntázy oxidu dusnatého (NOS), která katalyzuje přeměnu argininu na citrulin (obr. 1), přičemţ dochází k uvolnění NO. z N-konce argininu. Oxid dusnatý je důleţitou signální molekulou v biologických procesech. Jako neurotransmiter ovlivňuje centrální nervový systém a autonomní nervový systém, zajišťuje vasodilataci cév, relaxaci hladké svaloviny a účastní se imunitních reakcí. Nadprodukce v mozkové tkáni můţe vyvolat např. mrtvici nebo neurodegenerativní onemocnění. Nadměrná vazodilatace zase můţe vést k výraznému poklesu tlaku, následkem čehoţ můţe být aţ oběhové selhání a šok. Ve vodném prostředí má velmi krátký poločas rozpadu. Poločas se prodluţuje v prostředí s nízkou koncentrací kyslíku. V extracelulárním prostředí reaguje s kyslíkem a vodou za vzniku dusičnanů a dusitanů. Nadměrné zvýšení, které je následkem nedostatečné schopnosti organismu eliminovat a neutralizovat tyto sloučeniny, vyvolává stres z nahromaděných NO. (tzv. nitrosative stress), který vede k nitrosylové reakci. Následkem je změna struktury proteinů a inhibice jejich funkce. 7

NO H 2 N NH H 2 N N OH H 2 N O C C C NH O 2 + NADPH NH NH CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 H 2 N CH COOH arginin H 2 N CH COOH hydroxyarginin H 2 N CH COOH citrulin Obr. 1: Syntéza radikálu oxidu dusnatého NO. z argininu za účasti syntázy oxidu dusnatého. Radikál oxidu dusnatého velmi snadno reaguje se superoxidovým radikálem za vzniku peroxynitritu OONO., který oxiduje DNA a lipidy. 3. Antioxidanty 3.1. Význam a jejich funkce Jde o látky, které podporují růst buněk, ochraňují buňky před předčasným stárnutím, podporují správnou funkci imunitního systému a zajišťují antioxidační ochranu. Na vychytávání nebo likvidaci neţádoucích volných radikálů se podílí látky enzymové (superoxiddismutáza, kataláza a glutathionperoxidáza) a neenzymové povahy (kys. askorbová, α-tokoferol, glutathion, karotenoidy, flavonoidy...). Neutralizují volné radikály darováním svého vlastního elektronu a tím je ukončena řetězová reakce tvorby volných radikálů. Odevzdáním elektronu se z nich nestávají volné radikály, neboť jsou stabilní v obou formách. Za normálních podmínek je udrţována rovnováha mezi radikály a antioxidanty. Tato rovnováha je důleţitá pro udrţení zdraví a přeţití organismu. Redukční prostředí 8

podporuje proliferaci buněk, mírně oxidační prostředí podmiňuje diferenciaci buněk. Velmi oxidované prostředí vede k apoptóze a nekróze [5], [7], [8], [9]. Antioxidanty se tedy podílí na udrţování určité redoxní homeostázy v buňkách. Primárním ukazatelem redoxního stavu v buňkách je glutathion (redoxní pár redukované a oxidované formy 2GSH/GSSG) a thioredoxin (TRX). Jestliţe dojde ke zvýšení oxidační zátěţe, projeví se to poklesem koncentrace GSH ve prospěch GSSG. Zvyšuje se mnoţství proteinů obsahujících disulfidické vazby, coţ můţe pozměnit funkci enzymů a transkripčních faktorů. V redukovaném stavu je glutathion a thioredoxin udrţován účinkem glutathionreduktázy resp. TRX-reduktáza. GSH mimo jiné zabraňuje buňkám v apoptóze. 3.1.1. Enzymové antioxidanty Superoxiddismutáza (SOD) se nachází ve všech buňkách, přičemţ vysoké koncentrace dosahuje v erytrocytech. Rozlišujeme dvě formy superoxiddismutázy SOD1 a SOD2. SOD1 se nachází v cytosolu a v mezimembránovém prostoru mitochondií a ve svém aktivním centru obsahuje Cu a Zn. SOD2 je součástí matrix mitochondrií a ve svém aktivním centru má Mn. Superoxiddismutáza katalyzuje přeměnu superoxidového radikálu na peroxid vodíku. Vzniklý peroxid vodíku je dále odstraněn glutathionperoxidázou a katalázou (obr. 2). Glutathionperoxidáza (GSHPx) katalyzuje přeměnu peroxidu vodíku na neškodnou vodu a molekulární kyslík a současně podmiňuje oxidaci glutathionu. Oxidovaný glutathion je obnoven pomocí NADPH syntetizovaným v pentosovém cyklu účinkem glukoso-6-fosfát dehydrogenázy. Pro aktivaci enzymu je nutná přítomnost malého mnoţství selenu. Koncentrace tohoto enzymu nemůţe být zvýšena příjmem z potravy, protoţe dochází k jeho rozkladu v trávicím traktu. Koncentrace se můţe zvýšit podáváním jeho koenzymu glutathionu. [10] Kataláza (CAT) se tvoří v malém mnoţství v cytoplazmě buněk. Katalyzuje reakci, při které se peroxid vodíku rozkládá na kyslík a vodu. 9

kataláza H 2 O + ½ O 2 O 2 - SOD H 2 O 2 + Fe 2+ OH + Fe 3+ + OH - NADPH+H + 2 GSH GSHPx NADP + GSSG 2 H 2 O Obr. 2: Přeměna superoxidového radikálu na peroxid vodíku a jeho následná eliminace enzymovými antioxidačními systémy [6]. 3.1.2. Antioxidanty neenzymové povahy (scavengery) Jde o látky, které reagují s volnými radikály za vzniku dalšího radikálu, který však není tak toxický a nebezpečný. Látky rozpustné v tucích zajišťují ochranu před peroxidací lipidů, látky rozpustné ve vodě působí antioxidačně v cytoplazmě buněk. Tyto látky jsou hojně obsaţeny v nejrůznějších potravinách. Mezi tyto látky patří vitamín C, vitamín E, flavonoidy, polyfenoly, karotenoidy, třísloviny, sloučeniny selenu, zinku, manganu, mědi, germania... [6], [7]. Např. : Vitamín C (kys. askorbová) působí ve vysokých koncentracích jako antioxidants, naopak v nízkých koncentracích můţe vyvolat v přítomnosti dvoumocných iontů ţeleza a mědi peroxidaci. Jeho působení je lokalizováno do cytosolu buněk. Odevzdáním elektronu přechází na hydroaskorbát (askorbylový radikál) o velmi malé reaktivitě (obr. 3). Na svou redukovanou formu je převeden účinkem NADH, případně dismutuje na askorbát a dehydroaskorbát. Mimo jiné usnadňuje vstřebávání ţeleza, kdyţ jej udrţuje v redukované formě. 10

CH 2 OH CH 2 OH CH O OH O HO CH O OH O + H 2 O HO OH kyselina askorbová O OH askorbylový radikál Obr. 3: Antioxidační aktivita kys. askorbové, která vede ke vzniku askorbylového radikálu [6]. Vitamín E (α-tokoferol) má vysokou afinitu k hydroxylovým a superoxidovým radikálům. Uplatňuje se při ochraně buněčné membrány, kdy redukuje lipidové peroxylové radikály (LOO.) na hydroperoxidy, které jsou následně redukovány glutathionperoxidázou (obr. 4). Ztrátou elektronu přechází na tokoferylový radikál. Jeho regenerace je zajištěna askorbátem. CH 3 CH 3 HO R L-O-O O + L-O-O-H R H 3 C O CH 3 H 3 C O CH 3 CH 3 -tokoferol CH 3 tokoferylový radikál Obr. 4: Antioxidační aktivita α-tokoferolu, která vede ke vzniku tokoferylového radikálu [6]. Antioxidanty tedy zabraňují neţádoucím reakcím, které vedou k poškození organismu a rozvoji řady chorob (např. neurodegenerativní onemocnění Parkinsonova 11

choroba, Alzheimerova choroba; kardiovaskulární onemocnění, hypertenze, diabetes mellitus, rakovina ). Proto je důleţitý dostatečný příjem antioxidantů. Mezi potraviny s nejvyšším obsahem antioxidantů patří bobule, brokolice, rajčata, hrozny červeného vína, česnek, špenát, čaj, mrkev nebo sója. 4. Metody stanovení antioxidační kapacity (AOC) 4.1. Obecný přehled metod a jejich princip Antioxidanty přijímané potravou jsou aktivovány v trávicím traktu nebo po jejich vstřebání. Podléhají biotransformaci stejně jako xenobiotika, takţe se v organismu nacházejí v různých formách a jejich stanovení v organismu je proto obtíţné. Cílem stanovení antioxidační kapacity (AOC) je zjistit redukční účinek vzorku (potraviny, krevní plazma, rostliny...). Stanovení se provádí ve vzorcích za podmínek, které se velmi blíţí fyziologickému prostředí [11-14]. Metody pro stanovení AOC vychází ze dvou reakčních mechanismů. Během reakce dochází prostřednictvím antioxidantů buď k přenosu vodíkového atomu (Hydrogen Atom Transfer = HAT) nebo přenosu elektronu (Single Electron Transfer = SET). Metody zaloţené na HAT měří schopnost antioxidantů zhášet radikály dodáním vodíku (7). Reakce je nezávislá na ph, má rychlý průběh (obvykle sekundy aţ minuty). Metody zaloţené na SET měří schopnost antioxidantů redukovat radikály dodáním elektronu (8). Reaktivita SET-metody je zaloţena na deprotonaci a ionizační energii reaktivních funkčních skupin. Reakce je závislá na ph. Platí, ţe ionizační energie klesá s rostoucím ph. Metoda má pomalý průběh, dochází k interferenci se stopovým mnoţstvím kovů a nečistotami, coţ je příčinou vysoké variability a špatné reprodukovatelnosti. Hodnota AOC je vyjádřena procentuálním poklesem produktu a není závislá na kinetice reakce. Je vhodná pro stanovení kys. askorbové, kys. močové a polyfenolů. Výsledek reakce, která probíhá různými mechanismy, je stejný, liší se ale kinetika a potenciál reakce. V daném systému mohou existovat oba mechanismy současně. Pak se ke stanovení struktury a vlastností, rozpustnosti a rozdělovacího koeficientu antioxidantů vyuţívá mechanismus, který je v daném systému dominantní. Důleţitými 12

faktory určující mechanismus reakce jsou disociační a ionizační energie. X. + AH XH + A. (7) X. + AH X - + AH +. (8) Stručný přehled metod pouţívaných ke stanovení AOC poskytuje tabulka 1. Tabulka 1: Přehled metod. Metoda Činidlo Analyt. metoda Vzorek Citace TEAC ABTS+ průtoková, tělní [11], [12] elktrochemická tekutiny, FRAP ORAC Metoda TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) Metoda je zaloţena na reakci mezi činidlem a iniciátorem, která vede ke vzniku radikálu barevná stabilní látka. V přítomnosti antioxidantů dochází k redukci, coţ vede k odbarvení vzorku. Míra odbarvení vzorku je přímo úměrné antioxidační aktivitě. Stejným postupem se provádí stanovení ve vzorku obsahující klasické antioxidanty např. kys. askorbovou nebo trolox, aby bylo stanovení standardní. Jako činidlo se nejčastěji pouţívá ABTS /2,2 -azinobis(3-ethylbenzothiazolin)-6- lipidově peroxidační met. met. zaloţená na detekci oxid.poškození Briggs- Rauscherova metoda Fe 3+ komplexy (např. TPTZ) peroxylový radikál fykoeritrinu tetrachlormethan, peroxid vodíku experimentální oxidační stres spektrofotometrická spektrofotometrická (fluorimetrie) test na pokusném zvířeti test na pokusném zvířeti potraviny krevní plazmy, rostliny tělní tekutiny, potraviny esenciální antioxidanty malonát oscilometrická potraviny, léčivé rostliny [11], [12] [11], [12] [11], [12] potraviny [11], [12] [11], [13], [14], [15] TEAC = Trolox equivalent antioxidant capacity, FRAP = Ferric reduction ability of plasma, ORAC = Oxygen radical absorbance capacity, ABTS = 2,2 -azinobis(3- ethylbenzothiazolin)-6-sulfonát 13

sulfonát/, který je převeden na svůj intenzivně zbarvený modrozelený radikál ABTS+. [16] Nevýhodou je, ţe tento radikál není komerčně dostupný a je nutné jej připravit před stanovením AOC. Tvorba radikálu můţe být realizována chemickou reakcí, kde se jako iniciátor vyuţívá oxid manganičitý, AAHP /2,2 -azobis(2-amidinopropan) dihydrochlorid/ nebo síran draselný. Můţe vznikat v průběhu enzymatické reakce, kde se vyuţívá křenová peroxidáza nebo metmyoglobin. Nebo je jeho tvorba realizována elektrochemicky. Výhody metody: jednoduchá a rychlá reakce, široký rozsah ph, automatizace, přizpůsobení pro mikroelektrody, FIA a stanovení stop flow, hojně vyuţito ve výzkumných laboratořích, vhodné pro lipofilní i hydrofilní vzorky, tělní tekutiny, potravinářské vzorky. Nevýhody: mechanismus není typický pro savčí buňky, je-li redox potenciál niţší neţ potenciál ABTS+ (0,68V), dochází k redukci ABTS+ samotnými komponentami reakce např. velké mnoţství fenolických sloučenin má niţší potenciál, nesnadné kvantitativní vyhodnocení AOC [11], [12]. Metoda FRAP (Ferric reduction ability of plasma) nebo FOX (Ferrous oxidation assay) Během reakce dochází účinkem antioxidantů k redukci ţelezitých komplexů např. TPTZ (2,4,6-tripyridyl-S-triazin) nebo ferrikyanidu, přičemţ dochází ke tvorbě barevných produktů např. berlínská modř. Měří se tedy redukční síla, která závisí na stupni hydroxylace a rozsahu konjugace v polyfenolech. Redox potenciál Fe 3+ je podobný jako u metody TEAC, slouţí ke stanovení podobných sloučenin. Metoda byla nejdříve uţita k měření redukční síly v plazmě, následně byla modifikovaná pro stanovení v rostlinách. Variantou FRAP je CUPRAC, kde místo ţelezitých iontů jsou pouţity měďnaté ionty, které jsou redukovány na ionty měďné. Výhody: jednoduchá, rychlá, levná, robustní metoda, nevyţaduje speciální vybavení Nevýhody: nevhodné pro detekci sloučenin schopné přenosu H+ jako jsou thioly (glutathion) nebo proteiny Metoda ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) Metoda je zaloţena na vzniku peroxylového radikálu fykoeritrinu účinkem 14

oxidačního činidla ABAP (2,2 - azobis-2-methyl-propionamidin). K takto připravenému radikálu se přidá testovaný vzorek. Peroxylový radikál reaguje s fluorescenční sondou za vzniku nefluorescenčního produktu. Sleduje se rychlost poklesu signálu, kvantitativní stanovení radikálu se provádí fluorimetricky. Výhody: metoda představuje model mechanismu účinku antioxidantů na lipidy ve fyziologických systémech i v potravinách, uţito k detekci jak hydrofilních tak hydrofobních antioxidantů prostřednictvím změny zdroje radikálu a rozpouštědla, snadná automatizace Nevýhody: časově náročné, metoda je citlivá na teplotu, není specifická Lipidově peroxidační metody Modelové vzorky obsahují nenasycené mastné kyseliny, zkoumaný vzorek a pufr. Často se do systému přidává homogenizovaná ţivočišná tkáň (např. jaterní, mozková). Peroxidace lipidů je iniciována buď peroxidem vodíku nebo tetrachlormethanem. Metody zaloţené na detekci oxidačního poškození organismu U pokusných zvířat se vyvolá oxidační stres a následně jsou podávány potraviny bohaté na antioxidanty. Příznaky poškození organismu je např. přítomnost 8- hydroxy-2 -deoxyguanosin v moči, v krvi nález karbonylovaných proteinů, TBARS (thiobarbituric acid reactive substances), hydroperoxidů a konjugovaných dienů, případně přítomnost F2-isoprostanu, etanu a pentanu ve vydechovaném vzduchu. Briggs-Rauscherova metoda [11], [13], [14], [15] Jde o novou vysoce citlivou metodu, která vyuţívá peroxylového radikálu malonátu (realizuje transport elektronů) případně acetonu nebo acetoacetátu. Reakce probíhá v prostředí blízkém ph ţaludku (ph = 2). Reakční směs obsahuje peroxid vodíku, jodičnan, manganaté ionty (katalyzátor) a silnou kyselinu jako je kyselina sírová nebo chloristá (zajišťuje kyselé prostředí). K takto připravenému roztoku se přidá antioxidant (např. malonát). Během reakce dochází k velmi výrazné vizuální změně vzorku. Čerstvě připravené vzorky jsou bezbarvé a jejich zbarvení se průběhem reakce pomalu mění přes jantarové na tmavě modré (podmíněno vznikem komplexu jodu a škrobu). Následně dochází k rychlému odbarvení, které je podmíněno redukcí jodu na jodid účinkem malonátu. Optimálním indikátorem je škrob jako ukazatel 15

zvyšující se koncentrace jodidu. Průběh reakce: Nejdříve dochází k reakci jodičnanu s peroxidem vodíku za vzniku kyseliny jodné HOI (9). Vzniklá kyselina jodná HOI reaguje s peroxidem vodíku za vzniku jodidu (10), který je rychle vychytáván reakcí s kyselinou jodnou (vzniklou v první reakci) za vzniku jodu (11). Se sniţující se koncentrací HOI, roste koncentrace jodu. Nahromaděním dostatečného mnoţství jodu vzniká komplex jodidu, jodu a škrobu, coţ se projeví tmavě modrým zbarvením (12). Volný jod je vyvazován malonátem, pokles koncentrace vede k odbarvení vzorku (13). V přítomnosti chloridových iontů je barevná oscilace potlačena. Dochází k cyklickým změnám barvy roztoku (více jak 40 cyklů za 8 minut). Kvantitativní hodnocení radikálu je oscilometrické. IO - 3 + 2 H 2 O 2 + H + HOI + 2O 2 + 2H 2 O (bezbarvý roztok) (9) HOI + H 2 O 2 I - + O 2 + H + + H 2 O (bezbarvý roztok) (10) I - + HOI + H + I 2 + H 2 O (jantarově zbarvený) (11) I - + I 2 + škrob (tmavě modré zbarvení) (12) I 2 + CH 2 (COOH) 2 ICH(COOH) 2 + H + + I - (13) 4.2. Přehled analytických metod použitých pro stanovení AOC (období 2002-2008) Pro stanovení antioxidantů je nutný výběr vhodné analytické metody. Další z problémů, se kterým se setkáváme při stanovení AOC v potravinách je uchovávání a zpracování vzorku extrakce účinných látek, přečištění a zakoncentrování. A také příprava vhodných standardů pro zjištění AOC. 4.2.1 Neprůtokové metody A) Elektrochemické metody Voltametrie (diferenční pulzní voltametrie DPV, stacionární voltametrie DCV) [17] Tato metoda je vhodná pro stanovení α-, β-, γ- a δ-tokoferolů v rostlinných olejích 16

Metoda je rychlá a levná v porovnání např. s HPLC. Dostatečně citlivá pro stanovení běţných koncentracích tokoferolů v olejích. Metoda je zaloţena na elektrochemické oxidaci tokoferolů na skleněné uhlíkové elektrodě. Amperometrické stanovení [18] Zaloţeno na amperometrické redukci červeně zbarveného radikálu DPPH. (2,2- difenyl-1-pikrylhydrazyl) na skleněné uhlíkové elektrodě. Reakce se provádí v tříelektrodové elektrochemické cele. Metoda je vhodná pro stanovení AOC jak ve vodných tak etanolických roztocích, čajích, víně a v různých nápojích. Vysoká hodnota korelačního koeficientu (0,9993) v porovnání s amperometrickou a spektroskopickou metodou při stanovení troloxu. Stanovení za pouţití biosenzoru [19] Metoda je zaloţena na pouţití enzymatického biosenzoru superoxiddismutázy (SOD), která reaguje na koncentraci přítomného superoxidového radikálu. Vznik radikálu je podmíněn přítomností systému xanthin/xanthinoxidáza. Porovnává se koncentrace v přítomnosti a v nepřítomnosti antioxidantu. Při této metodě měly vyšší hodnotu AOC vzorky, které byly homogenizované neţ vzorky připravené centrifugací. B) Spektrofotometrické metody Spektrofotometrické stanovení [20], [21] Metoda se hojně pouţívá pro stanovení AOC v krevní plazmě. Nevýhodou je interference s různými metabolity např. bilirubin, kys. močová, albumin nebo kys. askorbová. Jako antikoagulační činidlo se pouţívá K-EDTA nebo heparin, pouţití citrátu je nevhodné, protoţe dochází ke sníţení AOC aţ o 20%. Stanovení se provádí paralelně ve blanku a ve vzorku. Reakční směs obsahuje pufr, krevní plazmu a krocín (ve vodě nerozpustné ţluté barvivo vyizolované z šafránu setého). Reakce je iniciována přídavkem ABAP /2,2'-Azobis-(2-amidinopropan) dihydrochlorid/ zahřátého na teplotu lidského těla (37 0 C), který působí jako oxidační činidlo. K odbarvení krocínu, které je způsobeno peroxylovým radikálem vzniklým rozkladem ABAP, dochází během inkubace při teplotě 37 0 C po dobu 60-75 minut. Antioxidanty inhibují toto odbarvení. Blankový vzorek obsahuje krocín, 17

fosfátový pufr a plazmu. AOC se pak vypočte ze vztahu: 100 x (Abs 0 Abs sample )/Abs 0, kde Abs 0 je hodnota absorbance naměřená ve vzorku bez antioxidantu, Abs sample je hodnota absorbance ve vzorku v přítomnosti antioxidantu. 4.2.2 Průtokové metody Mezi metody, které jsou zaloţené na měření v nosném proudu patří kontinuální průtoková analýza (CFA), průtoková injekční analýza (FIA), segmentovaná průtoková analýza (SFA), sekvenční injekční analýza (SIA) a také kapalinová chromatografie [22]. Automatizace průtokových metod FIA a SIA má význam pro rutinní pouţití stanovení AOC a to jak v komplexním vzorku (např. lidská plazma) tak i v čistých substancích (kys. askorbová, polyfenoly...). V porovnání s ostatními metodami jsou více výkonné, umoţňují kontrolovat reakční podmínky v místě a čase. Nastavení a kontrola reakčních podmínek má význam hlavně u stanovení forem, které jsou citlivé na vlivy okolního prostředí (např. teplota, světlo, přítomnost kyslíku...). Během posledních 3 let došlo k nárůstu publikací zabývajících se vyuţitím průtokových metod ke stanovení AOC (nejsou zde zahrnuty informace za rok 2008). Ve většině případů bylo stanovení AOC zaloţeno na odbarvení barevných radikálů a to buď ABTS+ (42%) nebo DPPH. (15%), které v reakci simulují ROS nebo RNS v systémech in vivo. Příklady vyuţití průtokových metod zaloţené na stanovení AOC proti ABTS+ znázorňuje tabulka 2 a stanovení AOC proti DPPH. znázorňuje tabulka 3. Předpokladem automatizace je tvorba ABTS+ in-line v systému a to buď elektrochemickou oxidací nebo enzymaticky. Další metody vycházely z amperometrického stanovení elektrochemického indexu (31%) a ve 12% případů byly pouţity jiné metody pro stanovení AOC [16]. Tomuto typu metod bude věnována samostatná kapitola, kde bude podrobně probrán princip, instrumentace a výhody systémů FIA a SIA. 18

Tabulka 2: Příklady pouţití průtokových metod pro stanovení AOC proti ABTS+ [16]. Průtoková metoda FIA [16] FIA [16] FIA [16] Tvorba radikálu Detekce Rychlost stanovení (hod -1 ) Typ vzorku chemicky Vis (734 nm) 30 vzorků pivo, káva, (K 2 S 2 O 8 ) kola, dţus, čaj chemicky Vis (není dáno) ~ 22 vzorků bílé víno, (K 2 S 2 O 8 ) plazma enzymaticky Vis (414 nm) 120 vzorků med a víno (H 2 O 2 +peroxidáza) FIA [16] elektrochemicky Vis (734 nm) 32 vzorků káva, červené víno,čaj FIA [16] enzymaticky (H 2 O 2 +peroxidáza) amperometrická 42 vzorků dţus, čaj, víno FIA [16] enzymaticky (glukóza +GOD/ H 2 O 2 + peroxidáza) amperometrická ~ 37 vzorků lihoviny a víno SIA [16] SIA [16] MSFIA [16] chemická (K 2 S 2 O 8 ) chemická (K 2 S 2 O 8 ) enzymatická (H 2 O 2 +peroxidáza) Vis (734 nm) 9-20 vzorků pivo, dţus, mléko, čaj, jogurt Vis (734 nm) 15 nebo 42 vzorků Vis (734 nm) 12 nebo 18 vzorků MSFIA = vícekanálový FIA systém, GOD = glukózooxidáza víno pivo, dţus, čaj, víno Tabulka 3: Příklady pouţití průtokových metod pro stanovení AOC proti DPPH. [16]. Průtoková metoda Detekce Rychlost stanovení Typ vzorku (hod -1 ) FIA [16] ESR 13 vzorků káva, červené víno, čaj SIA [16] Vis (525 nm) 45 vzorků rostlinné a houbové extrakty MSFIA [16] Vis (517 nm) 13 vzorků pivo, dţus, čaj, víno MSFIA [16] Vis (517 nm) 14 vzorků nevhodné MSFIA = vícekanálový FIA systém, ESR = elektronová spinová rezonanční spektroskopie 19

5. Průtokové metody instrumentace, princip Jde o jednoduché a instrumentálně nenáročné metody. Samotné stanovení je velmi rychlé, ale před kaţdým měřením je nutná optimalizace (objem dávkovaného vzorku, průtoková rychlost, délka reakční cívky, koncentrace činidel...), která je poměrné časově náročná. Pro tento typ analytických metod je charakteristický nosný proud činidla, s kterým se mísí vzorek a dochází tak k chemické reakci. Výsledný produkt je následně detekován v detektoru. Výhodou je dávkování přesných a poměrně malých objemů vzorku, nedochází tak k velké spotřebě reagencií. Metody jsou tedy velmi šetrné k ţivotnímu prostředí. Chemikálie jsou nasávány do systému přímo ze zásobních lahví pomocí systému hadiček, pracovník tedy přichází pouze minimálně do kontaktu s chemikáliemi. Je zde moţnost automatizace a sériového stanovení vzorků. Mezi metody, které jsou zaloţené na měření v nosném proudu patří kontinuální průtoková analýza (CFA), průtoková injekční analýza (FIA), segmentovaná průtoková analýza (SFA), sekvenční injekční analýza (SIA) a také kapalinová chromatografie, kde je nutné nejdříve provést separaci. Zde se budeme blíţe zabývat pouze metodou SIA, ale povaţuji za vhodné zmínit v této souvislosti i metodu FIA. [22] 5.1. FIA Průtoková rychlost je většinou 1 ml/min, objem vzorku reagující s nosným proudem je většinou 100 μl a vzorková frekvence 2 vzorky/min. [22], [23], [24]. Instrumentace (obr. 5): zásobní lahve s nosným proudem, peristaltická pumpa, injekční ventil, reakční smyčka, mísící smyčka, detektor, odpad. Obr. 5: Schéma FIA systému [27]. 20

Nosný proud je čerpán přímo ze zásobní lahve. Kontinuální průtok nosného proudu je zajištěn kvalitní peristaltickou pumpou s potlačením pulzace. Důleţitou součástí je injekční ventil, který slouţí k nadávkování přesného objemu vzorku. Vzorkem se naplní reakční smyčka a pootočením ventilu je vzorek nadávkován přímo do nosného proudu. Následuje mísící cívka, kde dochází k chemické reakci. U této metody není nutné, aby reakce proběhla aţ do ustálení chemické nebo komplexotvorné rovnováhy. Vyuţívá se zde kontrolované disperze vzorku, která je pro FIA charakteristická. Roztok vzorku se rozmývá v nosném proudu a vzniká tak koncentrační gradient. Tento koncentrační gradient se vyjádří pomocí disperzního koeficientu D je dán poměrem původní koncentrace analytu ve vzorku, který je aplikován do nosného proudu, a koncentrace odpovídající aktuální disperzi (14). Výpočet disperzního koeficientu: D = C 0 / C max (14) D...disperzní koeficient C 0.....původní koncentrace analytu ve vzorku (v čase 0) C max...koncentrace odpovídající aktuální disperzi v systému Hodnota disperzního koeficientu je vţdy větší neţ 1 a odečítá se v bodě odpovídající maximální koncentraci (C max ). Pak jde o D max. Rozlišujeme tři druhy disperze a to: omezená disperze, kde D = 1-3 střední disperze, kde D = 3-10 velká disperze, kde D = 10 Můţe docházet k disperzi vzorku s výraznými analytickým vlastnostmi, aniţ by došlo k reakci s nosným proudem. Nebo můţe docházet k disperzi a součastně k reakci s nosným proudem, kdy vzniká produkt s výraznými analytickými vlastnostmi. Detektor detekuje určitý fyzikální parametr vzniklého produktu a následně je proměřený produkt odveden do odpadní lahve. Detekce můţe být amperometrická, fluorimetrická, spektrofotometrická, je moţné vyuţít i potenciometrii s iontově selektivními elektrodami. Výsledkem měření je pík, který je dán závislostí signálu na čase. Plocha pod píkem odpovídá koncentraci analytu ve vzorku. Tvar a výška píku 21

závisí na objemu vzorku (s rostoucím objemem roste výška a šířka), délce reakčních smyček (s rostoucí délkou se pík rozšiřuje a výška klesá) a parametrech systému (průtoková rychlost, čerpané objemy, vnitřní objem detekční cely...). Je moţné přivádět i více vzorku nebo reagencií do nosného proudu najednou. K tomu je však nutná manuální přestavba systému, kdy je vyměněna mísící smyčka vícekanálový FIA systém (MSFIA). Pro niţší detekční limit se s výhodou pouţívá tzv. stop flow měření. Nosný proud je pozastaven přímo v detekční cele detektoru, dochází k nárůstu měřeného produktu a tím i signálu (odezvy). Lze pozorovat i kinetiku reakce. Jsou reálné různé modifikace tohoto systému, lze napojit např. plněné reaktory (vhodné pro oxidaci, redukci, solid phase extrakci SPE, absorpci...), separační jednotky (liquid-liquid extrakce LLE, difúze, dialýza...), termostatované reaktory, reaktory pro UV rozklad, imunoreaktory, speciální detekční cely aj. Je moţné provádět i on-line extrakci a není proto nutné upravovat vzorek před samotnou analýzou. Je moţné provádět extrakci kapalina-kapalina, kapalina-plyn a i SPE. Aby byla zajištěna reprodukovatelnost, je nutné dodrţet při měření vţdy stejné reakční podmínky. Vysoce všestranným, spolehlivým a kompaktním systémem je tzv. FIA Lab on valve. Tento systém spojuje jednotlivé komponenty do jednoho celku napojením na jeden vícepolohový ventil. 5.2. SIA Instrumentace (obr. 6): zásobní lahve s nosným činidlem, pístová pumpa, dvoucestný selekční ventil, mísící cívka, vícecestný ventil (6- aţ 10-cestný ventil), detektor, odpad [22], [24], [25] a [26]. Metoda je odvozena od FIA. V porovnání s FIA se zde ale nepouţívá kontinuální tok nosného proudu a činidel. SIA systém musí být ovládán počítačem s vyuţitím vhodného programu. SIA metoda je robustní; vysoké reprodukovatelnosti je dosaţeno díky přesné sekvenci jednotlivých kroků. Nevýhodou je niţší frekvence dávkování vzorku. 22

Obr. 6: Schéma SIA systému [27]. Velmi přesné dávkování malých objemů vzorku a činidla a řízené časování jednotlivých kroků umoţňuje sledovat kinetiku reakcí. Pomocí přepínání portů vícecestného ventilu dojde nejdřív k nadávkování jednotlivých činidel a vzorku ve formě zón do mísící smyčky. Během analýzy dochází k dostatečnému promísení vzorku s nosným proudem a reagenciemi, coţ je uskutečněno nízkotlakou obousměrnou pístovou pumpou, která kromě nasání nosného proudu umoţňuje otočení toku. Opakovanou změnou směru toku dojde k dostatečnému promísení a překryvu jednotlivých zón za vzniku produktu. Díky změně toku je i menší spotřeba činidel, minimální odpad a je tak moţné pracovat i s drahými činidly. Rychlost průtoku, objem dávkovaného mnoţství, dávkování jednotlivých činidel, optimalizace systému, přesné načasování jednotlivých kroků, to vše je realizováno pomocí speciálního softwaru a díky tomu je dosaţeno vysoké reprodukovatelnosti. Pomocí softwaru lze zvolit porty vícecestného ventilu, z kterých budou čerpány reagencie, není proto nutné manuálně přestavět celý systém pro pouţití více reagencií najednou. Lze nastavit poţadovanou rychlost toku činidla: - rychlý průtok pro promývání nebo plnění systému nosným proudem (100 200 μl/s), - střední průtok pro nástřik pomocných látek např. pufru (50 μl/s), - nízký průtok pro nástřik vzorku a činidla (20 μl/s) nebo - velmi nízký průtok (10 μl/s), který se vyuţívá při průchodu vzniklého produktu detektorem. Rychlost závisí také na typu chemické reakce, stabilitě produktu, detektoru, objemu detekční cely, citlivosti metody. 23

Podobně jako u FIA i zde mohou být zařazeny další přídatné systémy pro on-line úpravu vzorku (zakoncentrování, ředění, SPE), on-line odebírání vzorku ze systému a také je vyuţíván systém Lab on valve. 6. Stanovení AOC v potravinách metodou SIA Stručný přehled moţností vyuţití SIA pro stanovení AOC v různých potravinách a potravinových doplňcích zobrazuje tabulka 4. Tabulka 4: Přehled vyuţití SIA. Detekce Vzorek Rychlost AOC proti Citace analýzy radikálům chemiluminiscenční potraviny, 1 vzorek/2min. O 2., NO. [28] (pouţit luminol) farmaceutické doplňky spektrofotometrická červené a bílé 42 vzorků/hod. ABTS+ [29] víno fluorescenční červené a bílé 22 vzorků/hod. H 2 O 2 [29] spektrofotometrická (DAD) víno léčivé byliny, houby 45 vzorků/hod. DPPH. [31] DAD = diode-array detector 6.1. SIA s chemiluminiscenční detekcí Metoda SIA byla pouţita pro určení AOC proti superoxidovému radikálu (O 2.) a proti radikálu oxidu dusnatého (NO.) za vyuţití chemiluminiscenční detekce [28]. Jde o velmi rychlé stanovení, reprodukovatelné, které je vhodné pro screening potravin a farmaceutických doplňků. V tomto případě byla metoda pouţita k porovnání AOC tří různých multivitaminových doplňků (A-C) ve formě tablet. Tablety obsahovaly celou řadu antioxidantů, ale nejvíce byly zastoupeny kyselina askorbová, α-tokoferol a retinol. Jako chemiluminiscenční činidlo zde byl pouţit luminol rozpuštěný v N,Ndimethylformamidu (DMF). Luminol při reakci se superoxidovým radikálem a 24

radikálem oxidu dusnatého vykazuje intenzivní chemiluminiscenci. Projevem antioxidační aktivity antioxidačních látek, které zajišťují odklizení volných radikálů O 2. a NO., je pokles intenzity chemiluminiscence luminolu. Vyuţívá se zde tedy nepřímého měření AOC, kdy výsledný změřený signál je dán koncentrací volných radikálů. Pro tvorbu superoxidového radikálu byl pouţit systém hypoxantin/xantinoxidáza (HX/XO) a jako zdroj radikálu oxidu dusnatého byl pouţit NOR1 /(±)-(E)-4-methyl-2- [(E)-hydroxyimino]-5-nitro-6-methoxy-3-hexenamid/, který byl rozpuštěn ve směsi kyseliny chlorovodíkové a dimethylsulfoxidu (DMSO). V systému byly pouţity dvě pístové pumpy, dvě mísící smyčky, dva 6-cestné selekční ventily, HPLC pumpa pro přívod luminolu a chemiluminiscenční detektor. Celý proces byl řízen softwarem. Jednotlivé vzorky byly připraveny následujícím způsobem. Rozdrcením 5 tablet daného multivitaminového přípravku byl získán prášek, 4 mg tohoto prášku se rozpustily v 1 ml DMSO, rozpouštění bylo usnadněno pouţitím ultrazvukové lázně. Následovala filtrace a vzniklý filtrát se zředil vodou na poţadovanou koncentraci. Tímto způsobem byly připraveny vzorky všech tří testovaných přípravků (A-C). Nejdříve se stanovila AOC proti NO. a poté proti O 2.. V obou případech byl jako nosný proud pouţit roztok N-2-hydroxyethyl piperazin-n -2-ethansulfonová kyselina a hydroxidu sodného HEPES-NaOH pufr. Systém byl nejdřív naplněn nosným proudem a pak byly postupně nastříknuty zóny vzorků buď s obsahem nebo bez obsahu antioxidantů a následně reagencie pro tvorbu volných radikálu. V případě NO. to byl NOR1 a pro O 2. systém HX/XO. Změnou směru toku došlo k dostatečnému promísení, vzniklé radikály byly odklizeny antioxidanty přítomnými ve vzorku a pootočením selekčního ventilu putovala zóna do detektoru. Těsně před vstupem do detektoru byl pomocí HPLC pumpy přiveden luminol, který interagoval se zónou, došlo opět k promísení zón a výsledný produkt byl přiveden do detektoru. Všechna měření byla prováděná třikrát a při teplotě 24 ± 4 0 C. Doba analýzy jednoho vzorku trvala 2 minuty. Intenzita chemiluminiscence je dána volnými radikály, které nebyly odstraněny antioxidanty. AOC (%) se pak vypočte ze vztahu (15): 25

AOC(%) = (CLI B CLI S ) / CLI B x 100 (15) CLI B...intenzita chemiluminiscence blanku CLI S...intenzita chemiluminiscence ve vzorku Koncentrace vzorku, jehoţ AOC proti O 2. a NO. radikálům dosahuje 50%, se označuje jako IC 50 a tato hodnota je pouţita pro srovnání účinnosti jednotlivých antioxidantů. Hodnota IC 50 byla vypočtena regresí AOC vztaţené k logaritmické koncentraci jednotlivých vzorků. To znamená, ţe čím niţší hodnota IC 50, tím vyšší účinnost antioxidantu. Přehled dosaţených hodnot IC 50 kyseliny askorbové, α-tokoferolu a retinolu je zobrazeno v tabulce 5. Z těchto údajů vyplývá, ţe nejúčinnějším přípravkem v boji proti radikálu oxidu dusnatého i proti superoxidovému radikálu je přípravek A, který v porovnání s ostatními přípravky má vyšší obsah kyseliny askorbové. Tabulka 5: Procentuální obsah antioxidantů ve vzorku a hodnota IC 50 pro jednotlivé vzorky [28]. vzorky Obsah antioxidantů ve vzorku v % (w/w) IC 50 (μg/ml) proti k. askorbová α-tokoferolu retinol NO. - O 2 A 19 1,9 1,2 65 154 B 2,5 0,3 0,009 644 1074 C 0,8 0,07 0,004 206 3320 Pro dosaţení maximálního trvání relativní chemiluminiscenční intenzity (RCI) blanku je nutná optimalizace SIA systému. A to optimalizace průtokové rychlosti, aspirovaných objemů a koncentrací činidel. 6.2. SIA se spektrofotometrickou a fluorescenční detekcí Bylo prokázáno, ţe poţívání vína v malém mnoţství blahodárně působí na kardiovaskulární systém. V tomto případě byla metoda SIA pouţita pro srovnání AOC 26

ve 20 vzorcích červeného a bílého vína z různých regionů Portugalska [29]. Díky všestrannosti SIA lze provést stanovení pomocí dvou metodik současně. Jedna metodika je zaloţena na odbarvení ABTS+ radikálu /2,2 -azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6- sulfonová kyselina/ s vyuţitím spektrofotometrické detekce. Druhá metodika je zaměřena na stanovení aktivity látek schopných vychytávat radikál peroxidu vodíku (hydrogen peroxide scavenging activity assay = HPSA). Přítomné radikály zajišťují oxidaci kyseliny vanilové (homovanillic acid = HVA) na fluoreskující dimer, coţ je podpořeno peroxidázou. Přítomnost antioxidantů vede k poklesu intenzity fluorescence. V obou případech dochází k výrazné chemické reakci. Stanovení bylo zaměřeno na kyselinu galovou, kávovou, askorbovou, katechin a taxifolin, které jsou hojně zastoupeny ve víně. Pro srovnání jejich AOC a HPSA byl pouţit jako standard trolox (metoda TEAC). TEAC je definována jako koncentrace troloxu s AOC odpovídající 1 mm roztoku vzorku. K získání ABTS+ radikálu byla pouţita reakce ABTS se síranem draselným. Vzniklý roztok byl skladován v tmavé místnosti po dobu 12 hodin a aţ před vlastním pouţitím byl naředěn vodou v poměru 1:25. K tvorbě fluorescenčního dimeru byl připraven roztok peroxidu vodíku a kyseliny vanilové, který se připravuje čerstvý pro kaţdý den. Vzorky červeného vína byly naředěny 1:250 pro stanovení AOC proti H 2 O 2 a 1:2000 proti ABTS+. Vzorky bílého vína pak na 1:25 pro stanovení AOC proti H 2 O 2 a 1:400 proti ABTS+. V SIA systému byl pouţit 10-cestný ventil, peristaltická pumpy, mísící smyčka (3 m), 1 metr dlouhá reakční smyčka pro spektrofotometrickou detekci a 2 metry dlouhá reakční smyčka pro fluorimetrickou detekci. Ze všeho nejdřív je proměřen blank a vzniklý signál odpovídá maximu absorbance nebo fluorescence v nepřítomnosti antioxidantů. Signály měřených vzorků jsou niţší neţ blanku. Analytický cyklus začíná postupným nástřikem H 2 O 2, peroxidázy a HVA. Postupným nástřikem jsou zajištěny optimální výsledky. Změnou směru toku dojde k promísení jednotlivých zón a následně vstupu do fluorescenčního detektoru. Vzniklý signál odpovídá aktivitě látek odstraňující radikály peroxidu vodíku. Peroxidáza zajišťuje počáteční fluorescenční signál, díky kterému je zjištěna aktivita látek odstraňujících radiál peroxidu vodíku (tzv. scavenging activity). Fluorescenční detektor je citlivý na teplotu, je zde nutná kontrola teploty (udrţování na hodnotě 20 ± 0,5 0 C). Cyklus pokračuje nástřikem ABTS mezi dvě zóny vzorku, čímţ je zajištěno lepší promísení. Pak dochází k detekci se spektrofotometru. Vzniklý signál odpovídá AOC. 27

Na toto stanovení nemá vliv teplota. Ředění vzorků pro ABTS bylo provedeno in-line přímo v systému. Ředění je realizováno pouţitím dvou ředících smyček napojených na selekční ventil. Touto metodou lze stanovit aţ 30 vzorků za hodinu a lze ji pouţít pro široké koncentrační rozmezí. Výhodou je, ţe během jednoho analytického cyklu lze provést dvě stanovení. To vede k zisku informací o dvou měřených parametrech v kaţdém vzorku a to za krátký čas. Analýzou byly zjištěny výrazné rozdíly mezi jednotlivými typy vín v závislosti na regionu, kde se dané víno pěstuje. Při stanovení v červeném víně se hodnoty AOC vztaţené na koncentraci troloxu (TEAC) pohybovaly v rozmezí 3,13 (± 0,06) aţ 17,5 (± 0,3) mm, při stanovení v bílém víně byly hodnoty v rozmezí 0,81 (± 0,01) aţ 2,91 (± 0,06) mm. Při stanovení HPSA se hodnoty u červeného vína pohybovaly v rozmezí 0,086 (± 0,004) aţ 0,99 (± 0,05) mm a u bílého vína pak v rozmezí 0,012 (± 0,002) aţ 0,21 (± 0,01) mm. V obou stanovení byla dosaţena vyšší AOC v červeném víně neţ v bílém, coţ je dáno přítomností vysokého obsahu polyfenolů. Na rozdíl od bílého vína, kde se antioxidanty dostávají aţ během výrobního procesu. V porovnání s troloxem mají ale antioxidanty ve víně niţší účinek neţ trolox za stejných podmínek. Pouze kyselina galová dosáhla v obou stanovení podobných hodnot jako trolox. Na podobném principu bylo zaloţeno stanovení antioxidantů v různých nápojích, a potravinových doplňků jako např. ovocný dţus, osvěţující nápoj, černý a zelený čaj, nápoje (piva) a mléčné výrobky (mléko, jogurt). V tomto případě byla jako standard pouţita kyselina askorbová [30]. 6.3. SIA se spektrofotometrickou detekcí (DAD) V tomto případě byla metoda pouţita pro stanovení AOC ve zpracovaných lyofilizovaných extraktech hub a bylin [31]. Ke stanovení je potřeba pouze několik miligramů vzorku. Stanovení AOC bylo zaloţeno na redukci 2,2 -diphenyl-1- picrylhydrazylového radikálu (DPPH.) antioxidanty ve vodném nebo vodnoorganickém mediu. Účinkem antioxidantu, který svou činností sniţuje zastoupení 28

DPPH. radikálu ve vzorku, došlo k odbarvení roztoku. Výsledná absorbance vzorku pak byla porovnána s absorbancí blanku. Vhodnou optimalizací SIA metody lze detekovat i mikromolární koncentrace roztoků kyseliny askorbové, kyseliny kávové, katechinu, epikatechinu a rutinu. Touto metodou je moţné analyzovat aţ 45 vzorků za hodinu. Samotné metody zaloţené na redukci DPPH. radikálu jsou velmi časově náročné, kdy reakce trvá i 16-30 minut. Toto jde urychlit separací pomocí HPLC a následnou post-column detekcí antioxidantů ve směsi s DPPH. Ve spojení této metody se SIA je dosaţeno vyšší rychlosti zpracování vzorku. Je tedy vhodná pro sériové zpracování vzorků a pro rutinní screening. Byl pouţit SIA systém sloţený z peristaltické pumpy, mísící smyčka, 6-cestného selekčního ventilu, UV-VIS spektrofotometr s průtokovou Z-celou, ph metr pro měření ph a příslušný software. Nejdříve byla zjištěna spektrální charakteristika a stabilita DPPH v methanolu, ethanolu, roztok methanol-voda (1:1) a v roztoku ethanol-voda (1:1) bez přítomnosti antioxidantů. Všechna měření byla opakována 3x a nástřik vzorku byl opakován 10x. Stabilita DPPH ve vodném roztoku 50% ethanolu byla vyšší (1% pokles absorbance za 1 hodinu) neţ v čistém methanolu (2% pokles absorbance za 1 hodinu). Jako nosný proud byl proto pouţit vodný roztok 50% ethanolu. Optimalizace parametrů SIA systému byla provedena pomocí směsi 0,1 mm DPPH v prostředí ethanol-voda (1:1) a 0,1 mm katechinu v prostředí ethanol-voda (1:1). Bylo nutné dosáhnout maximální hodnoty účinnosti odbarvení DPPH. Index účinnosti odbarvení je vyjádřen v procentech a je charakterizován jako relativní sníţení výšky píku absorbance DPPH po nástřiku antioxidantu (16). Za optimalizovaných podmínek je procento odbarvení DPPH závislé na koncentraci antioxidantů v koncentračním rozmezí 0,01 0,4 mm kyseliny askorbové, kyseliny kávové, rutinu, katechinu a epikatechinu. %Q = 1 A x / A 0 x 100 (16) A x...absorbance blanku A 0...absorbance vzorku Byl zkoumán i vliv kyselosti roztoku antioxidantů na procentu odbarvení. Měření bylo provedeno při ph 4 aţ 7 za pouţití McIlvainova pufru (citrát-fosfátového pufru). 29

Procento odbarvení DPPH roztoku účinkem rutinu a kávové kyseliny bylo zkoumáno při ph 4,8 (citrát-fosfátový pufr v 50% ethanolu) ve více kyselém nebo alkalickém ph je procento odbarvení niţší. Doporučují zde proto pouţívat pro SIA měření ph okolo 5 nebo provést měření v mediu bez ovlivnění ph. Extrakt hub byl připraven následujícím způsobem. Houby byly zmraţeny účinkem tekutého dusíku a 1-5 g bylo rozmělněno. Následovala extrakce vodným roztokem 70% ethanolu v ultrazvukové lázni (10 minut). Směs byla filtrována a nerozpustné zbytky byly ještě 3x promyty 10 ml vodným roztokem 70% ethanolu. Ve vakuové odparce byl filtrát zakoncentrován na 1/5 objemu. Koncentrát byl smíchán s 5 ml vody a následně znovu filtrován na křemelinové půdě, vzniklý filtrát byl zakoncentrován na sirupovou konzistenci ve vakuovém evaporátoru. Následovala lyofilizace. Lyofilizát byl potřísněn tekutým dusíkem, rozmělněn a přenesen do vialky kde byl pročištěn argonem. Vzorek byl před vlastním měřením skladován při teplotě -23 aţ -27 0 C. Jako nosný proud byl tedy pouţit vodný roztok 50% ethanolu, dostatečné promísení zón roztoku a činidla je zajištěno nástřikem DPPH mezi dvě zóny vzorku obsahující antioxidanty. Následuje stop-flow (20 s) měření v detektoru a záznam píku. Pro kaţdý vzorek je měření opakováno 3x. Výsledky vzorků, které vykazovaly vysoké procento odbarvení, byly ještě zkontrolovány pomocí DPPH-metody. Ţádný z těchto vzorků se neukázal jako falešně pozitivní. Vzorky, které vykazovaly procento odbarvení 5%, byly označeny jako negativní. Negativita se potvrdila i při pouţití metody DPPH, kdy se procento odbarvení pohybovalo v rozmezí 3-9%. 30

7. Souhrn Tato práce zahrnuje přehled analytických metod a metod pouţívaných ke stanovení biologicky aktivních látek, a to konkrétně stanovení antioxidantů v potravinách a potravinových doplňcích. Pozornost byla zaměřena hlavně na průtokové metody, a to na sekvenční injekční analýzu. Informace pouţité v této práci byly čerpány z literatury za období 2002-2008 a pro jejich vyhledání byly pouţity databáze ScienceDirect, SpringerLink a PubMed. Jsou zde zahrnuty všeobecné informace o vlastnostech volných radikálů a jejich neţádoucích vlivech na lidské zdraví a také význam antioxidantů, které chrání lidský organismus proti nadměrnému hromadění vysoce reaktivních volných radikálů. V poslední době je této problematice věnována vysoká pozornost v různých odvětvích např. medicína, potravinářský průmysl, farmacie, diagnostika, screening... Samostatná kapitola je zaměřena na jednotlivé metody jako je TEAC, FRAP, ORAC, Briggs Rauscherova metoda a jiné, které jsou pouţívané pro stanovení antioxidační kapacity nejen v potravinách ale i např. v lidské plazmě. U kaţdé z metod je naznačen princip, na kterém je stanovení zaloţeno. Následuje přehled analytických metod, které jsou nejčastěji pouţívány pro tento typ stanovení. Detailněji jsou popsány průtokové metody, jak jiţ bylo zmíněno výše. Jsou zde zdůrazněny výhody systému SIA, jako je velmi nízká spotřeba vzorků a reagencií, s čímţ souvisí nízká zátěţ pro ţivotní prostředí a ekonomické náklady, nespornou výhodou je rychlost provedení analýz a automatizace. Veškeré naplánované kroky jsou řízeny speciálním softwarem a tím je zajištěna reprodukovatelnost a jsou tak eliminovaný lidské chyby. Pro tyto výhody je tento systém vyuţíván, čím dál tím více a to v různých oblastech. Nakonec jsou uvedeny konkrétní příklady stanovení AOC pomocí SIA systému lišící se detekcí a principy, na kterých je stanovení zaloţeno. 31