ALK testing algorithms and Czech registry of NSCLC. Aleš Ryška University Hospital, Hradec Králové

ALK testing algorithms and Czech registry of NSCLC Aleš Ryška University Hospital, Hradec Králové

Concept of targeted therapy The ultimate goal of personalised medicine is to define a disease sufficiently to enable identification and treatment of only those patients most likely to respond Heinemann V, et al. Cancer Treat Rev 213 DOI 1.116/j.ctrv.212.12.11.

Current situation pure morphology insufficient for diagnosis all countries of central European region - routine immunohistochemical testing of poorly differentiated NSCLC various awareness of pathologists in different regions proportion of NSCLC NOS varies significantly (.83%) % of NOS cases - inverse relationship to IHC demonstration of squamous (p63, p4, CK 5/6) and glandular (TTF1, CK7, napsin) differentiation

Journal of Thoracic Oncology Volume 5, Number 1, October 21

EGFR - current situation testing of EGFR = routine practice in all countries adenocarcinoma, NSCLC favor adenoca and NSCLC NOS testing upon clinical request (Serbia, Croatia, Lithuania) reflex testing (Austria, Czech Republic) reimbursement is a significant issue

EGFR - current situation frequency of EGFR mut = 8 to 15% all patients or only selected by certain clinical criteria (e.g. non-smokers) depends on local consensus between treating physicians and pathologists

Sequist LV et al.: Ann Oncol 22: 2616 2624, 211

EML4-ALK aberrant fusion gene encodes a cytoplasmic chimeric protein with constitutive kinase activity multiple EML4-ALK chimeric variants breakpoints within various EML4 exons other fusion partners (KIF5B, TFG, ) Soda M et al.: Nature 27; 448:561 566.

EML4-ALK uncommon, occurring in 2 to 7% of all non small-cell lung cancers more prevalent - neversmokers or history of light smoking more prevalent - in adenocarcinomas molecular subgroup - tumors susceptible to targeted kinase inhibition

Eunice L. Kwak EL et al.: N Engl J Med 21;363:1693-73

Sasaki T et al.: Eur J Cancer 46;(21): 1773 178

How to identify ALK+ patients? several methods FISH (CISH) currently gold standard IHC Multiplex RT-PCR

FISH/CISH Pros: Specificity Sensitivity Reliability Cons: Costs Difficult interpretation Loss of signal Special equipment availability issues

Kim H et al.: J Thorac Oncol. 211;6: 1359 1366

Atherly AJ, Camidge DR: Br J Canc (212) 16, 11 116

IHC Pros: Costs Specificity Reliability Interpretation is less difficult Stability of staining Automatization Availability Cons: Sensitivity (???)

D5F3 D9E4 ALK1 D5F3 ALK1 Mino-Kenudson M et al.: Clin Cancer Res 21; 16(5); 1561 71

D5F3 ALK1 Mino-Kenudson M et al.: Clin Cancer Res 21; 16(5); 1561 71

Novocastra, Clone 5A4, 1:5 dilution Bond Polymer Refine detection kit 262 patients, non-squamous cell histology 26 biopsies + 56 resection specimens EGFR wild-type or non-responders to EGFR TKI therapy Park HS, et al.: Lung Cancer (212), doi:1.116/j.lungcan.212.3.4 - in press

735 NSCLC 28 (3.8%) ALK FISH + 5A4, Novocastra, 1:3 Ventana immunostainer Paik JH, et al. Lung Cancer (211), doi:1.116/j.lungcan.211.11.8 - in press

J Thorac Oncol. 213;8: 45 51

Czech experience Validation study 17 preselected cases of LAca (123 resection specimens, 47 endobronchial biopsies) TMA 5 different primary antibodies, FISH as golden standard 5.26% of ALK rearranged cases detection - VENTANA BenchMark ULTRA 3 protocols feasible: D5F3, Cell Signaling cocktail D5F3 (Cell Signaling) + polyclonal ZAL4 (Invitrogen) 5A4, Novocastra (Leica) Sensitivity 1%, specificity 86-1%

Czech experience Total positivity (preselected series!) 5.26% cases with ALK rearrangement variant 1 Sen variant 1 Spec variant 2 Sen variant 2 variant 3 Spec Sen variant 3 Spec 1+ 1 % (8/8) 95.54 % (17/112) 1 % (1/1) 86.4 % (148/172) 1 % (1/1) 95.42 % (146/153) >1+ 1 % (8/8) 99.7 % (17/18) 9 % (9/1) 99.33 % (148/149) 1 % (1/1) 99.32 % (146/147)

J Thorac Oncol. 213;8: 883-891

Conclusion None method is perfect Solution must be pragmatic and feasible As many patients tested as possible As sensitive/specific method as possible Preanalytical phase absolutely crucial! Validation and quality control Financial issues

Key challenges for testing Awareness of new classification (211) Access to up-to-date cyto/histopathological diagnostics (incl. IHC) Availability of testing (for smaller centers) Limited specimens Optimal sequence (typing, EGFR, ALK) Satisfactory turnaround time Reimbursement

Clinician (bronchologist/pneumooncologist) Pathologist/mol. geneticist)

Clinician Pathologist (prim.) Pathologist (cent) Molecular geneticist Local oncologist Pneumooncologist

Czech experience National consensus interdisciplinary consensus conference 1 in 2 years Guidelines Regular updating Selection of laboratories for testing of predictive markers (1 for EGFR & ALK)

Are all eligible patients tested?

Počet vyšetření dle data vyšetření N = 18 844 25 1976 Počet vyšetření 2 1871 1544 1618 15 121 12 173 176 152 15 1 823 892 132 98 757 584 5 178 * 1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4. 1. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. čtvrt. 21 211 212 213 214 Datum vyšetření vzorku Pro Referenční centrum 6 jsou k dispozici kompletní data od roku 212. Pro Referenční centrum 8 jsou k dispozici kompletní data pouze za rok 211. Pro Referenční centrum 5 stejně tak Referenční centrum 7 jsou k dispozici data od roku 213. * Jedná se o průběžná data k únoru 214 45

Vzorky vyšetřené od 1.1.213 do 31.12.213 Grade N = 79 vyšetření Podíl vyšetření % 2% Referenční centrum 4 6,5 Referenční centrum 2 Referenční centrum 6 Referenční centrum 3 4% 6% 62,8 12,3 57,3 28,2 46,1 24,4 8% 1% 3,8 N= 478 3,5 N= 1133 25,7 41,3 34,2 N= 571 N= 818 Grade 1 Referenční centrum 1 46,3 41,7 12,1 N= 2388 Grade 2 Referenční centrum 5 31,6 Referenční centrum 7 32,3 Celkem 3,7 45,8 55,4 47,6 22,6 12,3 21,7 N= 117 Grade 3 N= 514 N= 79 48

Vzorky vyšetřené od 1.1.213 do 31.12.213 Referenční centrum 4 8 Vyplněno u 329 (68,8%) vyšetření. Referenční centrum 2 Vyplněno u 1115 (98,4%) vyšetření. 6 6 4 4 23,4 2 11,9 1, 2 18,5 8 Vyplněno u 561 (98,2%) vyšetření. 6 6 78,4 Referenční centrum 1 73,9 Vyplněno u 2129 (89,2%) vyšetření. Vyplněno u 816 (99,8%) vyšetření. 6 44, 4 4 2,5 2 16,6 2 3,6 1,1 1,4 1,4 1,1 1,6 2,9 5,9 16,3 2 9,8 11 11-2 21-3 31-4 41-5 51-6 61-7 71-8 81-9 91-1 8 4 1,7,2,4,1,1,4,4,2 1,7 Referenční centrum 5 71,7 8 Vyplněno u 176 (97,2%) vyšetření. 6 4 4 2 1,4 2,3 1,,7,7,4,4 1,3 2,8 Referenční centrum 7 8 Vyplněno u 512 (99,6%) vyšetření. 6 8,4 Všechny laboratoře 62,1 Vyplněno u 6538 (93,3%) vyšetření. 52, 6 4 2 13,7 2,1 1,,,4 1, 1,6 4,1 1, 14,3 2,1 1,,7,7,8 1,1 1,5 4,3 1,6 11 11-2 21-3 31-4 41-5 51-6 61-7 71-8 81-9 91-1 2 15,1 11 11-2 21-3 31-4 41-5 51-6 61-7 71-8 81-9 91-1 7, 1,6,7,5,5,9,7 1, 3,5 11 11-2 21-3 31-4 41-5 51-6 61-7 71-8 81-9 91-1 % vyšetření 8 Referenční centrum 3 11 11-2 21-3 31-4 41-5 51-6 61-7 71-8 81-9 91-1 % vyšetření Referenční centrum 6 11 11-2 21-3 31-4 41-5 51-6 61-7 71-8 81-9 91-1 11 11-2 21-3 31-4 41-5 51-6 61-7 71-8 81-9 91-1 17,8 2,3 1,8 1,3 1,2 1,2 2,6 1,5 4,5 1,8 1,5,9 1,5 1,5 2,1 2,4 8 N = 79 vyšetření 47,4 42,9 11 11-2 21-3 31-4 41-5 51-6 61-7 71-8 81-9 91-1 % vyšetření 8 Estrogenové receptory (%) Hodnota ER (%) Hodnota ER (%) Hodnota ER (%) 49

Vzorky vyšetřené od 1.1.213 do 31.12.213 Celková pozitivita v referenčních laboratořích - na bázi vyšetření Zahrnuty pouze vzorky primárně vyšetřené v referenční laboratoři a u IHC -2+ s uvedenou výslednou hodnotou z ISH vyšetření. N = 5624 vyšetření % vyšetření % Referenční centrum 4 Referenční centrum 2 2% 4% 77,8 87,1 6% 8%, 1% 22,2 N= 27 3,1 9,8 N= 97 Referenční centrum 6 83, 5,4 11,6 N= 335 Referenční centrum 3 83,4 7,2 9,4 N= 818 Negativní Referenční centrum 1 Referenční centrum 5 Celkem 86, 89,9 86,4 5, 9, N= 2372 IHC /1+/2+ & ISH 2, 3,5 6,5 N= 112 IHC 3+ 4,7 8,9 N= 5624 5

Srovnání výsledků z primárního a referenčního vyšetření Vzorky vyšetřené od 1.1.213 do 31.12.213 N = 1384 vzorků primárně vyšetřených mimo ref. laboratoř Podíl vyšetření % 2% 4% 6% 8% 1% Výsledek prim. vyšetření Výsledek z referenční laboratoře 1+ 2+ 3+ Výsledek z prim. vyšetření: 41,4 IHC 1+ IHC 2+ 21,8 IHC 3+ 3,5 9,5 41,4 38,9 138 33 (75,8%) (18,1%) 9 (4,9%) 2 (1,1%) 12,4 4,7 1+ 7 7 21 (41,4%) (41,4%) (12,4%) 8 (4,7%) 6, 2+ 156 279 239 (21,8%) (38,9%) (33,3%) 43 (6,%) 3+ 11 (3,5%) 33,3 18, Výsledek z referenční laboratoře: 18,1 75,8 IHC 69, IHC IHC 1+ IHC 2+ IHC 3+ 4,9 3 (9,5%) 57 218 (18,%) (69,%) 51

Essential role of pathologist in molecular testing Neoplasm yes x no Benig x malignant Primary x secondary Histological subtype (SCC, SqCC, AC, NOS, etc.) % cells, necrosis, fibrosis, etc. Macrodissection, microdissection Selection of testing method

Optimal complex result Integration of morphologic, IHC and molecular result Specific diagnosis (not only NSCLC NOS!) Specifies, which markers have been tested by which methods In case of detection of specific mutations explicitly states, which mutations have been tested Is ready in time..

Knowledge Pulmonologist Pathologist Oncologist Infrastructure Biopsy Laboratory Budget Testing Treatment Feedback IQC, EQC MDT