Využití stanovení volných lehkých řetězců v diagnostice a monitorování léčby mnohočetného myelomu
DOPORUČENÍ CMG a SMG 4. reedice Roman Hájek předseda CMG Zdenka Štefaníková předsedkyně SMG
Freelite TM Metoda kvantitativního stanovení volných (a to pouze volných) lehkých řetězců imunoglobulinů, vyhodnocení výpočtem poměru κ : λ
Struktura imunoglobulinů Těžké řetězce (γ, α, µ, δ, ε) Lehký řetězec (κ, λ) Lehký řetězec (κ, λ)
Imunoglobuliny jsou produkovány plasmatickými buňkami 2 : 1 Kappa Lambda Syntéza lehkých řetězců je vůči těžkým řetězcům ve 40% nadbytku 0,5 g/den Koncentrace immunoglobulinů v séru je úměrná počtu plasmatických buněk a rychlosti syntézy
nefron FLC - monomer 25 kda Glomerulus póry 40-60 kda dimer 50 kda Důsledek: sérové hodnoty volných lambda jsou cca 2 x vyšší Zpětná absorpce 10-30 g/den moč 3-5 mg/den VLŘ odchází močí
Vliv zpětné renální tubulární absorbce na hladinu FLC v moči 50,000 100000 5,000 10000 Sérový FLC (mg/l) 500 1000 250 100 Močový FLC (mg/l) 100 10 1 NR serum NR moč 0 6 12 18 24 Čas (měsíce)
Biologický poločas volných κ,λ a Ig Volný kappa Volný lambda IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM IgA1 IgA2 IgE IgD 2-3 hodiny 4,5 6 hodin 21 dní 20 dní 7 dní 21 dní 10 dní 6 dní 6 dní 2 dny 3 dny
Exponovaný povrch skrytý povrch Kappa Exponovaný povrch oblast pantu těžký řetězec karbohydrát Původně skrytý povrch je vazebným místem pro protilátku lehký řetězec Lambda
9 1000,00 poměr celkového kappa / celkovému lambda 8 7 6 5 4 3 2 1 0 LAMBDA KAPPA poměr volného kappa / volnému lambda 100,00 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 LAMBDA KAPPA Porovnání citlivosti stanovení celkových lehkých řeztězců a volných lehkých řetězců v séru pacientů s MM
Citlivost testů na stanovení lehkých 1000 řetězců koncentrace (mg/l) 100 10 1 SPEP Total κ & λ CZE sife rozsah normálních hodnot v séru rozsah normálních hodnot v moči sflc UPEP uife
SPE Vzorek VZOREK SÉRA séra VZOREK SÉRA SPE & FREELITE (κ:λ) Automatizované kvantitativní stanovení SPE FREELITE abnormální FREELITE abnormální FREELITE normální FREELITE normální SPE normální SPE abnormální SPE abnormální SPE normální závěr: závěr: závěr: závěr: MP přítomen = =FLC MP přítomen MP přítomen MP negativní
Přesnost různých metodických přístupů v diagnostice monoklonálních proteinů Protokol % zjištěných případů Myelom AL amyl MGUS SPE samotná 90 50 45 SPE, IFE sérum 95 70 98 SPE and UPE 95 75 70 SPE, UPE, sérum a 97 90 98 moč IFE FLC samotný 96 98 65 SPE a FLC 99 98 85 SPE, FLC a sérum IFE 99 98 100
Polyklonální proliferace plasmatických buněk Monoklonální proliferace plasmatických buněk Infekce Autoimmunita Tumory plasmatických buněk Zvýšená produkce obou FLC Zvýšená produkce jednoho FLC Normální poměr κ/λ zůstává zachován Poměr κ/λ je abnormální
100000 Normal sera volné lehké lambda (mg/l) 10000 1000 100 10 1 Normal sera 0,1 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 volné lehké kapa (mg/l)
100000 volné lehké lambda (mg/l) 10000 1000 100 10 1 Kappa BJM Normal sera 0,1 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 volné lehké kapa (mg/l)
100000 volné lehké lambda (mg/l) 10000 1000 100 10 1 Kappa BJM Lambda BJM Normal sera 0,1 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 volné lehké kapa (mg/l)
100000 Kappa BJM volné lehké lambda (mg/l) 10000 1000 100 10 1 Lambda BJM NSM Normal sera 0,1 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 volné lehké kapa (mg/l)
100000 Kappa BJM volné lehké lambda (mg/l) 10000 1000 100 10 1 Lambda BJM NSM AL Amyloidosis Normal sera 0,1 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 volné lehké kapa (mg/l)
100000 Kappa BJM volné lehké lambda (mg/l) 10000 1000 100 10 1 Lambda BJM NSM AL Amyloidosis Normal sera Renal impaired 0,1 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 volné lehké kapa (mg/l)
Otázka vztahu snížené funkce ledvin na hladiny FLC Studie 688 pacientů s renální nedostatečností jiného původu než MM Rozděleni podle závažnosti poškození ledvin CKD 1-5 Collin Hutchinson et al, Clin J Am Soc Nephrol. 2008
Vztah nárůstu sflc a poklesu rychlosti glomerulární filtrace
Vztah nárůstu hodnot poměru κ:λ a stádia chronické choroby ledvin
Sérové hladiny FLC u pacientů s chronickou chorobou ledvin 5. stupně
Poměr κ/λ Normální rozsah 0,26-1,65 navrhovaný Renální rozsah 0,37-3,1
KOMPLIKACE způsobené FLC 1) Při zjištění choroby trpí až 40 % pacientů poškozením ledvin. 2) U 12-20 % pacientů s MM se choroba poprvé projeví akutním selháním ledvin. ( Ze 142 pacientů nově závislých na hemodialýze mělo 41 MM Výsledky studie Hutchinson et al BMC Nephrology 2008) 3) 10 % pacientů zůstává dlouhodobě závislých na hemodialýze. 4) Vysoká mortalita. 5) Chemoterapie a transplantace ledvin bývají u pacientů s MM komplikované a rizikové.
Nefron kůra glomerulus proximální vinutý kanálek toxické poškození, nekróza distální kanálek zevní dřeň vnitřní dřeň filtrace FLC absorbce 10-30 g/den poškození voskovým válcem silné vzestupné raménko FLC + Tamm-Horsfallovy proteiny vytvářejí komplexy
Figure 3.8. Waxy cast from the urine of a patient with multiple myeloma. (Courtesy of R Johnson and J Feehally ). 11
Figure 3.9. Monoclonal FLCs stained by immunoperoxidase anti antibodies in the distal tubules of a patient with myeloma kidney. (Courtesy of R Johnson and J Feehally ). 11
DIALYZAČNÍ KOLONA GAMBRO
Freelite pro sledování účinnosti léčebného postupu i dlouhodobého účinku hemodialýzy Rutinní hemodialytické zařízení málo účinné pro odstranění proteinů Výměna plasmy nesplnila očekávání zůstává vysoký obsah extravaskulárních FLC extravaskulárních FLC může být až 80 % Možnost odstranění volných lehkých řetězců ze séra pacientů s mnohočetným myelomem pomocí dialytických membrán fy Gambro Zotavení ledvin je pro přežití pacienta klíčové
Gambro HC1100 Výsledky 6 hodinové dialýzy Volný FLC lambda v séru (mg/l) 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Serum free lambda Dialysate free lambda 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 čas (min) 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Volný FLC lambda v dialyzátu (mg/l)
1. Odstranění FLC hemodialýzou pomocí membrány HCO 1100 fy Gambro je vysoce účinné. 2. Prodlouženou hemodialýzou lze odstranit i extravaskulární zásoby FLC. 3. Pacienti mohou zůstat nezávislí na dialýze v případě zotavení ledvin. 4. Účinná chemoterapie je nezbytná. 5. Mezinárodní klinická studie EULITE pokračuje. 6. VZP přiřadila pro membrány kódy 7. Možnost pro HCO ve specializovaných centrech
Význam pro laboratorní pracovníky 1) SCREENING VZORKŮ S PODEZŘENÍM NA MM přesné, kvantitativní výsledky pouze ze vzorku séra možnost opustit močové vzorky ověřený a doporučovaný protokol: kombinace Freelite + elfo sér. proteinů citlivost stanovení NSMM záchyt 82 % pacientů AL amyloidóza záchyt 98 % pacientů LCMM záchyt 100% pacientů IIgMM záchyt 96 % pacientů NSMM, AL amyloidu, LCMM, IIgMM SLEDOVÁNÍ prověřeno použítí Freelite jako indikátoru účinnosti léčby možnost rozdělení pacientů s MGUS podle rizika progrese
Význam pro laboratorní pracovníky 2) VÝHODY AUTOMATICKÉHO STANOVENÍ přesnost, kvalita, snížení pracnosti, rychlé dosažení výsledku testu jednoduchá forma výsledků - konkrétní číslo
Význam pro hematoonkology 1) NESEKREČNÍ MM (NSMM) první možnost snadného stanovení a sledování pacientů stanovitelných 82 % pacientů AL AMYLOIDÓZA snadné stanovení prověřeno použítí Freelite jako indikátoru účinnosti léčby stanovitelných 98 % pacientů MM Z LEHKÝCH ŘETĚZCŮ (LCMM) stanovení a sledování v séru možnost opustit močové vzorky stanovitelných 100 % pacientů
Význam pro hematoonkology 2) MG NEJASNÉHO (NEURČENÉHO) VÝZNAMU (MGUS) prognostický znak progrese choroby možnost rozdělení pacientů podle rizika progrese řežim sledování MM Z INTAKTNÍCH IMUNOGLOBULINŮ (IIgMM) (IIMM) použitelnost stanovení FLC pro sledování choroby
Význam pro nefrology FLC JSOU NEFROTOXICKÉ MOLEKULY SLEDOVÁNÍ NSMM, AL amyloidu, LCMM, IIgMM prověřeno použítí Freelite jako indikátoru účinnosti léčby možnost rozdělení pacientů s MGUS podle rizika progrese Vysoce perspektivní možnost sledování průběhu specifické hemodialýzy a jejího dlouhodobého účinku VÝHODY AUTOMATICKÉHO STANOVENÍ kvalita rychlost jednoduchá forma výsledků - konkrétní číslo snížení pracnosti
FLC při MM - závěr 1. FLCs a immunoglobuliny jsou nezávislé markery onemocnění 2. FLC pomáhají sledovat pacienty s MGUS 3. FLCs mohou v časném stadiu indikovat relaps 4. FLCs mohou určit residuální chorobu 5. FLCs mají vztah ke stadiu choroby 6. FLCs mohou být nefrotoxické 7. FLCs reagují rychle na léčbu
Děkuji vám za pozornost Běla Říčařová bela.ricarova@bindingsite.cz
HEVYLITE TM
Hevylite je specificky zacílen vůči jedinečným úsekům spojů mezi lehkými a těžkými řetězci v konstantní části Ig Určuje tedy současně typ těžkého i lehkého řetězce v molekule Ig
Kombinace různých lehkých a těžkých řetězců v molekulách imunoglobulinů
1. Jasná identifikace, kvantifikace a typizace myelomových proteinů 2. Poměr H-kappa : H-lambda je citlivým ukazatelem choroby 3. Koriguje variabilitu způsobenou objemem plasmy a hematokritem 4. Metabolismus IgG je variabilní
IgA M-proteins difficult to identify by SPE Normal IgA Multiple Myeloma sera 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1
Myelomové proteiny IgA mohou být skryty pro denzitometrii Normální séra M-protein skrytý v β oblasti MM pacient IgAκ = 5000 mg/l IgAλ = 20 mg/l Typ = IgAκ
1. Jasná identifikace, kvantifikace a typizace myelomových proteinů 2. Poměr H-kappa : H-lambda je citlivým ukazatelem choroby 3. Koriguje variabilitu způsobenou objemem plasmy a hematokritem 4. Jednoduchý a rychlý test na automatickém analyzátoru 5. Metabolismus IgG je variabilní
Stanovení myelomových proteinů třídy IgA
Citlivé sledování monoklonálních proteinů IgA M-protein (g/l) 100 10 1 CVAMP ASCT SPE and sife Negativní IgA M-protein Celkový IgA Poměr IgAκ/IgA Hevylite IgAκ / IgAλ Normální rozsah 0.1 0 400 800 1200 1600 1000 100 10 1 0.1 HEVYLITE - poměr IgAκ / IgAλ
Co vlastně znamená parciální remise? Cyclophosphamide IFE / SPE Negative CVAMP 2nd Response IgG IgG normal range HLC Greater HLC ratio fall SPE Monoclonal protein absent by densitometry relapse SPE Greater HLC ratio increase No change in HLC ratio indicating no selective tumour killing remission IgGλ / IgGκ normal range Bradwell et al. Clin Chem 2009
1. Jasná identifikace, kvantifikace a typizace myelomových proteinů 2. Poměr H-kappa : H-lambda je citlivým ukazatelem choroby 3. Koriguje variabilitu způsobenou objemem plasmy a hematokritem 4. Metabolismus IgG je variabilní
Poměr koriguje rozdíly v hodnotách koncentrace Ig způsobené změnami objemu plasmy a hodnot hematokritu Ig κ/ig λ = 3/1 Ig κ/ig λ = 3/1 Ig κ/ig λ = 3/1
1. Jasná identifikace, kvantifikace a typizace myelomových proteinů 2. Poměr H-kappa : H-lambda je citlivým ukazatelem choroby 3. Koriguje variabilitu způsobenou objemem plasmy a hematokritem 4. Metabolismus IgG je variabilní
Neonatální Fc receptor (FcRn) ovlivňuje rychlost metabolismu IgG
Neonatální Fc receptor (FcRn) neboli Brambellův receptor Struktura podobná MHC I. třídy. Váže albumin a IgG Poprvé byl popsán u hlodavců jakožto jedinečný receptor schopný transportovat IgG z mateřského mléka přes střevní endotel. F.W Brambell, The transmission of immunity from mother to young and the catabolism of immunoglobulins, Lancet 2 (1966), pp. 1087 1093. Další studie objevily existenci podobného receptoru u člověka, kde jeho přítomnost v placentě usnadňuje transport mateřského IgG rostoucímu plodu. Byla prokázána úloha neonatálního Fc receptoru v recirkulaci IgG.
Recyklace IgG nespecifická absorpce endoteliální buňka vazba IgG na FcRn degradace IgG vázaný na FcRn je recyklován
Vztah mezi koncentrací sérových imunoglobulinů a biologickým poločasem
Automatická metoda Hevylite Dvojice testů pro oba izotypy imunoglobulinů IgG, IgA, IgM: IgA/kappa, IgA/lambda IgG/kappa, IgG/lambda IgM/kappa, IgM/lambda
Ještě jednou děkuji za pozornost Bela.Ricarova@bindingsite.cz
100000 10000 Serum Lambda FLC (mg/l) 1000 100 10 1 Normals Kappa Light Chain Myeloma Lambda Light Chain Myeloma Non Secretory Myeloma Intact Immunoglobulin Myeloma AL Amyloidosis CKD1 CKD2 CKD3 CKD4 CKD5 0,1 Serum Kappa FLC (mg/l) 0,1 1 10 100 1000 10000 100000