Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 1. Mikrofluidní bioaplikace

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 1 Mikrofluidní bioaplikace

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 2 Mikrofluidní aplikace pro bioanalýzu Transport, dávkování, promíchávání a adresování vzorků, pufrů a dalších elektrolytů. Homogenní a heterogenní biologické interakce typu ligand-receptor. Separace biologických molekul. Detekce a kvantifikace biologických složek. Zařízení integrující některé nebo všechny předešlé kroky.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 3 Typická zařízení pro mikrofluidní bioaplikace Kapilární/mikrokanálkové elektroforetické a isoelektrické fokusační systémy. Dielektroforetické a elektroosmotické třídiče a koncentrátory. Mikrokanálkové struktury pro řízený elektrokinetický transport vzorků. Mikrofluidní čipy pro proteinovou analýzu s různým stupněm integrace. Vysoce integrované mikrofluidní čipy pro analýzu DNA/RNA. Mikrofluidní PCR systémy. Kontinuálně pracující biosenzory. Průtokové cytometry

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 4 PCR polymerázová řetězová reakce Metoda používaná ke zmnožení molekuly DNA ze vzorku Ke zmnožení je dostačující jedna kopie DNA molekuly, z toho plyne citlivost metody na kontaminaci vzorku biologickým materiálem Metoda je založena na řízeném střídání teplotních cyklů, kdy dochází ke zmnožování DNA rychlostí 2 n, kde n je počet teplotních cyklů Cykly se skládají z následujících kroků denaturace dvojšroubovice DNA při 92-95 C hybridizace primeru na specifické místo ssdna 62 C syntéza komplementárního řetězce termofilní DNA polymerázou 68-80 C Řízení teplotního režimu je klíčovým problémem PCR metody V mikrofluidice je kvalitní řízení teplotního režimu umožněno vysokým poměrem teplosměnné plochy vůči reakčnímu objemu

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 5 Mikrofluidní čip pro dynamickou PCR V dynamickém uspořádání protéká roztok obsahující vzorek DNA, primery, báze a DNA polymerázu opakovaně různými teplotními zónami. Amplifikace molekul DNA (cca 30 cyklů) trvá obvykle kolem 30 minut. Transport reakční směsi je obvykle proveden elektroosmoticky.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 6 Dynamická PCR v zařízení se segmentovaným tokem V každé červené kapce probíhá amplifikace DNA. Jednotlivé kapky jsou odděleny olejovou fází. Kapky proudí v mikrokanálech v různých teplotních zónách dochází k amplifikaci. Jedná se o kontinuální sériové uspořádání PCR. IMM Mainz.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 7 Mikrofluidní čip pro stacionární PCR Ve stacionárním uspořádání je vzorek a ostatní komponenty umístěn v mikrofluidní komoře. Pomocí topných tělísek je měněna okolní teplota v požadovaných cyklech. Běžně je dosahováno rychlosti změn teploty okolo 30 C s -1. Toto uspořádání je typické pro klasické PCR systémy, kde je ovšem dosahováno mnohem pomalejších změn teploty. Mikrofluidní čipy jsou náchylnější na kontaminaci DNA kvůli vysoké vzájemné afinitě používaných konstrukčních materiálů a biologických molekul.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 8 Příklady komerčních PCR čipů Stacionární PCR Dynamická PCR

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 9 Elektroforéza Separační metoda založená na různé pohyblivosti iontů ve vloženém elektrickém poli. Obvykle jsou separovány velké molekuly biologického původu fragmenty DNA, proteiny atd. K separaci dochází, pokud molekuly nesou odlišný efektivní elektrický náboj nebo se liší jejich molekulové hmotnosti. Nárůst molekulové hmotnosti koreluje s poklesem difúzního koeficientu složky. Separace je obvykle prováděna na stacionárním médiu (vrstvě gelu) nebo v mikrokapiláře/mikrokanálku s axiálně vloženým stejnosměrným elektrickým napětím Molekuly s odlišnou pohyblivostí se rozdělí do separovaných zón. Velikost a poloha zón vypovídají o kvantitativním a kvalitativním složení separované směsi. K elektroforetickému systému je připojen detektor.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 10 Princip kapilární elektroforézy v mikrofluidních systémech Odpadní rezervoár W Rezervoár mobilní fáze - pufru Směr toku separovaných částic Odpadní rezervoár B Separační kanál Detektor W S Dávkování vzorku Rezervoár vzorku Zdroj stejnosměrného elektrického napětí

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 11 Využití elektroforézy elektroforetické kapilární pole Radiální matice separačních kanálků 96 kanálové mikrozařízení určené pro elektroforetickou separaci molekul DNA. Zařízení je opatřeno fluorescenčním detektorem. Separační kanál má průměr 200 mm. Kanálky dávkovacích zařízení mají šíři 110 mm a hloubku 50 mm. Délka separačních kanálů je 33 mm. Dávkovací zařízení

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 12 Využití elektroforézy automatizované 96-kapilárové zařízení pro separaci DNA 96 jamkové destička se vzorky DNA Separační kapiláry Zdroj vysokého napětí Fluorescenční detektor

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 13 Sekvenování DNA: Sangerova metoda http://www.techcouncil.org/the-sanger-dna-sequencing-methods-1

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 14 384-kanálová kapilární zařízení pro sekvenování DNA Zařízení slouží k detekci různě velkých fragmentů DNA vzniklých syntézou komplementárního řetězce DNA při sekvenování. Každá báze je označena specifickou značkou (jednou ze čtyř), jejíž přítomnost je možno detekovat pomocí laserem indukované fluorescence. Z pořadí detekovaných zón a barvy lze určit sekvenci bazí.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 15 Příklad komerčních sekvenovacích zařízení s integrovanou kapilární elektroforézou MegaBACE 4000 Capillary Array (jedno pole obsahuje 64 kapilár). Přístroj lze dále rozšířit.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 16 Využití elektroforézy příprava koncentrovaného analytu Polopropustná vrstva DF Schéma koncentrátoru Zvýšení koncentrace vzorku Přivedení vzorku DF Odvedení koncentrátu na separaci

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 17 Isoelektrická fokusace Separační metoda využívající odlišnosti hodnoty isoelektrického bodu různých biomolekul. Isoelektrický bod odpovídá hodnotě ph, kdy daná molekula nese celkově nulový elektrický náboj. Pokud je hodnota ph nižší, biomolekula získává celkově kladný elektrický náboj. Pro hodnoty ph vyšší je náboj biomolekuly celkově záporný. Fokusační metoda je založena na faktu, že biologická molekula migruje v elektrickém poli pouze tehdy, pokud je její celkový elektrický náboj nenulový. Jestliže je molekula transportována do oblasti, kde hodnota ph je rovna isoelektrickému bodu, její migrace se zastaví. V tomto místě může být poté detekována. Obvykle je používáno sériové uspořádání (viz dále). Mikrofluidní systémy umožňují také paralelní uspořádání.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 18 Isoelektrická fokusace Klasické sériové uspořádání s imobilizovaným gradientem ph V klasickém uspořádání je vytvořen sendvič skládající se z gelových komůrek oddělených membránami. V každé komůrce je pomocí pufru nastavena určitá hodnota ph. Komůrky jsou řazeny v sérii tak, aby hodnota ph monotónně klesala nebo rostla. Na systém je vloženo elektrické pole a do některé komory je vložen vzorek obsahující biologické molekuly. Ty se poté migrují do komor, kde je hodnota ph blízká jejich isoelektrickému bodu.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 19 Paralelní uspořádání komor s různou hodnotou ph Isoelektrická fokusace V paralelním uspořádání jsou komůrky s rozdílně nastavenými hodnotami ph odděleny nepropustnou přepážkou. V mikrofluidice je možno vytvořit velké pole komůrek s velmi malým charakteristickým rozměrem. Kolmo k tomuto komůrkovému poli je vložen gradient elektrického potenciálu a vzorek obsahující biologické molekuly je umístěn nad a/nebo pod komorami. Biomolekuly jsou poté separovány podle svého isoelektrického bodu v odpovídajících komůrkách. Uvedené řešení výrazně urychluje fokusaci vzhledem ke krátkým transportním vzdálenostem v laterálním směru. Je možno také využít automatických detektorů.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 20 SDS-PAGE Western blot Nterminus antibody T Sch 250 150 100 75 50 25 10

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 21 Chemické a biochemické interakce Při interakci jedné nebo několika chemických komponent (reaktantů) může dojít k jejich chemické přeměně za vzniku produktů. Chemická přeměna probíhá za přítomnosti nebo bez přítomnosti katalyzátorů, které se přímo účastní transformace a snižují její aktivační energii. Reaktanty katalyzátor Produkty V biochemických reakcích dochází velmi často při interakci ligandu a receptoru ke tvorbě ligandreceptorového komplexu a/nebo jeho zpětné disociaci Ligand + Receptor Komplex

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 22 Uspořádání chemické interakce Homogenní všechny reaktanty i katalyzátor jsou v jedné fázi, obvykle kapalné například kompetitivní imunoanalýza v roztoku Ag (aq) + Ab (aq) C (aq) Heterogenní jeden nebo více reaktantů nebo katalyzátor je umístěn v jiné fázi než ostatní reaktanty například heterogenní imunoanalýza s antigenem nebo protilátkou vázanou na pevný nosič Ag (s) + Ab (aq) C (s)

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 23 Heterogenní biochemické reakce Heterogenní uspořádání je obvyklé u všech vysoce paralelizovaných aplikací DNA čipů nebo různých proteinových čipů. Jeden z reaktantů receptor je imobilizován buď na povrchu pevné fáze nebo v gelové vrstvě. Receptorem může být antigen, protilátka, proteinové ligandy a receptory (GF, EGFR), jiné proteiny, ssdna, RNA atd. Rozpoznávání se děje na základě specifity komplementární interakce mezi antigenem a protilátkou, ssdna-ssdna, enzymem a substrátem atd. Zatímco DNA čipy obsahují velké množství vazných míst (až desítky tisíc), u proteinů to bývají obvykle jednotky až desítky.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 24 hemaglutinace http://en.wikipedia.org/wiki/blood_type

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 25 DNA čipy Zařízení pro detekci specifické sekvence bází v molekule DNA nebo RNA DNA čip je tvořen maticí detekčních míst (microarray) Detekční místa jsou obvykle tvořena gelem s imobilizovaným receptorem ssdna (denaturovaná jednořetězcová DNA) V analyzovaném vzorku jsou přivedeny fluorescenčně značené ssdna (ligandy) V případě komplementarity ligandu a receptoru proběhne hybridizace a stabilní dsdna (dvouřetězcová DNA) je vytvořena v detekčním místě Po odmytí nenavázané ssdna, může být provedena fluorescenční detekce.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 26 DNA čipy DNA čipy vykazují extrémní specifitu, která je závislá na počtu párů bází (pb) ve vzniklém komplexu ligandreceptor (~ 4 n, kde n je počet pb). Charakteristický rozměr detekčních míst bývá v mm, což umožňuje vytváření obrovských matic detekčních míst (fotolitografie, microspotting, inject printing). Na jednom DNA čipu mohou být vázány všechny sekvence DNA kódující nějaký gen určitého organizmu (cca desítky tisíc míst) DNA čipy jsou využívány pro detekci genetických poruch (mutací), identifikaci osob (DNA fingerprint), detekci přítomnosti virových nebo bakteriálních infekcí, zjišťování nejúčinnějšího léčebného postupu u závažných onemocnění (personal therapy)

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 27 Princip DNA čipu- schéma Typický fluorescenční obraz DNA čipu po hybridizaci

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 28 http://en.wikipedia.org/wiki/dna_microarray

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 29 DNA čipy Pod detekčním místem (gelem) bývá umístěna elektroda Vložené elektrické pole urychluje transport DNA ze vzorku k detekčnímu místu vlivem elektroforetické migrace Analýzu na čipu tak lze urychlit z hodin na minuty Zapojením vybraných elektrod je možné složky vzorku usměrňovat (adresovat) pouze ke zvoleným detekčním místům Vzhledem k univerzálnosti interakce ssdnassdna a její vysoké specificitě, je již mnoho DNA čipů dodáváno komerčně

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 30 Příklady komerčních DNA čipů DNA čip firmy Nanogen se 100 testovacími místy s uloženými mikroelektrodami pro adresování. DNA čip s možností adresování standardního připojení k řídící jednotce. Typická čtečka signálu DNA čipů

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 31 Na DNA čipu může být umístěn celý genom libovolného organizmu DNA čip Escherichia coli 18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm Sledování exprese až 5500 transkriptů Affymetrix, Inc. DNA čip Drosophila melanogaster (octomilka) 18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm Sledování exprese až 18500 transkriptů Affymetrix, Inc. DNA čip Myš 18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm Sledování exprese až 39000 transkriptů Affymetrix, Inc. DNA čip Člověk 18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm Sledování exprese až 47000 transkriptů Affymetrix, Inc.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 32 Příklady komerčních DNA čipů Vzhledem k vysoké specificitě hybridizační reakce lze princip DNA čipů použít např. ke zvýšení bezpečnosti různých čipových karet Každá sekvence DNA je spojena se specifickým signálem elektronického čipu karty. Tento signál může být identifikován pomocí čtecího zařízení s komplementárním signálem.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 33 Proteinové čipy Interakce mezi dvěma komplementárními proteiny nebo proteinem a molekulou nebílkovinné povahy Proteiny jsou velmi rozmanité molekuly proteiny, lipoproteiny, glykoproteiny fibrilární a globulární hydrofilní nebo hydrofóbní charakter povrchu isoelektrický bod, celkový elektrický náboj protilátky, antigeny, enzymy, receptory, ligandy, substráty řádové rozdíly v molekulární hmotnosti Specificita nebývá absolutní, enzym je schopen zpracovávat více substrátů, protilátky se mohou vázat na více antigenů (epitopů)

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 34 Proteinové čipy Z uvedených vlastností plyne, že žádný proteinový čip nemůže být tak univerzální a specifický jako DNA čipy Přístup ke konstrukci proteinového čipu také není univerzální, protože každá aplikace vyžaduje zvláštní přístup, což je determinováno charakterem zkoumaného proteinového systému Obvykle není vyžadován vysoký stupeň paralelizace (jedno až několik desítek detekčních míst) Typickým příkladem může být čip pro paralelní detekci několika antigenů spjatých s různými infekčními chorobami

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 35 Proteinové čipy Proteinové čipy mají řádově menší charakteristické rozměry než klasické systémy pro detekci proteinů (např. ELISA destičky) řádové snížení doby analýzy (např. rychlá diagnostika) snížení spotřeby proteinových reaktantů (cena) přenositelnost systému (k pacientovy, na místo analýzy) snadnější paralelizace reprodukovatelnější reakční podmínky (přesné dávkování, lepší homogenizace vzorku, ) Protože proteinové čipy nejsou masově rozšířené chybí univerzální porty ceny analýz jsou podstatně dražší než v klasických systémech, protože pořizovací náklady na detektory, obslužné zařízení i samotné čipy jsou obrovské čipy jsou vyráběny v malých sériích výhody proteinových čipů nepronikly mezi odbornou veřejnost

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 36 Příklad imunoanalýzy v homogenním uspořádání Kompetitivní imunoanalytické stanovení teofylinu v homogenním uspořádání. Dávkování reaktantů a manipulace s roztoky je založena na elektroosmotickém transportu.teofylin ze vzorku (5) a známé množství značeného teofylinu (6) jsou nejprve smíchány. Poté jsou inkubovány s omezeným množstvím protilátky (7). Vznikají komplexy značeného a neznačeného teofylinu s protilátkou a zůstává část nespotřebovaného značeného teofylinu. Značený teofylin a značený teofylin v komplexu jsou následně na základě různé elektroforetické mobility odděleny v separačním kanále a jejich množství je detekováno.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 37 Příklad imunoanalýzy v homogenním uspořádání Míchání a inkubace Kalibrační křivka relativní poměr značeného teofylinu volného a v komplexu vypovídá o koncentraci neznačeného teofylinu ve vzorku. Separace

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 38 Příklad imunoanalýzy v homogenním uspořádání Vysoce integrované šestikanálové zařízení pro paralelní imunoanalýzu v homogenním uspořádání. Zařízení obsahuje pouze jeden fluorescenční detektor. Separace komplexu a značeného antigenu se provádí na základě rozdílných elektroforetických mobilit. Využit elektroosmotický transport roztoků.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 39 Mikrofluidní čip pro detekci proteinů na pevné fázi Reakční komora Zařízení kombinuje následující procesy: imobilizace proteinu, inkubace, proplachování, detekce a regenerace. Transport je uskutečněn výhradně elektrokineticky. Heterogenní stanovení IgG ze vzorku vazbou na imobilizovaný Protein A

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 40 Mikrofluidní čip pro detekci proteinů na pevné fázi Fluorescenční detekce vázané protilátky Kvantifikace signálu v elektroosmotickém biosenzoru kalibrační křivka

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 41 Polystyrénový mikročip pro detekci IgG Experimentální mikročip testovaný pro přímou a sendvičovou detekci lidských IgG na Proteinu A. Protein A je imobilizován na stěně zařízení. Vzorek je přiveden v roztoku. Doba inkubace je 5 minut. Paralelizace kanálů umožňuje sestavení kalibračních křivek nebo paralelní detekci různých vzorků.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 42 Polystyrénový mikročip pro detekci IgG Intenzita fluorescenčního zabarvení v konkrétním kanále po vymytí zbytku vzorku vypovídá o koncentraci imobilizovaného komplexu PA-hIgG nebo PA-hIgGgIgG a tedy i o původní koncentraci IgG v analyzovaném vzorku.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 43 Polystyrénový mikročip pro detekci IgG Analýzou intenzity fluorescenčního signálu je možno získat kalibrační křivky mikrofluidního zařízení. Z nich lze pomocí matematického modelu určit rovnovážné a kinetické konstanty vazby ligand-receptor. Rychlostní konstanta Ab Ag kon C Rovnovážná konstanta K k d off k on Imobilizovaný Protein A a lidské IgG v roztoku k on = 5.5 m 3 mol -1 s -1 K d 3 10-6 mol m -3

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 44 PDMS mikročip pro kvantifikaci protilátek Mikročip z polydimethylsiloxanu (PDMS) Vynikající optické vlastnosti, snadná výroba Hydrofobní charakter povrchu Dvoukroková detekce myších protilátek migg higg glutardialdehyde migg FITC-gIgG

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 45 PDMS mikročip pro kvantifikaci protilátek Měřen profil fluorescenční emise napříč čipem Schéma detekční aparatury Zařízení obsahuje excitační laser a fotonásobič

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 46 PDMS mikročip pro kvantifikaci protilátek Výsledkem je kalibrační závislost intenzity fluorescenčního signálu na koncentraci myších protilátek ve vzorku

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 47 Mikročip pro heterogenní imunoanalýzu na vrstvě částic Sendvičová heterogenní imunoanalýza stanovení CEA (carcinoembryonic antigen) při diagnostice rakoviny. Mikrofluidní zařízení obsahuje mikročástice s imobilizovanou Ab proti CEA. CEA ze vzorku se váže na protilátku. Na vzniklý komplex se váží protilátky proti CEA a dále zlatem značené protilátky proti CEA protilátkám. Komplex obsahující zlaté částice může být detekován.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 48 Mikročip pro heterogenní imunoanalýzu na vrstvě částic Zařízení obsahuje lože mikročástic. Úniku mikročástic je zabráněno zúžením kanálku. Roztoky obsahující analyty jsou dávkovány tlakem řízenou konvekcí. Zařízení je schopno zpracovávat paralelně několik vzorků.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 49 Příklad komerčních proteinových čipů Kompaktní analyzátor Sandia fluorescenčně značených proteinových toxinů nm koncentrace Jádrem analyzátoru je mikrofluidní čip fungující na principu kapilární elektroforézy Modrý diodový laser excituje fluorescenční značku proteinů Transport vzorků je realizován elektrokineticky

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy 50 Průtoková cytometrie Metoda slouží k identifikaci a kvantifikaci specifických buněk třídění buněk Typické aplikace detekce rakovinných buněk v krvy, detekce mikroorganizmů Buňky se pohybují v sérii kanálkem a specifické buňky (například značené fluoreskující protilátkou) jsou opticky detekovány

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy 51 Průtokový cytometr v mikrofluidním čipu Chen HT, Wang YN, MICROFLUIDICS AND NANOFLUIDICS 6, 529-537, 2009

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 52 FACS - fluorescence activated cell sorting http://www.thoughtyoumayask.com/picsbtqq/fluorescence-activated-cell-sorting/2

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy 53 Elektrostatický dezintegrátor buněk Krátkodobé pulsy (50 ms) silného elektrického pole (1 10 7 Vm -1 ) dezintegrují buněčnou membránu/stěnu Carlos de la Rosa et al, IEEE TRANSACTIONS ON BIOMEDICAL ENGINEERING, VOL. 55, NO. 10, OCTOBER 2008

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 54 Dielektroforéza v AC elektrickém poli Dielektroforetická síla působí částice dielektrika v nehomogenním elektrickém poli Jedná se o interakci časově proměnného elektrického pole (AC) a parciálního náboje molekul nebo částic dielektrika (dipólu) Částice nemusí nést celkový elektrický náboj Velikost dielektroforetické síly závisí na tvaru částice, elektrických vlastnostech částic a okolního kapalného média, frekvenci AC elektrického pole Dielektroforetická síla nezávisí na polaritě elektrického pole Částice jsou vtahovány do oblastí s nejvyšší intenzitou elektrického pole, pokud je jejich dielektrická konstanta vyšší (jsou lépe polarizovatelné) než dielektrická konstanta okolního média (pozitivní dielektroforéza) Částice jsou vtahovány do oblastí s nejnižší intenzitou elektrického pole, pokud je jejich dielektrická konstanta nižší (jsou hůře polarizovatelné) než dielektrická konstanta okolního média Vysoce selektivní metoda pro manipulaci a separaci mikro a nanočástic, buněk atd.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 55 Dielektroforéza v mikročipu - příklad Separování a koncentrování směsi kvasinek a polystyrénových mikročástic Buňky malé, světlé Polystyrénové mikročástice velké, tmavé (Zhou et al., 2005)

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 56 Dielektroforéza - princip Frekvenčně závislá pozorovatelná až při velmi vysokých frekvencích (reorientace dipólů) Lépe (rychleji) jsou polarizovány dielektrika s větší dielektrickou konstantou Tato více polarizovaná dielektrika jsou vtahovány do oblasti větších intenzit elektrického pole (pozitivní dielektroforéza) Částice více polarizované vytlačují z těchto míst částice méně polarizované (negativní dielektroforéza) + d + d d + d

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 57 Dielektroforéza celková síla působící na kulovou částici Pro malé frekvence je Clausius- Mossotiho faktor (člen v závorce záporný) Pro vyšší frekvence je kladný f i g E r F k k rms m p m p m DEP 2 2 2 * 2 * * * * 3

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 58 Detektor červených krvinek založený na dielektroforéze Minerick et al. Electrophoresis (2003). Ve AC elektrickém poli se částice s odlišnou dielektrickou konstantou než má nosný elektrolyt koncentrují v místech největší nebo nejmenší intenzity elektrického pole. Buňky jsou také odpuzovány z povrchu elektrod vlivem elektrodové polarizace interagující s polarizací buněčné membrány.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 59 Kombinovaný AC elektroosmotický mísič a dielektroforetický koncentrátor Systém dvou soustředných elektrod na které je vloženo AC elektrické pole. Tangenciální coulombovskou silou je ke středu centrální elektrody strháván elektrický náboj tvořený polarizací elektrody. Pohybující se náboj strhává tekutinu, která proudí tangenciálně ke středu elektrody a poté normálovým směrem od elektrody. Dochází tak k promíchávání roztoku. Nad středem centrální elektrody jsou potom dielektroforetickou silou selektivně zachytávány molekuly DNA.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 60 Detektor bakterií založený na elektroosmotickém transportu ve střídavém elektrickém poli Zachycení Escherichia coli ve stagnantních bodech elektrod. Wu et al. Microfluid Nanofluid (2005). Páry ko-planárních elektrod. AC zdroj vytváří časově proměnné elektrické pole. Vlivem tangenciální složky elektrického pole dochází ke tvorbě vírů. Nad určitým místem elektrod vzniká stagnantní bod s nulovou tangenciální coulombovskou silou a bez pohybu tekutiny, kde jsou zachycovány částice buňky.

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 61 Hlavní budova ÚFE je situována v severní části Prahy, v Kobylisích, a je snadno dostupná z MHD. Nejjednoduším způsobem, jak se dopravit k hlavní budově ÚFE, je využití Pražského metra. Vystupte z metra na trase C v zastávce "KOBYLISY". Odtud je to již přibližně 10 minut pěšky. Můžete ale rovněž nasednout do tramvaje č. 17 ve směru "VOZOVNA KOBYLISY". Hlavní budova ÚFE se nachází mezi zastávkami "LÍBEZNICKÁ" a "VOZOVNA KOBYLISY". Hned po vystoupení z tramvaje uvidíte velkou žlutou budovu s malou věžičkou a anténami (parabolami) na střeše.